JP4806576B2 - 細胞培養容器、その製造方法および細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養容器、その製造方法および細胞培養方法に関する。

組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。

単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿や試験管のなかで細胞培養が行われる。この培養細胞を用いて、種々の検査が行われる。細胞培養試験に用いられる細胞培養株には、生体内での試験いわゆるin vivo試験と同様の薬剤感受性、毒性反応を示すことが要求される。また、細胞培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、細胞の生存率および増殖速度の向上が望まれている。

上記細胞培養試験は、同一条件下、評価する薬物等の量、濃度などを変量し、その効果を測定するものである。そのため、細胞培養容器の材質、形状等も同一にする必要がある。この細胞培養容器としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等が一般的に用いられる。ウェルプレートには、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレートまたはシャーレがある。これらは、一般に、プレート全体の大きさはほぼ同じであり、ウェル数が大きくなるほど、1ウェルのサイズが小さくなる。この1ウェルが１培養皿に相当する。また、特許文献１に示されるように、最近の微量化への流れから、さらに小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。
特開平１１−１６９１６６号公報

しかしながら、組織細胞の培養に、従来の細胞培養容器を用いると、細胞が薄く伸びて方向性のない形態となり、生体内での細胞機能を再現できないという問題点があった。これは、ウェルサイズが小口径したとはいえ、数μｍから数１０μｍのサイズである細胞にとっては、平板上での培養と変わらないためと考えられる。

本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであり、細胞の培養密度を高め、生体内での細胞機能を再現することができる細胞培養容器およびその製造方法を提供することを目的とする。

本発明にかかる細胞培養容器は、細胞が培養される面に、幅または直径５μｍ〜１０００μｍ、深さ５μｍ〜１０００μｍの複数のマイクロ容器を備え、３ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２〜２０ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２の培養密度を達成しうるものである。

本発明にかかる細胞培養方法は、細胞が培養される面に、幅または直径５μｍ〜１０００μｍ、深さ５μｍ〜１０００μｍの複数のマイクロ容器を備えた細胞培養容器を用い、３ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２〜２０ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２の培養密度を達成しうるものである。

本発明にかかる細胞培養容器の製造方法は、基板上にパターンを形成するステップと、前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して細胞培養容器を形成するステップとを備えたものである。

本発明によれば、細胞の培養密度を高め、生体内での細胞機能を再現することができる細胞培養容器およびその製造方法を提供することができる。

本発明者らは、鋭意研究した結果、プレート、シャーレ等の細胞培養容器において、細胞が培養される面に所望の寸法のマイクロ容器を形成することにより、細胞の培養密度を高め、生体内での細胞機能を再現するのに最適な細胞培養容器を提供できることを見出した。以下に、本発明の実施の形態について説明する。

通常、in vivo試験は、ラット等の実験動物を用い、薬剤等に対する毒性判定を行っている。実験動物を用いた試験は、試験結果の信頼性が高いが、実験動物を用いることによるコストおよび倫理的な問題が指摘されている。このため、細胞培養容器を用いたin vitro試験において、in vivo試験結果を再現できるような細胞培養形態が望まれている。

平板上での培養と比較し、マイクロ容器を有する細胞培養容器で培養することにより、細胞が薄く伸びて方向性のない形態となることが防止できる。マイクロ容器内に配置された細胞は、その中で立体的に増殖し、容器の深さが深ければ、多層化した状態となる。また、平板上での培養と比較し、増殖速度も速くなる。

実施の形態
実施の形態にかかる細胞培養容器の構成について図１（ａ）および図１（ｂ）を用いて説明する。図１（ａ）は、実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。

