CN109477053A - 液态培养基组合物的制造方法及制造装置 - Google Patents

液态培养基组合物的制造方法及制造装置 Download PDF

Info

Publication number
CN109477053A
CN109477053A CN201780043945.3A CN201780043945A CN109477053A CN 109477053 A CN109477053 A CN 109477053A CN 201780043945 A CN201780043945 A CN 201780043945A CN 109477053 A CN109477053 A CN 109477053A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liquid
feed line
pipeline
culture medium
interflow
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780043945.3A
Other languages
English (en)
Inventor
畑中大辅
林寿人
田所真介
小泽征巳
诸留圭介
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nissan Chemical Corp
Original Assignee
Nissan Chemical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nissan Chemical Corp filed Critical Nissan Chemical Corp
Publication of CN109477053A publication Critical patent/CN109477053A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M99/00—Subject matter not otherwise provided for in other groups of this subclass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
    • B01F23/40—Mixing liquids with liquids; Emulsifying
    • B01F23/45—Mixing liquids with liquids; Emulsifying using flow mixing
    • B01F23/451—Mixing liquids with liquids; Emulsifying using flow mixing by injecting one liquid into another
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
    • B01F23/40—Mixing liquids with liquids; Emulsifying
    • B01F23/45—Mixing liquids with liquids; Emulsifying using flow mixing
    • B01F23/453—Mixing liquids with liquids; Emulsifying using flow mixing by moving the liquids in countercurrent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B01F25/20—Jet mixers, i.e. mixers using high-speed fluid streams
    • B01F25/23—Mixing by intersecting jets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B01F25/30—Injector mixers
    • B01F25/31—Injector mixers in conduits or tubes through which the main component flows
    • B01F25/313—Injector mixers in conduits or tubes through which the main component flows wherein additional components are introduced in the centre of the conduit
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B01F25/30—Injector mixers
    • B01F25/31—Injector mixers in conduits or tubes through which the main component flows
    • B01F25/313—Injector mixers in conduits or tubes through which the main component flows wherein additional components are introduced in the centre of the conduit
    • B01F25/3131—Injector mixers in conduits or tubes through which the main component flows wherein additional components are introduced in the centre of the conduit with additional mixing means other than injector mixers, e.g. screens, baffles or rotating elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B01F2025/91—Direction of flow or arrangement of feed and discharge openings
