KR102075035B1 - 나노패턴시트와 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법 - Google Patents

나노패턴시트와 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 단일 세포(single cell)형의 유도만능줄기세포를 그루브(groove) 형 또는 포스트(post)형 패턴이 형성된 나노패턴시트 상에서 증식 배양 또는 계대 배양하여 미분화 상태의 유도만능줄기세포를 제조하는 단계; (b) 상기 미분화 유도만능줄기세포를 3차원 세포공배양용기에서 배양하여 유도만능줄기세포의 EB(embryoid body)를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 EB의 단일세포를 3차원 세포공배양분화용기의 웰에 식종(seeding)하고, 분화 배지(chondrogenic medium)를 첨가한 후, 35 내지 39℃의 인큐베이터에서 연골 분화를 유도함으로써 연골세포 펠렛을 수득하는 단계;를 포함하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법에 관한 것이다.

Description

나노패턴시트와 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법{Method for preparing pellet of chondrocytes using nano-pattern sheet and 3D cell co-culturing plate for differentiation}
본 발명은 나노패턴시트와 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 패턴이 형성된 나노패턴시트를 이용하여 미분화 상태의 유도만능줄기세포를 배양하고 3차원 세포공배양용기와 3차원 세포공배양분화용기를 이용하여 단일세포를 일정한 규격으로 공배양하고, 연골세포 분화 및 재생에 적용할 수 있는 나노패턴시트와 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법에 관한 것이다.
관절 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로서 연골세포와 풍부한 세포외기질로 이루어져 있다. 연골세포는 세포외 기질을 합성, 분비하므로 관절 연골의 유지에 중요한 역할을 한다. 노화에 따른 연골세포 수 및 연골세포 대사작용의 감소는 유병률이 높은 노인성 질환인 골관절염의 병인 중의 하나이다. 이와 같은 관절 연골은 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다.
관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이다. 최근에는 환자의 체세포를 유전자적 조절을 통해서 역분화를 유도한 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)기술이 개발되면서 기존의 자가연골세포 방식과 간엽줄기세포의 한계를 극복할 수 있는 새로운 세포치료방법이 될 수 있을 것으로 기대된다. 유도만능줄기세포는 환자 자신의 체세포만을 이용하기 때문에 세포치료 후 나타날 수 있는 면역 거부 반응을 일으키지 않는 이점이 있다. 따라서, 미분화 상태의 유도만능줄기세포를 안정적으로 배양하고, 연골세포로의 분화를 효율적으로 수행하여 할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 줄기세포는 2차원적 환경에서 보다 인체와 비슷한 3차원 구조에서 안정적으로 배양이 가능하다는 보고가 있으며, 다양한 융합기술을 적용하여 안정적인 줄기세포 3차원 배양기술을 확립하기 위한 연구가 진행되고 있다.
종래, 줄기세포의 3차원 배양기술의 예로 인간 중간엽 줄기세포가 혼합된 알지네이트 용액을 스테이지 상에 쾌속조형 방법으로 분배(dispose)하여 지주(strut)층을 형성하고, 가교 용액을 분사하여 지주층을 가교시키는 방법으로 다공성 3차원 적층 담체를 제조하고, 이를 중간엽 줄기세포 배양 배지에서 배양함으로써 3차원의 연골세포를 제조하는 기술이 알려져 있으나, 지주층 제조와 가교 공정을 수행해야 하므로 제조 공정이 매우 복잡하다.
따라서, 줄기세포의 배양 및 연골세포로의 분화 과정이 단순하면서도 생산 효율이 높고, 안정적인 3차원 연골세포 제조 기술의 개발이 필요한 실정이다.