細胞培養容器には、図１（ａ）に示すように、複数のマイクロ容器を構成する凹凸パターンが形成されている。凹凸パターンは、図１（ｂ）に示すように、２段の階段状に形成されている。すなわち、細胞培養容器の細胞を培養する面に、格子状に形成された第１の凸部２と、その上に形成された直方体状の第２の凸部３からなる２段の凸部４が形成されている。この２段の凸部４により形成される空間がマイクロ容器１である。すなわち、マイクロ容器１は、第１の凸部２により完全に囲まれた凹部と第２の凸部３により形成される凹部とからなる。第１の凸部２の側壁５および第２の凸部３の側壁６は底面に対して略垂直に形成されている。

第１の凸部２は、図１（ａ）に示すように矩形状のマイクロ容器１の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第２の凸部３は、隣接するマイクロ容器１の間の第１の凸部２の上に島状に配置されている。第２の凸部３は、矩形状のマイクロ容器１の四辺のそれぞれに設けられている。そのため、マイクロ容器１は完全には仕切られておらず、矩形状のマイクロ容器１の４つの頂点部分において、隣接するマイクロ容器１と連通している。なお、凹凸パターンは２段以上の階段状でもよく、また、１段でもよい。

マイクロ容器の幅または直径は、５〜１０００μｍが好ましく１０μｍ〜６００μｍがより好ましい。実施の形態の場合、マイクロ容器１の幅は対向する第２の凸部３の間隔に相当する。なお、マイクロ容器は矩形状に限らず、円形状およびそれらの複合形状であってもよい。また、側壁は傾斜していてもよく、段階状であってもよい。側壁が傾斜しているまたは階段状である場合、マイクロ容器の幅とは対向する側壁の間隔の最も広い部分を言う。容器幅または直径が５μｍより小さくなると、細胞を配置できる数が少なくなり、培養に必要な細胞密度を得ることが困難となる。１０００μｍより大きくなると、平板上での培養と同様、細胞が薄く伸びて方向性のない形態となり、培養に必要な細胞密度を得ることが困難となる。

マイクロ容器の深さは、５〜１０００μｍが好ましい。マイクロ容器の深さが５μｍよりも浅いと、細胞が多層化することができなくなり、培養密度が低下するとともに、培養速度も低下する。マイクロ容器深さが１０００μｍよりも深くなると、培養細胞の多層化が進行することで、最表層の細胞から遠い内部の細胞は、培養液の供給が遮断され、細胞から排出される老廃物の置換ができなくなるため、細胞死を発生させる結果となる。なお、マイクロ容器の深さとは、底面を基準とした側壁の高さとも言える。実施の形態の場合、マイクロ容器の深さは、２段の凸部４の高さに相当する。

平板よりも高い培養密度を実現するためには、細胞の培養密度が、３ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２〜２０ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２であることが好ましく、４ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２〜１５ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２であることがより好ましい。３ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２以下になると、平板上の培養密度と同等となり、培養速度も低下する。２０ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２以上になると、培養細胞の多層化により、内側の細胞への培養液の供給が困難となり、細胞死の発生が懸念される。

培養するために散布する細胞の密度は、８ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２以下、好ましくは６ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２以下であることが好ましい。細胞培養株は極めて高額であるため、散布する細胞の密度は低いほど良い。他方、散布する細胞の密度が低くなると、培養速度が遅くなる。このため、細胞形態の観察、薬剤感受性試験等の目的用途に応じて、散布する細胞の密度を設定することが望ましい。本発明にかかる細胞培養容器は、マイクロ容器を有することにより、散布する細胞の密度が比較的低い場合にも、培養密度を高めることができるものである。

細胞密度が増すことにより、細胞培養容器内での試験に加え、細胞を溶解または剥離して、比色試験等に用いることも可能となる。また、細胞培養試験に用いられる細胞株は、極めて高額である。通常の平板上での培養と比較し、数倍の培養密度が得られることで、細胞株購入費用を低減でき、実験効率向上も可能となる。

マイクロ容器間の間隔は、可能な限り近接することが、細胞数を増すうえで好ましいが、マイクロ容器間の間隔が狭くなることにより、工業的な微細加工が難しくなり、高コストとなるため、必要とする用途に応じて選択することが望ましい。