    • B01F2025/918—Counter current flow, i.e. flows moving in opposite direction and colliding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B01F2025/91—Direction of flow or arrangement of feed and discharge openings
    • B01F2025/919—Direction of flow or arrangement of feed and discharge openings characterised by the disposition of the feed and discharge openings
    • B01F2025/9191—Direction of flow or arrangement of feed and discharge openings characterised by the disposition of the feed and discharge openings characterised by the arrangement of the feed openings for one or more flows, e.g. for the mainflow and the flow of an additional component
    • B01F2025/91911—Direction of flow or arrangement of feed and discharge openings characterised by the disposition of the feed and discharge openings characterised by the arrangement of the feed openings for one or more flows, e.g. for the mainflow and the flow of an additional component with feed openings in the center of the main flow
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

使用具有第1流入管路11与第2流入管路12合流而形成流出管路13的结构的合流管路结构10，使含有特定化合物的第1液体1流入至第1流入管路11，使含有连接物质的第2液体2流入至第2流入管路12，使两种液体的液流合流，由此将两种液体混合，以流出管路13中的液流的形式形成分散有特定化合物介由连接物质结合而成的结构体的液态培养基组合物3。

Description

液态培养基组合物的制造方法及制造装置
技术领域
本发明涉及液态培养基组合物的制造方法及制造装置。更详细而言，本发明涉及下述制造方法及制造装置，所述制造方法中，将为了形成前述培养基组合物而应当混合的至少2种液体(含有特定的化合物的第1液体、及含有将该特定的化合物彼此结合而形成结构体的物质的第2液体)适当地混合，从而能制造适当地分散有前述结构体的培养基组合物。
背景技术
近年来，用于使在动物、植物体内发挥不同作用的各种器官、组织及细胞在生物体外增殖或维持的技术不断进展。使这些器官、组织在生物体外增殖或维持分别被称为器官培养、组织培养，使从器官、组织分离的细胞在生物体外增殖、分化或维持被称为细胞培养。
细胞培养是使分离的细胞在培养基中而在生物体外进行增殖、分化或维持的技术，其已成为对生物体内的各种器官、组织、细胞的功能及结构进行详细分析所不可缺少的技术。
另外，利用该技术培养的细胞及/或组织已在化学物质、医药品等的药效及毒性评价、酶、细胞生长因子、抗体等有用物质的大量生产、再生医疗(其修补由于疾病、缺损而丧失的器官、组织、细胞)、植物的品种改良、基因重组作物的制成等各种领域中得到利用。
作为用于培养细胞等(器官、组织、细胞)的培养基之一，可举出液体培养基，本申请的发明人已成功开发了能以悬浮状态培养细胞等的液态培养基组合物(专利文献1及2)。
对于专利文献1中记载的液态培养基组合物而言，特定的化合物(尤其是具有阴离子性官能团的高分子化合物)介由2价金属阳离子等发生聚集而形成不定形的结构体，该结构体分散于液体培养基中而成为悬浮的状态。下文中，将具有阴离子性官能团的高分子化合物等之类的上述特定的化合物亦称为“特定化合物”，将使该特定化合物彼此结合的2价金属阳离子等物质亦称为“连接物质”。
该培养基组合物成为能够在不伴有存在引起细胞等的受损、功能丧失的风险的操作(振荡、旋转等)的情况下以悬浮状态培养细胞等的理想液态培养基。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2014/017513号
专利文献2：美国专利申请公开第2014/0106348 A1号说明书
发明内容
发明所要解决的课题
上述专利文献1中记载的液态培养基组合物的原本期待的理想状态为下述状态：通过特定化合物彼此介由2价金属阳离子等连接物质连接而形成的结构体均匀分散于液体培养基中。
然而，本申请的发明人对该液态培养基组合物的实际的制作工序进行了详细研究，结果发现，为了得到这样的理想状态，必须注意混合方法、混合条件，以使得结构体不会在培养基组合物中的局部集中地形成。
例如，特定化合物为脱酰基结冷胶的情况下，在该脱酰基结冷胶与液体培养基混合时，介由液体培养基中的连接物质(例如，钙离子)而形成不定形的结构体，其成为用于使细胞等悬浮的载体。
然而，利用专利文献1及2中记载的方法来尝试大量地制造培养基组合物时发现，在向包含连接物质的液体培养基中注入包含高浓度的特定化合物的液体这样的混合方法中，在两种液体接触的瞬间，特定化合物与连接物质接触而形成结构体，因此，该结构体在混合液中较长地连接成带状而成为悬浮的状态(或带状的结构体缠结成团块状的状态)，有时无法成为原本期待的均匀的分散状态。另外还发现，即使以较高速度进行搅拌，也会产生这样的状态。并且还发现，一旦在液体培养基中形成这样的带状的结构体，从分子链所形成的双螺旋彼此介由连接物质(例如，钙离子)形成牢固的三维网络这样的该结构体的性质考虑，不容易将其细碎地切断而分散于母材中。
