WO2010047133A1 - 細胞保存方法、及び細胞輸送方法 - Google Patents

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WO2010047133A1
WO2010047133A1 PCT/JP2009/005618 JP2009005618W WO2010047133A1 WO 2010047133 A1 WO2010047133 A1 WO 2010047133A1 JP 2009005618 W JP2009005618 W JP 2009005618W WO 2010047133 A1 WO2010047133 A1 WO 2010047133A1
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WO
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cell
cells
living
container
cell culture
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Application number
PCT/JP2009/005618
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English (en)
French (fr)
Inventor
一丁田洋子
田崎剛
福田始弘
鶴田仁志
谷口英樹
Original Assignee
株式会社クラレ
公立大学法人横浜市立大学
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Priority to CN200980142214.XA priority patent/CN102203241B/zh
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/24—Gas permeable parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/54—Constructional details, e.g. recesses, hinges hand portable
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/22—Means for packing or storing viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a cell storage method for storing living cells and a cell transport method.
  • the technique used for testing and examining cells isolated from tissues is an indispensable method in the field of biotechnology. It is widely used for diagnosing diseases and pathological conditions, searching for new drugs and determining their efficacy, animal testing, plant testing, and testing for environmental pollutants. Therefore, the cells used in the biotechnology field have been extremely diversified.
  • the isolated cells may be used for the test immediately, but in many cases, the cells are cultured in a culture dish or a test tube.
  • Various tests are performed using the cultured cells.
  • Cell culture strains used for cell culture tests are required to exhibit drug sensitivities and toxic reactions similar to in vivo tests, so-called in vivo tests. That is, it is necessary to be able to construct a network between cells arranged with regularity on the surface of a cell culture vessel.
  • cell culture strains used for cell culture tests are extremely expensive, it is desired to improve cell survival rate and growth rate.
  • the above cell culture test measures the effect by varying the amount and concentration of the drug to be evaluated under the same conditions. Therefore, the material, shape, etc. of the cell culture container must be the same.
  • a plastic petri dish, a glass petri dish, a glass plate fixed in the container, a well plate, or the like is generally used.
  • Well plates include 6-well, 12-well, 48-well, and 96-well plates or petri dishes. In general, the size of the whole plate is substantially the same, and the larger the number of wells, the smaller the size of one well.
  • One well corresponds to one culture dish.
  • a 384-well plate consisting of a large number of culture dishes with a smaller diameter has begun to be used. The bottom of these culture dishes is a flat plate shape, and this bottom is used as the culture surface.
  • Patent Document 1 a method of immobilizing a special polymer on a flat culture surface
  • Patent Document 2 a method using a special apparatus
  • Patent Document 3 culturing in a polymer gel
  • Patent Document 1 has a problem that the immobilization method is complicated and cannot be stably produced, resulting in high costs.
  • the method described in Patent Document 2 has problems such as poor cell mass formation efficiency and high cost, regardless of the complexity of the culture method.
  • the method of Patent Document 3 has problems that the size of the cell mass cannot be controlled, and that the operability as a base is complicated. As described above, these methods are complicated, cannot be stably produced, and are expensive.
  • the living cells separated from the living body are desirably stored in the same environment as the living body.
  • hepatocytes were adhered to a flat culture plate, filled with a medium, and kept in a state of being kept warm (for example, 25 to 37 ° C.).
  • a flat culture plate filled with a medium
  • a state of being kept warm for example, 25 to 37 ° C.
  • the original functions of the cells are lost because they are greatly different from the environment in the living body.
  • there has been a problem that the function of the cells is further deteriorated due to environmental factors during culture or storage, such as vibration, temperature, and CO 2 concentration (change in pH of the medium).
  • Patent Document 1 or Patent Document 2 when cells cultured by the method disclosed in Patent Document 1 or Patent Document 2 are stored, there is a concern about cell detachment or cell death due to gel collapse when vibration occurs. For this reason, it has been difficult to transport the living cells while maintaining the three-dimensional structure of the living cells, and to use it in a place away from the separation place.
  • institutions that isolate cells from tissues are often different from institutions that test and inspect, and it has been desired to store and transport isolated cells without reducing their functions.
  • the present invention has been made to solve such problems, and an object of the present invention is to provide a cell preservation method and a cell transport method for preserving living cells while maintaining the cell function.
  • One aspect of the cell storage method of the present invention is a cell storage method for storing living cells using a cell culture container having a plurality of microspaces, and cultivating the living cells by attaching them to the surfaces of the plurality of microspaces. Then, after the culture, a medium is poured into the cell culture container so as to cover the plurality of microspaces, and the cell culture container is sealed and stored so that the medium does not leak out. A living cell is adhered to the surface of the micro space, cultured in a micro space suitable for culturing, and a three-dimensional structure is formed in each micro container. The three-dimensional structure is isolated by the micro container and then sealed. By storing in this manner, it becomes possible to store living cells while maintaining their functions.
  • the cell culture container is preferably kept at a temperature of 4 ° C. or higher and lower than 37 ° C. to store the living cells. Furthermore, the culture is preferably performed so that the cell population of the three-dimensional structure formed in the space of each micro space is sequestered so that the number of cells is isolated. By using microspaces, it is possible to prevent live cells cultured in each microspace from coming into contact with live cells in other microspaces.
  • the plurality of microspaces preferably have a bottom area of 0.01 to 0.1 mm 2 and a depth of 25 to 150 ⁇ m
  • the living cells include hepatocytes, pancreatic beta cells, cardiomyocytes, Liver differentiated from any one of nerve cells, skin epithelial cells, chondrocytes, bone cells, tissue stem cells, ES cells, and iPS cells, or any of tissue stem cells, ES cells, and iPS cells More preferably, they are any of cells, pancreatic beta cells, cardiomyocytes, nerve cells, skin epithelial cells, chondrocytes, and bone cells.
  • non-adherent cells are removed, and then the medium is injected into the cell culture vessel.
  • the live cells are cultured after the live cells are adhered and cultured, and then proliferated. It is preferable to be able to extend, aggregate or aggregate.
  • the cell seeding density is 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 , and the living cells are seeded in the plurality of microspaces, and the cell seeding density is 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm. 2 is more preferable.
  • a cell mass in which live cells are accumulated is preferably formed in the plurality of microspaces, and the diameter of the cell mass is more preferably 30 to 200 ⁇ m.
  • the medium contains at least one of serum, growth factors, and blood components, and the cell culture vessel is sealed with a membrane that allows oxygen or carbon dioxide to permeate. preferable.
  • one mode of the cell transport method according to the present invention is a cell transport method for storing and transporting live cells to a cell culture container having a plurality of micro spaces.
  • this transport method first, live cells are cultured on the surfaces of the plurality of microspaces. After the culture, a medium is poured into the cell culture container so as to cover the plurality of microspaces. Thereafter, the cell culture container is sealed so that the medium does not leak out. Then, the sealed cell culture container is transported using any transportation means such as a vehicle, a ship, or an aircraft.
  • This cell transport method makes it possible to transport the cells while maintaining the function of the living cells. Moreover, it is preferable that the said cell culture container is maintained at the temperature of 4 to 37 degreeC.
  • FIG. 6 is a VI-VI cross-sectional view showing still another configuration of the cell culture container according to the embodiment. It is a figure which shows the example of the state which culture
  • FIG. 6 is a VI-VI cross-sectional view showing still another configuration of the cell culture container according to the embodiment. It is a figure which shows the example of the state which culture
  • FIG. 6 is a VI-VI cross-sectional view showing still another configuration of the cell culture container according to the embodiment. It is a figure which shows the example of the state which culture
  • One embodiment of the cell storage method according to the present invention is to attach a living cell to a micro container using a cell culture container suitable for culturing a living cell, to form a three-dimensional structure in the micro container, Fill cell culture container with medium and store.