透過光観察を可能にするため、樹脂プレートをガラスプレートと同等の光透過率とするには、紫外線領域を含む波長３００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率を８０％以上、ヘイズ値を１０％以内とすることが好ましい。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、紫外線吸収剤が含まれないアクリル樹脂を用いるか、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有さない材料を選択する必要がある。また、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物には、紫外線吸収剤が含まれていない必要がある。

蛍光観察法では、蛍光色素を光らせるための光（励起光）は、細胞培養容器を透過しなければ、それにより発生した蛍光（蛍光放射光）を識別できない。したがって、高い光透過性が要求される。蛍光（蛍光放射光）を識別するために必要な透明性は、可視光の全光線透過率８０％以上、ヘイズ値１０％以内とする必要がある。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、例えば、ポリメチルメタクリレート等の光学特性に優れる材料を用いることが好ましく、結晶性樹脂であるポリオレフィン系樹脂を用いる場合は、非結晶状態で用いることが好ましい。

自家蛍光とは、ポリマー分子が紫外・可視光を吸収した後、光を放出して自ら蛍光を発することをいう。ガラスプレートは自家蛍光を発しないのに対し、樹脂プレートの多くは自家蛍光するため、サンプルから発生した蛍光（蛍光放射光）を識別できなくなり、蛍光分析の特徴である微量分析が困難となる。

自家蛍光の影響を受けないためには、波長２３０ｎｍ〜８００ｎｍの光を照射することで自家蛍光しないことが要求される。そのため、細胞培養容器には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。また、自家蛍光の可能性を極力排除するため、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物は、できる限り少量とするか、添加しないことが好ましい。

微分干渉観察法のコントラストを低下させずに、偏光顕微鏡や微分干渉顕微鏡により観察するために、光学ひずみの小さい材料が要求される。そのため、細胞培養容器には、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。

細胞培養容器に有機膜または無機膜を被覆することで、親水化または疎水化することができる。これにより、微細な突起への気泡の付着防止や細胞の接着度合いを制御することができる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を用いる方法、細胞の接着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法がある。また、一部分をマスクすることにより、他の部分のみを有機膜または無機膜により被覆することもできる。これにより、培養試験条件の幅をさらに広くすることができる。

スパッタリング法、蒸着法等の無機膜形成法は、油浸レンズ観察法への適用もできる。通常、油浸レンズに用いるオイルには、細胞を培養するガラスプレートおよび光学レンズと光学物性を適合させるため、有機溶剤が配合されている。有機溶剤は、樹脂製細胞培養容器に浸透し、白化や溶解の問題を発生させるため、適用できない可能性がある。無機材料は、ガスバリヤー効果と同時に、耐有機溶剤性を有するため、油浸レンズのオイルが接触する細胞培養容器の底面に、無機膜を形成することで、油浸レンズ観察法への適用も可能となり、樹脂製細胞培養容器の適用範囲を広げることができる。透過光観察を行う場合、膜厚を４００ｎｍ以下とするか、ＳｉＯ_２等の透明無機材料を用いることが好ましい。

上記の複数のマイクロ容器を有する樹脂製の細胞培養容器の製造方法について説明する。この製造方法は、基板上にマイクロ容器に相当するマイクロ空間構造を形成するステップと、基板上に形成されたマイクロ空間構造パターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して樹脂プレートを形成するステップとを備える。