因此，为了得到目标结构体良好分散的混合液，需要能高速地使两种液体接触的那样的特殊搅拌装置，但也已知在很多情况下，这样的特殊搅拌装置的搅拌作用通常仅限于对1L(L表示升)以下程度的少量的液体有效，而不适于大量(例如，5L以上等)制造上述的结构体良好分散的混合液。进而还发现，上述的特殊的搅拌装置是不可能进行密闭状态下的混合的装置，因此，难以在连续的混合过程中保持无菌状态，造成因外界气体而导致的培养基组合物的污染的可能性高。
本发明的目的在于解决上述的问题，提供一种制造方法及制造装置，所述制造方法能连续并且无菌地将包含2价金属阳离子等连接物质的任意液体、和包含特定化合物的液体以任意的比例混合，能大量地得到分散有微细的结构体的液态培养基组合物。
用于解决课题的手段
能达成前述目的的本发明的主要构成如下所述。
〔1〕液态培养基组合物的制造方法，其特征在于，包括下述工序：
使用具有第1流入管路与第2流入管路合流而形成流出管路的结构的合流管路结构，
使含有下述特定化合物(i)的第1液体流入至前述第1流入管路，并且，使含有下述连接物质(ii)的第2液体流入至前述第2流入管路，使两种液体的液流合流，由此将两种液体混合，以在流出管路中流动的状态形成液态培养基组合物，所述液态培养基组合物中分散有前述特定化合物介由前述连接物质结合而成的结构体。
特定化合物(i)，其是具有阴离子性的官能团的高分子化合物，其能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体。
连接物质(ii)，其是2价金属阳离子。
〔2〕如前述〔1〕所述的液态培养基组合物的制造方法，其中，前述特定化合物(i)为脱酰基结冷胶，第1液体为含有该脱酰基结冷胶的水溶液，
前述连接物质(ii)为钙离子及镁离子中的一方或两方，第2液体为含有钙离子及镁离子中的一方或两方的液体培养基、或该液体培养基的浓缩液。
〔3〕如前述〔2〕所述的培养基组合物的制造方法，其中，前述液态培养基组合物中的脱酰基结冷胶的浓度为0.001％(w/v)～1.0％(w/v)。
〔4〕如前述〔1〕～〔3〕中任一项所述的培养基组合物的制造方法，其中，在前述合流管路结构中，
(a)按照第1液体和第2液体相互朝向正相反的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路和第2流入管路排列成一条直线，并且，流出管路沿与第1流入管路及第2流入管路成直角的方向延伸；或者，
(b)按照第1液体和第2液体以相互成为V形的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路和第2流入管路排列成V形，并且，流出管路从合流部分起沿将该V字的内角进行二等分的方向延伸。
〔5〕用于制造液态培养基组合物的制造装置，该制造装置中，
具备具有第1流入管路与第2流入管路合流而形成流出管路的结构的合流管路结构，
具有为了供给含有下述特定化合物(i)的第1液体而与前述第1流入管路连接的第1液体供给源，并且，
具有为了供给含有下述连接物质(ii)的第2液体而与前述第2流入管路连接的第2液体供给源，
在前述合流管路结构中，被供给至第1流入管路的第1液体与被供给至第2流入管路的第2液体合流，由此将两种液体混合，以在流出管路中流动的状态形成液态培养基组合物，所述液态培养基组合物中分散有前述特定化合物介由前述连接物质结合而成的结构体。
特定化合物(i)，其是具有阴离子性的官能团的高分子化合物，其能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体。
连接物质(ii)，其是2价金属阳离子。
〔6〕如前述〔5〕所述的制造装置，其中，前述特定化合物(i)为脱酰基结冷胶，第1液体为含有该脱酰基结冷胶的水溶液，
前述连接物质(ii)为钙离子及镁离子中的一方或两方，第2液体为含有钙离子及镁离子中的一方或两方的液体培养基、或该液体培养基的浓缩液。
〔7〕如前述〔6〕所述的制造装置，其中，前述液态培养基组合物中的脱酰基结冷胶的浓度为0.001％(w/v)～1.0％(w/v)。
〔8〕如前述〔5〕～〔7〕中任一项所述的制造装置，其中，在前述合流管路结构中，
(a)按照第1液体和第2液体相互朝向正相反的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路和第2流入管路排列成一条直线，并且，流出管路沿与第1流入管路及第2流入管路成直角的方向延伸；或者，
(b)按照第1液体和第2液体以相互成为V字的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路和第2流入管路排列成V字状，并且，流出管路从合流部分起沿将该V字的内角进行二等分的方向延伸。
发明的效果
在以下的说明中，将第1液体与第2液体的混合液的混合状态根据在该混合液中形成的结构体的分散状态而称为“良好的混合状态”或“不理想的混合状态”。所谓“良好的混合状态”，是指结构体均匀分散于第1液体与第2液体的混合液中并持续悬浮的状态。反之，所谓“不理想的混合状态”，是指结构体未如上述那样均匀分散于混合液中、而是在局部集中存在的状态，例如是结构体在混合液中较长地连接成带状而进行悬浮或沉降的状态、带状的结构体局部地缠结而进行悬浮或沉降的状态。
结构体的分散状态可以成为从良好的混合状态至不理想的混合状态、而不分阶段地变化的各种状态。良好的混合状态与不理想的混合状态之间的边界状态(即，良好的混合状态的下限)可根据使用目的而利用后述的评价方法等适当确定。
通过本发明的制造方法及制造装置，第1液体和第2液体两方同时在各自的管路(第1流入管路和第2流入管路)内流动，在合流管路结构中合流，相互碰撞，成为混合液，在流出管路内流动。通过该合流的作用，在不使用混合用的搅拌子(通过外部动力来驱动的可动构件)的情况下，通过液体的输送力和合流管路结构的合流结构，能作为流出管路中的液流而形成良好的混合状态的液态培养基组合物。因此，通过本发明，例如，从实验用的少量的培养基组合物、至满足产业用的大型培养槽的那样的大量的培养基组合物，均能与所供给的两种液体的量相应地，从流出管路中连续地得到期望的量的液态培养基组合物。