한국등록특허공보 제10-1551660호 한국등록특허공보 제10-1544391호
본 발명의 목적은 3차원 세포공배양분화용기를 사용함으로써 종래 튜브에서의 분화에 비하여 연골분화용 배지의 소모를 줄이면서도 분화에 걸리는 시간도 줄일 수 있으며 연골분화 발현율도 향상시킬 수 있는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 나노체패턴시트를 이용해서 부분적인 분화가 발생하는 문제점을 해결하고 체외에서도 유도만능줄기세포의 안정적인 미분화를 유지할 수 있는 미분화 유도만능줄기세포의 배양방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 기존 2차원적 EB 생성 방법이 아니라 3차원 세포공배양용기를 활용하여 균일한 사이즈의 EB를 대량으로 생산할 수 있으며, 이후 재현성 있는 분화효율을 구현할 수 있는 유도만능줄기세포의 EB 배양방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
(a) 단일 세포(single cell)형의 유도만능줄기세포를 그루브(groove) 형 또는 포스트(post)형 패턴이 형성된 나노패턴시트 상에서 증식 배양 또는 계대 배양하여 미분화 상태의 유도만능줄기세포를 제조하는 단계; (b) 상기 미분화 유도만능줄기세포를 3차원 세포공배양용기에서 배양하여 유도만능줄기세포의 EB(embryoid body)를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 EB의 단일세포를 3차원 세포공배양분화용기의 웰에 식종(seeding)하고, 분화 배지(chondrogenic medium)를 첨가한 후, 35 내지 39℃의 인큐베이터에서 연골 분화를 유도함으로써 연골세포 펠렛을 수득하는 단계;를 포함하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법이 제공된다.
단계 (a)의 상기 나노패턴시트는, 그루브(groove) 형 또는 포스트(post)형 패턴이 형성된 마스크를 제조하고 리소그래피 공정을 통하여 웨이퍼 표면에 나노패턴을 형성하여 실리콘 마스터를 제조하는 단계; 상기 실리콘 마스터 표면을 소수성 처리하는 단계; 및 상기 소수성 처리된 실리콘 마스터를 이용하여 생체적합성 재료를 캐스팅함으로써 그루브(groove) 형 또는 포스트(Post)형 패턴이 형성된 나노패턴시트를 제조하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 리소그래피는 이빔 리소그래피(e-beam lithography) 또는 스캐너 리소그래피 (scanner lithography)에 의해 수행할 수 있다.
상기 소수성 처리는 옥타플루오로시클로부탄(octafluorocyclobutane, C4F8), 실란(silane, SiH4) 및 산화막(oxide, SiO2) 처리 중에서 선택된 어느 하나에 따라 수행될 수 있다.
상기 생체적합성 재료는 PDMS(Polydimethylsiloxane), 실리콘 (Silicone), 폴리에틸렌글라이콜(Polyethylene glycol), 및 알지네이트(Alginate) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 나노패턴시트의 패턴은 그루브의 폭(width) 또는 포스트의 지름(diameter)이 각각 200nm 내지 800nm 일 수 있다.
상기 나노패턴시트의 패턴은 그루브의 폭 또는 포스트의 포스트의 높이/지름의 비율이 0.8 내지 1.2인 것일 수 있다.
상기 나노패턴시트는 표면이 친수성 처리될 수 있다.
상기 친수성 처리는 산소플라즈마 처리 또는 화학적 처리를 통한 아민기 코팅에 따라 수행될 수 있다.
단계 (a) 이전에, 상기 나노패턴시트 표면에 PLO(poly-L-ornitnine) 및 피브로넥틴(fibronectin) 중에서 선택된 1종 이상으로 코팅 처리하여 세포부착성 증진 단계를 추가로 수행할 수 있다.
단계 (b)의 상기 3차원 세포공배양용기는 복수의 마이크로 반구체 웰 어레이를 포함하고, 상기 마이크로 반구체 웰은 각각 지름이 400 내지 800㎛이고, 깊이가 상기 지름의 1 내지 1.5배 일 수 있다.
단계 (b)에서 상기 EB의 단일세포는 EB를 DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline)로 세척한 후, Accutase®와 반응시킴으로써 형성될 수 있다.
상기 EB의 단일세포는 1.0×107 내지 1.5×107 cells/㎖로 분리될 수 있다.
단계 (c)에서 상기 인큐베이터는 3 내지 7%의 이산화탄소 농도의 분위기일 수 있다.
단계 (c)에서 상기 분화 배지(chondrogenic medium) 첨가 전 20 내지 40분 동안 상기 온도를 유지할 수 있다.
단계 (c)의 상기 3차원 세포공배양분화용기는 지름이 1.0 내지 5.0mm이고, 깊이가 1.5 내지 5.5mm인 반구형 웰이 복수 개 형성된 것일 수 있다.
상기 3차원 세포공배양분화용기의 재질은 PDMS(polydimethylsiloxane), 실리콘 (silicone), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), PMMA(polymethyl methacrylate), 및 COC (cyclic olefin copolymer) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,
상기 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법에 따라 제조된 연골세포 펠렛이 제공된다.