詳細には以下の通りである。
（i）基板上への第１レジスト層の形成
（ii）基板とマスクＡとの位置合わせ
（iii）マスクＡを用いた第１レジスト層の露光
（iv）第１レジスト層の熱処理
（v）第１レジスト層上への第２レジスト層の形成
（vi）基板とマスクＢとの位置合わせ
（vii）マスクＢを用いた第２レジスト層の露光
（viii）第２レジスト層の熱処理
（ix）レジスト層の現像
を行い、所望のレジストパターンを形成する。
（x）さらに、形成されたレジストパターンを導電化処理した後、形成されたレジストパターンにしたがって、基板上に金属構造体をメッキにより堆積させる。
（xi）この金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する
ことによって、細胞培養容器が製造される。
（v）〜（viii）の工程は任意であり、省略できる。一方、（v）〜（viii）の工程を複数回繰り返すこともできる。

レジストパターン形成処理についてさらに詳細に説明する。
基板上に、例えば、深さ３０μｍと深さ１００μｍの構造体を得ようとした場合、第１レジスト層（厚さ７０μｍ）、第２レジスト層（厚さ３０μｍ）順に形成し、各層に露光、または露光、熱処理を行う。現像工程では、最初に第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンが得られ、次に第１レジスト層と第２レジスト層を合わせた深さ１００μｍのパターンが得られる。深さ１００μｍのパターンが得られた時点で、第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液への溶解性を制御させることが要求される。

光分解型のポジ型レジストを用いて、耐アルカリ性を発現させる方法の一つとして、ベーク時間（溶剤の乾燥時間）を長くし、レジストを硬化させることがあげられる。通常、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度および感度に応じてベーク時間を設定している。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることができる。また、第１レジスト層のベークが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像において光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。ベークに用いる装置は、溶剤を乾燥できれば特に限定されるものではなく、オーブン、ホットプレート、熱風乾燥機等があげられる。光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐アルカリ性の発現幅は制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜２００μｍの範囲内が好ましく、１０〜１００μｍの範囲内であることがより好ましい。

光架橋型のネガ型レジストを用いて耐アルカリ性を発現させる方法として、ベーク時間の最適化の他に、架橋密度の最適化があげられる。通常、ネガ型レジストの架橋密度は、露光量によって設定することができる。化学増幅系ネガ型レジストの場合、露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定することができる。この露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることができる。光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜５００μｍの範囲内が好ましく、１０〜３００μｍの範囲内であることがより好ましい。

（i）基板１１上への第１レジスト層１２の形成について説明する。
図２（ａ）に基板１１上に第１レジスト層１２が形成された状態を示す。成形品形成ステップで得られる樹脂製細胞容器の平面度は、基板１１上へ第１レジスト層１２を形成する工程で決定づけられる。すなわち、基板上に第１レジスト層を形成した時点の平面度が金属構造体、ひいては細胞培養容器の平面度に反映される。

基板１１上に第１レジスト層１２を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピンコート方式、ディッピング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、直径３００ｍｍを超えるガラス基板にレジストを高い平面度で塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式が好ましい。

第１レジスト層１２として用いられるレジストは、ポジ型レジスト、ネガ型レジストのいずれもでもよい。いずれの場合も、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わる。そのため、例えば、ＵＶ露光装置を用いた場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジスト厚さ、感度に応じて種類を選択するのが好ましい。

第１レジスト層１２として用いるレジストがウェットレジストの場合、例えば、スピンコート方式で所定のレジスト厚さを得る方法としては、スピンコート回転数の変更や粘度調整による方法がある。スピンコート回転数の変更による方法は、スピンコーターの回転数を適宜設定することによって所望のレジスト厚さを得るものである。粘度調整による方法は、レジスト厚さが厚い場合や塗布面積が大きい場合に、平面度が低下することが懸念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整するものである。

例えばスピンコート方式の場合、１回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を保持することを考慮し、好ましくは１０〜５０μｍ、さらに好ましくは、２０〜５０μｍの範囲内であることが好ましい。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを得るためには、レジスト層を複数回に分けて形成することができる。

第１レジスト層１２にポジ型レジストを用いた場合、ベーク時間（溶剤の乾燥）が過度に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。