关于在混合液中形成特定化合物介由连接物质结合而成的结构体的这样的2种液体，本发明首次记载了通过前述这样的基于合流的混合能得到良好的混合状态。对于这样的混合方法而言，在第1液体为含有该脱酰基结冷胶的水溶液、第2液体为含有钙离子及镁离子中的一方或两方的液体培养基时，其有用性变得特别显著。
另外，对于本发明的制造方法及制造装置而言，第1液体和第2液体在合流时均为液流是重要。通过该特征，即使两种液体的浓度存在差异，也能通过调节两种液体的流量的比率、流速的比率来使两种液体良好地合流而进行混合。例如，在第1液体的特定化合物的浓度低、第2液体为通常的液体培养基的这样的情况下，通过使第1液体与第2液体的流量、流速的比率为同等程度而将两种液体合流，从而能将两种液体良好地混合。另外，在第1液体的特定化合物的浓度高、第2液体为通常的液体培养基的这样的情况下，例如，调节第1管路的截面积，即使使两种液体高速地碰撞，但通过减小第1液体的流量相对于第2液体的流量的比率而使两种液体合流，从而也能将两种液体良好地混合。如上所述，即使第1液体中的特定化合物的浓度、和第2液体中的连接物质的浓度在宽范围内变动，也能通过改变流量、流速的比率(尤其是流量的比率)而将两种液体良好地混合。
另外，本发明的制造方法及制造装置中，通过在合流管路结构的后段加入静态混合器(市售的构件、或与其类同的流路结构)，从而能将两种液体更良好地混合。
另外，通过本发明的制造方法及制造装置，如图1所示那样，第1液体和第2液体不与外界气体等污染源接触、并且不与不必要的构件接触地从各自的供给源移动、合流，被相互混合，从而可以无菌地被供给至目标容器等。
另外，若使用蠕动泵作为用于分别地输送第1液体和第2液体的泵，则连接用的管路、合流管路结构可以在使用后丢弃，而不需要进行管路内的洗涤等维护。
附图说明
[图1]图1为概略地表示本发明的制造方法及制造装置的结构的图。该图中，为了进行说明，仅以截面图示出合流管路结构内的流路。
[图2]图2为表示本发明中的合流管路结构的优选方式例的截面图。
[图3]图3为表示本发明中的合流管路结构的另一优选方式例的截面图。
[图4]图4为示例本发明中的合流管路结构内的第1、第2液体的优选的碰撞状态的示意图。
[图5]图5为表示本发明中的合流管路结构的又一优选方式例的截面图。
[图6]图6为表示本发明中的合流管路结构的合流部分的优选方式例的截面图。
[图7]图7为表示本发明的实施例4的运行(Run)1与运行2中的、锥形管底部(白色的圆圈包围的部分)的珠的分散情形的照片图。
[图8]图8为表示本发明的实施例5的运行2与运行5中的、锥形管底部的珠的分散情形的照片图。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明的制造方法，但提及本发明的制造装置时，也对该制造装置的结构进行详细说明。
该制造方法是将含有下述特定化合物(i)的第1液体、和含有下述连接物质(ii)的第2液体混合从而制造液态培养基组合物的方法。
特定化合物(i)，其是具有阴离子性的官能团的高分子化合物，其能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体。
连接物质(ii)，其是2价金属阳离子。
特定化合物、连接物质、及分别含有它们的第1液体、第2液体、作为它们的混合液的液态培养基组合物的详细情况在后文中说明。
对于该制造方法而言，如图1所例示的那样，使用具有第1流入管路11与第2流入管路12合流而形成流出管路13的结构的合流管路结构10。如后文所述，合流管路结构10可以具有各种结构。因此，图1中，将合流管路结构10整体地以点划线来表示，代表性地，作为单纯的T字形的合流管路而描绘了内部的流路结构(合流结构)。各液体的液流的方向是为了进行说明，不受图中的液流方向(水平方向、垂直方向)的限制(其他图也同样)。该制造方法中，以液流方式将含有前述特定化合物(i)的第1液体1输送至第1流入管路11，并且，以液流方式将含有前述连接物质(ii)的第2液体2输送至第2流入管路12，使两种液体的液流合流，在流出管路13中形成两种液体混合而成的混合液(即，作为制造目标的液态培养基组合物)3。由此，可以以流出管路13中的液流的形式得到分散有前述特定化合物介由前述连接物质结合而成的结构体的、处于良好的混合状态的液态培养基组合物。
另外，对于本发明的制造装置而言，如图1所例示的那样，是能实施本发明的制造方法从而制造良好的混合状态的液态培养基组合物的装置。如图1所例示的那样，该制造装置具有上述的合流管路结构10，还具有第1液体供给源S1和第2液体供给源S2。
第1液体供给源S1是为了供给上述第1液体1而构成的装置，图1的例子中，至少具有收容第1液体1的容器、和用于送出该第1液体1的装置。图1中，以单纯的容器的方式绘制了第1液体供给源S1，省略了用于送出液体的装置的图示。第1液体供给源S1例如介由连接管C1与合流管路结构10的第1流入管路11连接。同样地，第2液体供给源S2是为了供给上述第2液体2而构成的装置。图1的例子中，第2液体供给源S2至少具有收容第2液体2的容器、和用于送出该第2液体2的装置(省略了用于送出液体的装置的图示)，例如介由连接管C2与合流管路结构10的第2流入管路12连接。
与合流管路结构10的流出管路13连接的供给管C3表明了用于将制造的液态培养基组合物3供给至容器等的管路，但并非必须。制造的液态培养基组合物3可以从流出管路13的出口直接被供给至使用目标容器等。
通过以上的构成，在该制造装置运转时，从第1液体供给源S1被供给至第1流入管路11的第1液体1、与从第2液体供给源S2被供给至第2流入管路12的第2液体2合流而被混合，由此，形成分散有前述特定化合物介由前述连接物质结合而成的结构体的液态培养基组合物3，从流出管路13流出。因此，第1、第2液体供给源的两种液体1、2在不与外界气体等污染源接触的情况下，仅以所需要的量并且以良好的混合状态被供给而形成液态培养基组合物3。
首先，对含有前述特定化合物(i)的第1液体1、含有前述连接物质(ii)的第2液体2、及通过这些液体的混合而形成的液态培养基组合物(分散有特定化合物介由连接物质结合而成的结构体的液体)3进行详细说明。
〔第1液体〕
