JP2005080607A - 細胞培養プレートおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
細胞に培養液を供給する流路と、凹凸パターンを有することで、培養が困難とされる細胞の増殖も可能となり、生体内で持っていた機能と同様の機能を有することによりバイオアッセイ等に好適な細胞培養プレートを提供することが可能である。
【解決手段】
細胞培養プレート３００は、複数の流路３０１、凹凸パターン領域３０２、及び貫通穴３０３を有している。各凹凸パターン領域３０２の間には流路３０１が形成され、流路３０１から培養液が凹凸パターン領域３０２に流入し、もしくは、凹凸パターン領域３０２から流路３０１に流出する。凹凸パターン領域３０２において、凹凸パターンによって、細胞培養空間が形成されている。
【選択図】 図３

Description

本発明は、薬物などの効果判定やその毒性を試験する場合に培養細胞を用いて行うバイオアッセイ法に好適な、細胞培養プレート、および、その製造方法に関するものである。

組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。
単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くは細胞培養の方法により培養皿や試験管のなかで培養が行われている。この培養系のなかで種々の検査が行われる。

これらのアッセイは、通常均一な培養系を設定し、評価する薬物等の量、濃度などを変えてその効果を見るものである。そのため培養に用いる培養器も一定の均一に形成された物が用いられる。この培養器は、培養皿というものが一般的に用いられる。
培養皿として一般的に用いられているものには、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレートがある。
また、最近の微量化への流れから、更に小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。

しかしながら、組織細胞の培養は、従来市販されている細胞培養皿で行うと、細胞が薄く伸びて方向性のない形態を取り、生体内で持っていた機能を示さなくなってしまう問題を有していた。
理由として、１個のウェルプレートは容器形状であるが、数μｍから数１０μｍのサイズである細胞にとっては、平板上での培養と変わらないことが考えられる。
特に、培養が難しい組織細胞、例えば肝細胞等の組織細胞の増殖では、生体内で持っていた機能を持たせることが更に困難となる。

係る問題を解決する方法として、培養プレート上に組織細胞の増殖に適した微細凹凸パターンを形成し、そのプレート上で細胞を培養させることが試みられている。
これは、細胞を微細凹凸パターン上に配し、方向性をもって立体的に細胞を増殖させようとするものである。
しかしながら、この方法は、培養液の鮮度が保たれていないため、細胞の増殖によって生体内で持っていた機能を発揮させるには至っていないのが現状である。

通常、細胞培養は、培養プレートを培養液に浸した状態で１日〜数日間かけて行う。人体が生体中で血液を介して酸素や栄養分を受け取り、老廃物を排出するのと同様、細胞も培養液から酸素や栄養分を受け取り、培養液中に老廃物を排出する。
この老廃物が細胞増殖に影響を与えており、数日間にわたって細胞増殖を行う場合は、複数回の培養液交換を行っているが、その鮮度が変動しているために生体内で持っていた機能を示させるには至っていない。

尚、同一培養プレート内で培養の状況をかえながら、かつ同一の培養環境を保つ方法として、培養領域を変化させることが提案されている（特許文献１を参照）。培養器は、細胞培養領域が任意の率で変化した培養皿が連続して形成されている。培養領域が連続して変化している培養皿とは、たとえば、培養面積１００％、７５％、５０％、２５％、０％の培養皿が連続して形成されているものをいう。これによって、培養環境を変えることなく、培養細胞の細胞数を任意にコントロールでき、この培養プレートを様々な条件でのバイオアッセイに使用する事が可能となる。

特開平１１−１６９１６６号公報

上記したように、従来の細胞培養皿で行うと、細胞が薄く伸びて生体内で持っていた機能を示さない。あるいは、
方向性をもって立体的に細胞を増殖させるため、微細凹凸パターン上で細胞を培養すると、培養液中に老廃物を排出することによって培養液の鮮度が低下し、細胞が生体内で持っていた機能を示さない。

そこで、本発明者らは、上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、細胞に培養液を供給する流路と、細胞培養のための空間構造を形成する凹凸パターンを有するプレートが、バイオアッセイ等に好適な細胞培養プレートであることを見出して本発明を完成した。
すなわち本願発明は、細胞の培養を行う細胞培養プレートであって、培養液および／または試薬が通液する流路と、細胞が配置、培養される空間構造を形成する凹凸パターンとを有することを特徴とする。これにより、効果的に細胞培養を行うことができる。好ましくは、
培養液および／または試薬を混合する混合部をさらに有する。あるいは、電気的細胞融合のための電極を有することが好ましい。これにより、用途に応じた細胞培養プレートを提供することができる。

好ましくは、培養液供給及び集積化の観点から、前記細胞培養プレートの流路の幅が１μｍ〜１０００μｍ、流路の深さが１μｍ〜１０００μｍである。あるいは、細胞培養の観点から、好ましくは、前記細胞培養プレートの凹凸パターンにより形成される細胞が配置、培養される空間構造の高さが３μｍ〜１０００μｍ、幅が３μｍ〜１０００μｍ、奥行が３μｍ〜１０００μｍである。あるいは、好ましくは、前記細胞培養プレートの凹凸パターン内部に、高さが２０ｎｍ〜１００μｍ、幅またはピッチが２０ｎｍ〜１００μｍの凹凸パターンを有する。