  • the micro container forms a three-dimensional structure of living cells and maintains the structure.
  • the micro container isolates the three-dimensional structure of living cells formed inside from the three-dimensional structure of other living cells. For this reason, it is necessary to use a suitable micro container for culturing living cells.
  • the cell culture container used for this preservation for example, the following container is used.
  • the cells In the cell culture container, an uneven pattern, that is, a plurality of micro containers are formed.
  • the cells can be cultured in a form in which the cells are aggregated without variation in each micro container.
  • the micro container can culture
  • the micro space is a space formed by a micro container, and more specifically indicates a space formed by a concavo-convex pattern formed on a plane. In the following description, the micro container and the micro space are not particularly distinguished.
  • the dimension of the micro container surrounded by the side wall needs to be in an optimum range for culturing cells. If the bottom area of the micro container is too large, the cells will grow thin and do not have a three-dimensional structure, similar to the culture on a flat plate. On the other hand, if the bottom area of the micro container is too small, cells cannot be accommodated. Therefore, the size of the space is preferably in a range that can accommodate one or more according to the cell type to be cultured. For example, when a hepatocyte mass in which a plurality of cells are accumulated is formed, it is preferable that the hepatocyte mass can be stored.
  • the height of the side wall needs to be in an optimum range so that cells cultured in the micro container do not move to the adjacent micro container. If the height of the side wall is too low, the cells get over the side wall and are not suitable for culture. If the height of the side wall is too high, it will be difficult to produce, and it will be difficult for the substance to diffuse, and the culture environment will deteriorate. Therefore, it is preferable that the height of the side wall be in a range in which the cultured cells arranged in the micro container can be stably cultured in the micro container according to the cell type.
  • the cell type to culture it can also apply to various culture systems by setting the height of a side wall, a micro container dimension, and the width
  • Live cells include two types of frozen cells and fresh cells.
  • cell lines and other ES cells Embryonic® Stem® cells
  • Fresh cells are primary cells that have not been frozen.
  • FIG. 1 is a plan view showing the configuration of the cell culture container according to the present embodiment
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line II-II in FIG.
  • the cell culture container 10 includes a micro container 11, a side wall 12, and an opening 13.
  • a plurality of side walls 12 are formed in a mesh shape on the culture surface of the cell culture container 10, and a space surrounded on all sides by the side walls 12 becomes the micro container 11.
  • the opening part 13 is formed in the center part of each edge
  • the bottom area in the present invention refers to a projected area when parallel light is irradiated from above to the bottom of the container in the direction perpendicular to the horizontal surface of the micro container opening (the same surface as the upper surface of the side wall 12).
  • the bottom of the micro container is U-shaped, the shape projected by parallel light incident on the bottom from above in the direction perpendicular to the opening surface is the bottom area.
  • the major axis and minor axis of the projected bottom are, in the case of circles and ellipses, the distance on each axis at the intersection of the major axis and minor axis and the circumference passing through the center of gravity, called the major axis and minor axis.
  • the difference between the area of the polygon and the extrapolated circle or ellipse that passes through each vertex is the longest and shortest axis.
  • the bottom shape of the micro container 11 is not particularly limited, and various shapes other than a square, a circle, and a polygon can be adopted.
  • the bottom area is preferably 0.01 mm 2 to 0.1 mm 2 .
  • the major axis of the bottom is preferably 1 to 1.5 times the minor axis.
  • an isotropic shape is preferable, and if it is a square, for example, when forming a hepatocyte mass with an equivalent diameter of 100 ⁇ m, the length of one side is preferably 100 ⁇ m to 300 ⁇ m.
  • the portion of 50% or more from the upper part of the side surface is preferably 80 ° to 90 °, particularly 85 ° to 90 °. It is preferable that
  • the height c of the side wall 12 is not limited so long as cells cultured in the micro container 11 ride on and move to the adjacent micro container 11.
  • 50 ⁇ m to 150 ⁇ m is preferable.
  • the width d of the opening 13 for communicating the adjacent microcontainers 11 with each other may be such that the cultured cells cannot move from the microcontainer 11 in which the cultured cells are initially seeded to the adjacent microcontainer 11.
  • the equivalent diameter of the cultured cells is 20 ⁇ m, it is preferably 5 to 15 ⁇ m.
  • the opening 13 is not essential, and the four sides of the micro container 11 may be completely surrounded by the side walls 12 as shown in FIGS. 3 and 4.
  • FIG. 3 is a plan view showing the configuration of another cell culture container according to the present embodiment
  • FIG. 4 is a sectional view taken along the line IV-IV in FIG.
  • the cell culture container according to the present embodiment may have a partitioned spot composed of a predetermined number of a plurality of micro containers.
  • FIG. 5 is a plan view showing the configuration of still another cell culture unit according to the present embodiment
  • FIG. 6 is a cross-sectional view taken along the line VI-VI in FIG. 5 and 6 show an example in which the structure of the micro container shown in FIGS. 3 and 4 is used.
  • FIG. 5 shows a side wall 24 and a partitioned spot 23 for partitioning a plurality of micro containers.
  • the height d of the side wall 24 only needs to be a volume that can hold a supernatant such as a culture solution or a reaction solution without drying, and may be set for convenience.
  • the side wall 24 it is possible to use different media for each spot 23.
  • the configuration example having the side wall 24 is shown, but the configuration without the side wall 24 may be used.
  • the method for producing the concavo-convex pattern on the cell culture vessel is not particularly limited. For example, transfer molding using a mold, three-dimensional stereolithography, precision machine cutting, wet etching, dry etching, laser processing, electric discharge processing, etc. A method is mentioned. It is preferable to appropriately select these production methods in consideration of the use of the cell culture container, required processing accuracy, cost, and the like.
  • the transfer molding method using a mold there is a method of forming a concavo-convex pattern by resin molding using a metal structure as a mold.
  • This method is preferable because the shape of the metal structure can be reproduced in a concavo-convex pattern on the resin at a high transfer rate, and the cost of the material can be reduced by using a general-purpose resin material.
  • the method using such a metal structure mold is excellent in that it is low in cost and can satisfy high dimensional accuracy.
  • Examples of the manufacturing method of the metal structure include plating treatment on a resist pattern produced by photolithography and a resin pattern produced by three-dimensional stereolithography, precision mechanical cutting, wet etching, dry etching, laser processing, electric discharge. Processing etc. are mentioned. What is necessary is just to select suitably in consideration of a use, the required process precision, cost, etc.
  • Examples of a method for forming a concavo-convex pattern on a resin using the metal structure obtained above as a mold include, for example, injection molding, press molding, monomer cast molding, solvent cast molding, hot emboss molding, roll transfer by extrusion molding, etc. Can be mentioned. It is preferable to employ injection molding from the viewpoint of productivity and mold transferability.
  • the material constituting the cell culture vessel is not particularly limited as long as it has self-supporting properties, and examples thereof include synthetic resin, silicon, and glass. From the viewpoint of cost and cell visibility by microscopic observation, it is preferable to use a transparent synthetic resin as a material.
  • the transparent synthetic resin include acrylic resins such as polymethyl methacrylate and methyl methacrylate-styrene copolymers, styrene resins such as polystyrene, olefin resins such as cycloolefin, polyethylene terephthalate, and polylactic acid.
  • ester resins silicone resins such as polydimethylsiloxane, and polycarbonate resins.
  • Such a resin may contain various additives such as a colorant, a diffusing agent, and a thickener as long as the transparency is not impaired.
  • the cell culture container is provided with a modified layer and / or a coating layer on the surface of the concavo-convex pattern for the purpose of improving the hydrophilicity, biocompatibility, cell affinity, etc. of the container surface. Also good.