第1液体含有能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体的、具有阴离子性的官能团的高分子化合物作为特定化合物。
作为阴离子性的官能团，可举出羧基、磺基、磷酸基及它们的盐，优选羧基或其盐。本发明中可使用的高分子化合物可以包含选自前述阴离子性的官能团的组中的1种或2种以上。
作为本发明中可使用的高分子化合物的优选的具体例，没有特别限制，可举出由10个以上的单糖类(例如，三碳糖、四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖等)聚合而成的多糖类，更优选可举出具有阴离子性的官能团的酸性多糖类。此处所谓酸性多糖类，没有特别限制，只要在其结构中具有阴离子性的官能团即可，例如为具有糖醛酸(例如，葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多糖类、在结构中的一部分具有硫酸基或磷酸基的多糖类、或具有这两方的结构的多糖类，不仅包含天然来源的多糖类，还包含由微生物产生的多糖类、以基因工程方式产生的多糖类、或使用酶人工合成的多糖类。更具体而言，可例举由选自由透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶(下文中，有时也称为DAG)、鼠李聚糖胶(rhamsangum)、迪特胶(diutan gum)、黄原胶、角叉菜胶、汉生胶、己糖醛酸、岩藻多糖、果胶、果胶酸(pectin acid)、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸类肝素(heparitin sulfate)、硫酸角质(keratosulfate)、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李聚糖及它们的盐组成的组中的1种或2种以上构成的多糖类。多糖类优选为透明质酸、DAG、迪特胶、黄原胶、角叉菜胶或它们的盐，更优选为DAG或其盐。关于DAG，也可使用经磷酸化的DAG。该磷酸化可利用已知的方法进行。
此处所谓盐，可举出例如锂、钠、钾之类的碱金属的盐、钙、钡、镁之类的碱土金属的盐或铝、锌、铜、铁、铵、有机碱及氨基酸等的盐。
这些高分子化合物(多糖类等)的重均分子量优选为10,000～50,000,000，更优选为100,000～20,000,000，进一步优选为1,000,000～10,000,000。例如，该分子量可利用基于凝胶渗透色谱法(GPC)的普鲁兰多糖换算来测定。
本发明中，可将上述具有阴离子性的官能团的多糖类组合多种(优选2种)而使用。也可以将具有阴离子性的官能团的多糖类与不具有阴离子性的官能团的多糖类组合。多糖类的组合的种类没有特别限制，能够通过介由2价金属阳离子结合从而在液体培养基中形成上述的结构体即可，优选该组合至少包含DAG或其盐。即，优选的多糖类的组合包含DAG或其盐、及DAG或其盐以外的多糖类(例如黄原胶、海藻酸、角叉菜胶、迪特胶、甲基纤维素、刺槐豆胶或它们的盐)。作为具体的多糖类的组合，可举出DAG和鼠李聚糖胶、DAG和迪特胶、DAG和黄原胶、DAG和角叉菜胶、DAG和汉生胶、DAG和刺槐豆胶、DAG和κ-角叉菜胶、DAG和海藻酸钠、DAG和甲基纤维素等，但不限于这些。
所谓脱酰基结冷胶，是以1—3连接的葡萄糖、1-4连接的葡萄糖醛酸、1-4连接的葡萄糖及1-4连接的鼠李糖这4分子的糖为结构单元的直链状的高分子多糖类，是R1、R2均为氢原子、n为2以上的整数的以下通式(I)表示的多糖类。其中，R1可包含甘油基，R2可包含乙酰基，乙酰基及甘油基的含量优选为10％以下，更优选为1％以下。
[化学式1]
特定化合物可以是利用化学合成法得到的化合物，但该特定化合物为天然物时，也可以是通过利用常用技术从含有该化合物的各种植物、各种动物、各种微生物中萃取及分离纯化而得到的化合物。例如，结冷胶可通过以下方式来制造：在发酵培养基中培养生产微生物，利用通常的纯化方法将在菌体外生产的粘膜物回收，进行干燥、粉碎等工序后，制成粉末状。另外，在脱酰基结冷胶的情况下，在将粘膜物回收时，实施碱处理，将键合于1—3连接的葡萄糖残基的甘油基和乙酰基进行脱酰基化后回收即可。作为结冷胶的生产微生物的例子，可举出少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)及对该微生物的基因进行修饰而得的微生物，但不限于此。
脱酰基结冷胶的情况下，可使用市售的脱酰基结冷胶，例如三晶株式会社制“KELCOGEL(CP Kelco公司的注册商标)CG-LA”、三荣源F.F.I株式会社制“KELCOGEL(CPKelco公司的注册商标)”等。另外，作为天然型结冷胶，可使用三荣源F.F.I株式会社制“KELCOGEL(CP Kelco公司的注册商标)HT”等。
第1液体通常为特定化合物的溶液。用于该溶液的溶剂没有特别限制，只要是能将特定化合物溶解的溶剂即可，通常为水或亲水性溶剂，优选为水。即，在优选的方式中，第1液体为特定化合物的水溶液。
第1液体中含有的特定化合物的浓度没有特别限制，只要能达到以下效果即可：在与第2液体混合时，在混合液中，特定化合物通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体，并且，该结构体在混合液中均匀分散，进而，最终得到的液态培养基组合物通过包含该结构体从而能对细胞或组织进行悬浮培养。由下文中详细说明的、能对细胞或组织进行悬浮培养的培养基组合物中的特定化合物的浓度、和第1液体的体积相对于最终产物中得到的培养基组合物的体积的比率，能算出第1液体中的特定化合物的浓度。例如，将体积V1的第1液体、与体积V2的第2液体混合，最终得到体积V1+V2的液态培养基组合物的情况下，为了使该液态培养基组合物中的特定化合物的浓度为C％(w/v)，使第1液体中的特定化合物的浓度为C×(V1+V2)/V1％(w/v)即可。
第1液体中的2价金属阳离子浓度需要低于第1液体中的特定化合物形成结构体的浓度。作为2价金属阳离子，可举出钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铁离子、铜离子等。尤其是，钙离子及镁离子中的一方或两方(下文中，也记载为“钙离子及/或镁离子”)有助于DAG等特定化合物的结构体形成。