好ましくは、前記細胞培養プレートが細胞固定化のための表面処理が施されている。あるいは、前記細胞培養プレートが、複数枚のプレートを積層させた構造であることが好ましい。これにより効率的な細胞培養が可能となる。あるいは、第２の流路をさらに備え、前記流路及び第２の流路は、前記凹凸パターンと連結され、培養液および／または試薬が、前記流路をから、前記凹凸パターンに流入し、培養液および／または試薬が、前記凹凸パターンから、前記第２の流路に流出することが好ましい。これにより、培養液および／または試薬の供給と副生成物などの排出を効果的に行うことができる。

本発明の他の態様は、培養液および／または試薬が通液する流路と、細胞が配置、培養される空間構造を形成する凹凸パターンとを有する細胞培養プレートを製造する方法であって、基板上にレジストパターン形成するステップと、前記基板上に形成された前記レジストパターンもしくはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記細胞培養プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して樹脂成形細胞培養プレートを形成するステップと、を備える。これにより、所望の細胞培養プレートを効果的に製造することができる。

前記基板上にレジストパターンを形成するステップが、レジスト層が所望の高さ、または、深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップを含むことができる。これにより、所望の高さもしくは深さの構造を有する細胞培養プレートを製造することができる。さらに、前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、露光における各層のマスクパターンの位置が同じ位置になるように、マスクパターンの位置を合わせるマスク位置合わせステップをさらに備えることが好ましい。これにより、精度の高い細胞培養プレートを製造することができる。あるいは、前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、各レジスト層に感度の異なるレジストを用いることが好ましい。これによって、レジストパターンをより精度良く形成することができる。

本発明によれば、効果的に細胞培養を行うことができる細胞培養プレート及びその製造方法を提供することができる。

以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細胞培養プレートは、
（ａ）培養液を流すための流路；
（ｂ）細胞を培養するための凹凸パターン；
を有している。図１は本発明による細胞培養プレート１００の構造の一例を示している。細胞培養プレート１００は２つの流路１０１、１０２が合流する混合部１０３を備えている。混合部１０３によって混合された培養液や試薬等の液体は、培養領域に１１０に導入される。培養領域内には、液体が流れる複数の流路１１１と、細胞培養のための空間構造を形成する凹凸パターンからなる培地としての凹凸パターン領域１１２が形成されている。培地内は、凹凸パターンによって培養液が流れる流路が形成される。細胞から副生される生成物などは、流路１２０を通って培養領域１１０から排出される。細胞培養プレート１００はさらに、電気的細胞融合のための電極１３０を有している。

（ａ）培養液を流すための流路について説明する。培養液を流すための流路は、常に新鮮な培養液を細胞に供給することによって、細胞が排出した老廃物による培養液の鮮度低下、ひいては細胞が生体内で持っていた機能を示さなくなることを防止する。
流路の形状は、培養液を供給可能であればどのような形状も可能である。流路の幅、または深さを微細化すれば高密度な細胞培養プレートが可能となるが、培養液の十分な供給量を確保できる目的において、適宜選択することが望ましい。
流路の幅、深さは、培養液が供給可能であり、効率のよい集積化された細胞培養プレートを実現する観点から、１μｍから１０００μｍが好ましく、３μｍから５００μｍが更に好ましい。

培養液を供給するための流路は、培養液の他に試薬等を供給するための流路として使用することができる。あるいは、培養液、または試薬等の流路をそれぞれ別に形成することができる。例えば、図１における流路１０１を培養液が流れ、流路１０２を試薬等が流れることができる。培養液、または試薬等を供給するための流路は、細胞を培養するための凹凸パターンに液体を直接供給することができる。あるいは、図１の混合部１０３のように、細胞培養プレートは、培養液を供給するための流路と試薬等を供給する流路が合流し、培養液や試薬等を混合させるための混合部を有することができる。混合部で混合された混合物は、直接にあるいは流路を介して凹凸パターンに供給される。
細胞を培養するための凹凸パターンに培養液および試薬等を供給することによって、細胞から生成物が副生される。細胞培養プレートは、図１の流路１２０のように、この生成物を回収するための流路を有することができる。

細胞培養プレートは、例えば、図１の流路１１１及び培地としての凹凸パターン領域１１２のように、培養液を供給するための複数の流路を有し、その間に細胞を培養するための凹凸パターンを有する培地を備えることができる。流路から供給された培養液は凹凸パターンの供給口から供給される。
あるいは、細胞培養プレートは、例えば、細胞を培養するための凹凸パターンを有する培地上を培養液が流れる構造を備えることができる。この構造において、流路の幅は、最大値として、細胞培養プレートと等しい幅であることができる。
細胞培養プレート上に細胞を固定化するための表面処理が施すことによって、細胞が培地から流出することを防ぐことができる。
この他、例えば、培養プレートにガラス、またはプラスチック板を重ね合わせることで管状の流路を形成することができる。

（ｂ）細胞を培養するための凹凸パターンについて説明する。細胞を培養するための凹凸パターンは、細胞が薄く伸びて方向性のない形態を取り、生体内で持っていた機能を示さなくなってしまうことを防止し、立体的に細胞を培養することを可能とする。
基板の表面に微細な凹凸パターンを造形し、その空間構造において細胞が増殖する。細胞を増殖させるための空間構造は、ガラス、またはプラスチック板を重ね合わせることで空間構造を形成する構造であってもよい。
凹凸パターンの形状は、細胞を培養する目的に適した形状であればどのような形状も可能である。凹凸パターンの形状は、工業技術、および製作コストの観点から適宜選択することが望ましい。
凹凸パターンの高さ、幅、または奥行の各寸法は、立体的な方向に細胞を培養させる観点から、３μｍ〜１０００μｍが好ましく、５μｍ〜５００μｍが更に好ましい。

