WO2007126127A1 - 細胞培養容器およびその製造方法 - Google Patents

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WO2007126127A1
WO2007126127A1 PCT/JP2007/059414 JP2007059414W WO2007126127A1 WO 2007126127 A1 WO2007126127 A1 WO 2007126127A1 JP 2007059414 W JP2007059414 W JP 2007059414W WO 2007126127 A1 WO2007126127 A1 WO 2007126127A1
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WO
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cell culture
culture container
cell
cells
resist
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/059414
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yuji Morimoto
Taiji Nishi
Taisuke Kamada
Go Tazaki
Motohiro Fukuda
Original Assignee
Kuraray Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2008513329A priority patent/JP5281886B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture container and a method for producing the same.
  • Methods for testing and testing cells isolated from tissues are indispensable in biotechnology-related fields. Widely used in diagnosing diseases, pathological conditions, searching for new drugs and determining their efficacy, or in animal testing, plant testing, and environmental pollutant testing. For this reason, the cells used in the biotechnology field have become extremely diversified.
  • the isolated cells may be used immediately for testing, but in many cases, the cells are cultured in culture dishes or test tubes. Various tests are performed using the cultured cells. Cell culture strains used for cell culture tests are required to exhibit drug sensitivities and toxic reactions similar to in vivo tests, so-called in vivo tests. In other words, it is necessary to be able to construct a network between regularly arranged cells on the surface of a cell culture vessel. In addition, since cell culture strains used in cell culture tests are extremely expensive, it is desired to improve cell viability and growth rate.
  • the above cell culture test measures the effect of varying the amount and concentration of the drug to be evaluated under the same conditions. Therefore, the material and shape of the cell culture container must be the same.
  • a plastic petri dish Glass petri dishes, glass plates fixed in containers, tool plates, etc. are generally used. There are 6, 1 2, 4 8, and 9 6 uel plates or petri dishes. In general, the overall size of the plate is almost the same, and the larger the number of wells, the smaller the size of one well. This 1well is equivalent to 1 culture dish.
  • 3 4 4 well plates consisting of a large number of culture dishes with a smaller diameter have begun to be used.
  • Patent Document 1 a method of coating a cell culturing surface according to a desired pattern with a cell adhesion inducer such as polylysine has been disclosed (see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 4-8 1 7 3 Disclosure of Invention
  • the present invention has been made to solve such problems, and an object of the present invention is to provide a cell culture container capable of reproducing cell functions in vivo, a production method thereof, and a cell culture method. To do. Means for solving the problem
  • the cell culture container according to the present invention is a cell culture container having an M convex pattern on a surface on which cells are cultured, and the concave part of the concave / convex pattern communicated with the cell culture part and the cell culture part
  • a bottom opening width of the cell culture part is 1.0 to 20 times the equivalent diameter of the culture cell, and a cell adhesion inducing substance is formed only on the bottom face and side wall of the recess. It is a thing.
  • the method for producing a cell culture container according to the present invention is a method for producing a cell culture container having a concavo-convex pattern on a surface on which cells are cultured, and is constituted by a concave portion of the concavo-convex pattern.
  • the method includes a step of forming a culture channel and a microchannel communicating with the cell culture unit, and a step of introducing a cell adhesion inducer into only the four portions by capillary action.
  • the cell culture container and cell culture method which can reproduce the cell function in the living body can be provided.
  • FIG. 1A is a plan view schematically showing a configuration of a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1B is a cross-sectional view of FIG. 1A.
  • FIG. 2 is a SEM photograph of the cell culture container according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3A is a diagram schematically showing a method for producing a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3B is a diagram schematically showing a method for manufacturing the cell culture container according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3C is a diagram schematically showing a method for manufacturing the cell culture container according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3D is a diagram schematically showing a method for manufacturing the cell culture container according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 E is a diagram schematically showing a method for producing a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3F is a diagram schematically showing a method for producing a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3G is a diagram schematically showing a method for producing a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3H is a diagram schematically showing a method for producing a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4A is a plan view schematically showing a cell culture container according to Comparative Example 2.
  • FIG. 4B It is an enlarged view in a broken line circle of FIG. 4A.
  • FIG. 4C is a sectional view of FIG. 4B.
  • FIG. 5A is a plan view schematically showing a cell culture container according to Example 1 of the present invention.
  • FIG. 5B is an enlarged view in a broken circle in FIG. 5A.
  • FIG. 5C is a cross-sectional view of FIG. 5B.
  • FIG. 6A is a plan view schematically showing a cell culture container according to Example 2 of the present invention.
  • FIG. 6B is an enlarged view inside the broken-line circle in FIG. 6A.
  • FIG. 6C is a cross-sectional view of FIG. 6B.
  • FIG. IV A plan view schematically showing a cell culture container according to Example 3 of the present invention.
  • FIG. 7B is an enlarged view inside the broken circle in FIG. 7A.
  • FIG. 7C is a cross-sectional view of FIG. 7B.
  • FIG. 8A is a plan view schematically showing a cell culture container according to Example 4 of the present invention.
  • FIG. 8B is an enlarged view inside the broken-line circle in FIG. 8A.
  • FIG. 8C is a cross-sectional view of FIG. 8B.
  • FIG. 8D is a cross-sectional view of FIG. 8B.
  • FIG. 9 is a photograph of pheochromocytoma (PC 12) after 10 days in Comparative Example 2.
  • FIG. 1 OA is a photograph of pheochromocytoma (PC 12) after 10 days of culture in Example 1.
  • FIG. 1 OB is a photograph of pheochromocytoma (PC 12) after 10 days in Example 1. Explanation of symbols
  • the inventors of the present invention formed a microchannel having a desired dimension on a surface where cells are cultured (hereinafter referred to as a culture surface) in a cell culture container such as a plate or a petri dish.
  • a culture surface a surface where cells are cultured
  • a cell culture container such as a plate or a petri dish.
  • the entire culture surface is coated with a cell adhesion inducer such as collagen, laminin, or polylysine, and the cells are placed. As a result, cells are randomly placed over the entire culture surface and cannot be placed regularly.
  • a cell adhesion inducer such as collagen, laminin, or polylysine
  • Randomly arranged and proliferated cells form disordered, complex and numerous cell-to-cell networks with neighboring cells and cells separated by more than 100 ⁇ m. Therefore, for example, when observing signal transmission between cells using a fluorescent probe, the cells in the container are uniformly stained by the fluorescent probe. In addition, the network diameter required for signal transmission is reduced, and the fluorescence intensity is also reduced. Therefore, it is not possible to elucidate the order control mechanism through signal transmission in the network.
  • a microchannel is formed on the culture surface. If a cell adhesion inducing substance is introduced into the microchannel using the capillary phenomenon and dried, the cell adhesion inducing substance can be easily coated only on a predetermined part of the culture surface. For this reason, cells adhere to only a predetermined site and proliferate. As a result, an ordered cell-to-cell network is formed like a logic circuit. In other words, a signal transmission model that reproduces a living tissue can be realized, and can be applied to the study of signal transmission processes using cultured cells. Similarly, drug sensitivity and toxicity tests can be applied to study the signal transduction process. Since the network path can be controlled, the network diameter is increased and the fluorescence intensity is improved. For this reason, the signal transmission process can be easily observed. In the future, it can be expected to expand into the field of regenerative medicine by combining with homoculture, heteroculture, or capillary cell sheet.
  • FIG. 1A is a plan view showing the configuration of the cell culture container according to the embodiment.
  • 1B is a cross-sectional view of FIG. 1A
  • FIG. 2 is a SEM photograph (perspective view). '
  • a plurality of microchannels 1 are formed in a mesh shape.
  • the region surrounded by the rectangular projections 3 is the micro flow path 1.
  • the four vertices of the rectangular convex part 3 are rounded as if the corners were rounded, but they may be completely rectangular or chamfered.
  • the side wall of the flange 3 is formed substantially perpendicular to the bottom surface.
  • a cell adhesion-inducing substance-containing liquid is introduced into the microchannel 1 and dried to coat the cell-inducing substance on the microchannel.
  • cells are placed at the intersection 2 of the microchannel 1.
  • Placement-A fixed network of cells is formed along the microchannel 1.
  • microchannel 1 formed on the culture surface is 0.1 times the equivalent diameter of the cultured cells
  • the width of the flow path is larger than 200 / zm, a plurality of cells are arranged, which also serves as a container for culturing the cells. Even if a plurality of cells are arranged in the microchannel 1, a network is formed along the microchannel 1, so that it can be used for research on signal transmission between cells.
  • the width of the intersecting portion 2 which is a cell culture portion is preferably 1.0 to 20 times the equivalent diameter of the cultured cell.
  • the depth of the microchannel 1 (side wall height) is preferably 0.1 to 10 times the equivalent diameter of the cultured cells. Specifically, 2 ⁇ ! ⁇ 500 / xm is preferred, 5 ⁇ ! The range of ⁇ 400 ⁇ is more preferable. If it is shallower than 2 ⁇ , it becomes difficult to introduce the cell adhesion inducer-containing liquid due to capillary action, and if it is deeper than 500 Am, the difficulty in manufacturing technology increases and the cost increases.
  • the distance between the opposing microchannels 1 is preferably 5 ⁇ to 150 mm in both length and width, and 10 ⁇ ! More preferably, ⁇ 100 mm. If it is less than 5 ⁇ m, the cells can approach each other without forming a network and are not suitable for studies on action potential transmission between cells. If it exceeds 1 50 mm, it will be difficult to observe the cell scanning function.
  • the cell adhesion inducer-containing liquid In order to introduce the cell adhesion inducer-containing liquid into the surface on which the cells are cultured, for example, it can be injected into the end of the microchannel 1 using a pipette or the like. Provide an introduction area 5 consisting of a recess communicating with at least one, It is preferable to add the cell adhesion inducer-containing liquid dropwise because the operation is simple.
  • the depth of the microchannel 1 may be increased stepwise in order to promote uniform introduction of the cell adhesion inducer-containing liquid into the microchannel 1.
  • a more advanced cell network can be constructed by installing a microphone mouth container at the intersection 2 of the microchannel 1 on the cell culture surface.