  • the method for providing the modified layer is not particularly limited unless it is a method for losing self-supporting property or a method for causing extreme surface roughness of 100 ⁇ m or more.
  • a graft polymer by chemical treatment, solvent treatment, or surface graft polymerization is used. And methods such as chemical treatment such as introduction of carbon, physical treatment such as corona discharge, ozone treatment, and plasma treatment.
  • the method for providing the coating layer is not particularly limited, and examples thereof include dry coating such as sputtering and vapor deposition, wet coating such as inorganic material coating and polymer coating. It is desirable to impart hydrophilicity to the concavo-convex pattern in order to inject the culture solution without mixing bubbles, and inorganic vapor deposition is preferred as a method for forming a uniform hydrophilic film.
  • a cell affinity protein such as collagen or fibronectin.
  • a cell affinity protein such as collagen or fibronectin.
  • the extracellular matrix suitable for the cultured cells is used. It is particularly preferable to arrange an organic film.
  • the cells are placed only in the micro container for culturing the cells, and the appropriate number of cells is seeded in order to express similar forms and functions in the living body in the space.
  • the cell seeding density of 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 is preferable, and the cell seeding density of 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 is more preferable. preferable.
  • the micro container is square and one side is 200 ⁇ m, 5.0 ⁇ 10 4 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 is preferable. Under such conditions, a hepatocyte mass having a diameter of 30 to 200 ⁇ m can be obtained.
  • the cell storage method live cells are cultured and stored using the above-described cell culture container having a plurality of micro containers. Specifically, first, a culture process is performed in which live cells are attached to the surfaces of a plurality of micro containers of the cell culture container and cultured. Then, the preservation
  • Viable cells are adherent cells.
  • adhering the living cells to the surface of the micro container it is possible to prevent the living cells from colliding with the surface of the micro container or the like from flowing out of the micro container during storage / transport.
  • the loss of the function of the cultured live cell is suppressed, the dryness due to the live cell being exposed from the culture medium, the deterioration of the cell function based on this, and the like are prevented.
  • the living cells to be cultured are parenchymal cells. Specifically, any of hepatocytes, pancreatic beta cells, cardiomyocytes, neurons, skin epithelial cells, chondrocytes, bone cells, tissue stem cells, ES cells, and iPS cells (induced pluripotent stem cells) is used. . Alternatively, any one of hepatocytes, pancreatic beta cells, cardiomyocytes, nerve cells, skin epithelial cells, chondrocytes, and bone cells differentiated from any of tissue stem cells, ES cells, and iPS cells. Use.
  • the culturing step includes (1) a step of adhering cells, (2) a step of removing non-adherent cells, and (3) a step of further culturing the cells to proliferate, spread or aggregate.
  • removing non-adherent cells waste products can be removed and the medium can be prevented from being contaminated.
  • the living cells are further cultured to a desired cell mass size by culture growth or the like. For example, the cells are grown, propagated and aggregated until the diameter of the cell aggregate becomes 30 to 200 ⁇ m.
  • Each microcontainer is designed to have a size that accommodates a desired cell mass.
  • the living cells are adhered (seeded) to the surface of a plurality of microcontainers, and the cell population of the three-dimensional structure formed in the space of each microcontainer is isolated. Incubate to achieve cell number.
  • the cell population corresponding to the number of cells for one three-dimensional structure is formed and isolated in the micro container by the above-described process.
  • one cell population (cell mass) formed in the micro container is used.
  • the living cells are isolated by the micro container with a wall higher than the size of the living cells, and the living cells adhere to the micro container. For this reason, it does not contact the adjacent three-dimensional structure. Thereby, even in non-stationary environment (transportation state etc.), a uniform three-dimensional structure can be formed or maintained in living cells.
  • the medium is injected in such an amount that the cultured living cells are not dried and are not exposed to the outside air.
  • the medium used during storage is a medium containing nutrient components, and includes serum or blood components such as growth factors.
  • the components contained in the medium are determined according to the living cells to be stored.
  • the cell culture container is sealed by a sealing means so that the medium does not leak out.
  • the cell culture container is, for example, a petri dish or plate having an opening, or a flask in which a plurality of micro containers are formed.
  • the opening part of the upper surface of the cell culture container is covered with a sealing means such as a film or a cap, and the living cells are stored in a state isolated from the outside.
  • the sealing means may be made of a material that blocks inflow of liquid or gas, or may be one that transmits carbon dioxide or oxygen. What is necessary is just to select according to the living cell and culture
  • when transporting live cells it is essential that the medium be sealed so that it does not leak out. It may be the case where it preserve
  • the cell culture container is preferably adjusted to any temperature within a temperature range of 4 ° C. or more and less than 37 ° C., more preferably 6 ° C. or more and less than 25 ° C., and 10 ° C. or more and 20 ° C. or less. More preferably.
  • the storage step includes a period for transporting the sealed cell culture container prepared in the storage preparation step. It is preferable that the temperature is adjusted during the transportation period.
  • FIG. 7 shows an example of the state of the cell culture container after completion of the storage preparation step.
  • FIG. 7 shows an example in which the culture process and the storage preparation process are performed using the cell culture container shown in FIGS. 5 and 6.
  • the cross-sectional view shown in FIG. Are added. Specifically, the living cells 40 are adhered to each micro container 11 in the cell culture container 20 and cultured. In FIG. 7, the living cells 40 are indicated by black circles in a simplified manner, and the culture medium 50 is shown up to the position of the two-dot chain line.
  • the sealing means 30 seals the cell culture container 20.
  • the amount of the medium shown in FIG. 7 is an example.
  • a medium having a volume of one third of the container may be injected, or the medium is injected until there is no air layer between the sealing means 30 and the medium. It may be the case.
  • the volume of the medium is appropriately selected depending on the type of living cells, the culture state, and the like.
  • a living cell is stored with a three-dimensional structure formed in a state of being adhered to a hard plastic culture base. can do. It is known that the function of a living cell is improved when it is made into a three-dimensional structure. Therefore, it becomes possible to preserve
  • the present invention can be applied when fresh hepatocytes separated from a living body are transported to another place.
  • fresh hepatocytes separated from a living body are said to survive only for a predetermined time (60 hours). Even in such a case, it can be expected that the three-dimensional structure of fresh hepatocytes is maintained and the cells can be transported in a state where the functions are maintained.
  • one embodiment of the present invention can also be applied when fresh hepatocytes separated from a living body are transported in a frozen state, and after thawing the frozen cells, the method of the present invention can be used in an unfrozen state. It can be expected to make it possible to store or transport.
  • the three-dimensional structure of the living cells may be damaged by peeling the gel from the living cells or changing the shape of the gel.
  • it can be expected that a living cell can be transported while maintaining a three-dimensional structure and maintaining a function.
  • Example 01 Example when stored in a cell culture vessel with multiple microspaces and when stored on a flat plate
  • a film in which a silicon dioxide film is formed to 100 nm on the surface of the resin substrate by vacuum deposition is prepared, and the film is attached to a 24-hole plate made of polystyrene without a culture bottom by laser welding, and then sterilized by ⁇ rays.
  • a culture vessel having a plurality of microspaces of 24 wells was prepared and used for a storage test.
  • ⁇ Comparative Example 01> Commercially available (Becton Dickinson, Falcon (registered trademark)) planar gamma sterilized planar 24-well culture plates were used for the preservation test.
  • Cell culture A human liver cancer-derived cell line HepG2 (Human Science Research Data Bank, Resource No. JCRB1054) was grown to a predetermined number of cells in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator using a culture flask (manufactured by CORNIGN).