細胞を培養するための空間構造において、例えば、空間構造の底部に細胞の増殖を促進するために２０ｎｍから１００μｍの微細凹凸パターンより好ましくは５０ｎｍから５０μｍの微細凹凸パターンを有してもよい。微細凹凸パターンの高さ、幅、またはピッチの各寸法は、工業的に再現しやすい観点から、１μｍから１００μｍであるのが好ましく、３μｍから５０μｍであるのがより好ましい。
また、更に微細な凹凸パターンを、例えば、シリコンのドライエッチングによって造形することにより、例えば細胞から生成される物質などを分子レベルの大小の違いによって分離、抽出することが期待できる。この場合の微細凹凸パターンの高さ、幅、またはピッチは、効率よく分離、抽出を行う観点から２０ｎｍから３μｍが好ましく、５０ｎｍから１μｍがより好ましい。凹凸パターンもしくは微細凹凸パターンの寸法は、その最大寸法を基準とすることができる。

培養プレートに使用される材質は、表面処理の効率から、プラスチック素材が好適であるが、ガラス、シリコン等を用いてもよく、培養細胞に対して毒性を持たず、表面処理可能なものならば、どのようなものでも使用できる。
また、細胞の成長過程を観察していく場合、例えば蛍光顕微鏡を用いて観察するときには透過光観察が可能な透明材料が好ましい。
本発明の細胞培養プレートの製造方法は、所望の形状を有していれば特に限定するものではない。通常想定される製造方法として、例えば、シリコン材料、ガラス材料へのドライエッチング、ウェットエッチング等が想定できる。樹脂材料への成形方法として、例えば、押し出し成形、射出成形、ホットエンボス成形、ナノインプリント成形、ブロー成形、カレンダー成形、キャスト成形、プレス成形等が採用可能である。

本発明の細胞培養プレートは、電気的細胞融合のための電極を有しておいてもよい。電気的細胞融合の目的は、例えば、電気的細胞融合による異なる２種類の細胞の獲得、その副生成物を得ることである。
電極を構成するためには、例えば、細胞培養プレートにマスキングを施し、蒸着法、スパッタ法等により、金、銀、白金、銅、アルミニウム、ＩＴＯなどの導電性膜を堆積させる方法が挙げられる。
本発明の細胞培養プレートを積層させることで、複数の細胞培養を同時に行うことができ、バイオアッセイに好適な培養プレートを効率よく提供することが可能となる。
本発明の細胞培養プレートを積層して使用する際、培養液を供給するための貫通穴などの位置合わせを行うことが必要である。位置合わせには、例えば、細胞培養プレートの共通位置にマーキングを施し、光学顕微鏡、ＣＣＤカメラで位置合わせをする方法、レーザー干渉計を用い位置合わせをする方法等が挙げられる。

本発明の培養プレートには所定の表面処理を施すことができる。細胞の付着を促すための表面処理の方法は、種々の方法が適用できる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射などを用いる方法、細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が挙げられる。また、一部分を被覆しておき、任意の部分を改質することも可能である。
本発明による細胞培養プレートの製造方法の一実施形態について、図２を参照して説明する。本形態の製造方法は、基板上に形成された前記レジストパターンにしたがって金属を付着することによって金属構造体を形成し、形成された金属構造体を使用して樹脂成形品を形成する。本形態の製造方法により得られる細胞培養プレートは、樹脂成形品であるにもかかわらず高い精度などを発揮することができる。また、当該細胞培養プレートの製造方法によれば、精密であると同時に安価に細胞培養プレートを形成することができるため、製造コストを極力抑えられる利点を発揮できるような産業上大量に使用される用途に適用した場合に、特に効果的である。

本形態の細胞培養プレート製造方法は、まず、
所望のレジストパターンを形成する。次に、形成されたレジストパターンにしたがって、基板上に金属構造体をメッキにより堆積させる。この金属構造体を型として、樹脂成形品を形成することによって、細胞培養プレートが製造される。
レジストパターン形成処理について、図２（ａ）−（ｅ）を参照して、更に詳細に説明する。本形態のレジストパターン形成処理は、
（ｉ） 基板上への第１レジスト層の形成
（ｉｉ） 基板と第１マスクとの位置合わせ
（ｉｉｉ） 第１マスクを用いた第１レジスト層の露光
（ｉｖ） 第１レジスト層の熱処理
（ｖ） 第１レジスト層上への第２レジスト層の形成
（ｖｉ） 基板と第２マスクとの位置合わせ
（ｖｉｉ） 第２マスクを用いた第２レジスト層の露光
（ｖｉｉｉ）第２レジスト層の熱処理
（ｉｘ） レジスト層の現像
を行う。

基板上に、例えば、深さ３０μｍと深さ１００μｍの異なるレベルを備える構造体を形成する場合、第１レジスト層（厚さ７０μｍ）、第２レジスト層（厚さ３０μｍ）の順に基板上に形成し、各層の形成時に露光、または露光、熱処理を行う。
現像工程では、最初に第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンが得られ、次に第１レジスト層と第２レジスト層を合わせた深さ１００μｍのパターンが得られる。深さ１００μｍのパターンが得られた時点で、第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液への溶解性を制御させることが要求される。