  • the width of the microchannel 1 is 10 ⁇ and the width of the microcontainer is 40 ⁇ in diameter, the cells are placed in the microcontainer because they cannot enter the channel.
  • a network is formed along the micro flow path 1.
  • the width or diameter of the micro container is 5 ⁇ rr! ⁇ 1000 ⁇ m is preferable, and a range of 10 ⁇ m to 500 ⁇ m is more preferable. If it is smaller than 5 ⁇ , it will be difficult to place cells, and if it is larger than 1 00 ⁇ , multiple cells will adhere randomly in one microcontainer, making it impossible to induce the formation of the network into the intended pattern. .
  • cell types to which the cell culture vessel according to the present invention can be applied are not limited, but cell types that form a network from neurites such as rat and mouse neurons and pheochromocytoma (PC 1 2) are particularly preferred. It is.
  • the resin plate has the same light transmittance as that of the glass plate.
  • the light transmittance at wavelengths of 300 nm to 800 nm including the ultraviolet region is 80% or more, and the haze value is 10%. It is preferable to be within.
  • materials that do not have a ring structure in the chemical structure such as the power to use acrylic resin that does not contain UV absorbers ⁇ PC (polycarbonate), polystyrene, etc.
  • additives such as antioxidants, viscosity improvers, heat stabilizers, and anti-sticking agents need not contain UV absorbers.
  • the light (excitation light) for causing the fluorescent dye to shine cannot be discriminated from the fluorescence (fluorescence radiation light) generated unless it passes through the cell culture vessel. Therefore, high light transmittance is required.
  • the transparency required to distinguish fluorescence (fluorescent radiation) must be at least 80% visible light transmittance and within 10% haze.
  • Autofluorescence means that after a polymer molecule absorbs ultraviolet and visible light, it emits light and emits fluorescence. While glass plates do not emit autofluorescence, many resin plates do autofluorescence, making it impossible to distinguish the fluorescence generated from the sample (fluorescence emission light), making it difficult to perform microanalysis, a characteristic of fluorescence analysis.
  • the cell culture vessel can be made hydrophilic or hydrophobic by coating it with an organic or inorganic membrane. Thereby, it is possible to prevent bubbles from adhering to fine protrusions and to control the degree of cell adhesion.
  • methods using low-temperature plasma treatment, corona discharge treatment, ultraviolet irradiation, collagen that promotes cell adhesion, etc. There is a method of applying.
  • by masking a part only the other part can be covered with an organic film or an inorganic film. Thereby, the range of the culture test conditions can be further widened.
  • Inorganic film formation methods such as sputtering and vapor deposition can also be applied to oil immersion lens observation methods.
  • the oil used in the oil immersion lens is mixed with an organic solvent in order to make the optical properties compatible with the glass plate and optical lens for culturing cells.
  • Organic solvents may not be applicable because they penetrate resin cell culture vessels and cause whitening and dissolution problems.
  • Inorganic materials have a gas barrier effect and at the same time are resistant to organic solvents. Therefore, an inorganic film is formed on the bottom of the cell culture vessel in contact with the oil in the oil immersion lens. And the application range of the resin cell culture container can be expanded.
  • a transparent inorganic material such force S I_ ⁇ 2 to 4 0 0 nm or less thickness.
  • a method for producing a resin-made cell culture container having a plurality of micro-containers will be described.
  • a metal is attached in accordance with a step of forming a micro space structure corresponding to a micro container on a substrate, a microphone mouth space structure pattern formed on the substrate, or a transfer pattern thereof, and the resin plate Forming a metal structure having a pattern opposite to the structure pattern; and transferring a pattern of the metal structure to form a resin plate.
  • the microchannel and microcontainer obtained by this method form a resin plate by transferring the pattern of the metal structure that will be the master, so that both high dimensional accuracy and low cost can be achieved.
  • a cell adhesion inducer may be introduced into the microchannel using a capillary phenomenon, a complicated pattern Jung process for forming the cell adhesion inducer is unnecessary.
  • a cell culture container is manufactured.
  • the steps (V) to (viii) are optional and can be omitted.
  • the steps (V) to (vi i i) can be repeated a plurality of times.
  • the resist pattern forming process will be described in more detail.
  • the first resist layer (thickness 70 ⁇ ), the second resist layer ( (Thickness 30 ⁇ ⁇ ))
  • each layer is exposed, or exposed and heat-treated.
  • a pattern with a depth of 3 ° ⁇ , which is the second resist layer is first obtained, and then a pattern with a depth of 100 ⁇ is obtained by combining the first resist layer and the second resist layer. It is done.
  • a pattern with a depth of 100 m is obtained, in order not to dissolve or deform the pattern with a depth of 30 ⁇ as the second resist layer in the developer, dissolve each layer in the developer. Control is required.
  • the baking time may be increased to cure the resist.
  • the beta time is set according to the film thickness, solvent concentration such as thinner, and sensitivity. By increasing this time, it is possible to provide alkali resistance.
  • the beta of the first resist layer advances too much, the resist will be extremely hardened, and it will be difficult to form a pattern by dissolving the portion irradiated with light in the subsequent development. It is preferable to select appropriately such as shortening.
  • the apparatus used for the beta is not particularly limited as long as the solvent can be dried, and examples thereof include an oven, a hot plate, and a hot air dryer.
  • the range of alkali resistance is limited, so the resist thickness to be set is preferably within the range of 5 to 200 ⁇ , More preferably, it is in the range of 100 / zm.
  • the crosslinking density of the negative resist can be set by the exposure amount.
  • the crosslinking density can be set by the exposure amount and the heat treatment time. By increasing the exposure amount or the heat treatment time, the alkali resistance can be exhibited.
  • the resist thickness to be set is preferably within the range of 5 to 500 ⁇ m, more preferably within the range of 10 to 300 ⁇ m. preferable.
  • FIG. 3A shows a state in which the first resist layer 12 is formed on the substrate 11.
  • the flatness of the resin cell container obtained in the molded product forming step is determined by the process of forming the first resist layer 12 on the substrate 11. That is, the flatness at the time when the first resist layer is formed on the substrate is reflected in the flatness of the metal structure, and thus the cell culture vessel.
  • the method of forming the first resist layer 12 on the substrate 11 1 is not limited at all, but in general, the spin coating method, the dating method, the roll method, the bonding of the dry film resist, etc. can be fisted.
  • the spin coating method is a method of applying a resist on a rotating glass substrate, and has an advantage of applying the resist to a glass substrate having a diameter of more than 30 Omm with a high degree of flatness. Therefore, the Svin Coat method is preferable from the viewpoint of realizing high flatness.
  • the resist used as the first resist layer 12 may be either a positive type resist or a negative type resist. In either case, the depth of focus of the resist varies depending on the sensitivity of the resist and the exposure conditions. For this reason, for example, when a UV exposure apparatus is used, it is preferable to select the exposure time and UV output value according to the resist thickness and sensitivity.
  • the resist used as the first resist layer 12 is a wet resist
  • the method of changing the spin coat rotational speed is to obtain a desired resist thickness by appropriately setting the spin coater rotational speed.
  • the method using viscosity adjustment is to adjust the viscosity according to the flatness required in actual use because there is a concern that the flatness may decrease when the resist thickness is large or the coating area is large. is there.
  • the thickness of the resist layer applied at one time is preferably 10 to 50 ⁇ , more preferably 20 to 50 in consideration of maintaining high flatness. It is preferable to be within the range.
  • the resist layer can be formed in multiple steps.
  • the baking time will be reduced. It is preferable to select appropriately such as shortening the length.
  • a method of cutting and pinning the substrate and mask A at the same position a method of positioning using a laser interferometer, a position mark at the same position on the substrate 1 1 and mask A 1 3, optical
  • a method of aligning with a microscope For example, a position mark is formed on a substrate by a photolithographic method, and a position mark is drawn on a mask A by a laser drawing apparatus. Even in manual operation using an optical microscope, it is effective in that accuracy within 5111 can be easily obtained.
  • the mask A 13 used in the process shown in FIG. 3B is not limited in any way, and examples thereof include an emulsion mask and a mouth mask.
  • the size and accuracy depend on the mask A 13 used.
  • the dimensions and accuracy are also reflected in the resin cell culture vessel. Therefore, in order to make each dimension and accuracy of the resin cell culture container predetermined, it is necessary to define the size and accuracy of the mask A 13.
  • Mask A 1 3 is made of quartz glass from the viewpoint of temperature expansion coefficient and UV transmission absorption. However, since it is relatively expensive, it is preferable to appropriately define the resin molded product according to the accuracy required for practical use. In order to obtain structures with different desired depths or heights as designed, or structures with different first and second resist patterns, the first resist layer 12 and the second resist layer 14 The mask pattern design used for exposure (transmission Z shading part) must be reliable, and simulation using CAE analysis software is one of the solutions.
  • the light source used for exposure is preferably ultraviolet light or laser light, which has low equipment costs. Synchrotron radiation can be used when the equipment cost is high and the price of the resin plate is substantially high, but it is desired to obtain a deep exposure depth.
  • exposure conditions such as exposure time and exposure intensity vary depending on the material, thickness, and the like of the first resist layer 12, it is preferable to adjust appropriately according to the pattern to be obtained. Adjustment of exposure conditions is important because it affects the size and accuracy of the spatial structure pattern. In addition, since the depth of focus varies depending on the type of resist, for example, when using a UV exposure apparatus, it is preferable to select the exposure time and the UV output value according to the resist thickness and sensitivity.
  • Heat treatment after exposure is known as annealing to correct the shape of the resist pattern.
  • annealing it is performed only when a chemically amplified negative resist is used for the purpose of chemical crosslinking.
  • Chemically amplified negative resists are mainly composed of two-component or three-component systems, and, for example, an epoxy group at the end of a chemical structure is opened by light during exposure to cause a crosslinking reaction by heat treatment. .
  • the heat treatment time is, for example, 100 m
  • the crosslinking reaction proceeds in several minutes under the condition of a set temperature of 100 ° C.
  • FIG. 3C shows a state in which the second resist layer 14 is formed.