본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,
상기 연골세포 펠렛을 이용한 연골재생 방법이 제공된다.
본 발명의 유도만능줄기세포를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법은 3차원 세포공배양분화용기를 사용함으로써 종래 튜브에서의 분화에 비하여 연골분화용 배지의 소모를 줄이면서도 분화에 걸리는 시간도 줄일 수 있으며 연골분화 발현율도 향상되는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 적용되는 미분화 유도만능줄기세포의 배양방법은 나노구조체패턴시트를 이용해서 부분적인 분화가 발생하는 문제점을 해결하고 체외에서도 유도만능줄기세포의 안정적인 미분화를 유지할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 적용되는 유도만능줄기세포의 EB 배양방법은 기존 2차원적 EB 생성 방법이 아니라 3차원 세포공배양용기를 활용하여 균일한 사이즈의 EB를 대량으로 생산할 수 있으며, 이후 재현성 있는 분화효율을 구현할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 제조예 1 및 2에 따라 제조된 그루브형 및 포스트형 실리콘 마스터의 사진 및 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 제조예 3 및 4에 따라 제조된 그루브형 및 포스트형 나노패턴시트의 사진 및 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 3 및 4에서 사용한 세포공배양용기 StemFIT 3D (H449800)의 형태를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 5에서 사용한 세포공배양분화용기 StemFIT 3D (H449800)의 형태를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1에 따라 각각 5대 계대 배양된 유도만능줄기세포의 SEM 이미지를 비교한 것이다.
도 6 및 도 7은 실시예 1, 2 및 비교예 1에 따라 미분화 배양한 유도만능줄기세포의 1회(P1), 5회(P5), 10회(P10) 계대 배양에 다른 증식능을 Ki67 세포증식마커를 이용하여 분석한 결과이다.
도 8 내지 도 11은 실시예 1, 2 및 비교예 1에 따라 배양한 유도만능줄기세포의 미분화능을 분석한 결과이다.
도 12는 실시예 3, 실시예 4 및 비교예 2에 따라 배양된 EB의 형성을 1일 및 9일 경과시를 비교한 결과이다.
도 13 및 도 14는 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 펠렛의 크기를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 유도만능줄기세포의 연골세포의 DNA 전체량과 DNA 대비 GAG(glycosaminoglycan)양의 비율을 분석한 결과이다.
도 16은 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 유도만능줄기세포의 연골세포의 분화시간에 따른 연골형성 정도를 Safranin-O 염색에 의해 분석한 결과이다.
도 17 및 도 18은 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 유도만능줄기세포 연골세포에서의 RT-qPCR과 IHC(Immunohistochemistry)로 연골분화 유전자의 발현 정도를 분석한 결과이다.
도 19 및 도 20은 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 유도만능줄기세포 연골세포에서의 RT-qPCR과 IHC(Immunohistochemistry)로 골생성 유전자의 발현 정도를 분석한 결과이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.
먼저, 단일 세포(single cell)형의 유도만능줄기세포를 그루브(groove) 형 또는 기둥( Post )형 패턴이 형성된 나노패턴시트 상에서 증식 배양 또는 계대 배양하여 미분화 상태의 유도만능줄기세포를 제조한다(단계 a).
상기 나노패턴시트는 아래의 방법에 따라 제조될 수 있다.
우선, 그루브(groove) 형 또는 기둥(post)형 패턴이 형성된 마스크를 제조하고 리소그래피 공정을 통하여 웨이퍼 표면에 나노패턴을 형성하여 실리콘 마스터를 제조한다.
상기 리소그래피는 이빔 리소그래피(e-beam lithography) 또는 스캐너 리소그래피 (scanner lithography)에 의해 수행하는 것이 바람직하다.
이후, 상기 실리콘 마스터 표면을 소수성 처리할 수 있다.
상기 소수성 처리는 옥타플루오로시클로부탄(octafluorocyclobutane, C4F8), 실란(silane, SiH4), 산화막(oxide, SiO2) 처리 등에 의해 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 소수성 처리된 실리콘 마스터를 이용하여 생체적합성 재료를 캐스팅함으로써 그루브(groove) 형 또는 기둥(Post)형 패턴이 형성된 나노패턴시트를 제조한다.