スピンコート方式によりレジスト層を形成する場合、第２レジスト層のベーク（溶剤の乾燥）時間を調整することによって、耐アルカリ性を発現させることが可能である。例えば、
光分解型のポジ型レジストを用いる場合、ベーク時間（溶剤の乾燥時間）を長くし、レジストを硬化させることによって耐アルカリ性を発現させることができる。通常、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度、および感度に応じてベーク時間を設定している。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることが可能となる。
また、第１レジスト層のベークが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像において光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。
ベークに用いる装置は、溶剤を乾燥できれば特に限定されるものではなく、オーブン、ホットプレート、熱風乾燥機等があげられる。光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐アルカリ性の発現幅は制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜２００μｍの範囲内が好ましく、１０〜１００μｍの範囲内であることがより好ましい。

光架橋型のネガ型レジストを用いる場合、ベーク時間の最適化の他に、架橋密度の最適化によって耐アルカリ性を発現させることができる。通常、ネガ型レジストの架橋密度は、露光量によって設定することが可能である。
化学増幅系ネガ型レジストの場合、露光量および熱処理時間によって設定することが可能である。この露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることが可能となる。
光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜５００μｍの範囲内が好ましく、１０〜３００μｍの範囲内であることがより好ましい。

以下、図２を参照して、本形態の製造方法について具体的に説明する。
（ｉ）基板１上への第１レジスト層２の形成（図２（ａ））について説明する。
成形品形成ステップで得られる細胞培養プレートの平面度は、基板上へ第１レジスト層を形成する工程にて決定づけられる。すなわち、基板上に第１レジスト層を形成した時点の平面度が金属構造体、ひいては細胞培養プレートの平面度に反映される。
基板上に第１レジスト層を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピンコート方式、ディッピング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、直径３００ｍｍを超えるガラス基板にレジストを高い平面度で塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式が好ましく用いられる。

用いられるレジストにはポジ型レジスト、ネガ型レジストの２種類がある。いずれも、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わるため、例えば紫外線露光装置を使用した場合、レジスト厚さ、感度に応じて露光時間、出力値を選択するのが望ましい。
用いるレジストがウェットレジストの場合、例えばスピンコート方式で所定のレジスト厚さを得るには、スピンコート回転数を変更する方法と、粘度調整する方法がある。
スピンコート回転数を変更する方法は、スピンコーターの回転数を設定することによって所望のレジスト厚さを得るものである。粘度調整する方法は、レジスト厚さが厚い場合、又は塗布面積が大きくなると平面度が低下することが懸念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整するものである 。

例えばスピンコート方式の場合、１回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を保持することを考慮し、好ましくは１０〜５０μｍ、さらに好ましくは、２０〜５０μｍの範囲内である。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを得るためには、複数のレジスト層を形成することができる。
第１レジスト層にポジ型レジストを使用した場合、ベーク時間（溶剤の乾燥）が過度に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。

（ｉｉ）基板とマスク３との位置合わせについて説明する。
第１レジスト層２のパターンと、第２レジスト層４のパターンにおける位置関係を所望の設計通りにするためには、第１マスク３を用いた露光時に、正確な位置合わせを行うことが必要となる。
位置合わせには、基板１と第１マスク３の同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板１と第１マスク３の同位置に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。
光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板に位置マークを作製し、マスク３にはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、５μｍ以内の精度が簡単に得られる点で有効である。

（ｉｉｉ）第１マスク３を用いた第１レジスト層２の露光について説明する。図２（ｂ）に示される工程で使用する第１マスク３は何ら限定されないが、エマルジョンマスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、使用するマスクによって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および精度は、樹脂成形品にも反映される。したがって、ナノ、マイクロ構造細胞培養プレートの各寸法、および精度を所定のものとするためには、マスクの寸法、および精度を規定する必要がある。マスクの精度を高める方法は何ら限定しないが、例えば、マスクのパターン形成に使用する光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができるが、設備費用が高額であり、マスク製作費が高額となるため、ナノ、マイクロ構造細胞培養プレートが実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが望ましい。
マスクの材質は温度膨張係数、紫外線透過吸収性能の面から石英ガラスが好ましいが、比較的高価であるため、樹脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが望ましい。
設計通りの所望の深さ、または高さが異なる構造体、または第１レジストパターンと第２レジストパターンが異なる構造体を得るには、１レジスト層、および第２レジスト層の露光に用いるマスクのパターン設計（透過／遮光部）が確実であることが必要であり、ＣＡＥ解析ソフトを使用したシミュレーションもその解決策の一つである。

露光に用いられる光源としては、設備費用が安価である紫外線ランプまたはレーザー光源であることが好ましい。シンクロトロン放射光は露光深度が深いものの、設備費用が高額であり、実質的にナノ、マイクロ構造細胞培養プレートの価格が高額となるため工業的に実用的でない場合が多いが、１００ｎｍ以下の特に微細なパターンが必要な場合には有効である。
露光時間や露光強度等の露光条件はレジスト層２の材質、厚み等により変化するため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に流路の幅、深さ、容器間隔、および容器幅（または直径）、深さ等のパターンの寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジストの種類により焦点深度が変わるため、例えば紫外線露光装置を使用した場合、露光時間、出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが望ましい。