  • the formation of the second resist layer 14 is performed by the same method as the formation of the first resist layer 12 described in (i) above.
  • alkali resistance can be expressed by setting the beta time to about 1.5 to 2.0 times the normal time. .
  • the alignment between the substrate 1 and the mask B 15 is performed in the same manner as the alignment between the substrate 1 and the mask A 13 described in (ii) above.
  • Fig. 3D shows the exposure of the second resist layer 14.
  • the heat treatment of the second resist layer 14 is performed in the same manner as the heat treatment of the first resist layer 12 described in (iv) above.
  • the heat treatment of the second resist layer 14 is performed so that the pattern of the second resist layer 14 is not dissolved or deformed when the pattern of the first resist layer 12 is obtained in the subsequent development. .
  • Chemical crosslinking proceeds, and alkali resistance is manifested by increasing the crosslinking density. It is preferable that the heat treatment time for developing the alkali resistance is appropriately selected according to the resist thickness from the usual 1.1 to 2.0 times range.
  • a predetermined developer corresponding to the resist used it is preferable to use a predetermined developer corresponding to the resist used. It is preferable that development conditions such as development time, development temperature, and developer concentration are appropriately adjusted according to resist thickness and pattern shape. For example, if the development time is too long to obtain the required depth, it will become larger than a predetermined dimension, so it is preferable to set conditions appropriately. By this development process, a resist pattern 16 is formed.
  • Examples of methods for improving the plane accuracy of the top surface of the cell culture container or the bottom of the fine pattern include a method of changing the resist type (negative type or positive type) used in resist coating, and a method of polishing the surface of the metal structure. Etc.
  • the resist layers are exposed and developed at the same time, or after forming and exposing a single resist layer, a further resist layer is formed. Layer formation and exposure can be performed, and two resist layers can be developed simultaneously.
  • metal is deposited along the resist pattern 16 obtained in the resist pattern forming step, and the micro space structure surface of the metal structure 18 is formed along the resist pattern 16. Thus, the metal structure 18 is obtained.
  • a conductive film 17 is formed.
  • the method for forming the conductive film 17 is not particularly limited, but is preferably a vacuum deposition method, a sputtering method, or the like.
  • Examples of the conductive material used for the conductive film 17 include gold, silver, platinum, copper, and aluminum.
  • metal is deposited along the resist pattern 16 by plating to form a metal structure 18.
  • the plating method is not particularly limited, and for example, electrolytic plating, electroless plating, etc. can be fisted.
  • the metal used is not particularly limited, nickel, a nickel-cobalt alloy, copper, and gold can be used, and nickel is preferably used from the viewpoint of economy and durability.
  • the metal structure 18 may be polished according to its surface condition. However, since there is a concern that dirt may adhere to the modeled object, it is preferable to perform ultrasonic cleaning after polishing. Further, the metal structure 18 may be surface-treated with a release agent or the like in order to improve the surface state.
  • the inclination angle in the depth direction of the metal structure 18 is preferably 50 ° to 90 °, more preferably 60 ° to 87 °, from the shape of the resin molded product.
  • the metal structure 18 deposited by plating is separated from the resist pattern 16.
  • a resin molded product 19 is formed using the metal structure 18 as a mold.
  • the method for forming the resin molded product 19 is not particularly limited, and examples thereof include injection molding, press molding, monomer cast molding, solvent cast molding, roll transfer method by extrusion molding, etc. From the viewpoint of productivity and mold transferability Injection molding is preferably used.
  • the shape of the metal structure 18 can be reproduced on the resin molded product 19 with a high transfer rate. it can. Transfer rate TJP20 7/059414
  • the minimum flatness of the resin molded product 19 is preferably 1 or more from the viewpoint of easy industrial reproduction.
  • the maximum value of the flatness of the resin molded product 19 is preferably 200 111 or less from the viewpoint of preventing the molded product from warping and coming into contact with the optical system unit.
  • the dimensional accuracy of the molded part of the resin molded product is preferably within a range of ⁇ 0.5 to 10% from the viewpoint of easy industrial reproduction.
  • Example and comparative example concerning this invention are shown.
  • the size of the microchannel of the cell culture vessel was varied, and the degree of network construction and cell excitability of rat brain hippocampal neurons and pheochromocytoma (PC 12) were evaluated.
  • the total light transmittance and haze value as optical property values were measured using a visible light transmittance meter (model: HA-TR) manufactured by Suga Test Instruments Co., Ltd. Specifically, the total light transmittance was measured twice by a method based on JIS K6 714, and the average value was obtained.
  • the thickness of the deposited film was measured by a stylus method using a surface shape measuring instrument (DEKTAK3030) manufactured by ULVAC, Inc.
  • the method for introducing the cell adhesion inducer is as follows.
  • the surface for culturing the cells was immersed in a cell adhesion inducer-containing solution and then dried for 6 hours.
  • a cell adhesion inducer-containing solution was dropped onto the introduction region 5 using a pipette, and was introduced into only the microchannel and the side wall and the lower part of the microcontainer by capillary action, and then dried for 6 hours.
  • the cell adhesion inducer containing solution was polylysine + laminin for brain hippocampal neurons and collagen I for pheochromocytoma.
  • the number of cells spread was 2.0 x 10 4 for all cells. Brain hippocampal neurons were cultured for 10 days after cell spreading. PC 1 2 cells Transgrowth factors were added and then cultured for 10 days.
  • the degree of cell network construction was observed using an inverted microscope (TE 200 00-PF S) manufactured by Nikon Corporation.
  • the degree of network construction was classified into ⁇ (network construction), ⁇ (partial construction), and X (random network) and evaluated.
  • the activity state (cell excitability) in cell network construction was measured by analyzing intracellular C a 2+ kinetics using Do jindo's C a 2+ sensitive fluorescent dye (model: F 1 uo -4). .
  • a ratio imaging system (AQUACO SMO S / RAT IO) manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd. was used, and it was classified into 0, 1 + to 4+ grades according to the difference in staining in the network and evaluated. .
  • a commercially available sterilized polystyrene petri dish ( ⁇ 90mm—depth 20mm) was used.
  • the optical properties were a total light transmittance of 84% and a haze value of 4.3%.
  • FIG. 4A is an enlarged view in a circle indicated by a dotted line in FIG. 4A, and is a plan view schematically showing a configuration of a cell culture container according to Comparative Example 2.
  • FIG. FIG. 4C is a cross-sectional view of FIG. 4B.
  • the optical properties were a total light transmittance of 83% and a haze value of 8.2%.
  • FIG. 5B is an enlarged view in a circle indicated by a dotted line in FIG. 5A, and is a plan view schematically showing a configuration of the cell culture container according to Example 1.
  • FIG. 5C is a cross-sectional view of FIG. 5B.
  • a 0.3 m thick silicon oxide (Si02) film was formed using an ULVAC, Inc. (model: UEP) vapor deposition system. . Thereafter, it was sterilized.
  • the optical properties were a total light transmittance of 87% and a haze value of 9.7%.
  • the microchannel 1 with a width of 20 ⁇ m, a depth of 50 ⁇ , and a distance of both length and width (width of convex part 3) 280 ⁇ and a cell adhesion inducer-containing liquid of 4 mm
  • the introduction region 5 is one step lower than the microchannel 1 and has a recess.
  • FIG. 6B is an enlarged view in a circle indicated by a dotted line in FIG. 6A, and shows the structure of the cell culture container according to Example 2. It is a top view which shows composition normally.
  • FIG. 6C is a cross-sectional view of FIG. 6B.
  • the optical properties were a total light transmittance of 88% and a haze value of 5.2%.
  • FIG. 7B is an enlarged view in a circle indicated by a dotted line in FIG. 7A, and is a plan view schematically showing the configuration of the cell culture container according to Example 3.
  • FIG. 7C is a cross-sectional view of FIG. 7B.
  • a 0.3 / zm thick silicon oxide (Si02) film is formed using an ULVAC (UEP) vapor deposition system. did. Thereafter, it was sterilized.
  • ULVAC ULVAC
  • the optical properties were a total light transmittance of 89% and a haze value of 4.2%.
  • an injection molding method is used on a resin plate with a width of 24mm, a length of 74mm and a thickness of 1.0mm as shown in Fig. 8A Figure 8 B and (c), width of 10 ⁇ m, depth of 30 ⁇ , distance between both vertical and horizontal (width of convex part 3) 1 90 ⁇ of microchannel 1 and diameter of cell adhesion inducer-containing liquid
  • the introduction region 5 is a recess that is one step lower than the microchannel 1.
  • FIG. 8B is an enlarged view in a circle indicated by a dotted line in FIG. 8A, and is a plan view schematically showing the configuration of the cell culture container according to Example 4.
  • 8C is a sectional view taken along the line VIII CV IIIC in FIG. 8B
  • FIG. 8D is a sectional view taken along the VIIID-VIIID in FIG. 8B.
  • the micro container 4 is located below the micro flow path 1, the cell adhesion inducing substance-containing liquid is easily introduced into the microphone mouth container 4.
  • the optical properties were a total light transmittance of 89% and a haze value of 6.5%.
  • Table 1 summarizes the results of culturing rat brain hippocampal neurons and pheochromocytoma (PC 12) for the above comparative examples and examples.
  • FIG. 9 shows a photomicrograph of pheochromocytoma (PC 12) after 10 days in the cell culture container of Comparative Example 2.
  • Fig. 10 shows microscopic observations (Fig. 10 A) and Ca 2 + derived from intracellular fluorescent probe for pheochromocytoma (PC 1 2) after 10 days in the cell culture container of Example 1 The fluorescent image (Fig. 10B) is shown.
  • the present invention is used, for example, in a cell culture container for culturing cells isolated from tissues and using them for testing and examination.