상기 생체적합성 재료는 PDMS(Polydimethylsiloxane), 실리콘 (Silicone), 폴리에틸렌글라이콜(Polyethylene glycol), 알지네이트(Alginate) 등일 수 있다.
상기 나노패턴시트의 패턴은 그루브의 폭(width) 또는 기둥의 지름(diameter)이 각각 200nm 내지 800nm인 것이 바람직하다.
상기 나노패턴시트의 패턴은 그루브의 폭 또는 기둥의 포스트의 높이/지름의 비율이 0.8 내지 1.2의 범위인 것이 바람직하다.
본 단계 이후, 상기 나노패턴시트의 표면을 친수성 처리하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
상기 친수성 처리는 산소플라즈마 처리 또는 화학적 처리를 통한 아민기 코팅에 따라 수행하는 것이 바람직하다.
상기 나노패턴시트 상에서의 배양 전에 상기 나노패턴시트 표면에 PLO(poly-L-ornitnine) 및 피브로넥틴(fibronectin) 중에서 선택된 1종 이상으로 코팅 처리하여 세포부착성 증진 단계를 추가로 수행하는 것이 바람직하다.
상기 유도만능줄기세포는 나노패턴시트 상에 1×103 내지 1×105 cell/cm2의 밀도로 올려 배양하는 것이 바람직하다.
본 단계에서 최초 1 내지 2일간 ROCK(rho-associated protein kinase) 저해제를 첨가할 수 있다.
본 단계에서의 배양은 3일 내지 7일 동안 증식 배양하거나, 또는 3일 내지 7일 마다 계대 배양할 수 있다.
종래의 2차원 배양에 주로 사용되는 ECM(extracellular matrix)으로 Matrigel을 예로 들 수 있다. 유도만능줄기세포를 matrigel에서 배양할 경우 세포의 부착은 매우 용이하지만 장기간 배양해야 되는 줄기세포의 경우 부분적 분화가 발생하는 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명의 유도만능줄기세포 배양방법은 나노패턴시트를 이용함으로써 체외에서도 안정적인 미분화를 유지할 수 있는 효과가 있다.
다음으로, 상기 미분화 유도만능줄기세포를 3차원 세포공배양용기에서 배양하여 유도만능줄기세포의 EB ( embryoid body )를 형성한다(단계 b).
상기 3차원 세포공배양용기는 복수의 마이크로 반구체 웰 어레이를 포함하고, 상기 마이크로 반구체 웰은 각각 지름이 400 내지 800㎛이고, 깊이가 상기 지름의 1 내지 1.5배인 것을 사용할 수 있다.
종래 2차원적 EB 생성은 로 바인딩 디쉬(low binding dish) 방식을 사용해서 서스펜션 배양(suspension culture)으로 불규칙하게 생성되었다. 이와 같은 방법으로 유도만능줄기세포를 분화시킬 경우 분화효율이 일정하지 않고, 실험자에 따라 결과가 다양하게 나타나는 문제점이 있었다. 그러나 본 발명에 적용되는 EB 형성방법은 균일한 사이즈의 EB를 생성할 수 있으며, 따라서 유도만능줄기세포의 분화효율을 향상시키고, 재현성 있는 분화 효율을 달성할 수 있는 효과가 있다.
마지막으로, 상기 EB 의 단일세포를 3차원 세포공배양분화용기의 웰에 식종( seeding )하고, 35 내지 39℃의 인큐베이터에서 분화 배지( chondrogenic medium )를 첨가하여 연골 분화를 유도함으로써 연골세포 펠렛을 수득한다(단계 c).
단계 (b)에서 배양된 EB는 DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline)로 세척한 후, Accutase®와 반응시킴으로써 단일세포로 다시 분리될 수 있다.
상기 단일세포는 1.0×107 내지 1.5×107 cells/㎖로 분리하는 것이 바람직하다.
상기 인큐베이터는 3 내지 7%의 이산화탄소 농도의 분위기를 유지하는 것이 바람직?.
상기 분화 배지(chondrogenic medium) 첨가 전 20 내지 40분 동안 상기 온도를 유지하는 것이 바람직하다.