  • a DMEM (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum was used as the medium.
  • the grown cells were detached from the bottom of the culture using a 0.25% trypsin solution, and the cells were collected by centrifugation.
  • the collected cells were adjusted with a DMEM culture solution containing 10% FBS so that the cell concentration was 4 ⁇ 10 5 cells / mL, and 500 ⁇ L was added to each well. Thereafter, the cells were cultured for 3 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • Table 1 shows the results of measuring the amount of albumin secretion.
  • the amount of secretion was three times that of Comparative Example 01.
  • a film in which a silicon dioxide film is formed to 100 nm on the surface of the resin substrate by vacuum deposition is prepared, and the film is attached to a 24-hole plate made of polystyrene without a culture bottom by laser welding, and then sterilized by ⁇ rays.
  • a culture vessel (culture plate) having a plurality of microspaces of 24 wells was prepared and used for a storage test.
  • Cell culture A human liver cancer-derived cell line HepG2 (Human Science Research Data Bank, Resource No. JCRB1054) was grown to a predetermined number of cells in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator using a culture flask (manufactured by CORNIGN).
  • a DMEM (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum was used as the medium.
  • the grown cells were detached from the bottom of the culture using a 0.25% trypsin solution, and the cells were collected by centrifugation.
  • the collected cells were adjusted with a DMEM culture solution containing 10% FBS so that the cell concentration was 4 ⁇ 10 5 cells / mL, and 500 ⁇ L was added to each well of the culture vessel.
  • the cells were then cultured for 3 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • the number of microspaces in one field of view refers to the number of microspaces (microcontainers) existing in one field of view (field of view in an arbitrary range).
  • “Number of microspaces in one visual field in which cell clumps are formed” refers to the number of microspaces in which cell clumps of 30 to 200 ⁇ m are formed in one microfield in one visual field.
  • Table 2 shows the cell mass formation rate.
  • the cell mass formation rate before storage was 80 to 100%.
  • Example 02 (18 ° C.)
  • the form before storage was almost completely maintained.
  • Example 03 (6 ° C.)
  • the cell mass formation rate decreased, but the form of 60% to 80% was maintained.
  • Example 04 (0 ° C.)
  • the formation rate was as low as 30%, and the form was hardly maintained.
  • Example 05 (37 ° C.) had the lowest formation rate of 25%, and the form was hardly maintained. From these results, it was found that the storage temperature is preferably 10 ° C. or higher and 20 ° C. or lower, and particularly preferably 18 ° C.
  • Cell culture A human liver cancer-derived cell line HepG2 (Human Science Research Data Bank, Resource No. JCRB1054) was grown to a predetermined number of cells in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator using a culture flask (manufactured by CORNIGN).
  • a DMEM (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum was used as the medium.
  • the grown cells were detached from the bottom of the culture using a 0.25% trypsin solution, and the cells were collected by centrifugation. The collected cells were adjusted to the cell concentration shown in Examples with DMEM culture medium containing 10% FBS, and 500 ⁇ L was added to each well of the culture vessel. Thereafter, the cells were cultured for 3 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • Example 06> When seeding the cells, the cell concentration was adjusted to 4 ⁇ 10 5 cells / mL and stored under the following storage conditions.
  • Example 07> When seeding the cells, the cell concentration was adjusted to 40 ⁇ 10 5 cells / mL and stored under the storage conditions shown below.
  • Example 8A and 8B are photographs when culturing in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours after removal from the storage container.
  • Example 06 FIG. 8A
  • Example 07 FIG. 8B
  • Table 3 shows the amount of albumin secretion.
  • Example 06 showed a high value of about 2.8 times that of Example 07.

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Abstract

　生細胞の機能を維持したい状態で生細胞を保存する細胞保存方法を提供する。細胞保存方法の一態様は、複数のマイクロ容器（１１）を有する細胞培養容器（２０）を用いて生細胞（４０）を保存する方法であって、生細胞を複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養し、培養後、複数のマイクロ容器（１１）を覆うように、培地（５０）を細胞培養容器（２０）へ注入して保存する。適切な大きさの細胞培養容器に生細胞を接着させ、培養して、三次元構造体を形成させることにより、生細胞の三次元構造体を維持し、機能を維持した状態で生細胞を保存することが可能になる。

Description

細胞保存方法、及び細胞輸送方法
　本発明は、生細胞を保存する細胞保存方法、及び細胞輸送方法に関する。
　組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。