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Abstract

生体内での細胞機能を再現することができる細胞培養容器およびその製造方法を提供すること。本発明にかかる細胞培養容器は、細胞が培養される面に凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、前記凹凸パターンの凹部は、細胞培養部と、前記細胞培養部に連通したマイクロ流路とを備え、前記細胞培養部の底面幅が培養細胞の相当直径の1．０倍～２０倍であり、前記凹部の底面及び側壁上にのみ細胞接着誘導物質が形成されたものである。

Description

細胞培養容器およびその製造方法
技術分野
[ 0 0 0 1 ]
本発明は、 細胞培養容器およびその製造方法に関する。
明 背景技術 田
[ 0 0 0 2 ]
組織から単離した細胞を試験、 検査に用いる手法は、 バイオテクノロジー関 連分野では欠かせない方法となっている。 疾病、 病態の診断、 新薬の探索およ び薬効の判定、 あるいは動物検査、 植物検査、 環境汚染物質の試験などに幅広 く用いられている。 そのため、 バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、 極めて多様化してきている。
[ 0 0 0 3 ]
単離した細胞は、 直ちに試験に用いられる場合もあるが、 多くの場合、 培養 皿や試験管のなかで細胞培養が行われる。 この培養細胞を用いて、 種々の検査 が行われる。 細胞培養試験に用いられる細胞培養株には、 生体内での試験いわ ゆる in vivo試験と同様の薬剤感受性、 毒性反応を示すことが要求される。 す なわち、 細胞培養容器の表面で規則性を有して配列された細胞間のネットヮー クを構築できることが必要とされる。 また、 細胞培養試験に用いられる細胞培 養株は極めて高額であるため、 細胞の生存率および増殖速度の向上が望まれて いる。
[ 0 0 0 4 ]
上記細胞培養試験は、 同一条件下、 評価する薬物等の量、 濃度などを変量し、 その効果を測定するものである。 そのため、 細胞培養容器の材質、 形状等も同 一にする必要がある。 この細胞培養容器としては、 プラスチック製シャーレ、 ガラス製シャーレ、 容器内に固定されたガラスプレート、 ゥヱルプレート等が 一般的に用いられる。 ゥエルプレートには、 6ゥヱル、 1 2ゥエル、 4 8ゥェ ル、 9 6ゥエルの各プレートまたはシャーレがある。 これらは、 一般に、 プレ ート全体の大きさはほぼ同じであり、 ゥエル数が大きくなるほど、 1ゥエルのサ ィズが小さくなる。 この 1ゥエルが 1培養皿に相当する。 また、 最近の微量ィ匕 への流れから、 さらに小口径で多数の培養皿からなる 3 8 4ゥエルプレートも 使用され始めている。
[ 0 0 0 5 ]
しかしながら、 組織細胞の培養に、 従来の細胞培養容器を用いると、 細胞が 薄く伸びて方向性のない形態となる。 また、 細胞培養容器の表面にランダムに 配置されるため、 細胞間のネットワークは、 複雑に交錯して形成される。 その ため、 生体内での細胞機能を再現できないという問題があった。 この理由とし て、 ゥエルサイズを小口径にしても、 細胞サイズは数/ z m〜数 1 0 μ πιである ため、 平板上での培養と変わらないこと、 ピペット等を用いて細胞を配置する 際、 培養液によって細胞が移動するため、 規則正しく配置できないこと等が考 えられる。
[ 0 0 0 6 ]
上記問題を解決するため、 細胞接着誘導物質であるポリリジンなどを、 所望 するパターン通りに細胞が培養される面に被覆する方法が開示されている （特 許文献 1参照） 。
[特許文献 1 ] 特開 2 0 0 4— 8 1 7 3号公報 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[ 0 0 0 7 ]
し力 しながら、 特許文献 1に記載の方法では、 細胞が培養される面全体にポ リリジンを被覆した後、 線幅 2 0 μ πιの金属メッシュをマスクとしてその上に 重ね、 紫外線を照射し、 洗浄後に紫外線が照射されていない 2 Ο μ πιのパター ンを得る。 そのため、 1枚のプレートの製造ごとに複雑な工程が必要となり、 高コストとなる問題があった。 また、 1枚ごとに紫外線を照射し、 微細なポリ リジンパターンを製造するため、 金属メッシュとポリリジンの隙間、 紫外線照 射条件、 洗浄条件により、 ポリリジンパターンが安定して製造できない問題も あった 0
[ 0 0 0 8 ]
本発明は、 このような問題を解決するためになされたものであり、 生体内で の細胞機能を再現することができる細胞培養容器、 その製造方法および細胞培 養方法を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[ 0 0 0 9 ]
本発明にかかる細胞培養容器は、 細胞が培養される面に M凸パターンを有す る細胞培養容器であって、 前記凹凸パターンの凹部は、 細胞培養部と、 前記細 胞培養部に連通したマイク口流路とを備え、 前記細胞培養部の底面幅が培養細 胞の相当直径の 1. 0倍〜 2 0倍であり、 前記凹部の底面及び側壁上にのみ細胞 接着誘導物質が形成されたものである。
[ 0 0 1 0 ]
本発明にかかる細胞培養容器の製造方法は、 細胞が培養される面に凹凸パタ ーンを有する細胞培養容器の製造方法であって、 前記凹凸パタ一ンの凹部によ り構成される、 細胞培養部及び前記細胞培養部に連通したマイクロ流路を形成 するステップと、 毛細管現象により前記四部のみに細胞接着誘導物質を導入す るステップとを備えるものである。 発明の効果
[ 0 0 1 1 ]
本発明によれば、 生体内での細胞機能を再現することができる細胞培養容器 および細胞培養方法を提供することができる。 T JP2007/059414
4 図面の簡単な説明
[ 0 0 1 2 ]
[図 1 A]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面 図である。
[図 1 B ]図 1 Aの断面図である。
[図 2 ]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の S EM写真である。
[図 3 A]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す 図である。
[図 3 B ]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す 図である。
[図 3 C]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す 図である。
[図 3 D]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す 図である。
[図 3 E ]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す 図である。
[図 3 F ]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す 図である。
[図 3 G]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す 図である。
[図 3 H]本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す 図である。
[図 4 A ]比較例 2にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。
[図 4 B ]図 4 Aの破線円内の拡大図である。
[図 4 C]図 4 Bの断面図である。
[図 5 A]本発明の実施例 1にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。
[図 5 B ]図 5 Aの破線円内の拡大図である。 [図 5 C]図 5 Bの断面図である。
[図 6 A]本発明の実施例 2にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。
[図 6 B]図 6 Aの破線円内の拡大図である。
[図 6 C]図 6 Bの断面図である。
[図 Ί A]本発明の実施例 3にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。
[図 7 B]図 7 Aの破線円内の拡大図である。
[図 7 C]図 7 Bの断面図である。
[図 8 A]本発明の実施例 4にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。
[図 8 B]図 8 Aの破線円内の拡大図である。
[図 8 C]図 8 Bの断面図である。
[図 8 D]図 8 Bの断面図である。
[図 9]比較例 2において、 10日間培養後の褐色細胞腫 （PC 1 2) の写真で ある。
[図 1 OA]実施例 1において、 1 0日間培養後の褐色細胞腫 （PC 1 2) の写 真である。
[図 1 OB]実施例 1において、 10日間培養後の褐色細胞腫 （PC 12) の写 真である。 符号の説明
[001 3]
1 マイクロ流路
2 交差部
3 凸部
4 マイクロ容器
5 導入領域
1 1 基板
12 第 1レジスト層
13 マスク A 1 4 第 2レジスト層
1 5 マスク B
1 6 レジストパターン
1 7 導電性膜
1 8 金属構造体
1 9 樹脂製成型品
発明を実施するための最良の形態
[ 0 0 1 4 ]
本発明者らは、 鋭意研究した結果、 プレート、 シャーレ等の細胞培養容器に おいて、 細胞が培養される面 （以下、 培養面という） に所望の寸法のマイクロ 流路を形成し、 そのマイクロ流路に、 毛細管現象を利用して、 細胞接着誘導物 質含有液を導入することにより、 細胞の培養密度を高め、 生体内での細胞機能 を再現するのに最適な細胞培養容器を提供できることを見出した。 以下に、 本 発明の実施の形態について説明する。
[ 0 0 1 5 ]
通常、 細胞の培養試験では、 細胞の接着 ·増殖を促進するため、 培養面全体 に、 コラーゲン、 ラミニン、 ポリリジン等の細胞接着誘導物質を被覆し、 細胞 を配置する。 そのため、 細胞は、 培養される面全体にランダム配置され、 規則 正しく配置できない。
ランダムに配置され、 増殖した細胞は、 近隣の細胞や 1 0 0 μ m以上離れた 細胞との間で、 無秩序で複雑かつ多数の細胞間ネットワークを形成する。 した がって、 例えば、 蛍光プローブを用いて細胞間の信号伝達を観察する場合、 容 器内の細胞は、 蛍光プローブにより一様に染色されてしまう。 また、 信号伝達 に必要なネットワーク径が細くなり、 蛍光強度も小さくなる。 そのため、 ネッ トワーク内信号伝達を介した秩序統制機構を解明することができない。