（ii）基板１１とマスクＡ１３との位置合わせについて説明する。
第１レジスト層１２のパターンと、第２レジスト層１４のパターンにおける位置関係を所望の設計通りにするためには、マスクＡ１３を用いた露光時に、正確な位置合わせを行うことが必要となる。位置合わせには、基板とマスクＡの同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板１１とマスクＡ１３の同位置に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板に位置マークを作製し、マスクＡにはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、５μｍ以内の精度が簡単に得られる点で有効である。

（iii）マスクＡ１３を用いた第１レジスト層１２の露光について説明する。
図２（ｂ）に示される工程で用いるマスクＡ１３は何ら限定されないが、エマルジョンマスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、用いるマスクＡ１３によって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および精度は、樹脂製細胞培養容器にも反映される。したがって、樹脂製細胞培養容器の各寸法、および精度を所定のものとするためには、マスクＡ１３の寸法、および精度を規定する必要がある。マスクＡ１３の精度を高める方法は何ら限定されないが、例えば、マスクＡ１３のパターン形成に用いるレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができるが、設備費用が高額であり、マスクＡ１３製作費が高額となるため、樹脂製細胞培養容器が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。

マスクＡ１３の材質は温度膨張係数、ＵＶ透過吸収性能の面から石英ガラスが好ましいが比較的高価であるため、樹脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。設計通りの所望の深さまたは高さが異なる構造体、あるいは、第１レジストパターンと第２レジストパターンが異なる構造体を得るには、第１レジスト層１２および第２レジスト層１４の露光に用いるマスクのパターン設計（透過／遮光部）が確実であることが必要であり、ＣＡＥ解析ソフトを用いたシミュレーションもその解決策の一つである。

露光に用いられる光源は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であることが好ましい。シンクロトロン放射光は、設備費用が高額であり、実質的に樹脂プレートの価格が高額となるものの、露光深度が深いものを得たい場合などに用いることができる。

露光時間や露光強度等の露光条件は第1レジスト層１２の材質、厚み等により変化するため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に空間構造パターンの寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジストの種類により焦点深度が変わるため、例えばＵＶ露光装置を用いた場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが好ましい。

（iv）第１レジスト層１２の熱処理について説明する。
露光後の熱処理は、レジストパターンの形状を補正するためにアニールといわれる熱処理が知られている。ここでは、化学架橋を目的とし、化学増幅系ネガレジストを用いた場合のみに行う。化学増幅系ネガレジストとは、主に、２成分系または３成分系からなり、露光時の光によって、例えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応させるものである。熱処理時間は、例えば膜厚１００μｍの場合、設定温度１００℃の条件下においては数分で架橋反応は進行する。

第１レジスト層１２の熱処理が進行しすぎると、後の現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後の第２レジスト層１４の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ましい。

（v）第１レジスト層１２上への第２レジスト層１４の形成について説明する。
図２（ｃ）に第２レジスト層１４が形成された状態を示す。この第２レジスト層１４の形成は、上記（i）において説明した第１レジスト層１２の形成と同様の方法による。また、スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベーク時間を通常の１．５〜２．０倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる。これにより、第１レジスト層１２と第２レジスト層１４の現像終了時、第２レジスト層１４のレジストパターンの溶解、または変形を防止することができる。

（vi）基板１とマスクＢ１５との位置合わせについて説明する。基板１とマスクＢ１５との位置合わせは、上記（ii）について説明した、基板１とマスクＡ１３との位置合わせと同様の方法による。

（vii）マスクＢ１５を用いた第２レジスト層１４の露光について説明する。マスクＢ１５を用いた第２レジスト層１４の露光は、上記（iii）において説明したマスクＡ１３を用いた第１レジスト層１２の露光と同様の方法による。図２（ｄ）に第２レジスト層１４の露光の様子を示す。