　単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿や試験管のなかで細胞培養が行われる。この培養細胞を用いて、種々の検査が行われる。細胞培養試験に用いられる細胞培養株には、生体内での試験いわゆるin vivo試験と同様の薬剤感受性、毒性反応を示すことが要求される。すなわち、細胞培養容器の表面で規則性を有して配列された細胞間のネットワークを構築できることが必要とされる。また、細胞培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、細胞の生存率及び増殖速度の向上が望まれている。
　上記細胞培養試験は、同一条件下、評価する薬物等の量、濃度などを変量し、その効果を測定するものである。そのため、細胞培養容器の材質、形状等も同一にする必要がある。この細胞培養容器としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等が一般的に用いられる。ウェルプレートには、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレート又はシャーレがある。これらは、一般に、プレート全体の大きさはほぼ同じであり、ウェル数が大きくなるほど、１ウェルのサイズが小さくなる。この１ウェルが１培養皿に相当する。また、最近の微量化への流れから、さらに小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。これらの培養皿の底部は平坦な平板状であり、この底面を培養面として用いている。
　しかしながら、組織細胞の培養に、従来の細胞培養容器を用いると、細胞が薄く伸びて方向性のない形態となる。また、細胞培養容器の表面にランダムに配置されるため、細胞間のネットワークは、複雑に交錯して形成される。そのため、生体内での細胞機能を再現できないという問題があった。例えば、肝細胞では肝機能を維持することで知られるスフェロイド状の肝細胞塊を形成しない。
　上記問題を解決するため、平板状の培養面に特殊な高分子を固定化する方法（特許文献１参照）、特殊な装置を使用する方法（特許文献２参照）、高分子ゲル中で培養する方法（特許文献３参照）などが開示されている。
　しかしながら、特許文献１に記載の方法では、固定化方法が煩雑で安定的に製造できず、高コストとなる問題があった。また、特許文献２に記載の方法では、培養方法が複雑であるのに関わらず、細胞塊の形成効率が悪く、高コストになる等の問題があった。特許文献３の方法では、細胞塊の大きさが制御できない、また、基盤としての操作性が煩雑であることなどの問題点があった。このようにこれらの方法は煩雑であり、安定的に製造できず、高コストとなっていた。
特許第３１７７６１０号公報 特開平７－７９７７２号公報 特開平８－３０８５６２号公報
　生体より分離した生細胞は、生体と同様の環境で保存されることが望ましい。例えば、非凍結の肝細胞を保存する場合、平面状の培養プレートに肝細胞を接着させ、培地を満たし、保温（例えば２５～３７℃）状態に置かれて保存されていた。しかしながら、平面で細胞を培養した場合、生体内の環境と大きく異なるため、細胞が有する本来の機能を消失させるという問題があった。また、培養中あるいは保存中の環境要因、例えば、振動・温度・ＣＯ２濃度（培地のｐＨの変動）などにより、さらに細胞の機能が低下するという問題があった。
　また、特許文献１または特許文献２に開示された方法で培養した細胞を保存すると、振動が生じた場合などに、細胞の剥離やゲルの崩壊による細胞死などが懸念されていた。このため、生細胞の三次元構造体を維持した状態で保存したまま輸送し、分離場所から離れた場所で利用することは困難であった。その一方で、組織から細胞を単離する機関と、試験、検査する機関とは異なることが多く、単離した細胞の機能を低下させずに保存し、輸送することが望まれていた。
　本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、細胞機能を維持した状態で生細胞を保存する細胞保存方法、及び細胞輸送方法を提供することを目的とする。
　本発明の細胞保存方法の一態様は、複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器を用いて生細胞を保存する細胞保存方法であって、生細胞を前記複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養し、前記培養後、前記複数のマイクロ空間を覆うように、培地を前記細胞培養容器へ注入し、前記細胞培養容器を、培地が漏れ出さないように密封して保存する。マイクロ空間の表面に生細胞を接着させ、培養に適したマイクロ空間を用いて培養して三次元構造体を各マイクロ容器内に形成させ、三次元構造体をマイクロ容器によって隔離した後、密封して保存することによって、生細胞を、機能を維持した状態で保存することが可能になる。
　また、前記細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度に保たれて、前記生細胞が保存されることが好ましい。さらに、培養は、前記表面に接着され、かつ、各マイクロ空間の空間内に形成される三次元構造体の細胞集団が隔離される細胞数になるように培養することが好ましい。マイクロ空間を用いることによって、各マイクロ空間に培養させた生細胞が他のマイクロ空間の生細胞と接触することを防止できる。
　前記複数のマイクロ空間は、底部面積が０．０１～０．１ｍｍ２であり、深さが２５～１５０μｍであることが好ましく、また、前記生細胞は、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれか、あるいは、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれかから分化させた、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、及び骨細胞のうちのいずれかであることがより好ましい。
　前記培養後、非接着細胞を除去してから前記培地を前記細胞培養容器へ注入することがより好ましく、前記生細胞の培養は、生細胞を接着させて培養した後、さらに培養して、増殖、伸展、または凝集させることが可能となることが好ましい。
　細胞播種密度１×１０２～１×１０６細胞／ｃｍ２で、生細胞が前記複数のマイクロ空間に播種されたことがより好ましく、細胞播種密度１×１０４～１×１０６細胞／ｃｍ２であるのがより好ましい。前記複数のマイクロ空間に、生細胞が集積した細胞塊が形成されることが好ましく、前記細胞塊の直径は、３０～２００μｍであることがより好ましい。
　前記培地は、血清、増殖因子、及び血中成分の少なくとも一つを含むこと、酸素または二酸化炭素を透過させる膜を用いて前記細胞培養容器を密封すること、の少なくとも一つであることがより好ましい。
　また、本発明に係る細胞輸送方法の一態様は、複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器へ生細胞を保存して輸送する細胞輸送方法である。この輸送方法は、まず、生細胞を前記複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養する。前記培養後、前記複数のマイクロ空間を覆うように、培地を前記細胞培養容器へ注入する。その後、前記細胞培養容器を、培地が漏れ出さないように密封する。そして、密封した前記細胞培養容器を、車両、船舶、または航空機のいずれかの輸送手段を用いて輸送する。この細胞輸送方法により、生細胞の機能を維持した状態で輸送することが可能になる。また、前記細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度に保たれることが好ましい。
　本発明によれば、細胞機能を維持した状態で生細胞を保存する細胞保存方法、及び細胞輸送方法を提供することができる。
実施の形態に係る細胞培養容器の構成を示す平面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器の構成を示すＩＩ－ＩＩ断面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器の他の構成を示す平面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器の他の構成を示すＩＶ－ＩＶ断面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器のさらに他の構成を示す平面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器のさらに他の構成を示すＶＩ－ＶＩ断面図である。 図５及び図６に示した細胞培養容器を用いて細胞を培養し、密封した状態例を示す図である。 実施例０６の結果を示す写真である。 実施例０７の結果を示す写真である。
　本発明に係る細胞保存方法の一態様は、生細胞の培養に適する細胞培養容器を用いて生細胞をマイクロ容器に接着させて培養し、マイクロ容器内に三次元構造体を形成させ、培養後細胞培養容器に培地を満たして保存する。マイクロ容器は、生細胞の三次元構造体を形成させ、またその構造を維持させる。また、マイクロ容器は、内部に形成された生細胞の三次元構造体を他の生細胞の三次元構造体から隔離する。このため、生細胞を培養するマイクロ容器に適切なものを用いる必要がある。この保存に用いる細胞培養容器は、例えば、次のような容器を用いる。
　細胞培養容器には凹凸パターンすなわち複数のマイクロ容器が形成されている。これにより、生体内と同様な立体的な細胞生育が可能であることに加え、各マイクロ容器内において、ばらつき無く細胞が凝集した形態で培養できる。また、マイクロ容器は、例えば、マイクロ容器を仕切る側壁（凸部）の高さを最適化することで、凝集した生細胞（例えば、肝細胞塊）をマイクロ容器内のみで培養することができる。ここで、マイクロ空間は、マイクロ容器よって形成される空間であり、より具体的には、平面上に形成された凹凸パターンによって形成される空間を指す。以降の説明では、マイクロ容器とマイクロ空間とを特に区別しない。
　側壁により囲まれたマイクロ容器の寸法は、細胞を培養するために最適な範囲とすることが必要である。マイクロ容器の底部面積が大きすぎると、平板上での培養と同様、細胞は薄く伸び、立体構造とならない。一方、マイクロ容器の底部面積が小さすぎると、細胞を収容できなくなる。従って、空間の寸法は、培養する細胞種に応じて、一又は複数個が収容できる範囲とすることが好ましい。例えば、細胞が複数個集積した肝細胞塊を形成させる場合、その肝細胞塊が収納できる範囲とすることが好ましい。
　側壁の高さは、マイクロ容器で培養する細胞を隣接するマイクロ容器へ移動させないために最適な範囲とすることが必要である。側壁の高さが低すぎると、細胞が側壁を乗り越えてしまい、培養に適さない。側壁の高さが高すぎると、作製が困難な上、物質拡散がしにくくなり培養環境が悪化してしまう。従って、側壁の高さは、細胞種に応じて、マイクロ容器内に配置された培養細胞を、そのマイクロ容器内において安定的に培養し続けられる範囲とすることが好ましい。