[ 0 0 1 6 ]
本発明にかかる細胞培養容器には、 培養面にマイクロ流路が形成されている。 そして、 毛細管現象を利用して、 細胞接着誘導物質をそのマイクロ流路に導入 し、 乾燥すれば、 容易に、 培養面の所定の部位のみに細胞接着誘導物質を被覆 することができる。 そのため、 細胞は所定の部位のみに接着し、 増殖する。 そ の結果、 ロジック回路のように、 秩序ある細胞間ネットワークが形成される。 すなわち、 生体組織を再現した信号伝達モデルを実現でき、 培養した細胞を用 いた信号伝達過程の研究に適用できる。 同様に、 薬剤感受性、 毒性試験でも、 その信号伝達過程の研究に適用できる。 ネットワーク経路が制御できるため、 ネットワーク径が太くなり、 蛍光強度も向上する。 このため、 信号伝達過程を 容易に観察できる。 また、 将来的には、 ホモ培養、 ヘテロ培養または毛細血管 細胞シート等と組み合わせることによって、 再生医療分野への展開が期待でき る。
[ 0 0 1 7 ]
実施の形態
以下に、 本発明の実施の形態について説明する。 ただし、 本発明が以下の実 施の形態に限定される訳ではない。 また、 説明を明確にするため、 以下の記載 および図面は、 適宜、 簡略化されている。
実施の形態にかかる細胞培養容器の構成について図 1 A、 図 1 Bおよぴ図 2 を用いて説明する。 図 1 Aは、 実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を示す 平面図である。 図 1 Bは、 図 1 Aの断面図、 図 2は、 S EM写真 （斜視図） で ある。 '
[ 0 0 1 8 ]
細胞培養容器の培養面には、 図 1 Aに示すように、 複数のマイクロ流路 1が 網目状に形成されている。 換言すれば、 矩形状の凸部 3に囲まれた領域がマイ クロ流路 1である。 矩形状の凸部 3の 4つの頂点は角が R加工されたように丸 みを帯びた形状であるが、 完全な矩形や面取りされたような形状でもよい。 ώ 部 3の側壁は底面に対して略垂直に形成されている。 このマイクロ流路 1に細 胞接着誘導物質含有液を導入し、 乾燥することにより、 マイクロ流路上に細胞 誘導物質を被覆する。 細胞培養では、 マイクロ流路 1の交差部 2に細胞が配 4
8 置 -固定され、 マイクロ流路 1に沿って、 細胞のネットワークが形成される。
[0 0 1 9]
培養面に形成されるマイクロ流路 1の幅は、 培養細胞の相当直径の 0. 1倍
〜1 0倍であることが好ましい。 具体的数値としては、 幅 ！！！〜 。。 ]!! が好ましく、 5 μ π！〜 4 0 0 μ mの範囲がより好ましい。 2 μπιよりも小さい、 または 5 0 0 μ よりも大きいと、 毛細管現象により細胞接着誘導物質含有液 を導入することが困難となる。 そのため、 制御されたネットワーク形成が困難 となる。 流路の幅が 200 /zmよりも大きくなると、 細胞が複数配置され、 細 胞を培養する容器の役割を兼ねることになる。 マイクロ流路 1内に細胞が複数 配置されても、 マイクロ流路 1に沿ってネットワークが形成されるため、 細胞 間の信号伝達等の研究に用いることはできる。 また、 細胞培養部である交差部 2の幅は培養細胞の相当直径の 1. 0倍〜 2 0倍であることが好ましい。
[0 0 2 0]
マイクロ流路 1の深さ （側壁の高さ） は、 培養細胞の相当直径の 0. 1倍〜 1 0倍であることが好ましい。 具体的数値としては、 2 μπ！〜 5 00 /xmが好 ましく、 5 μπ！〜 400 μπιの範囲がより好ましい。 2 μπιよりも浅いと、 毛 細管現象により細胞接着誘導物質含有液を導入することが困難となり、 5 0 0 Amよりも深いと、 製造技術上での難易度が増し、 高コストとなる。
[0 0 2 1 ]
対向するマイクロ流路 1同士の間隔は、 縦 ·横いずれも 5 μπι〜 1 5 0mm が好ましく、 1 0 μ π！〜 1 00 mmがさらに好ましい。 5 μ m未満では、 細胞 がネットワークを形成しなくても近接でき、 細胞間の活動電位伝達に関する研 究等には適さなくなる。 1 5 0mmを超えると、 細胞の走査機能を観察するこ とが困難になる。
[0 0 2 2]
細胞が培養される面に、 細胞接着誘導物質含有液を導入するには、 例えば、 ピぺット等を用いてマイクロ流路 1の端部に注入することもできるが、 マイク 口流路の少なくとも 1つと連通する凹部からなる導入領域 5を設けて、 そこに 細胞接着誘導物質含有液を滴下するのが、 操作が簡便になり好ましい。 マイク ロ流路 1の深さは、 細胞接着誘導物質含有液のマイクロ流路 1への均一な導入 を促進するために、 段階的に深くしてもよい。
[0023]
細胞が培養される面におけるマイクロ流路 1の交差部 2にマイク口容器を設 けることにより、 さらに高度な細胞ネットワークを構築することもできる。 例 えば、 マイクロ流路 1の幅を 10 μπ マイクロ容器の幅を直径 40 μπιとし た場合、 細胞は流路に入れないため、 マイクロ容器に配置される。 そして、 マ イクロ流路 1に沿ってネットワークが形成される。 マイクロ容器の幅または直 径は、 5 μ rr！〜 1000 μ mが好ましく、 10 μ m〜 500 μ mの範囲がより 好ましい。 5 μπιよりも小さいと、 細胞を配置することが困難となり、 1 00 Ο μπιよりも大きいと、 複数の細胞が一マイクロ容器内で無秩序に接着し、 ネ ットワーク形成を意図したパターンに誘導できなくなる。
[0024]
本発明にかかる細胞培養容器を適用できる細胞種は限定されないが、 特に、 ラットやマウスの神経細胞、 褐色細胞腫 （PC 1 2) 等の神経突起部からネッ トワークを形成する細胞種が特に好適である。
[0025]
透過光観察を可能にするため、 樹脂プレートをガラスプレートと同等の光透 過率とするには、 紫外線領域を含む波長 300 nm〜800 nmの光透過率を 80%以上、 ヘイズ値を 10%以内とすることが好ましい。 上記要求を満たす ため、 細胞培養容器には、 紫外線吸収剤が含まれないアクリル樹脂を用いる力 \ PC (ポリカーボネイト） 、 ポリスチレン等の化学構造に環構造を有さない材 料を選択する必要がある。 また、 酸化防止剤、 粘度向上剤、 耐熱安定剤、 膠着 防止剤等の添加物に、 紫外線吸収剤が含まれていない必要がある。
[0026]
蛍光観察法では、 蛍光色素を光らせるための光 （励起光） は、 細胞培養容器 を透過しなければ、 それにより発生した蛍光 （蛍光放射光） を識別できない。 したがって、 高い光透過性が要求される。 蛍光 （蛍光放射光） を識別するため に必要な透明性は、 可視光の全光線透過率 8 0 %以上、 ヘイズ値 1 0 %以内と する必要がある。 上記要求を満たすため、 細胞培養容器には、 例えば、 ポリメ チルメタクリレート等の光学特性に優れる材料を用いることが好ましく、 結晶 性樹脂であるポリオレフィン系樹脂を用いる場合は、 非結晶状態で用いること が好ましい。
[ 0 0 2 7 ]
自家蛍光とは、 ポリマー分子が紫外'可視光を吸収した後、 光を放出して自 ら蛍光を発することをいう。 ガラスプレートは自家蛍光を発しないのに対し、 樹脂プレートの多くは自家蛍光するため、 サンプルから発生した蛍光 （蛍光放 射光） を識別できなくなり、 蛍光分析の特徴である微量分析が困難となる。
[ 0 0 2 8 ]
自家蛍光の影響を受けないためには、 波長 2 3 0 n m〜8 0 0 n mの光を照 射することで自家蛍光しないことが要求される。 そのため、 細胞培養容器には、 P C (ポリカーポネイト） 、 ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹 脂材料を選択する必要がある。 また、 自家蛍光の可能性を極力排除するため、 酸化防止剤、 粘度向上剤、 耐熱安定剤、 膠着防止剤等の添加物は、 できる限り 少量とするか、 添カ卩しないことが好ましい。
[ 0 0 2 9 ]
微分干渉観察法のコントラストを低下させずに、 偏光顕微鏡や微分干渉顕微 鏡により観察するために、 光学ひずみの小さい材料が要求される。 そのため、 細胞培養容器には、 P C (ポリカーボネイト） 、 ポリスチレン等の化学構造に 環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。
[ 0 0 3 0 ]
細胞培養容器に有機膜または無機膜を被覆することで、 親水化または疎水化 することができる。 これにより、 微細な突起への気泡の付着防止や細胞の接着 度合いを制御することができる。 例えば、 低温プラズマ処理、 コロナ放電処理、 紫外線照射等を用いる方法、 細胞の接着を促すタンパク質であるコラーゲン等 を塗布する方法がある。 また、 一部分をマスクすることにより、 他の部分のみ を有機膜または無機膜により被覆することもできる。 これにより、 培養試験条 件の幅をさらに広くすることができる。
[ 0 0 3 1 ]
スパッタリング法、 蒸着法等の無機膜形成法は、 油浸レンズ観察法への適用 もできる。 通常、 油浸レンズに用いるオイルには、 細胞を培養するガラスプレ 一トおよび光学レンズと光学物性を適合させるため、 有機溶剤が配合されてい る。 有機溶剤は、 樹脂製細胞培養容器に浸透し、 白化や溶解の問題を発生させ るため、 適用できない可能性がある。 無機材料は、 ガスバリヤ一効果と同時に、 耐有機溶剤性を有するため、 油浸レンズのオイルが接触する細胞培養容器の底 面に、 無機膜を形成することで、 油浸レンズ観察法への適用も可能となり、 樹 脂製細胞培養容器の適用範囲を広げることができる。 透過光観察を行う場合、 膜厚を 4 0 0 n m以下とする力 S i〇 2等の透明無機材料を用いることが好ま しい。
[ 0 0 3 2 ]
上記の複数のマイクロ容器を有する樹脂製の細胞培養容器の製造方法につい て説明する。 この製造方法は、 基板上にマイクロ容器に相当するマイクロ空間 構造を形成するステップと、 基板上に形成されたマイク口空間構造パターンま たはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、 前記樹脂プレートの構造 パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、 前記金属 構造体のパターンを転写して樹脂プレートを形成するステップとを備える。
[ 0 0 3 3 ]