상기 3차원 세포공배양분화용기는 지름이 1.0 내지 5.0mm이고, 깊이가 1.5 내지 5.5mm인 반구형 웰이 복수 개 형성된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 3차원 세포공배양분화용기의 재질은 PDMS(Polydimethylsiloxane), 실리콘 (Silicone), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), PMMA(polymethyl methacrylate), COC (cyclic olefin copolymer) 등을 사용할 수 있다.
종래 튜브 배양 방식은 고가의 연골분화용 배지가 많이 소모되며, 초기 펠렛을 형성시키는 과정도 원심분리기를 사용해서 작업을 진행해야 하는 번거로움이 있다. 이에 반해 본 발명의 세포공배양분화용기를 사용한 분화 방법은 경우 단일세포를 용기에 넣어주는 것만으로 작업을 수행할 수 있고, 매일 배양액만 교체하는 것만으로 분화를 용이하게 수행할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 상술한 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법에 따라 제조된 연골세포 펠렛을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 연골세포 펠렛을 이용한 연골재생 방법을 제공한다.
[실시예]
제조예 1: 그루브(groove)형 실리콘 마스터 제조
먼저, 그루브의 폭과 높이가 각각 약 5㎛로 형성된 그루브형 실리콘 마스터를 제조하였다. 구체적으로 나노구조체패턴이 형상된 레티클(reticle) 마스크를 제작하고 이빔리소그래피 (e-beam lithography) 공정을 통하여 실리콘 웨이퍼 표면에 그루브 패턴을 형상화 하였다. 이후, 나노패턴시트를 캐스팅할 때 패턴 손상을 막기 위하여 옥타 플루오르 시클로 부탄 (Octafluorocyclobutane, C4F8)으로 표면처리함으로써 소수성 처리를 하였다.
제조예 2: 포스트( post )형 실리콘 마스터 제조
그루브 형이 아닌 지름과 높이가 각각 약 3㎛로 형성된 포스트형 패턴이 형성된 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 실리콘 마스터를 제조하였다.
참고로 제조예 1 및 2에 따라 제조된 그루브형 및 포스트형 실리콘 마스터의 사진 및 SEM 이미지를 도 1에 나타내었다.
제조예 3: 그루브(groove)형 나노패턴시트 제조
제조예 1에 따라 제조된 그루브형 실리콘 마스터를 기반으로 PDMS를 캐스팅하여 그루브형 나노패턴시트를 제조하고, 세포배양 전 세포 부착성을 높이도록 표면에 산소 플라즈마 처리를 하였다.
제조예 4: 포스트( post )형 나노패턴시트 제조
제조예 2에 따라 제조된 포스트형 실리콘 마스터를 기반으로 한 것을 제외하고는 제조예 3과 동일한 방법으로 포스트형 나노패턴시트를 제조하였다.
참고로 제조예 3 및 4에 따라 제조된 그루브형 및 포스트형 나노패턴시트의 사진 및 SEM 이미지를 도 2에 나타내었다.
실시예 1: 그루브형 나노패턴시트에서 미분화 유도만능줄기세포 배양
제조예 3의 그루브형 나노패턴시트를 이용하여 미분화 유도만능줄기세포를 배양하였다. 구체적으로, 단일 세포형의 유도만능줄기세포(iPSc)를 1×103 cells/cm2로 나노패턴시트에 올린 후 처음 2일간 Y-27632를 넣어주었다. iPSCs는 총 5일간 배양하였으며 매일 새로운 배지로 교체하였다. iPSCs는 5일에 한 번씩 계대 배양을 하였고 50일 동안 10회의 계대 배양을 진행하였다.
실시예 2: 포스트형 나노패턴시트에서 미분화 유도만능줄기세포 배양
제조예 3의 그루브형 나노패턴시트 대신에 제조예 4의 포스트형 나노패턴시트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 유도만능줄기세포를 배양하였다.
실시예 3: 유도만능줄기세포 EB ( embryoid body ) 배양
실시예 1에 따라 배양된 유도만능줄기세포를 세포공배양용기 (StemFIT 3D)를 사용하여 유도만능줄기세포의 EB를 형성하였다. 이때 사용한 세포공배양용기는 StemFIT 3D (H449800)으로 반구체 지름은 800㎛이며, 깊이는 800㎛로 이루어져 있으며 웰의 개수는 449개로 구성되어 있다. 마이크로 세포공배양용기를 이용해서 일정한 크기의 EB를 449개 얻을 수 있었다.