（viii）第２レジスト層１４の熱処理について説明する。第２レジスト層１４の熱処理は、上記（iv）において説明した第１レジスト層１２の熱処理と同様の方法による。また、第２レジスト層１４の熱処理は、後の現像において第１レジスト層１２のパターンが得られた時点で、第２レジスト層１４のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の１．１〜２．０倍の範囲からレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい。

（ix）レジスト層１２および１４の現像について説明する。図２（ｅ）に示す現像工程では、用いたレジストに対応する所定の現像液を用いることが好ましい。現像時間、現像温度、現像液濃度等の現像条件はレジスト厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、所定の寸法よりも大きくなってしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。この現像工程により、レジストパターン１６が形成される。

細胞培養容器の上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては、例えば、レジスト塗布で用いるレジスト種類（ネガ型、ポジ型）を変更する方法、金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。

なお、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、それら複数のレジスト層を同時に露光・現像処理する、あるいは、一つのレジスト層を形成および露光処理した後、さらにレジスト層の形成および露光処理を行い、２つのレジスト層を同時に現像処理することができる。

（x）金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。
金属構造体形成ステップとはレジストパターン形成ステップで得られたレジストパターン１６に沿って金属を堆積させ、金属構造体１８のマイクロ空間構造面をレジストパターン１６に沿って形成することにより、金属構造体１８を得る工程である。

図２（ｆ）に示すように、この工程では予めレジストパターン１６に沿って導電性膜１７を形成する。導電性膜１７の形成方法は、特には限定されないが、好ましくは、真空蒸着法、スパッタリング法等による。導電性膜１７に用いられる導電性材料としては金、銀、白金、銅、アルミニウムなどを挙げることができる。

図２（ｇ）に示すように、導電性膜１７を形成した後、レジストパターン１６に沿って金属をメッキにより堆積させ、金属構造体１８を形成する。メッキ方法は特に限定されないが、例えば電解メッキ、無電解メッキ等を挙げることができる。用いられる金属は特に限定されないが、ニッケル、ニッケル−コバルト合金、銅、金を挙げることができ、経済性・耐久性の観点からニッケルが好ましく用いられる。

金属構造体１８はその表面状態に応じて研磨しても構わない。ただし、汚れが造形物に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。また、金属構造体１８はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理しても構わない。なお、金属構造体１８の深さ方向の傾斜角度は、樹脂成形品の形状から５０°〜９０°であることが望ましく、より望ましくは６０°〜８７°である。メッキにより堆積した金属構造体１８はレジストパターン１６から分離される。

（xi）成形品形成ステップについて詳細に説明する。
成形品形成ステップは、図２（ｈ）に示すように、前記金属構造体１８を型として、樹脂成形品１９を形成する工程である。樹脂成形品１９の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体１８を型として射出成形で樹脂成形品１９を形成する場合、金属構造体１８の形状を高い転写率で樹脂成形品１９に再現することができる。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）等を用いる方法がある。

樹脂成形品１９の平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から１μｍ以上であることが好ましい。樹脂成形品１９の平面度の最大値は、例えば、該成形品に反り等が発生して光学系ユニットと接触しない等、支障とならない観点から２００μｍ以下であることが好ましい。樹脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から±０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。

以下に、本発明にかかる実施例および比較例を示す。これらの実施例および比較例は、マイクロ容器の寸法を変量し、細胞の培養密度およびＡＬＰ（アルカリフォスターゼ）活性を評価したものである。光学物性値である全光透過率およびヘイズ値は、株式会社スガ試験機製の可視光線透過率計（型式：ＨＡ−ＴＲ）を用いて測定した。具体的には、全光線透過率をＪＩＳ Ｋ６７１４に準拠した方法で２回測定し、その平均値を求めた。また、蒸着膜の厚さは、株式会社アルバック製の表面形状測定器（ＤＥＫＴＡＫ３０３０）による触針法にて測定した。