本方法により得られるマイクロ流路ぉよびマイクロ容器は、 原盤となる金属 構造体のパターンを転写することにより樹脂プレートを形成するため、 高い寸 法精度と低コストを両立できる。 また、 そのマイクロ流路に、 毛細管現象を利 用して、 細胞接着誘導物質を導入すればよいため、 細胞接着誘導物質を形成す るための複雑なパターンユングプロセスが不要である。
[ 0 0 3 4 ] 詳細には以下の通りである。
(i) 基板上への第 1レジスト層の形成
(ii) 基板とマスク Aとの位置合わせ
(iii) マスク Aを用いた第 1レジスト層の露光
(iv) 第 1レジスト層の熱処理
(v) 第 1レジスト層上への第 2レジスト層の形成
(vi) 基板とマスク Bとの位置合わせ
(vii) マスク Bを用いた第 2レジスト層の露光
(viii) 第 2レジスト層の熱処理
(ix) レジスト層の現像
を行い、 所望のレジストパターンを形成する。
(X) さらに、 形成されたレジストパターンを導電化処理した後、 形成されたレ ジストパターンにしたがって、 基板上に金属構造体をメツキにより堆積させる。
(xi) この金属構造体を型として、 樹脂成形品を形成する
ことによって、 細胞培養容器が製造される。 （V) 〜 （viii) の工程は任意であ り、 省略できる。 一方、 （V) 〜 （vi i i) の工程を複数回繰り返すこともできる。
[ 0 0 3 5 ]
レジストパターン形成処理についてさらに詳細に説明する。 基板上に、 例え ば、 深さ 3 0 μ πιと深さ 1 0 0 μ ΐηの構造体を得ようとした場合、 第 1レジス ト層 （厚さ 7 0 μ πι) 、 第 2レジスト層 （厚さ 3 0 μ ιη) 順に形成し、 各層に 露光、 または露光、 熱処理を行う。 現像工程では、 最初に第 2レジスト層であ る深さ 3◦ μ πιのパターンが得られ、 次に第 1レジスト層と第 2レジスト層を 合わせた深さ 1 0 0 μ πιのパターンが得られる。 深さ 1 0 0 mのパターンが 得られた時点で、 第 2レジスト層である深さ 3 0 μ πιのパターンを現像液に溶 解、 または変形させないためには、 各層の現像液への溶解性を制御させること が要求される。
[ 0 0 3 6 ]
光分解型のポジ型レジストを用いて、 耐アルカリ性を発現させる方法の一つ として、 ベーク時間 （溶剤の乾燥時間） を長くし、 レジストを硬化させること があげられる。 通常、 レジストは膜厚、 シンナー等の溶剤濃度および感度に応 じてベータ時間を設定している。 この時間を長くすることによって耐ァルカリ 性を持たせることができる。 また、 第 1レジスト層のベータが進行しすぎると、 レジストが極度に硬化し、 後の現像において光が照射された部分を溶解させパ ターンを形成することが困難になることから、 ベーク時間を短くする等、 適宜 選択することが好ましい。 ベータに用いる装置は、 溶剤を乾燥できれば特に限 定されるものではなく、 オーブン、 ホットプレート、 熱風乾燥機等があげられ る。 光架橋型のネガ型レジストと比較して、 耐アルカリ性の発現幅は制限され るため、 設定するレジスト厚さは、 各層を合わせて 5〜2 0 0 μ ιηの範囲内が 好ましく、 1 0〜1 0 0 /z mの範囲内であることがより好ましい。
[ 0 0 3 7 ]
光架橋型のネガ型レジストを用いて耐ァルカリ性を発現させる方法として、 ベーク時間の最適化の他に、 架橋密度の最適化があげられる。 通常、 ネガ型レ ジストの架橋密度は、 露光量によって設定することができる。 化学増幅系ネガ 型レジストの場合、 露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定すること ができる。 この露光量、 または熱処理時間を長くすることによって、 耐ァルカ リ性を発現させることができる。 光架橋型のネガ型レジストの場合、 設定する レジスト厚さは、 各層を合わせて 5〜5 0 0 μ πιの範囲内が好ましく、 1 0〜 3 0 0 μ ηιの範囲内であることがより好ましい。
[ 0 0 3 8 ]
(i) 基板 1 1上への第 1レジスト層 1 2の形成について説明する。
図 3 Aに基板 1 1上に第 1レジスト層 1 2が形成された状態を示す。 成形品 形成ステップで得られる樹脂製細胞容器の平面度は、 基板 1 1上へ第 1 レジス ト層 1 2を形成する工程で決定づけられる。 すなわち、 基板上に第 1レジスト 層を形成した時点の平面度が金属構造体、 ひいては細胞培養容器の平面度に反 映される。
[ 0 0 3 9 ] 基板 1 1上に第 1 レジスト層 1 2を形成する方法は何ら限定されないが、 一 般的にスピンコート方式、 デイツビング方式、 ロール方式、 ドライフィルムレ ジストの貼り合わせ等を拳げることができる。 なかでも、 スピンコート方式は、 回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、 直径 3 0 O mmを超 えるガラス基板にレジストを高い平面度で塗布する利点がある。 従って、 高い 平面度を実現できる観点から、 スビンコ一ト方式が好ましい。
[ 0 0 4 0 ]
第 1レジスト層 1 2として用いられるレジストは、 ポジ型レジスト、 ネガ型 レジストのいずれもでもよい。 いずれの場合も、 レジストの感度、 露光条件に より、 レジストの焦点深度が変わる。 そのため、 例えば、 U V露光装置を用い た場合、 露光時間、 U V出力値をレジスト厚さ、 感度に応じて種類を選択する のが好ましい。
[ 0 0 4 1 ]
第 1レジスト層 1 2として用いるレジストがウエットレジストの場合、 例え ば、 スピンコート方式で所定のレジスト厚さを得る方法としては、 スピンコー ト回転数の変更や粘度調整による方法がある。 スピンコート回転数の変更によ る方法は、 スピンコーターの回転数を適宜設定することによつて所望のレジス ト厚さを得るものである。 粘度調整による方法は、 レジスト厚さが厚い場合や 塗布面積が大きい場合に、 平面度が低下することが懸念されるため、 実際使用 上で要求される平面度に応じて粘度を調整するものである。
[ 0 0 4 2 ]
例えばスピンコート方式の場合、 1回で塗布するレジスト層の厚さは、 高い 平面度を保持することを考慮し、 好ましくは 1 0〜 5 0 μ πι、 さらに好ましく は、 2 0〜 5 0 の範囲内であることが好ましい。 高い平面度を保持したう えで、 所望のレジスト層の厚さを得るためには、 レジスト層を複数回に分けて 形成することができる。
[ 0 0 4 3 ]
第 1レジスト層 1 2にポジ型レジストを用いた場合、 ベータ時間 （溶剤の乾 9414
15 燥） が過度に進行しすぎると、 レジストが極度に硬化し、 後の現像においてパ ターンを形成することが困難になることから、 設定するレジスト厚さ力 0 0 m以上でない場合、 ベーク時間を短くする等、 適宜選択することが好ましい。
[ 0 0 4 4 ]
(ii) 基板 1 1とマスク A 1 3との位置合わせについて説明する。
第 1レジスト層 1 2のパターンと、 第 2レジスト層 1 4のパターンにおける 位置関係を所望の設計通りにするためには、 マスク A 1 3を用いた露光時に、 正確な位置合わせを行うことが必要となる。 位置合わせには、 基板とマスク A の同位置に切削加工を施しピン固定する方法、 レーザー干渉計を用い位置だし する方法、 基板 1 1とマスク A 1 3の同位置に位置マークを作製、 光学顕微鏡 で位置合わせをする方法等があげられる。 光学顕微鏡で位置合わせをする方法 は、 例えば、 フォトリソグラフ法にて基板に位置マークを作製し、 マスク Aに はレーザー描画装置で位置マークを描画する。 光学顕微鏡を用いた手動操作に おいても、 5 111以内の精度が簡単に得られる点で有効である。
[ 0 0 4 5 ]
(iii) マスク A 1 3を用いた第 1 レジスト層 1 2の露光について説明する。
図 3 Bに示される工程で用いるマスク A 1 3は何ら限定されないが、 ェマル ジョンマスク、 ク口ムマスク等を挙げることが出来る。 レジストパターン形成 ステップでは、 用いるマスク A 1 3によって寸法、 および精度が左右される。 そして、 その寸法、 および精度は、 樹脂製細胞培養容器にも反映される。 した がって、 樹脂製細胞培養容器の各寸法、 および精度を所定のものとするために は、 マスク A 1 3の寸法、 および精度を規定する必要がある。 マスク A 1 3の 精度を高める方法は何ら限定されないが、 例えば、 マスク A 1 3のパターン形 成に用いるレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることがで きるが、 設備費用が高額であり、 マスク A 1 3製作費が高額となるため、 樹脂 製細胞培養容器が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。
[ 0 0 4 6 ]
マスク A 1 3の材質は温度膨張係数、 U V透過吸収性能の面から石英ガラス が好ましいが比較的高価であるため、 樹脂成形品が実用的に要求される精度に 応じて適宜規定するのが好ましい。 設計通りの所望の深さまたは高さが異なる 構造体、 あるいは、 第 1レジストパターンと第 2レジストパターンが異なる構 造体を得るには、 第 1 レジスト層 1 2および第 2レジスト層 1 4の露光に用い るマスクのパターン設計 （透過 Z遮光部） が確実であることが必要であり、 C A E解析ソフトを用いたシミュレーションもその解決策の一つである。
[ 0 0 4 7 ]
露光に用いられる光源は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であ ることが好ましい。 シンクロ トロン放射光は、 設備費用が高額であり、 実質的 に樹脂プレートの価格が高額となるものの、 露光深度が深いものを得たい場合 などに用いることができる。
[ 0 0 4 8 ]
露光時間や露光強度等の露光条件は第 1 レジスト層 1 2の材質、 厚み等によ り変化するため、 得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。 特 に空間構造パターンの寸法、 および精度に影響を与えるため、 露光条件の調節 は重要である。 また、 レジストの種類により焦点深度が変わるため、 例えば U V露光装置を用いた場合、 露光時間、 U V出力値をレジストの厚さ、 感度に応 じて選択するのが好ましい。
[ 0 0 4 9 ]
(iv) 第 1レジスト層 1 2の熱処理について説明する。