실시예 4: 유도만능줄기세포 EB ( embryoid body ) 배양
실시예 1 대신에 실시예 2에 따라 배양된 유도만능줄기세포를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 유도만능줄기세포 EB를 배양하였다.
참고로 실시예 3 및 4에서 사용한 세포공배양용기 StemFIT 3D (H449800)의 형태를 도 3에 나타내었다.
실시예 5: 세포공배양분화용기에서의 연골세포 펠렛 제조
실시예 4에 따라 배양된 EB Accutase®를 이용하여 1.25×107 cells/㎖의 단일 세포로 분리하였고, 2.5x105 cells/20㎕을 세포공배양분화용기(ChondroFIT)의 각 well에 바로 seeding하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 30분 그대로 유지한 후, ChondroFIT에 5㎖의 chondrogenic medium을 첨가하여 연골 분화를 7일, 14일, 21일 단위로 분화과정을 모니터링하였다. ChondroFIT (C163000)의 재질은 PDMS이고, 각 웰은 지름 3.0mm, 깊이 3.5mm이며, 전체 들어가는 media volume 은 5.0㎖, 각 웰에 들어가는 media 양은 25㎕이다. 참고로 실시예 5에서 사용한 세포공배양분화용기 ChondroFIT (C163000)의 형태를 도 4에 나타내었다.
비교예 1: 플랫 ( flat ) 면에서의 유도만능줄기세포 배양
그루브형 나노패턴시트 대신에 패턴이 없는 평평한 PDMS면에서 유도만능줄기세포를 배양한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 유도만능줄기세포를 배양하였다.
비교예 2: 유도만능줄기세포 EB ( embryoid body ) 배양
그루브형 나노패턴시트 대신에 패턴이 없는 평평한 PDMS면에서 배양된 유도만능줄기세포를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 유도만능줄기세포 EB를 배양하였다.
비교예 3: 튜브에서의 연골세포 펠렛 제조
세포공배양분화용기 대신에 5㎖ 라운드 튜브들을 이용하고 각 튜브당 2.5x105 cells/500㎕의 셀을 넣고, 추가적으로 10분 동안의 원심분리 과정을 수행한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 연골세포 펠렛을 제조하였다.
[시험결과]
시험예 1: 배양된 유도만능줄기세포의 SEM 사진
도 5는 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1에 따라 각각 5대 계대 배양된 유도만능줄기세포의 SEM 이미지를 비교한 것이다.
도 5에 따르면, 비교예 1의 패턴이 없는 평평한 PDMS 면에서 유도만능줄기세포를 배양한 경우에 세포의 필로포디아(filopodia)가 바닥으로 뻗어 나가는 모양을 관찰할 수 있었다. 이에 따라, 균일한 미분화 상태의 유도만능줄기세포를 수득하기 어려움을 확인할 수 있다.
이에 반해, 실시예 1 또는 2의 그루브형 또는 포스트형의 나노패턴시트를 이용하여 배양한 경우에는 세포의 필로포디아(filopodia)가 바닥으로 뻗어 나가지 못하는 모습을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 이에 따라 세포가 쉽게 바닥으로 뻗어 나가지 못하기 때문에 유도만능줄기세포의 분화를 억제할 수 있고, 균일한(homogenous) 미분화 상태로 대량 배양을 할 수 있음을 확인할 수 있다.
시험예 2: 세포증식능 분석
실시예 1, 2 및 비교예 1에 따라 미분화 배양한 유도만능줄기세포의 1회(P1), 5회(P5), 10회(P10) 계대 배양에 다른 증식능을 Ki67 세포증식마커를 이용하여 분석하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
이에 따르면, Ki67은 세포 주기에서 S기에 해당하는 세포 증식 마커로 계대 배양이 진행될 수록 패턴이 없는 플랫한 시트(비교예 1)에서는 증식능이 줄어들고 그루브형(실시예 1) 또는 포스트 형(비교예 1)의 나노패턴시트에서는 증식능이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3: 미분화능 분석
도 8 내지 도 11은 실시예 1, 2 및 비교예 1에 따라 배양한 유도만능줄기세포의 미분화능을 분석한 결과이다.