　また、側壁に開口部を設け、複数のマイクロ容器を連通した構造とするにより、細胞への酸素や栄養分の供給及び細胞からの老廃物の除去を効率良く行うことができる。なお、培養する細胞種に応じ、側壁の高さ、マイクロ容器寸法、開口部の幅を適宜設定することにより、多様な培養系に適用することもできる。
　また、本明細書では、生細胞は、生体組織から分離した細胞（＝初代培養細胞）の継代していない細胞をさす。生細胞には、凍結細胞と新鮮細胞の２種類が含まれる。また、株化細胞、その他ＥＳ細胞（Embryonic Stem cells）等全てが含まれる。新鮮細胞は初代培養細胞の凍結していないもののことをさす。
実施の形態
　以下に、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。
　はじめに実施の形態に係る細胞保存用法に用いる細胞培養容器について説明し、続いて細胞保存方法について説明する。まず、細胞培養容器の構成例を、図１、２を用いて説明する。図１は、本実施の形態に係る細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図２は図１のＩＩ－ＩＩ断面図である。図１に示すように、細胞培養容器１０はマイクロ容器１１、側壁１２、開口部１３を備える。細胞培養容器１０の培養面には、複数の側壁１２が網目状に形成されており、この側壁１２に四方を囲われた空間がマイクロ容器１１となる。また、各マイクロ容器１１の四辺に形成された側壁１２の各辺の中央部に、開口部１３が形成されている。
　図１において、マイクロ容器１１の底部の幅ａ、マイクロ容器１１を区画するための側壁１２の幅ｂ、高さｃ、隣接するマイクロ容器１１が互いに連通するための開口部１３の幅ｄを示した。本発明における底部面積とは、マイクロ容器開口水平面（側壁１２上面と同一面）に垂直方向に上方から容器底へ平行光を照射した際の投影面積のことをいう。例えば、マイクロ容器の底がＵ字形状である場合、その開口面に垂直方向な上方より底に入射した平行光が投影する形状が底部面積となる。投影底部の長径及び短径とは、円及び楕円の場合、その重心を通る長軸及び短軸と円周との交点の各軸上の距離を長径及び短径といい、多角形の場合、その多角形の面積との差が最小となり各頂点を通る外挿円又は外挿楕円の長径および短径をいい、各頂点を通る外挿円又は外挿楕円を描けない場合は、最も多くの頂点を通る近似円又は楕円の長径および短径をいう。
　マイクロ容器１１の底部形状は特に制限されるものではなく、正方形、円、多角形以外にも種々の形状を採用することができる。生体内での肝機能を再現する細胞培養には、この底部面積は０．０１ｍｍ２～０．１ｍｍ２が好ましい。また、底部の長径が短径の１～１．５倍であることが好ましい。さらに、等方的形状が好ましく、正方形であれば、例えば、相当直径１００μｍの肝細胞塊を形成させる場合、一辺の長さが１００μｍ～３００μｍが好ましい。
　マイクロ容器１１の水平面と側壁１２とがなす角度は、細胞が乗り上げない角度でなければならないため、側面の上部から５０％以上の部分は８０°～９０°が好ましく、特に、８５°～９０°であることが好ましい。
　側壁１２の高さｃは、マイクロ容器１１で培養する細胞が乗り上げ隣接するマイクロ容器１１へ移動しなければよく、例えば、相当直径１００μｍの肝細胞塊を形成させる場合、５０μｍ～１５０μｍが好ましい。
　隣接するマイクロ容器１１を互いに連通するための開口部１３の幅ｄは、培養細胞が最初に播種されたマイクロ容器１１から隣接するマイクロ容器１１に移動できない程度であればよい。例えば、培養細胞の相当直径が２０μｍであれば、５～１５μｍであることが好ましい。なお、開口部１３は必須ではなく、図３及び図４に示すように、マイクロ容器１１の四辺が側壁１２により完全に囲まれていてもよい。ここで、図３は、本実施の形態に係る他の細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図４は図３のＩＶ－ＩＶ断面図である。
　また、図５及び図６に示すように、本実施の形態に係る細胞培養容器は、所定数の複数のマイクロ容器からなる区画されたスポットを有していてもよい。ここで、図５は、本実施の形態に係るさらに他の細胞培養部の構成を示す平面図であり、図６は図５のＶＩ－ＶＩ断面図である。図５及び図６では、図３及び図４に示すマイクロ容器の構造を用いている例を示す。図５には、複数のマイクロ容器を区画化する側壁２４とその区画化されたスポット２３を示した。側壁２４の高さｄは、培養液や反応液等の上清液が乾燥せず保持できる容量であればよく、便宜設定すればよい。側壁２４を有することにより、各スポット２３で異なる培地を用いることも可能となる。また、図５及び図６において、側壁２４を有する構成例を示したが、側壁２４を備えていない構成であってもよい。
　細胞培養容器上の凹凸パターンを作製する方法としては、特に限定されないが、例えば、モールドを用いた転写成形、３次元光造形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザ加工、放電加工等の方法が挙げられる。細胞培養容器の用途、要求される加工精度、コスト等を考慮してこれらの製造方法を適宜選択することが好ましい。
　モールドを用いて転写成形方法の具体例としては、金属構造体を型として樹脂成形で凹凸パターンを形成する方法が挙げられる。この方法は金属構造体の形状を高い転写率で樹脂へ凹凸パターンに再現することが可能であり、また汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので好ましい。このような金属構造体の型を用いる方法は、低コストであり、高い寸法精度を満足できる点で優れている。
　上記金属構造体の製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィによって作製されたレジストパターンや３次元光造形によって作製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザ加工、放電加工等が挙げられる。用途、要求される加工精度、コスト等を考慮して適宜選択すればよい。
　上記で得られた金属構造体を型として用いて樹脂へ凹凸パターンを成形する方法としては、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等の方法を挙げることができる。生産性及び型転写性の観点から射出成形を採用することが好ましい。
　細胞培養容器を構成する材料としては、自己支持性を有するものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン、ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡観察による細胞視認性の観点から、透明な合成樹脂を材料とすることが好ましい。透明な合成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル－スチレン共重合体等のアクリル系樹脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸等のエステル系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂、ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。このような樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。
　細胞培養容器は、容器表面の親水性、生体適合性、細胞親和性等を向上させることを目的として、凹凸パターン表面側に表面処理を行い、改質層及び／又はコーティング層が配されていてもよい。上記改質層を設ける方法としては、自己支持性を失う方法や１００μｍ以上の極端な表面荒れを起こす方法でなければ特に制限はないが、例えば、薬品処理、溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフトポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放電、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処理等の方法が挙げられる。またコーティング層を設ける方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、スパッタ、蒸着等のドライコーティング、無機材料コーティング、ポリマーコーティング等のウェットコーティング等の方法が挙げられる。凹凸パターン上には、気泡の混入することなく培養液を注入するために親水性を付与することが望ましく、均一な親水性膜を形成させる方法として、無機蒸着が好ましい。
　また、細胞親和性を考慮した場合には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞親和性タンパク質をコーティングすることがより好ましい。コラーゲン水溶液等を均一にコートするために、上述の親水性膜を形成させた後、コートすることが好ましい。通常、肝細胞培養においては、生体内環境を模倣して細胞外マトリックス表面での培養が望ましいため、上記のように均一な親水性無機膜を配した後に、培養細胞に適した細胞外マトリックスからなる有機膜を配することが特に好ましい。
　また、上述した細胞培養容器を用いる細胞培養方法は、細胞を培養するマイクロ容器のみに細胞を配置させ、その空間内で生体内に類似した形態や機能を発現させるため、適切な細胞数を播種する必要があり、細胞播種密度１．０×１０２～１．０×１０６細胞／ｃｍ２が好ましく、細胞播種密度１．０×１０４～１．０×１０６細胞／ｃｍ２がより好ましい。例えば、マイクロ容器が正方形で、１辺が２００μｍの場合、５．０×１０４～５．０×１０５細胞／ｃｍ２が好ましい。このような条件のもと、直径が３０～２００μｍに及ぶ肝細胞塊を得ることができる。
　続いて、本実施の形態に係る細胞保存方法について説明する。細胞保存方法は、上述した複数のマイクロ容器を有する細胞培養容器を用いて生細胞を培養し、保存する。具体的には、まず、細胞培養容器の複数のマイクロ容器の表面に生細胞を接着させて培養する培養工程を行う。続いて、複数のマイクロ容器を覆うように、培地（培養液）を細胞培養容器へ注入して保存の準備をする保存準備工程を行う。このようにして作成された細胞培養容器を保存する（保存工程）。以下に各工程をより詳しく説明する。
　まず、培養工程について説明する。生細胞は接着性の細胞を用いる。生細胞をマイクロ容器表面に接着させることにより、保存・輸送中に生細胞がマイクロ容器の表面等に衝突すること、マイクロ容器から流出することなどを防止できる。これにより、培養した生細胞の機能の損失を抑制したり、生細胞が培地から露出することによる乾燥、これに基づく細胞機能の低下などを防止する。