培養密度測定方法は、以下の通りである。密度にして０．４ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２および１．１ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２のラット切歯歯髄由来の歯髄細胞（ＲＰＣ−Ｃ２Ａ）を散布し、４８時間および９６時間培養した後、細胞染色用蛍光色素であるプロピウムイオダイド（ＰＩ：Propidium Iodide）により、細胞核を染色した。カールツァイス社製の共焦点レーザースキャン顕微鏡（型式：ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ）を用いて、１０００μｍ^２における染色された細胞数を計測した。１条件につき、１０視野の観察を行い、その平均値を求めた。

ＡＬＰは、体内のあらゆる臓器や組織に存在するリン酸酵素である。ＡＬＰ陽性細胞であるラット切歯歯髄由来の歯髄細胞（ＲＰＣ−Ｃ２Ａ）は、高密度状態で陽性反応を示すことが知られている。密度にして０．４ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２および１．１ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２のラット切歯歯髄由来の歯髄細胞（ＲＰＣ−Ｃ２Ａ）を散布し、４８時間および９６時間培養した後、ＡＬＰ活性を評価した。ＡＬＰ活性レベルは、染色性の違いにより０および１＋〜４＋の等級に分類した。等級の数値が大きいほど、活性していることを示す。ＡＬＰ染色にはＤＡＫＯ社製のＤＡＫＯ New Fuchsin Substrate System（code No. Ｋ０６９８）を用いた。なお、ＡＬＰ染色法は一例であり、本発明の適用範囲を限定するものではない。

［比較例１］
市販の滅菌済みのポリスチレン製シャーレ（φ９０ｍｍ−深さ２０ｍｍ）を用いた。光学物性値は、全光線透過率８５％、ヘイズ値３．７％であった。

［比較例２］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。光学物性値は、全光線透過率９０％、ヘイズ値１．８％であった。

［比較例３］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図３に示す縦・横３μｍ、深さ３μｍの複数のマイクロ容器１を有するプレートを作製した。図３（ａ）は、比較例３にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。この樹脂プレートを、滅菌した。次に、マイクロ容器への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。光学物性値は、全光線透過率８６％、ヘイズ値９．１％であった。

［比較例４］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図３に示すような形状の縦・横５ｍｍ、深さ２ｍｍの複数の容器を有するプレートを作製した。この樹脂プレートを、滅菌した。次に、容器への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。光学物性値は、全光線透過率８９％、ヘイズ値４．５％であった。

［実施例１］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図３に示す縦・横５０μｍ、深さ２０μｍの複数のマイクロ容器１を有するプレートを作製した。図３（ａ）は、実施例１にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図でもあり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。この樹脂プレートを、滅菌した。次に、マイクロ容器１への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。光学物性値は、全光線透過率８５％、ヘイズ値９．５％であった。

［実施例２］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図４に示す縦・横９０μｍ、深さ２０μｍの複数のマイクロ容器１を有するプレートを作製した。図４（ａ）は、実施例２にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図であり、図４（ｂ）は図４（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。これは、図１に示す第1の突起２が無く、第２の突起３のみを有する構成であり、この第２の突起３の寸法が、幅１０μｍ、長さ６０μｍ、高さ２０μｍである。この樹脂プレートを、滅菌した。次に、マイクロ容器１への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。光学物性値は、全光線透過率８６％、ヘイズ値８．８％であった。

［実施例３］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図３に示す縦・横１００μｍ、深さ５０μｍの複数のマイクロ容器１を有するプレートを作製した。図３（ａ）は、実施例３にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図でもあり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。この樹脂プレートを、滅菌した。次に、マイクロ容器１への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。光学物性値は、全光線透過率８８％、ヘイズ値７．３％であった。