（ｉｖ）第１レジスト層２の熱処理について説明する。露光後の熱処理は、レジストパターンの形状を補正するためにアニールといわれる熱処理が知られている。
ここでは、化学架橋を目的とし、化学増幅系ネガレジストを使用した場合のみに行う。化学増幅系ネガレジストは、主に、２成分系、または３成分系からなり、露光時の光によって、例えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応する。熱処理時間については、例えば膜厚１００μｍの場合、設定温度１００℃の条件下において、数分で架橋反応は進行する。
第１レジスト層の熱処理が進行しすぎると、後の現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後の第２レジスト層の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ましい。

（ｖ）第１レジスト層２上への第２レジスト層４の形成（図２（ｃ））について説明する。（ｉ）について説明したことに加え、以下の点を記す。
スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベーク時間を通常の１．５〜２．０倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる。これにより、第１レジスト層と第２レジスト層の現像終了時、第２レジスト層のレジストパターンの溶解、または変形を防止することができる。

（ｖｉ）基板と第２マスク５との位置合わせについて説明する。（ｉｉ）について説明したことと同様の要領にて、位置合わせを実施する。
（ｖｉｉ）マスクＢを用いた第２レジスト層の露光（図２（ｄ））について説明する。（ｉｉｉ）について説明したことと同様の要領にて、露光を実施する。
（ｖｉｉｉ）第２レジスト層４の熱処理について説明する。（ｉｖ）について説明したことに加え、以下の点を記す。
第２レジスト層４の熱処理は、後の現像において第１レジスト層２のパターンが得られた時点で、第２レジスト層４のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の１．１〜２．０倍の範囲からレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい。

（ｉｘ）レジスト層の現像について説明する。図２（ｅ）に示される工程の現像は、用いたレジストに対応する所定の現像液を用いることが好ましい。現像時間、現像温度、現像液濃度等の現像条件は、レジスト厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、除去部が所定の寸法よりも大きくなってしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。
レジスト層全体の厚みが増してくると、現像工程において、レジスト底部の幅（または直径）よりも表面の幅（または直径）が広くなることが懸念される。レジストを複数層形成する場合、各レジスト層の形成において、感度の異なるレジストを段階に分けて形成することが好ましい場合がある。この場合には、例えば、表面に近い層のレジストの感度を底部に近い層よりも高くすることなどが挙げられる。具体的には、感度の高いレジストとして東京応化工業株式会社製のＢＭＲ Ｃ−１０００ＰＭを、そして感度の低いレジストとして東京応化工業株式会社製のＰＭＥＲ−Ｎ−ＣＡ３０００ＰＭを用いることができる。その他、レジストの乾燥時間を変えることにより感度を調整するようにしてもよい。例えば、東京応化工業株式会社製のＢＭＲ Ｃ−１０００ＰＭを使用した場合、スピンコート後のレジスト乾燥時、１層目の乾燥時間を１１０℃で４０分、２層目の乾燥時間を１１０℃で２０分とすることで、１層目の感度を高めることができる。

成形品の上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては、例えば、レジスト塗布で使用するレジスト種類（ネガ型、ポジ型）を変更する方法、金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。

なお、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、複数のレジスト層を同時に露光・現像処理する、あるいは、本形態のように一つのレジスト層を形成及び露光処理した後、さらにレジスト層の形成及び露光処理を行い、２つのレジスト層を同時に現像処理することが可能である。

金属構造体形成ステップについて、図２（ｆ）、（ｇ）を参照して、さらに詳細に説明する。金属構造体形成ステップは、レジストパターン形成ステップで得られたレジストパターンに沿って金属を堆積させ、金属構造体の凹凸面をレジストパターンに沿って形成することにより、金属構造体を得る工程である。
図２（ｆ）に示されるように、この工程では予めレジストパターンに沿って導電性膜７を形成する。導電性膜７の形成方法は特に限定されないが、好ましくは蒸着、スパッタリング等を用いることができる。導電性膜に用いられる導電性材料としては金、銀、白金、銅、アルミニウム、ニッケルなどを挙げることができる。
図２（ｇ）に示されるように、導電性膜を形成した後、パターンに沿って金属をメッキにより堆積して金属構造体を形成する。金属を堆積させるメッキ方法は特に限定されないが、例えば電解メッキ、無電解メッキ等を挙げることができる。用いられる金属は特に限定されないが、ニッケル、ニッケル-コバルト合金、銅、金を挙げることができ、経済性・耐久性の観点からニッケルが好ましく用いられる。
メッキにより堆積した金属構造体はレジストパターンから分離される。

金属構造体はその表面状態に応じて研磨してもよい。ただし、汚れが造形物に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。また、金属構造体はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理してもよい。なお、金属構造体の深さ方向の傾斜角度は、樹脂成形品の形状から５０°〜９０°であることが望ましく、より望ましくは６０°〜８７°である。研磨は、レジストパターンから分離する前に行っても良いし、分離後に行っても良い。

成形品形成ステップについて更に詳細に説明する。成形品形成ステップは、図２（ｈ）に示されるように、金属構造体８を型として、樹脂成形品９を形成する工程である。樹脂成形品の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体を型として射出成形で樹脂成形品を形成する場合、金属構造体の形状を高い転写率で樹脂成形品に再現することが可能である。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）等を使用して行うことができる。