　培養する生細胞は、実質細胞が用いられる。具体的には、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）のうちのいずれかを用いる。あるいは、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれかから分化させた、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、及び骨細胞のうちのいずれかを用いる。
　培養工程には、（１）細胞を接着させる工程、（２）非接着細胞を除去する工程、（３）細胞をさらに培養し増殖または伸展または凝集させる工程を含む。非接着細胞を除去することにより、老廃物を除去し、培地が汚染されることを防ぐことができる。また、さらに培養増殖等により、生細胞を所望の細胞塊の大きさになるまで培養する。例えば、細胞凝集塊の直径が３０～２００μｍになるまで増殖・進展・凝集させる。各マイクロ容器は、所望の細胞塊が入る大きさに設計される。このように、生細胞の培養は、生細胞が複数のマイクロ容器の表面に接着され（播種され）、かつ、各マイクロ容器の空間内に形成される三次元構造体の細胞集団が隔離される細胞数になるように培養する。
　上述した工程により、マイクロ容器内に三次元構造体１個分の細胞数に相当する細胞集団を形成し、隔離する。ここでは、マイクロ容器内に形成される細胞集団（細胞塊）を１個分としている。生細胞は、マイクロ容器によって、生細胞の大きさより高い壁で隔離され、かつ、生細胞はマイクロ容器に接着している。このため、隣り合う三次元構造体と接することがない。これにより、非静置環境（輸送状態など）においても、生細胞に均一な三次元構造体を形成させ、または、維持させることができる。
　次に、保存準備工程について説明する。培地は、培養した生細胞が乾燥しないような、また外気に触れないような量を注入する。保存中に用いる培地は、栄養成分を含む媒体であり、例えば、血清、あるいは増殖因子などの血中成分を含む。培地が含む成分は、保存する生細胞に応じて決定される。
　また、細胞培養容器は、培地が漏れ出さないように密封手段によって密封される。細胞培養容器は、例えば、開口部分を有するシャーレ若しくはプレート、フラスコに複数のマイクロ容器が形成されたものである。密封にあたっては、細胞培養容器の上面の開口部分をフィルムまたはキャップなどの密封手段で覆い、生細胞を外部と隔離させた状態で保存する。密封手段は、液体や気体の流入を遮断する材質ものであってもよいし、二酸化炭素あるいは酸素と透過するものを用いてもよい。保存する生細胞や培養状態に応じて選択されればよい。また、生細胞を輸送する場合、培地が漏れ出さないように密封されることが必須となるが、静置状態で保存される期間には、培地の乾燥が防止できる程度に蓋をした状態であってもよいし、開口部分が空いた状態で保存する場合であってもよい。生細胞の保存状態に応じて、細胞培養容器が密封されていない状態であってもよい。
　最後に保存工程について説明する。保存時には、細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度範囲のいずれかの温度に調整されるのが好ましく、６℃以上２５℃未満であるのがより好ましく、１０℃以上２０℃以下であるのがさらに好ましい。また、保存工程には、保存準備工程で作製した密封された細胞培養容器を輸送する期間も含まれる。輸送する期間にも温度調節が実施されるのが好ましい。
　ここで、保存準備工程終了後の細胞培養容器の状態例を図７に示す。図７では、図５及び図６に示した細胞培養容器を用いて、培養工程及び保存準備工程を行った一例を示し、図６に示した断面図に断面図に生細胞４０と密封手段３０とを追加したものである。具体的には、細胞培養容器２０内の各マイクロ容器１１には、生細胞４０が接着され、培養されている。図７では、生細胞４０は黒塗りの丸で簡略化して示し、培地５０は、二点鎖線の位置まで入れられたことを示す。密封手段３０は、細胞培養容器２０を密封している。図７に示す培地の量は一例であり、例えば容器の３分の１の容積の培地を注入する場合であってもよいし、密封手段３０との間に空気層がなくなる状態まで培地を注入する場合であってもよい。培地の容量は、適宜生細胞の種類、培養状態などによって選択される。
　以上説明したように、上記実施の形態の一態様によれば、特殊な高分子を用いることなく、生細胞を、硬いプラスチック状の培養基盤と接着させた状態で三次元構造を形成させて保存することができる。生細胞は、三次元構造体にすると細胞の機能が向上することが知られている。従って、生細胞を培養した後、機能を維持した状態で保存することが可能となる。
　さらに、車両、船舶、航空機等の輸送手段を用いて細胞を輸送する場合、輸送中の環境要因、例えば、振動・温度・ＣＯ２濃度（培地のｐＨの変動）などにより、さらに細胞の機能が低下すること、あるいは、輸送中に生じる振動によって、細胞の剥離やゲルの崩壊による細胞死などが懸念されていた。これらの問題についても本発明の実施の形態の一態様を適用することによって、生細胞の機能を維持して輸送することが可能となる。
　例えば、生体から分離した新鮮肝細胞を他の場所に輸送する場合に本発明を適用することができる。特に、生体から分離した新鮮肝細胞は、所定時間（６０時間）しか生存しないとされている。このような場合にも新鮮肝細胞の三次元構造を維持し、機能を維持した状態で細胞を輸送することを可能にすることが期待できる。また、生体から分離した新鮮肝細胞を凍結した状態で輸送していた場合にも本発明の一態様を適用でき、凍結細胞を融解した後、本発明の方法を用いることで、非凍結状態で保存または輸送することを可能にすることが期待できる。さらに、生細胞の三次元構造をゲルなどの高分子を用いて輸送する場合には、ゲルが生細胞から剥がれたり、ゲルの形状が変形することによって生細胞の三次元構造が壊れることがあったが、本発明の一態様を適用することによって、三次元構造を維持し、機能を維持した状態で生細胞を輸送することを可能にすることが期待できる。
　次に本発明に係る細胞培養方法の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例０１］
　複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器で保存した場合と平板で保存した場合の実施例
（培養容器）
＜実施例０１＞
　図３、４に示す凹凸パターン形状であって、ａ＝２００μｍ、ｂ＝２０μｍ、ｃ＝５０μｍ、のパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上に凹凸パターン形状の転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させたフィルムを作製し、ポリスチレン製の培養底面のない２４穴プレートに、レーザ溶着法でフィルムを貼り付けた後、γ線滅菌を行い、２４ウェルの複数のマイクロ空間を有する培養容器を作製し保存試験に用いた。
＜比較例０１＞
　市販（ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン（登録商標））のγ線滅菌済み平面状２４ウェル培養プレートを保存試験に用いた。
　（細胞培養）
　ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（財団法人ヒューマンサイエンス研究資料バンク　資源番号ＪＣＲＢ１０５４）を、培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＧＮ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で、所定の細胞数まで増殖させた。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地を用いた。増殖させた細胞を、０．２５％トリプシン溶液を用いて培養底面から剥離し、遠心分離法にて細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液で、細胞濃度が４×１０５個／ｍＬになるように調整し、各ウェルに５００μＬずつ添加した。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した。
（保存試験）
　実施例０１、比較例０１に示した培養容器を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した後、培地を吸引し、各ウェルに新たに５００μＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ、培養プレートをプラスチック製のフィルムで密閉した後、３７℃のインキュベータに入れ、２４時間保存した。
（分析：アルブミン分泌量の測定）
　２４時間保存した後、培地を吸引し、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で２日間培養した。培養後の上澄みを回収し、ヒトアルブミン分析ＥＬＩＳＡキット（Bethyl Laboratories社製）を用いて、２日間のヒトアルブミン量を測定した。
（結果）
　表１にアルブミン分泌量を測定した結果を示した。実施例０１は、比較例０１の３倍の分泌量となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例０２－０５］
　保存温度についての実施例
（培養容器）
　図３、４に示す凹凸パターン形状であって、ａ＝２００μｍ、ｂ＝２０μｍ、ｃ＝５０μｍ、のパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上に凹凸パターン形状の転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させたフィルムを作製し、ポリスチレン製の培養底面のない２４穴プレートに、レーザ溶着法でフィルムを貼り付けた後、γ線滅菌を行い、２４ウェルの複数のマイクロ空間を有する培養容器（培養プレート）を作製し保存試験に用いた。
（細胞培養）
　ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（財団法人ヒューマンサイエンス研究資料バンク　資源番号ＪＣＲＢ１０５４）を、培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＧＮ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で、所定の細胞数まで増殖させた。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地を用いた。増殖させた細胞を、０．２５％トリプシン溶液を用いて培養底面から剥離し、遠心分離法にて細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液で、細胞濃度が４×１０５個／ｍＬになるように調整し、培養容器の各ウェルに５００μＬずつ添加した。その後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した。