第1液体中可包含除特定化合物、溶剂以外的因子。作为该因子，可举出生理上被允许的缓冲剂、盐、等渗剂，但不限于这些。
第1液体的制备可通过以下方式进行：将特定化合物添加至上述溶剂(例如水)中，于该特定化合物能溶解的温度(例如60℃以上、80℃以上、90℃以上)进行搅拌，将该特定化合物溶解，直至成为透明的状态。使用进行了脱2价金属阳离子处理的特定化合物(DAG等)时，由于不需要进行加热而溶解于水中，因而溶解操作容易进行。必要时，对得到的特定化合物的溶液进行脱2价金属阳离子处理，使溶液中的2价金属阳离子浓度低于结构体形成浓度。根据需要，可以在溶剂中预先添加特定化合物以外的因子，也可以在得到的特定化合物的溶液中添加特定化合物以外的因子。第1液体优选进行了灭菌处理。作为灭菌处理的方法，可举出高压釜、过滤灭菌等，但不限于这些。
〔第2液体〕
第2液体含有2价金属阳离子作为连接物质。作为2价金属阳离子，可举出钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铁离子、铜离子等。2价金属阳离子的种类没有特别限制，只要第1液体中包含的特定化合物能够通过介由该2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体即可，优选为钙离子。
第2液体通常为连接物质(即，2价金属阳离子)的溶液。用于该溶液的溶剂没有特别限制，只要是能将特定化合物溶解的溶剂即可，通常为水或亲水性溶剂，优选为水。即，在优选的方式中，第2液体为连接物质(即，2价金属阳离子)的水溶液。
第2液体中包含下述量的2价金属阳离子：将第1液体和第2液体混合，最终得到的液态培养基组合物中的2价金属阳离子浓度足以使第1液体中的特定化合物形成结构体。
第2液体中的2价金属阳离子浓度可由最终得到的液态培养基组合物中的2价金属阳离子浓度、和第1液体与第2液体的混合比计算。
第2液体中，可以包含除连接物质(即，2价金属阳离子)、溶剂以外的因子。作为该因子，可举出适于培养拟培养的细胞的培养基构成成分。作为该培养基构成成分，可举出缓冲剂(碳酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、HEPES等)、无机盐(NaCl等)、各种氨基酸、各种维生素(胆碱、叶酸等)、糖类(葡萄糖等)、抗氧化剂(一硫代甘油等)、丙酮酸、脂肪酸、血清、抗生素、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、各种细胞因子、各种激素、各种生长因子、各种胞外基质等，但不限于这些。第2液体优选进行了灭菌处理。作为灭菌处理的方法，可举出高压釜、过滤灭菌等，但不限于这些。
优选方式中，第2液体为含有结构体形成浓度的2价金属阳离子(优选钙离子及/或镁离子)的液体培养基，或为该液体培养基的浓缩液。
通过本发明，即使第1液体的特定化合物浓度高(即，即使第1液体中包含的溶剂(水)的量少)，也能将第1液体和第2液体良好地混合。因此，在第1液体的特定化合物浓度高、第1液体为少量的情况下，可以忽略第1液体对第2液体(液体培养基)的稀释，因此，第2液体可以不是浓缩液，而是能不稀释地直接使用的液体培养基。
另一方面，第1液体的特定化合物浓度较低时(即，第1液体中包含的溶剂(水)的量较多时)，存在容易将第1液体和第2液体良好地混合在一起的倾向，结构体能良好地分散。因此，第1液体的特定化合物浓度低时(溶剂(水)的量对于第2液体而言无法忽略时)，考虑到第2液体(液体培养基)通过第1液体而被稀释，第2液体(液体培养基)优选为在混合后成为理想的液体培养基的那样的浓缩液。
第2液体除了含有2价金属阳离子(优选钙离子及/或镁离子)及水之外，还含有适于培养拟培养的细胞的培养基构成成分。通常使用的细胞培养用液体培养基中的钙离子浓度的范围为0.1～2.0mM左右，镁离子浓度为0.1～1.0mM左右，因此，对于基于DAG等特定化合物的结构体形成而言是充分的。对于第2液体中的2价金属阳离子(优选钙离子及/或镁离子)的浓度而言，可以考虑到与第1液体的混合比而以最终得到的液态培养基组合物中的2价金属阳离子浓度成为结构体形成浓度的方式调节。对于其他连接物质而言也同样。另外，对于第2液体中的适于培养拟培养的细胞的培养基构成成分的浓度而言，可以考虑到与第1液体的混合比而以最终得到的液态培养基组合物中的培养基构成成分的浓度成为适于培养拟培养的细胞的浓度范围内的方式调节。例如，将体积V1的第1液体、与体积V2的第2液体混合，最终得到体积V1+V2的液态培养基组合物的情况下，为了使该液态培养基组合物中的2价金属阳离子的浓度为Ci，使第2液体中的2价金属阳离子的浓度为Ci×(V1+V2)/V2即可。对于其他连接物质而言也同样。同样地，将体积V1的第1液体、与体积V2的第2液体混合，最终得到体积V1+V2的液态培养基组合物的情况下，为了使该液态培养基组合物中的培养基构成成分的浓度为Cm，使第2液体中的培养基构成成分的浓度为Cm×(V1+V2)/V2即可。
本方式中，通过利用本发明的制造方法将第1液体和第2液体混合，能立即得到包含第1液体中所含的特定化合物介由第2液体中所含的连接物质结合而成的结构体的目标液态培养基组合物。
当然，第2液体中也可以不包含上述的细胞培养用培养基构成成分的一部分或全部。这种情况下，本发明的制造方法中，可以将第1液体和第2液体混合，得到包含第1液体中所含的特定化合物介由第2液体中所含的连接物质结合而成的结构体的混合液，通过向该混合液中添加上述细胞培养用液体培养基构成成分的一部分或全部，从而得到目标液态培养基组合物。
关于第1液体与第2液体的体积混合比，相对于第1液体的体积100而言，第2液体的体积例如为10～9900，优选为100～4900。
优选的方式中，利用本发明的制造方法制造的液态培养基组合物中含有的特定化合物的90摩尔％以上(优选95摩尔％以上、更优选99％以上、最优选100％)来自第1液体，该培养基组合物中含有的2价金属阳离子的90摩尔％以上(优选95摩尔％以上、更优选99％以上、最优选100％)来自第2液体。
〔液态培养基组合物〕
可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物含有第1液体中所含的特定化合物介由第2液体中所含的连接物质(即，2价金属阳离子)结合而成的结构体，并且，该结构体被均匀分散于该培养基组合物中，因此，使用该培养基组合物时，能在维持悬浮状态的状态下培养细胞、组织。