露光後の熱処理は、 レジストパターンの形状を補正するためにァニールとい われる熱処理が知られている。 ここでは、 化学架橋を目的とし、 化学増幅系ネ ガレジストを用いた場合のみに行う。 化学増幅系ネガレジストとは、 主に、 2 成分系または 3成分系からなり、 露光時の光によって、 例えば、 化学構造の末 端のエポキシ基が開環し、 熱処理によって架橋反応させるものである。 熱処理 時間は、 例えば膜厚 1 0 0 mの場合、 設定温度 1 0 0 °Cの条件下においては 数分で架橋反応は進行する。
[ 0 0 5 0 ] 第 1レジスト層 1 2の熱処理が進行しすぎると、 後の現像において未架橋部 分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、 設定するレジス ト厚さが 1 0 0 A m以上でない場合、 熱処理時間を短くする、 または後の第 2 レジスト層 1 4の熱処理のみとする等、 適宜選択することが好ましい。
[ 0 0 5 1 ]
(V) 第 1レジスト層 1 2上への第 2レジスト層 1 4の形成について説明する。 図 3 Cに第 2レジスト層 1 4が形成された状態を示す。 この第 2レジスト層 1 4の形成は、 上記 (i) において説明した第 1レジスト層 1 2の形成と同様の 方法による。 また、 スピンコート方式にて、 ポジ型レジストを使用してレジス ト層を形成する場合、 ベータ時間を通常の 1 . 5〜2 . 0倍程度とすることで、 耐アルカリ性を発現させることができる。 これにより、 第 1レジス ト層 1 2と 第 2レジスト層 1 4の現像終了時、 第 2レジスト層 1 4のレジストパターンの 溶解、 または変形を防止することができる。
[ 0 0 5 2 ]
(vi) 基板 1とマスク B 1 5との位置合わせについて説明する。
基板 1とマスク B 1 5との位置合わせは、 上記 （ii) について説明した、 基 板 1とマスク A 1 3との位置合わせと同様の方法による。
[ 0 0 5 3 ]
(vii) マスク B 1 5を用いた第 2レジスト層 1 4の露光について説明する。
マスク B 1 5を用いた第 2レジスト層 1 4の露光は、 上記 (iii) において説 明したマスク A 1 3を用いた第 1 レジスト層 1 2の露光と同様の方法による。 図 3 Dに第 2レジスト層 1 4の露光の様子を示す。
[ 0 0 5 4 ]
(viii) 第 2レジスト層 1 4の熱処理について説明する。
第 2レジスト層 1 4の熱処理は、 上記 （iv) において説明した第 1レジス ト 層 1 2の熱処理と同様の方法による。 また、 第 2レジス ト層 1 4の熱処理は、 後の現像において第 1レジスト層 1 2のパターンが得られた時点で、 第 2レジ スト層 1 4のパターンが溶解、 または変形させないために行う。 熱処理によつ て化学架橋が進行し、 架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。 耐ァ ルカリ性を発現させるための熱処理時間は、 通常の 1 . 1〜2 . 0倍の範囲か らレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい。
[ 0 0 5 5 ]
(ix) レジスト層 1 2および 1 4の現像について説明する。
図 3 Eに示す現像工程では、 用いたレジストに対応する所定の現像液を用い ることが好ましい。 現像時間、 現像温度、 現像液濃度等の現像条件はレジスト 厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。 例えば、 必要な深 さを得るために現像時間を長くしすぎると、 所定の寸法よりも大きくなつてし まうため、 適宜条件を設定することが好ましい。 この現像工程により、 レジス トパターン 1 6が形成される。
[ 0 0 5 6 ]
細胞培養容器の上面、 または微細パターン底部の平面精度を高める方法とし ては、 例えば、 レジスト塗布で用いるレジスト種類 （ネガ型、 ポジ型） を変更す る方法、 金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。
[ 0 0 5 7 ]
なお、 所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、 それ ら複数のレジスト層を同時に露光 '現像処理する、 あるいは、 一つのレジスト 層を形成および露光処理した後、 さらにレジスト層の形成および露光処理を行 レ、、 2つのレジスト層を同時に現像処理することができる。
[ 0 0 5 8 ]
(X) 金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。
金属構造体形成ステツプとはレジストパターン形成ステップで得られたレジ ストパターン 1 6に沿って金属を堆積させ、 金属構造体 1 8のマイクロ空間構 造面をレジストパターン 1 6に沿って形成することにより、 金属構造体 1 8を 得る工程である。
[ 0 0 5 9 ]
図 3 Fに示すように、 この工程では予めレジストパターン 1 6に沿って導電 T/JP2007/059414
19
性膜 1 7を形成する。 導電性膜 1 7の形成方法は、 特には限定されないが、 好 ましくは、 真空蒸着法、 スパッタリング法等による。 導電性膜 1 7に用いられ る導電性材料としては金、 銀、 白金、 銅、 アルミニウムなどを挙げることがで きる。
[ 0 0 6 0 ]
図 3 Gに示すように、 導電性膜 1 7を形成した後、 レジストパターン 1 6に 沿って金属をメツキにより堆積させ、 金属構造体 1 8を形成する。 メツキ方法 は特に限定されないが、 例えば電解メツキ、 無電解メツキ等を拳げることがで きる。 用いられる金属は特に限定されないが、 ニッケル、 ニッケル一コバルト 合金、 銅、 金を挙げることができ、 経済性'耐久性の観点からニッケルが好ま しく用いられる。
[ 0 0 6 1 ]
金属構造体 1 8はその表面状態に応じて研磨しても構わない。 ただし、 汚れ が造形物に付着することが懸念されるため、 研磨後、 超音波洗浄を実施するこ とが好ましい。 また、 金属構造体 1 8はその表面状態を改善するために、 離型 剤等で表面処理しても構わない。 なお、 金属構造体 1 8の深さ方向の傾斜角度 は、 樹脂成形品の形状から 5 0 ° 〜9 0 ° であることが望ましく、 より望まし くは 6 0 ° 〜8 7 ° である。 メツキにより堆積した金属構造体 1 8はレジスト パターン 1 6から分離される。
[ 0 0 6 2 ]
(xi) 成形品形成ステップについて詳細に説明する。
成形品形成ステップは、 図 3 Hに示すように、 前記金属構造体 1 8を型とし て、 樹脂成形品 1 9を形成する工程である。 樹脂成形品 1 9の形成方法は特に 限定されないが、 例えば射出成形、 プレス成形、 モノマーキャスト成形、 溶剤 キャスト成形、 押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、 生産性、 型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。 所定の寸法を選択した金 属構造体 1 8を型として射出成形で樹脂成形品 1 9を形成する場合、 金属構造 体 1 8の形状を高い転写率で樹脂成形品 1 9に再現することができる。 転写率 TJP20 7/059414
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を確認する方法としては、 光学顕微鏡、 走査電子顕微鏡 (SEM) 、 透過電子 顕微鏡 (TEM) 等を用いる方法がある。
[0063]
樹脂成形品 1 9の平面度の最小値は、 工業的に再現し易い観点から 1 以 上であることが好ましい。 樹脂成形品 1 9の平面度の最大値は、 例えば、 該成 形品に反り等が発生して光学系ュニットと接触しない等、 支障とならない観点 から 200 111以下であることが好ましい。 樹脂成形品の造形部に対する寸法 精度は、 工業的に再現し易い観点から ±0. 5〜10%の範囲内であることが 好ましい。
[0064]
以下に、 本発明にかかる実施例および比較例を示す。 これらの実施例および 比較例は、 細胞培養容器のマイクロ流路の寸法を変量し、 ラット脳海馬神経細 胞および褐色細胞腫 (PC 12) のネットワーク構築度合および細胞興奮性を 評価したものである。 光学物性値である全光透過率およびヘイズ値は、 株式会 社スガ試験機製の可視光線透過率計 （型式： HA— TR) を用いて測定した。 具体的には、 全光線透過率を J I S K6 7 14に準拠した方法で 2回測定し、 その平均値を求めた。 また、 蒸着膜の厚さは、 株式会社アルバック製の表面形 状測定器 (DEKTAK3030) による触針法にて測定した。
[0065]
細胞接着誘導物質の導入方法は以下の通りである。 比較例の場合、 細胞を培 養する面を細胞接着誘導物質含有液に浸した後、 6時間乾燥した。 実施例の場 合、 ピペットを用いて細胞接着誘導物質含有液を導入領域 5に滴下し、 毛細管 現象により、 マイクロ流路およびマイクロ容器の側壁、 低部のみに導入した後、 6時間乾燥した。 細胞接着誘導物質含有液は、 脳海馬神経細胞ではポリリジン +ラミニン、 褐色細胞腫ではコラーゲン Iを用いた。
[0066]
散布した細胞数は、 いずれの細胞も 2. 0 X 104個とした。 脳海馬神経細胞 では、 細胞散布後 10日間培養した。 PC 1 2細胞では、 細胞散布 2日後に神 経成長因子を添加し、 その後 10日間培養した。
[0067]
細胞のネットワーク構築度合は、 株式会社ニコン製の倒立顕微鏡 （TE 20 00-PF S) を用いて観察した。 ネットワーク構築度合を、 〇 （ネットヮー ク構築） 、 △ (一部構築） 、 X (ランダムネットワーク） に分類し、 評価した。
[0068]
細胞のネットワーク構築における活動状態 （細胞興奮性） については、 Do j i n d o社の C a 2 +感受性蛍光色素 （型式： F 1 u o -4) を用いて細胞内 C a 2+動態を測定 '解析した。 解析には、 浜松ホトニクス株式会社製のレシオ イメージングシステム （AQUACO SMO S/RAT I O) を用い、 ネット ワークにおける染色性の違いにより、 0、 1 +〜 4+の等級に分類し、 評価を 行った。
[0069]
[比較例 1 ]
市販の滅菌済みのポリスチレン製シャーレ （φ 90mm—深さ 20mm) を 用いた。
光学物性値は、 全光線透過率 84%、 ヘイズ値 4. 3%であった。
[0070]