（保存試験）
　３日間培養した後、培地を吸引し、各ウェルに５００μＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れた。培養容器をプラスチック製のフィルムで密閉した後、以下の実施例の保存方法で保存した。保存中の庫内温度は温度センサーを用いて測定し、目的温度を保っていることを確認した。
＜実施例０２＞
　１８℃の定温保温剤が入った保存容器（日立物流社製）を用い、２４時間保存した。このときの庫内の温度は、１８℃±０．５℃であった。
＜実施例０３＞
　６℃の定温保温剤が入った保存容器（日立物流社製）を用い、２４時間保存した。このときの庫内の温度は、６℃±０．５℃であった。
＜実施例０４＞
　発泡スチロール製の容器の中に氷を入れ、その上に培養容器を置き２４時間保存した。このときの培養容器底面の温度は０℃±０．５℃であった。
＜実施例０５＞
　３７℃のインキュベータに入れ、２４時間保存した。
（分析）
　２４時間保存後、培地を吸引し、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。その後、倒立顕微鏡を用いて観察を行い、任意の視野について、３０～２００μｍの細胞塊が形成された数をカウントし、以下の式で細胞塊形成率を算出した。また、保存前の細胞塊形成率についても同様の方法で算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001

　ただし、（式１）において、
「１視野内マイクロ空間の個数」は、１視野（任意の範囲の視野）に存在するマイクロ空間（マイクロ容器）の個数をいう。
「細胞塊が形成された１視野内マイクロ空間個数」は、１視野内マイクロ空間のうち、３０～２００μｍの細胞塊が形成されているマイクロ空間の個数をいう。
（結果）
　表２に細胞塊形成率を示した。保存前の細胞塊形成率は、８０～１００％であった。実施例０２（１８℃）では、保存前の形態がほぼ完全に保たれていた。実施例０３（６℃）は、細胞塊形成率が低下するものの、６０％～８０％の形態が維持されていた。実施例０４（０℃）は３０％と形成率が低くほとんど形態が維持されなかった。実施例０５（３７℃）は２５％と形成率が一番低く、ほとんど形態が維持されなかった。
　この結果から、保存温度は、１０℃以上２０℃以下が好ましく、１８℃が特に好ましいことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例０６、０７］
　細胞密度についての実施例
（培養容器）
　実施例０６、０７は、実施例０２－０５と同じ培養容器を使用した。
（細胞培養）
　ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（財団法人ヒューマンサイエンス研究資料バンク　資源番号ＪＣＲＢ１０５４）を、培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＧＮ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で、所定の細胞数まで増殖させた。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地を用いた。増殖させた細胞を、０．２５％トリプシン溶液を用いて培養底面から剥離し、遠心分離法にて細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液で、実施例に示した細胞濃度に調整し、培養容器の各ウェルに５００μＬずつ添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した。
＜実施例０６＞
　細胞を播種する際、細胞濃度を４×１０５個／ｍＬに調整し、以下に示す保存条件で保存した。
＜実施例０７＞
　細胞を播種する際、細胞濃度を４０×１０５個／ｍＬに調整し、以下に示す保存条件で保存した。
（保存条件）
　３日間培養した後、培地を吸引し、各ウェルに５００μＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ、培養プレートをプラスチック製のフィルムで密閉した後、１８℃の定温保温剤が入った容器（日立物流社製）に入れ、２４時間保存した。
（分析）
（アルブミン分析）
　２４時間保存した後、培地を吸引し、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で２日間培養した。培養後の上澄みを回収し、ヒトアルブミン分析ＥＬＩＳＡキット（Bethyl Laboratories社製）を用いて、２日間のヒトアルブミン分泌量（ｎｇ／ｍＬ／２ｄａｙｓ）を測定した。次に、０．２５％のトリプシン溶液で細胞を剥離し、トリパンブルーで生細胞の値を算出、１０５個あたりの値を、以下に記載の表３のアルブミン分泌量とした（ｐｇ／１０５／２ｄａｙｓ）。
（形態観察）
　２４時間保存した後、培地を吸引し、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した後、倒立顕微鏡を用いて形態を観察した。
（結果）
　図８Ａ、８Ｂは、保存容器から取り出した後、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した時の写真である。
　実施例０６（図８Ａ）では球状の細胞塊が形成されているのに対し、実施例０７（図８Ｂ）ではマイクロ空間内に細胞が密に詰まった状態で塊となり、死んだ細胞が区画外で凝集していた。表３にアルブミン分泌量を示した。アルブミン分泌量については、実施例０６は実施例０７の約２．８倍という高い値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　なお、本発明は上記に示す実施の形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。
１０、２０　細胞培養容器
１１　マイクロ容器
１２　側壁
１３　開口部
２３　スポット
２４　スポットの側壁
３０　密封手段
４０　生細胞
５０　培地

Claims (15)

  1. 　複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器を用いて生細胞を保存する細胞保存方法であって、
    　生細胞を前記複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養し、
    　前記培養後、前記複数のマイクロ空間を覆うように、培地を前記細胞培養容器へ注入し、
    　前記細胞培養容器を、培地が漏れ出さないように密封して前記生細胞を保存する細胞保存方法。
  2. 　前記細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度に保たれて前記生細胞が保存されることを特徴とする請求項１記載の細胞保存方法。
  3. 　前記培養は、前記表面に接着され、かつ、各マイクロ空間の空間内に形成される三次元構造体の細胞集団が隔離される細胞数になるように培養することを特徴とする請求項１または２記載の細胞保存方法。
  4. 　前記複数のマイクロ空間は、底部面積が０．０１～０．１ｍｍ２であり、深さが２５～１５０μｍであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  5. 　前記生細胞は、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  6. 　前記生細胞は、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれかから分化させた、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、及び骨細胞のうちのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  7. 　前記培養後、非接着細胞を除去してから前記培地を前記細胞培養容器へ注入することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  8. 　前記生細胞の培養は、生細胞を接着させて培養した後、さらに培養して、増殖、伸展、または凝集させることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  9. 　細胞播種密度１×１０２～１×１０６細胞／ｃｍ2で、生細胞が前記複数のマイクロ空間に播種されたことを請求項１乃至８のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  10. 　前記複数のマイクロ空間に、生細胞が集積した細胞塊が形成されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  11. 　前記細胞塊の直径は、３０～２００μｍであることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  12. 　前記培地は、血清、増殖因子、及び血中成分の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  13. 　酸素または二酸化炭素を透過させる膜を用いて前記細胞培養容器を密封することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
  14. 　複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器へ生細胞を保存して輸送する細胞輸送方法であって、
    　生細胞を前記複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養し、
    　前記培養後、前記複数のマイクロ空間を覆うように、培地を前記細胞培養容器へ注入し、
    　前記細胞培養容器を、培地が漏れ出さないように密封し、
    　密封した前記細胞培養容器を、車両、船舶、または航空機のいずれかの輸送手段を用いて輸送する細胞輸送方法。
  15. 　前記細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度に保たれることを特徴とする請求項１４記載の細胞輸送方法。
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