金属構造体を型として、例えば射出成形で樹脂成形品を形成する場合、１枚の金属構造体で１万枚〜５万枚、場合によっては２０万枚もの樹脂成形品を得ることができ、金属構造体の製作にかかる費用負担を大幅に解消することが可能である。また、射出成形１サイクルに必要な時間は５秒〜３０秒と短く、生産性の面で極めて効率的である。射出成形１サイクルで同時に複数個の樹脂成形品を形成可能な成形金型を使用すれば、更に生産性を向上することが可能となる。上記成形方法では金属構造体を金属型として用いても、金属構造体を予め用意した金属型内部にセットして用いても構わない。

樹脂成形品を形成するのに使用する樹脂材料としては特に限定されないが、例えば、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコン樹脂等を挙げることができる。
これらの樹脂は必要に応じて滑剤、光安定剤、熱安定剤、防曇剤、顔料、難燃剤、帯電防止剤、離型剤、ブロッキング防止剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤などの１種または２種以上を含有することができる。

樹脂成形品の平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から１μｍ以上であることが好ましい。樹脂成形品の平面度の最大値は、例えば、該成形品を他の基板と貼り合わせ、または重ね合わせて使用する際に支障とならない観点から２００μｍ以下であることが好ましい。樹脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から±０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。
樹脂成形品の厚さに対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から±０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。樹脂成形品の厚さは特に規定されないが、射出成形での取り出し時の破損、取り扱い時の破損、変形、歪みを考慮し、０．２〜１０ｍｍの範囲内であることが好ましい。樹脂成形品の寸法は特に限定されないが、リソグラフィー法でレジストパターンを形成する際、例えば、レジスト層の形成をスピンコート法にて行う場合、直径４００ｍｍの範囲の中から採取できるよう用途に応じて適宜選択することが好ましい。

本発明の培養プレート及びその製造方法の実施例を説明する。以下において、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
図２（ａ）を参照して、基板上に、有機材料（東京応化工業製「ＰＭＥＲ Ｎ-ＣＡ３０００ＰＭ」）をベースとする１回目のレジスト塗布を行った。
そして、図２（ｂ）を参照して、第１レジスト層を形成した後、基板と所望のマスクパターンに加工した第１マスクとの位置合わせを行った。

次に紫外線露光装置（キャノン製「ＰＬＡ−５０１Ｆ」波長３６５ｎｍ、露光量３００ｍＪ／ｃｍ^２）により、第１レジスト層を紫外線により露光を行った後、ホットプレート（１００℃×４分）を用いて第１レジスト層の熱処理を行った。
図２（ｃ）を参照して、基板上に、有機材料（東京応化工業製「ＰＭＥＲ Ｎ-ＣＡ３０００ＰＭ」）をベースとする２回目のレジスト塗布を行った。
そして、図２（ｄ）を参照して、第２レジスト層を形成した後、基板と所望のマスクパターンに加工した第２マスクとの位置合わせを行った。
次に紫外線露光装置（キャノン製「ＰＬＡ−５０１Ｆ」波長３６５ｎｍ、露光量１００ｍＪ／ｃｍ^２）により、第２レジスト層の紫外線露光を行った後、ホットプレート（１００℃×８分）を用いて第２レジスト層の熱処理を行った。

図２（ｅ）に示すように、前記レジスト層を有する基板を現像し、基板上にレジストパターンを形成した（現像液：東京応化工業製「ＰＭＥＲ現像液Ｐ-７Ｇ」）。
そして、図２（ｆ）に示すように、レジストパターンを有する基板表面に真空蒸着を行い、レジストパターンの表面に銀からなる導電性膜を堆積させた。
次に、図２（ｇ）に示すように、レジストパターンを有する基板をニッケルメッキ液に浸け、電気メッキを行い、レジストパターンを転写した金属構造体（以下、ニッケル構造体）を得た。最後に、
図２（ｈ）に示すように、得られたニッケル構造体を金型に装着し、射出成形でニッケル構造体のパターンを転写し、プラスチック成形体を得た。

＜細胞培養プレート１＞
図２に示す成形品を形成する方法に従って、レジスト塗布を２回繰り返して第１レジスト層を形成、露光、熱処理を実施、さらにレジスト塗布を１回行って第２レジスト層を形成、露光、熱処理を実施した後、図３に示すような細胞培養プレート３００を製造した。細胞培養プレート３００は、横３０ｍｍ×縦１４．４ｍｍ、厚さ１．３ｍｍの基板に、複数の流路３０１、凹凸パターン領域３０２、及び貫通穴３０３を有している。図３においては、一部の流路及び凹凸パターン領域のみに符号が付されている。各凹凸パターン領域３０２の間には流路３０１が形成され、流路３０１から培養液が凹凸パターン領域３０２に流入し、もしくは、凹凸パターン領域３０２から流路３０１に流出する。

凹凸パターン領域３０２において、凹凸パターンによって、細胞培養空間及び流路が形成されている。凹凸パターン領域３０２内には、規則的に配置された複数の凸部が形成され、凸部間に形成されたギャップを介して培養液が流れることができる。一方の貫通孔３０３から流入した培養液は、流路３０３及び凹凸パターン領域３０２を流れて、もう一方の貫通孔３０３から排出される。これによって、新しい培養液を供給し、又、副生成物を排出することができる。各流路３０１は、その幅４００μｍ、長さ１２０００μｍ、深さ６０μｍの寸法を有している。凹凸パターン領域３０２は、幅６００μｍ、長さ１２０００μｍの寸法を有している。凹凸パターン領域３０２は、４０μｍの開通口（凸部間ギャップ）と、６０μｍ高さ、１６０μｍの幅、１６０μｍの奥行を有する直方体状の空間構造とを備える。凸部間ピッチは２００μｍである。