이에 따르면, 유도만능줄기세포의 미분화능을 검증하는 마커로 Oct3/4, Nanog를 통해서 나노구조체패턴시트에서 미분화능을 잘 유지하는 것을 알 수 있었다. 나노패턴시트에서는 계대 배양 5회(P5)에서 미분화능을 인지하는 마커의 발현이 급격히 증가하는 양상을 관찰할 수 있었다. 분석 결과 비교예 1의 플랫한 면에서의 배양 보다 실시예 1, 2의 그루브형 또는 포스트형의 나노패턴시트에서 유도만능줄기세포의 안정화가 이뤄지면서 최적의 미분화능을 유지한다는 것을 확인할 수 있다.
시험예 4: EB 형성 분석
도 12는 실시예 3, 실시예 4 및 비교예 2에 따라 배양된 EB의 형성을 1일 및 9일 경과시를 비교한 결과이다.
이에 따르면, 평평한 시트에서 배양된 유도만능줄기세포를 사용하여 EB를 형성한 비교예 2에 비하여, 그루브형 또는 포스트형의 나노패턴시트에서 배양된 유도만능줄기세포를 사용하여 훨씬 EB를 형성한 실시예 3 및 4의 경우 EB 형성의 효과가 훨씬 우수한 것을 확인할 수 있었다. 특히, EB 형성 9일 경과 후에는 EB의 크기에서도 실시예 3 및 4에 따라 배양된 EB가 훨씬 크게 형성된 것을 확인할 수 있었다.
시험예 5: 유도만능줄기세포의 연골세포 분화 비교
(1) 펠렛 크기
도 13 및 도 14는 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 펠렛의 크기를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 이에 따르면, 비교예 3의 튜브 배양에서 보다 실시예 5의 세포공배양분화용기에서 배양한 경우 연골세포 펠렛의 크기가 상대적으로 컸으며, 21일이 경과한 시점에서는 도시된 바와 같이, 크기의 차이가 더 두드러짐을 확인할 수 있었다.
(2) DNA 양 및 GAG/DNA 비율
도 15는 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 유도만능줄기세포의 연골세포의 DNA 전체량과 DNA 대비 GAG(glycosaminoglycan)양의 비율을 분석한 결과이다. 이에 다르면, DNA 전체량은 연골 분화 시간이 지남에 따라 크게 변화가 없는 것으로 나타났다. 이에 반해, GAG/DNA 비율을 살펴보면, 튜브를 사용한 비교예 3의 배양방법에서는 21일 경과시 연골 분화가 거의 완성된 데 반해, ChondroFIT을 사용한 실시예 5의 경우 14일에 연골 분화가 거의 완성되었으며, 이는 21일 경과시의 비교예 3의 결과와 거의 유사함을 확인할 수 있다.
(3) Safranin-O 염색 분석
도 16은 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 유도만능줄기세포의 연골세포의 분화시간에 따른 연골형성 정도를 Safranin-O 염색에 의해 분석한 결과이다. 이에 따르면, 상기 GAG/DNA 비율과 마찬가지로 실시예 5에 따른 경우 연골세포의 형성 정도가 더 우수하며, 14일 배양한 결과 비교예 3의 21일 배양 결과와 유사한 수준의 연골 형성을 나타내었다.
(4) 연골 분화 유전자 분석
도 17 및 도 18은 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 유도만능줄기세포 연골세포에서의 RT-qPCR과 IHC(Immunohistochemistry)로 연골분화 유전자의 발현 정도를 분석한 결과이다. 이에 따르면, 연골분화 유전자인 SOX9과 Aggrecan 분석한 결과 실시예 5의 ChondroFIT으로 연골로 분화한지 14일 만에 비교예 3의 튜브 배양법법으로 21일 연골분화 한 수치보다 높게 발현된 것으로 확인되었다.
(5) 골생성 유전자 분석
도 19 및 도 20은 실시예 5와 비교예 3에 따라 분화된 유도만능줄기세포 연골세포에서의 RT-qPCR과 IHC(Immunohistochemistry)로 골생성 유전자의 발현 정도를 분석한 결과이다. 이에 따르면, 골확장(hypertrophic) 및 생성(osteogenic) 마커인 COL10A1과 Runx2는 연골분화 마커와는 반대로 실시예 5의 ChondroFIT 보다 비교예 3의 튜브 방법보다 낮은 발현율을 나타냈다. 이와 같은 결과는 골생성과 연골생성은 상호 배타적 관계를 이루고 있기 때문에 연골 생성이 활발할 경우 골생성은 반대로 약해지며, 골생성이 활발할 경우 연골 생성이 둔화되는 양상을 나타내기 때문이다.