［実施例４］
株式会社クラレ製のアクリル樹脂（パラペットＧＨ−Ｓ）を用い、スタンパーを使用した射出成形法により、幅２４ｍｍ、長さ７４ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの樹脂プレート上に、図３に示す縦・横５００μｍ、深さ５０μｍの複数のマイクロ容器１を有するプレートを作製した。図３（ａ）は、実施例４にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す平面図でもあり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。この樹脂プレートを、滅菌した。次に、マイクロ容器１への気泡混入を防止するため、株式会社アルバック（型式：ＵＥＰ）の蒸着装置を用い、厚さ０．３μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）膜を形成した。光学物性値は、全光線透過率９０％、ヘイズ値５．１％であった。

以上の比較例および実施例についての、散布した細胞の密度が０．４ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２の場合の培養結果を表１にまとめて示す。

平板や複数のマイクロ容器が幅５〜１０００μｍ、深さ５〜１０００μｍの範囲でない細胞培養容器を用いた比較例の場合、９６時間培養後であっても、培養密度が３ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２以下であり、ＡＬＰ活性の等級値も低い。図５に、比較例１において４８時間培養後、ＡＬＰ染色された細胞の写真を示す。このＡＬＰ活性の等級値は０である。

実施例では、複数のマイクロ容器の幅を５〜１０００μｍ、深さを５〜１０００μｍとすることで、４８時間培養後であっても、培養密度およびＡＬＰ活性の等級値は比較例よりも高く、９６時間培養後では、培養密度およびＡＬＰ活性の等級値がさらに高い。また、実施例では、高い透明性と培養密度およびＡＬＰ活性を達成しており、透過光での細胞観察用途に特に適している。図６（ａ）に、実施例２において４８時間培養後、染色された細胞核の写真、図６（ｂ）に実施例２において９６時間培養後、染色された細胞核の写真を示す。また、図７には実施例２において９６時間培養後、ＡＬＰ染色された細胞の写真を示す。このＡＬＰ活性の等級値は４＋である。

次に、比較例および実施例についての、散布した細胞の密度が１．１ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２の場合の培養結果を表２にまとめて示す。

比較例の場合、散布した細胞数が増えても、培養密度およびＡＬＰ活性の等級値にほとんど変化がない。９６時間培養後であっても、培養密度が３ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２以下であり、ＡＬＰ活性の等級値も低い。

実施例では、散布した細胞数が増えると、顕著に培養密度が向上し、４８時間培養後にはＡＬＰ活性の等級値はいずれの実施例でも４＋となった。すなわち、本発明を適用することにより、細胞培養を用いた種々の試験・研究における精度および効率の向上が期待できる。

本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器の製造方法を模式的に示す図である。 比較例３、本発明の実施例１、実施例３および実施例４にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。 本発明の実施例２にかかる細胞培養容器を模式的に示す平面図である。 比較例１において、４８時間培養後、ＡＬＰ染色された細胞の写真である。 実施例２において、４８時間および９６時間培養後、染色された細胞核の写真である。 実施例２において、９６時間培養後、ＡＬＰ染色された細胞の写真である。

符号の説明

１ マイクロ容器
２ 第１の凸部
３ 第２の凸部
４ ２段の凸部
５ 第１の凸部の側壁
６ 第２の凸部の側壁
１１ 基板
１２ 第１レジスト層
１３ マスクＡ
１４ 第２レジスト層
１５ マスクＢ
１６ レジストパターン
１７ 導電性膜
１８ 金属構造体
１９ 樹脂製成型品

Claims (3)

1. 細胞が培養される面に、幅または直径５μｍ〜１０００μｍ、深さ５μｍ〜１０００μｍの複数のマイクロ容器を備えた細胞培養容器に、密度が８ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２以下の歯髄細胞を散布するステップと、
   培養密度が３ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２〜２０ｃｅｌｌｓ／１０００μｍ^２に到達するまで培養するステップと、を備える細胞培養方法。
2. 前記細胞培養容器が、透明性を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
3. 前記細胞培養容器が、最表面の全体または一部に親水性または疎水性の有機膜または無機膜を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養方法。