＜細胞培養プレート２＞
図２に示す成形品を形成する方法に従って、レジスト塗布を２回繰り返して第１レジスト層を形成、露光、熱処理を実施、さらにレジスト塗布を１回行って第２レジスト層を形成、露光、熱処理を実施した後、図４に示すような細胞培養プレート４００を製造した。細胞培養プレート４００は、横３０ｍｍ×縦１４．４ｍｍ、厚さ１．３ｍｍの基板に、複数の流路４０１、凹凸パターン領域４０２、及び貫通穴４０３を有している。図４においては、一部の流路及び凹凸パターン領域のみが符号が付されている。各流路４０１は、幅４００μｍ、長さ１２０００μｍ、深さ７０μｍの寸法を有している。凹凸パターン領域４０２において、凹凸パターンによって、細胞培養空間（ブロック）及び流路が形成されている。凹凸パターン領域４０２には複数の凸部が形成され、凸部間のギャップを介して培養液が流れることができる。凹凸パターン領域４０２は、幅６００μｍ、長さ１２０００μｍ寸法を有している。さらに、８０μｍの開通口と、２０μｍ高さを有する凹凸パターンを備える。凹凸パターン領域４０２の長手方向、小口方向における凸部間ピッチは２００μｍである。凹凸パターン領域４０２は、さらに、高さ２０μｍ、幅１６０μｍ、奥行１６０μｍの直方体状の空間構造を備える。

＜細胞培養プレート３＞
図２に示す成形品を形成する方法に従って、レジスト塗布を２回繰り返して第１レジスト層を形成、露光、熱処理を実施、さらにレジスト塗布を１回行って第２レジスト層を形成、露光、熱処理を実施した後、図５に示すような細胞培養プレート５００を製造した。細胞培養プレート５００は、横３０ｍｍ×縦１４．４ｍｍ、厚さ１．３ｍｍの基板に、流路５０１、凹凸パターン領域５０２、培養液を循環させるための複数の貫通穴５０３を備えている。流路５０１の幅は１２４００μｍ、深さは７０μｍである。凹凸パターン領域５０１には、開通口４０μｍ、４０μｍ高さの凹凸パターンが形成されている。凹凸パターン領域５０２内のパターン形状は、図３に示した構造と実質的に同一である。

＜細胞培養プレート４＞
図２に示す成形品を形成する方法に従って、レジスト塗布を２回繰り返して第１レジスト層を形成、露光、熱処理を実施、さらにレジスト塗布を１回行って第２レジスト層を形成、露光、熱処理を実施した後、図６に示すような細胞培養プレート６００を製造した。細胞培養プレート６００は、横３７ｍｍ×縦１４．４ｍｍ、厚さ１．３ｍｍの基板に、流路６０１−６０３、凹凸パターン領域６０４、培養液を循環させるための貫通穴６０５を備えている。流路６０１、６０２は、幅１２４００μｍ、深さ７０μｍの寸法を備える。凹凸パターン領域６０４は、開通口４０μｍ、４０μｍ高さの凹凸パターンを備える。凹凸パターン領域６０４内のパターン形状は、図３に示した構造と実質的に同一である。

［細胞培養プレート１〜４の調製］
アクリル製細胞培養プレート１〜４を用い、エタノール及び純水で超音波洗浄を行い十分に乾燥させた。次に細胞の付着を促すコラーゲンを塗布して、細胞を培養するためのプレートを作製した。
［比較用培養プレートＡ、Ｂの調整］
ポリスチレンで成形された２４ウェルプレートを有する培養プレートＡ、ポリスチレンで成形された１５３６ウェルプレートを有する培養プレートＢを用い、ガンマ線滅菌を行った。次に細胞の付着を促すコラーゲンを塗布して細胞を培養するためのプレートを作製した。

［培養プレート上の細胞培養環境］
ラットの骨髄とニワトリ胚心臓から分離培養したラット骨髄間質細胞とニワトリ胚線繊芽細胞を、細胞培養プレート１〜４の凹凸パターン領域、および比較用培養プレートＡ、Ｂのウェル上に配置した。
細胞培養プレートは、培養液に浸すともにアクリル製プレートを重ね合わせ、貫通穴により培養液を循環させた。比較用培養プレートはシャーレの培養液に浸して、細胞の分化・増殖に最適な培養の環境比較を行った。

［培養プレート上の細胞培養比較］
３日間の細胞培養試験を行い、細胞培養プレートは常に新鮮な培養液を供給可能であるため、培養液の交換は行わなかった。比較用培養プレートＡおよびＢは、２日目に培養液の交換を行った。
比較用細胞培養プレートＡでは、平板上で細胞培養を行うため、細胞が薄く伸びて方向性のない形態をとり、生体内で持っていた機能を示していないと推察された。
比較用細胞培養プレートＢでは、ウェルプレートサイズが小さいため、微細凹凸パターンで細胞を培養した効果が期待されたが、細胞は薄くのびて方向性のない形態となった。細胞の培養が難しいとされる、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞では細胞から排出される老廃物によって培養液のＰＨが変化するなどして、細胞の生存環境に影響を与えていたと推測する。