실시예 5의 경우 COL10A1이 14일까지 발현이 거의 나타나지 않았으며, 21일에 정도 분화를 시켰을 때 비교예 3의 분화 7일 경과시와 비슷한 생성 정도를 나타냈다. 골분화 마커인 Runx2는 실시예 5와 비교예 3에서 둘 다 비슷한 양상으로 낮게 나타났지만 전반적으로 튜브에서 분화하는 경우 초기에 좀 더 높게 발현되다가 14일 정도 되면 거의 비슷한 발현으로 낮게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. (a) 단일 세포(single cell)형의 유도만능줄기세포를 그루브(groove) 형 또는 포스트(post)형 패턴이 형성된 나노패턴시트 상에서 증식 배양 또는 계대 배양하여 미분화 상태의 유도만능줄기세포를 제조하는 단계;
    (b) 상기 미분화 유도만능줄기세포를 3차원 세포공배양용기에서 배양하여 유도만능줄기세포의 EB(embryoid body)를 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 EB의 단일세포를 3차원 세포공배양분화용기의 웰에 식종(seeding)하고, 분화 배지(chondrogenic medium)를 첨가한 후, 35 내지 39℃의 인큐베이터에서 연골 분화를 유도함으로써 원심분리 없이 연골세포 펠렛을 수득하는 단계;를 포함하고,
    단계 (a)의 상기 나노패턴시트는,
    그루브(groove) 형 또는 포스트(post)형 패턴이 형성된 마스크를 제조하고 리소그래피 공정을 통하여 웨이퍼 표면에 나노패턴을 형성하여 실리콘 마스터를 제조하는 단계;
    상기 실리콘 마스터 표면을 옥타플루오로시클로부탄(octafluorocyclobutane, C4F8), 실란(silane, SiH4) 및 산화막(oxide, SiO2) 처리 중에서 선택된 어느 하나에 따라 소수성 처리하는 단계; 및
    상기 소수성 처리된 실리콘 마스터를 이용하여 생체적합성 재료를 캐스팅함으로써 그루브(groove) 형 또는 포스트(post)형 패턴이 형성된 나노패턴시트를 제조하는 단계;를 포함하는 방법에 따라 제조되고,
    단계 (b)의 상기 3차원 세포공배양용기는 복수의 마이크로 반구체 웰 어레이를 포함하고, 상기 마이크로 반구체 웰은 각각 지름이 400 내지 800㎛이고, 깊이가 상기 지름의 1 내지 1.5배이고,
    단계 (c)에서 상기 단일세포는 1.0×107 내지 1.5×107 cells/㎖로 분리하고, 상기 3차원 세포공배양분화용기는 지름이 1.0 내지 5.0mm이고, 깊이가 1.5 내지 5.5mm인 반구형 웰이 복수 개 형성된 것인,
    3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 리소그래피는 이빔 리소그래피(e-beam lithography) 또는 스캐너 리소그래피 (scanner lithography)에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생체적합성 재료는 PDMS(Polydimethylsiloxane), 실리콘 (Silicone), 폴리에틸렌글라이콜(Polyethylene glycol), 및 알지네이트(Alginate) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 나노패턴시트의 패턴은 그루브의 폭(width) 또는 포스트의 지름(diameter)이 각각 200nm 내지 800nm 인 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 나노패턴시트의 패턴은 그루브의 폭 또는 포스트의 높이/지름의 비율이 0.8 내지 1.2인 것을 이루는 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 나노패턴시트는 표면이 친수성 처리된 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 친수성 처리는 산소플라즈마 처리 또는 화학적 처리를 통한 아민기 코팅에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    단계 (a) 이전에, 상기 나노패턴시트 표면에 PLO(poly-L-ornitnine) 및 피브로넥틴(fibronectin) 중에서 선택된 1종 이상으로 코팅 처리하여 세포부착성 증진 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    단계 (c)에서 상기 인큐베이터는 3 내지 7%의 이산화탄소 농도의 분위기인 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    단계 (c)에서 상기 분화 배지(chondrogenic medium) 첨가 전 20 내지 40분 동안 상기 온도를 유지하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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