作为培养对象的细胞、组织的来源生物的种类没有特别限制，不仅包括动物(昆虫、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、泛甲壳类、六足类、哺乳类等)，还包括植物。
一个方式中，作为培养对象的细胞为支持物依赖性的细胞。若使用可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物，则可在不使用作为支持物的载体的情况下，在维持悬浮状态的状态下培养支持物依赖性的细胞。
本发明中，所谓细胞及/或组织的悬浮，是指处于相对于培养容器而言细胞及/或组织可以接触底面但不附着于底面的状态(非粘附)。此外，本发明中，在使细胞及/或组织增殖、分化或维持时，将不伴有针对液体的培养基组合物的来自外部的压力、振动或该组合物中的振荡、旋转操作等，细胞及/或组织在该液态培养基组合物中均匀分散并且处于悬浮状态的状态称为“悬浮静置”，将在该状态下培养细胞及/或组织称为“悬浮静置培养”。另外，作为“悬浮静置”中能进行悬浮的时间，包括5分钟以上、1小时以上、24小时以上、48小时以上、7天以上等，但不限于这些时间，只要保持悬浮状态即可。
对于可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物而言，能够在能维持、培养细胞、组织的温度范围(例如，0～40℃)的至少1个温度点，进行细胞及/或组织的悬浮静置。可通过本发明得到的液态培养基组合物优选能够在25～37℃的温度范围的至少1个温度点(最优选37℃)进行细胞及/或组织的悬浮静置。
是否能悬浮静置例如可通过以下方式来评价：以2×104个细胞/mL的浓度将作为培养对象的细胞均匀分散于作为评价对象的培养基组合物中，向15mL锥形管中注入10mL，在4℃～10℃左右的温度下静置至少5分钟以上(例如1小时以上、24小时以上、48小时以上、7天以上)，观察是否能维持该细胞的悬浮状态。全部细胞中的70％以上为悬浮状态时，可作出维持了悬浮状态的结论。也可用聚苯乙烯珠(尺寸为500-600μm，Polysciences Inc.制)代替细胞来进行评价。
优选的方式中，对于可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物而言，未由于包含上述结构体而导致其粘度实质提高。所谓“未实质提高液体的粘度”，是指液体的粘度不高于8mPa·s。此时的该液体的粘度(即，可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物的粘度)在37℃时为8mPa·s以下，优选为4mPa·s以下，更优选为2mPa·s以下。包含结构体的液体的粘度可在37℃条件下、使用E型粘度计(东机产业株式会社制，TV-22型粘度计，机型：TVE-22L，锥形转子：标准转子1°34’×R24，转速100rpm)进行测定。
可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物中的特定化合物的浓度取决于特定化合物的种类，可在特定化合物能在液态培养基组合物中形成上述的结构体从而(优选在不实质提高该液体培养基的粘度的情况下)使细胞及/或组织均匀悬浮(优选使其悬浮静置)的范围内适当设定。例如，在DAG的情况下，为0.001％～1.0％(w/v)，优选为0.003％～0.5％(w/v)，更优选为0.005％～0.3％(w/v)，进一步优选为0.01％～0.05％(w/v)，最优选为0.01％～0.03％(w/v)。在黄原胶的情况下，为0.001％～5.0％(w/v)，优选为0.01％～1.0％(w/v)，更优选为0.05％～0.5％(w/v)，最优选为0.1％～0.2％(w/v)。在κ-角叉菜胶及刺槐豆胶混合体系的情况下，以两种化合物的总和计，为0.001％～5.0％(w/v)，优选为0.005％～1.0％(w/v)，更优选为0.01％～0.1％(w/v)，最优选为0.03％～0.05％(w/v)。在天然型结冷胶的情况下，为0.05％～1.0％(w/v)，优选为0.05％～0.1％(w/v)。
组合使用多种(优选2种)上述多糖类作为特定化合物的情况下，该多糖类的浓度可在该多糖类的组合能在液态培养基组合物中形成上述的结构体从而(优选在不实质提高该液体培养基的粘度的情况下)使细胞及/或组织均匀悬浮(优选悬浮静置)的范围内适当设定。例如，使用DAG或其盐、与DAG或其盐以外的多糖类的组合的情况下，作为DAG或其盐的浓度，可例举0.005～0.02％(w/v)、优选0.01～0.02％(w/v)，作为DAG或其盐以外的多糖类的浓度，可例举0.0001～0.4％(w/v)、优选0.005～0.4％(w/v)、更优选0.1～0.4％(w/v)。作为具体的浓度范围的组合，可举出以下组合。
DAG或其盐：0.005～0.02％(优选0.01～0.02％)(w/v)
DAG以外的多糖类
黄原胶：0.1～0.4％(w/v)
海藻酸钠：0.0001～0.4％(w/v)(优选为0.1～0.4％(w/v))
天然结冷胶：0.0001～0.4％(w/v)
刺槐豆胶：0.1～0.4％(w/v)
甲基纤维素：0.1～0.4％(w/v)(优选0.2～0.4％(w/v))
角叉菜胶：0.05～0.1％(w/v)
迪特胶：0.05～0.1％(w/v)
一个方式中，脱酰基结冷胶或其盐、和二价金属阳离子在介质中维持无规卷曲状态，并且，组合能介由二价金属离子交联的酸性多糖类或其盐而作为特定化合物使用。该酸性多糖类优选为选自由海藻酸、果胶及果胶酸组成的组中的任一种，更优选为海藻酸。作为盐，可举出锂、钠、钾之类的碱金属的盐；钙、钡、镁之类的碱土金属的盐；铝、锌、铜、铁等的盐；铵盐等，优选为钠盐。作为该酸性多糖类或其盐，优选使用海藻酸钠。本方式中，可通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物中的脱酰基结冷胶或其盐的浓度例如为0.002～0.01(w/v)％，优选为0.002～0.009(w/v)％，更优选为0.003～0.009(w/v)％，前述酸性多糖类或其盐(例如海藻酸钠)的浓度例如为0.004～0.1(w/v)％，优选为0.004～0.02(w/v)％，更优选为0.004～0.015(w/v)％，进一步优选为0.005～0.015(w/v)％。