[比較例 2 ]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂 （パラペット GH— S) を用い、 スタンパ 一を使用した射出成形法により、 図 4Aに示す、 幅 24mm、 長さ 74mm、 厚さ 1. 0 mmの樹脂プレート上に、 図 4 Bおよび （c) に示す縦 '横 50 m、 深さ 30 μπιの複数のマイクロ容器 4を有するプレートを作製した。 マイ クロ容器 4同士の間隔は縦.横いずれも 15 μπιである。 図 4Bは、 図 4 Aに おける点線で示した円内の拡大図であって、 比較例 2にかかる細胞培養容器の 構成を模式的に示す平面図である。 図 4 Cは図 4 Bの断面図である。
次に、 マイクロ容器への気泡混入を防止するため、 株式会社アルバック製の 蒸着装置 （UEP) を用い、 厚さ 0. 2 の酸化ケィ素 （S i〇2) 膜を形成 7059414
22 した。 その後、 滅菌した。
光学物性値は、 全光線透過率 83%、 ヘイズ値 8. 2%であった。
[0071]
[実施例 1 ]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂 （パラペット GH— S) を用い、 スタンパ 一を使用した射出成形法により、 図 5Aに示す、 幅 24mm、 長さ 74mm、 厚さ 1. Ommの樹脂プレート上に、 図 5 Bおよび （c) に示す、 幅 20 μπι、 深さ 30 μπι、 縦横いずれも間隔 （凸部 3の幅） 180 μπιのマイクロ流路 1 および細胞接着誘導物質含有液の直径 4mmの導入領域 5を 2つ有するプレー トを作製した。 導入領域 5はマイクロ流路 1よりも一段低く、 凹部となってい る。 図 5Bは、 図 5 Aにおける点線で示した円内の拡大図であって、 実施例 1 にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図である。 図 5 Cは図 5 Bの 断面図である。
次に、 マイクロ流路 1への気泡混入を防止するため、 株式会社アルバック (型式： UEP) の蒸着装置を用い、 厚さ 0. 3 mの酸化ケィ素 （S i〇2) 膜を形成した。 その後、 滅菌した。
光学物性値は、 全光線透過率 87%、 ヘイズ値 9. 7%であった。
[0072]
[実施例 2 ]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂 （パラペット GH—S) を用い、 スタンパ 一を使用した射出成形法により、 図 6 Aに示す、 幅 24mm、 長さ 74mm、 厚さ 1. Ommの樹脂プレート上に、 図 6 Bおよび （c) に示す、 幅 20 μ m、 深さ 50 μιη、 縦横いずれも間隔 （凸部 3の幅） 280 μιηのマイクロ流路 1 および細胞接着誘導物質含有液の直径 4 mmの導入領域 5を 2つ有するプレー トを作製した。 導入領域 5はマイクロ流路 1よりも一段低く、 凹部となってい る。 また、 2つの導入領域 5を中心に凹部が十字状に形成され、 細胞接着誘導 物質含有液がプレート全体に充満しやすくなつている。 図 6 Bは、 図 6 Aにお ける点線で示した円内の拡大図であって、 実施例 2にかかる細胞培養容器の構 成を模式的に示す平面図である。 図 6 Cは図 6 Bの断面図である。
次に、 マイクロ流路 1への気泡混入を防止するため、 株式会社アルバック (型式： UEP) の蒸着装置を用い、 厚さ 0. 3 μπιの酸化ケィ素 （S i〇2) 膜を形成した。 その後、 滅菌した。
光学物性値は、 全光線透過率 88%、 ヘイズ値 5. 2%であった。
[0073]
[実施例 3 ]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂 （パラペット GH—S) を用い、 スタンパ 一を使用した射出成形法により、 図 7Aに示す、 幅 24mm、 長さ 74mm、 厚さ 1. 0 mmの樹脂プレート上に、 図 7 Bおよび （c) に示す、 幅 25 μ m、 深さ 50 μπι、 縦横いずれも間隔 （凸部 3の幅） 275 μπιのマイクロ流路 1 および細胞接着誘導物質含有液の 4 mm X 20 mmの導入領域 5を 2つ有する プレートを作製した。 導入領域 5はマイクロ流路 1よりも一段低く、 凹部とな つている。 図 7Bは、 図 7 Aにおける点線で示した円内の拡大図であって、 実 施例 3にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図である。 図 7 Cは図 7 Bの断面図である。
次に、 マイクロ流路 1への気泡混入を防止するため、 株式会社アルバック (型式： UEP) の蒸着装置を用い、 厚さ 0. 3 /zmの酸化ケィ素 （S i〇2) 膜を形成した。 その後、 滅菌した。
光学物性値は、 全光線透過率 89%、 ヘイズ値 4. 2%であった。
[0074]
[実施例 4 ]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂 （パラペット GH— S) を用い、 スタンパ 一を使用した射出成形法により、 図 8 Aに示す、 幅 24mm、 長さ 74mm、 厚さ 1. 0 mmの樹脂プレート上に、 図 8 Bおよび （c) に示す、 幅 1 0 μ m、 深さ 30 μπι、 縦横いずれも間隔 （凸部 3の幅） 1 90 μπιのマイクロ流路 1 および細胞接着誘導物質含有液の直径 10 mmの導入領域 5を 1つ有し、 さら に、 マイクロ流路 1の交差部 2に直径 40 μπι、 深さ 20 μπιのマイクロ容器 4を有するプレートを作製した。 導入領域 5はマイクロ流路 1よりも一段低く 凹部となっている。 また、 導入領域 5を中心に凹部が十字状に形成され、 細胞 接着誘導物質含有液がプレート全体に充満しやすくなつている。 図 8 Bは、 図 8 Aにおける点線で示した円内の拡大図であって、 実施例 4にかかる細胞培養 容器の構成を模式的に示す平面図である。 図 8 Cは図 8 Bの V I I I C-V I I I C断面図、 図 8Dは図 8 Bの V I I I D— V I I I D断面図である。 図 8 Dに示すように、 マイクロ容器 4は、 マイクロ流路 1の下側に位置するため、 細胞接着誘導物質含有液はマイク口容器 4へ容易に導入される。
次に、 マイクロ流路 1への気泡混入を防止するため、 株式会社アルバック (型式： UEP) の蒸着装置を用い、 厚さ 0. 3 μπιの酸化ケィ素 （S i〇2) 膜を形成した。 その後、 滅菌した。
光学物性値は、 全光線透過率 89%、 ヘイズ値 6. 5%であった。
[0075]
以上の比較例および実施例についての、 ラット脳海馬神経細胞および褐色細 胞腫 （PC 1 2) の培養結果を表 1にまとめて示す。
[0076]
[表 1]
Figure imgf000026_0001
[0077]
マイクロ流路 1を有さない比較例の場合、 細胞は規則性のあるネットワーク を構築できなかった。 また、 ネットワーク径が細いため、 細胞興奮性も、 実施 例と比較して低い。 マイクロ容器 4のみを備える比較例 2では、 細胞接着誘導 物質が培養面全体に被覆された結果、 細胞がマイク口容器の壁を乗り越えて、 ランダムにネットワークを形成した。 図 9に、 比較例 2の細胞培養容器で 1 0 日間培養後の褐色細胞腫 （P C 1 2 ) の顕微鏡観察写真を示す。
[ 0 0 7 8 ]
一方、 実施例では、 マイクロ流路 1を有することで、 毛細管現象により、 マ イクロ流路 1のみに細胞接着誘導物質含有液が導入されたため、 細胞が、 マイ クロ流路 1の壁を乗り越えることなく、 高度にネットワークを形成できる。 マ イクロ流路 1の深さは、 実施例 2の 3 0 μ πιよりも深くすることで、 確実に流 路のみに細胞接着誘導物質を導入でき、 より完成度の高いネットワークを構築 できる。 また、 ネットワーク径が太くなるため、 細胞興奮性も、 比較例に比べ 高い。 また、 実施例は、 透明性、 ネットワーク構築および細胞興奮性すべてに おいて優れており、 透過光での細胞観察用途に特に適している。 図 1 0に、 実 施例 1の細胞培養容器で 1 0日間培養後の褐色細胞腫 （P C 1 2 ) について、 顕微鏡観察写真 （図 1 0 A) および細胞内蛍光プローブによる C a 2 +由来の蛍 光イメージ （図 1 0 B ) を示す。 産業上の利用可能性
[ 0 0 7 9 ]
本発明は、 例えば、 組織から単離した細胞を培養し、 試験、 検査に用いるた めの細胞培養容器に利用される。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 細胞が培養される面に凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、 前記凹凸パターンの凹部は、 細胞培養部と、 前記細胞培養部に連通したマイ クロ流路とを備え、
前記細胞培養部の底面幅が培養細胞の相当直径の 1. 0倍〜 2 0倍であり、 前記凹部の底面及び側壁上にのみ細胞接着誘導物質が形成された細胞培養容 ¾5。
2. 前記細胞接着誘導物質を前記凹凸パターンの凹部に導入するための、 前記 マイクロ流路の少なくとも 1つと連通する凹部からなる導入領域を備えること を特徴とする請求項 1に記載の細胞培養容器。
3. 前記凹部の底面及び側壁が表面処理をされ、 その上に細胞接着誘導物質が 形成されていることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の細胞培養容器。
4. 前記表面処理は親水化処理であることを特徴とする請求項 3記載の細胞培 容 。
5. 前記側壁の高さが培養細胞の相当直径の 0 . 5倍〜 1 0倍であることを特 徴とする請求項 1〜 4いずれかに記載の細胞培養容器。
6. 前記マイクロ流路の底面幅が培養細胞の相当直径の 0 . 1倍〜 1 0倍であ ることを特徴とする請求項 1〜 5いずれかに記載の細胞培養容器。
7. 少なくとも前記細胞が配置される凹凸パターン領域が透明であることを特 徴とする請求項 1〜 6いずれかに記載の細胞培養容器。
8. 細胞が培養される面に凹凸パターンを有する細胞培養容器の製造方法であ つて、
前記 H0凸パターンの凹部により構成される、 細胞培養部及び前記細胞培養部 に連通したマイク口流路を形成するステップと、
毛細管現象により前記凹部のみに細胞接着誘導物質を導入するステツプとを 備える細胞培養容器の製造方法。
9. 前記凹部を表面処理し、 その上に細胞接着誘導物質を導入することを特徴 とする請求項 8記載の細胞培養容器の製造方法。
10. 前記表面処理は親水化処理であることを特徴とする請求項 9記載の細胞培 養容器の製造方法。
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