一方、細胞培養プレート１〜４では、方向性を有した形態で細胞を培養することに成功した。ラット骨髄間質細胞は、凹凸パターンエリア内で立体的に増殖することが確認された。ニワトリ胚線維芽細胞は、凹凸パターンの壁に沿って立体的に増殖することが確認され、骨髄間質細胞と線維芽細胞とでは異なる動きで細胞が増殖することが判明した。キーエンス社製の蛍光バイオ顕微鏡（型式：ＶＢ）を用いて、実施例２における細胞増殖の結果を示す写真を図７に示す。これは、それぞれの細胞が分化、増殖により組織を形成したことを示すものである。尚、図７において、表示内容を明確にするため、格子状に配置された凹凸パターンの壁は、細胞増殖の結果を示す写真に後から合成により追加されている。また、本例において、凹凸パターンの壁の幅（図７における壁の短方向）は約４０μｍ、壁によって規定される一つの空間の幅は約１６０μｍであった。それに対し、比較用培養プレートＡおよびＢでは、上記のような写真を得ることができず、それはいずれも組織を形成できなかったことを示している。このことは、細胞の成長が難しいとされる細胞も、老廃物を取り除くことによって、立体空間で培養することができることを意味しており、本願発明の培養プレートが、各種細胞の分化、増殖、遊走などを研究することができる培養プレートとして有用であることを示している。

本形態の細胞培養プレートにより、培養が困難とされる細胞の増殖も可能となり、生体内で持っていた機能と同様の機能を有することにより薬物のバイオアッセイ等に好適な培養プレートを提供できる。さらに具体的には、細胞に培養液を供給する流路によって、細胞培地には新鮮な培養液が供給されると同時に、細胞から排出される老廃物を取り除くことができ、培養プレートが生体内で持っている機能を示すことが可能となる。

本発明に係る細胞培養プレートの一例を示す構造図である。 本発明に係る細胞培養プレートの製造工程を示す模式図である。 本発明に係る細胞培養プレートの一実施例の構造を示す構成図である。 本発明に係る細胞培養プレートの一実施例の構造を示す構成図である。 本発明に係る細胞培養プレートの一実施例の構造を示す構成図である。 本発明に係る細胞培養プレートの一実施例の構造を示す構成図である。 本発明に係る細胞培養プレートによる細胞増殖の結果を示す写真である。

符号の説明

１ 基板、２ 第１レジスト層、３ 第１マスク、４ 第２レジスト層、５ 第２マスク、６ レジストパターン、７ 導電性膜、８ 金属構造体、９ 細胞培養プレート、１００ 培養プレート、１０１、１０２ 流路、１０３ 混合部、１１０ 培養領域に、１１１ 流路、１１２ 凹凸パターン領域、１２０ 流路、１３０ 電極、３００、４００、５００、６００ 細胞培養プレート、３０１、４０１、５０１、６０１、６０２、６０３ 流路、３０２、４０２、５０２、６０４ 凹凸パターン領域、３０３、４０３、５０３、６０５ 貫通孔

Claims (14)

1. 細胞の培養を行う細胞培養プレートであって、
   培養液および／または試薬が通液する流路と、
   細胞が配置、培養される空間構造を形成する凹凸パターンと、
   を有することを特徴とする細胞培養プレート。
2. 培養液および／または試薬を混合する混合部をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養プレート。
3. 電気的細胞融合のための電極をさらに有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養プレート。
4. 前記細胞培養プレートの流路の幅が１μｍ〜１０００μｍ、流路の深さが１μｍ〜１０００μｍであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞培養プレート。
5. 前記細胞培養プレートの凹凸パターンにより形成される細胞が配置、培養される空間構造の高さが３μｍ〜１０００μｍ、幅が３μｍ〜１０００μｍ、奥行が３μｍ〜１０００μｍであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞培養プレート。
6. 前記細胞培養プレートの凹凸パターン内部に、高さが２０ｎｍ〜１００μｍ、幅またはピッチが２０ｎｍ〜１００μｍの凹凸パターンを有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞培養プレート。
7. 前記細胞培養プレートが細胞固定化のための表面処理が施されていること特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞培養プレート。
8. 前記細胞培養プレートが樹脂成形品であることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞培養プレート。
9. 前記細胞培養プレートが、複数枚のプレートを積層させた構造であることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞培養プレート。
10. 第２の流路をさらに備え、
    前記流路及び第２の流路は、前記凹凸パターンと連結され、
    培養液および／または試薬が、前記流路をから、前記凹凸パターンに流入し、
    培養液および／または試薬が、前記凹凸パターンから、前記第２の流路に流出する、
    請求項１に記載の細胞培養プレート。
11. 培養液および／または試薬が通液する流路、並びに、細胞が配置、培養される空間構造を形成する凹凸パターンを有する細胞培養プレートの製造方法であって、
    基板上にレジストパターンを形成するステップと、
    前記基板上に形成されたレジストパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記細胞培養プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、
    前記金属構造体のパターンを転写して樹脂成形細胞培養プレートを形成するステップと、
    を備えた細胞培養プレートの製造方法。
12. 前記基板上にレジストパターンを形成するステップが、レジスト層が所望の高さ、または、深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップを含むことを特徴とする請求項１１記載の細胞培養プレートの製造方法。
13. 前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、露光における各層のマスクパターンの位置が同じ位置になるように、マスクパターンの位置を合わせるマスク位置合わせステップをさらに備えることを特徴とする請求項１２記載の細胞培養プレートの製造方法。
14. 前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、各レジスト層に感度の異なるレジストを用いることを特徴とする請求項１２記載の細胞培養プレートの製造方法。

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