需要说明的是，该浓度可利用下式计算。
浓度[％(w/v)]＝特定化合物的重量(g)/培养基组合物的体积(mL)×100
优选的方式中，使用DAG或其盐作为特定化合物，使用钙离子作为连接物质。第1液体为DAG或其盐的水溶液。第2液体为含有钙离子的液体培养基的浓缩液。对于第1液体与第2液体的体积混合比而言，如上所述，相对于第1液体的体积(V1)100而言，第2液体的体积(V2)为10～9900，优选为100～4900。作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的DAG浓度优选为0.01％～0.05％(w/v)，最优选为0.01％～0.03％(w/v)。作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的钙离子浓度为DAG形成结构体的浓度，通常为0.1～2.0mM左右。作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的培养基构成成分的浓度在适于培养拟培养的细胞(例如哺乳动物细胞)的浓度范围内。
第1液体中的DAG浓度是上述的作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的DAG浓度乘以(V1+V2)/V1(即，110/100～10000/100，优选为200/100～5000/100)而得到的浓度。
第2液体中的钙离子浓度是上述的作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的钙离子浓度乘以(V1+V2)/V2(即，110/10～10000/9900，优选为200/100～5000/4900)而得到的浓度。
第2液体中的培养基构成成分的浓度是上述的作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的培养基构成成分的浓度乘以(V1+V2)/V2(即，110/10～10000/9900，优选为200/100～5000/4900)而得到的浓度。
DAG介由钙离子结合而成的结构体均匀地分散而被包含在该液态培养基组合物中，由此，能在粘度不实质提高的情况下，使细胞及/或组织均匀悬浮(优选使其悬浮静置)。
若使用通过本发明的制造方法得到的液态培养基组合物，则能够在不伴有存在引起细胞、组织的受损、功能丧失的风险的操作(振荡、旋转等)的情况下，以悬浮状态培养细胞及/或组织。此外，若使用该培养基组合物，则在培养时，不仅能容易地更换培养基，而且还能容易地回收所培养的细胞及/或组织。若使用该培养基组合物，则能以悬浮状态培养以往需要在培养板上以单层进行培养、在粘附于细胞容器的状态下进行培养的细胞，因此，能在不损害其功能的情况下高效地大量制备粘附性的细胞。
对于第1液体与第2液体的混合液而言，其本身可以是作为制造目标的培养基组合物，也可以通过向该混合液中进一步加入添加物从而形成作为制造目标的培养基组合物。
接下来，对本发明的制造方法及制造装置中的合流管路结构进行详细说明。如图1所示那样，该合流管路结构具有第1流入管路11与第2流入管路12合流而形成流出管路13的结构，可利用以第1液体1与第2液体2通过合流而被混合的方式构成的结构。合流管路结构可以是如T字形管、Y字管等那样2个流入管路单纯地合流的流路结构，也可以是下述结构：第1流入管路和第2流入管路中的一方或两方为多个，这些第1流入管路和第2流入管路在一点进行合流，从各流入管路流入的第1液体1和第2液体2在一点进行碰撞，作为混合液流出至流出管路的结构(即，中心碰撞型混合器)。另外，合流管路结构可以具有下述结构：可在不使用可动的搅拌子的情况下，仅通过流路的结构而以成为较高的混合度的方式使两种液体合流的结构；另外，也可以具有下述流路结构：不仅使第1液体和第2液体合流、而且根据需要还可以使其他液体合流而进行混合的具有其他流入管路的流路结构。
图2为例示2个流入管路单纯地进行合流的合流管路结构的截面图。图2(a)、(b)是使T形的合流管路结构10的截面简单化而进行表示的图，图2(c)是使Y形的合流管路结构的截面简单化而进行表示的图。可以适当地赋予用于与外部的管连接的接头的结构(螺丝、连接器(coupling)等)。图中示出的管路的各部分的姿态是为了进行说明的姿态。
图2(a)的方式中，与图1的示意图同样，位于图中的T形的上部的1个水平方向的管路由2个流入管路11、12构成，从中央的合流部向下方延伸的管路成为流出管路13。分别流入至流入管路11、12的第1液体1和第2液体2在中央的合流部合流而相互混合在一起，成为混合液(要制造的液态培养基组合物)3，在流出管路13中流动，为了供给而将其排出。该方式中，按照第1液体1和第2液体2相互朝向正相反的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路11和第2流入管路12排列成一条直线，并且，流出管路13沿与第1流入管路11及第2流入管路12成直角的方向延伸。由此，两种液体1、2相互剧烈碰撞而混合在一起。另外，两种液体形成层流而流入流出管路13这样的现象也不会发生。
图2(b)的方式是图2(a)所示的T形的流路结构的变形方式，位于图2(a)所示的T形的上部的水平方向的管路11、12在图2(b)作为垂直方向的管路使用，成为流入管路11、流出管路13。另外，图2(a)的T形的垂直方向的管路13在图2(b)中成为水平方向的流入管路12。
图2(c)的方式中，位于Y形的上部的2个倾斜方向的管路成为第1、第2流入管路11、12，它们进行合流，成为向下方延伸的流出管路13。
图3为例示合流管路结构10的另一方式的截面图。
图3的方式中，以第1液体1与第2液体2形成V形(即，以规定的内角θ)而相互碰撞的方式，将第1流入管路11和第2流入管路12排列成V形。在两种液体1、2形成角度而进行碰撞的方面，与图2(c)的Y形的合流管路结构同样。然而，图3的方式中，与Y形的合流管路结构相反，流出管路13从合流部分以在V形的内角θ的范围内的方式延伸，更优选的方式中，沿将V形的内角θ进行二等分的方向延伸。由此，两种液体1、2与图2(a)的T形的合流管路结构同样，相互剧烈碰撞而混合在一起。另外，由于流出管路13位于第1流入管路11与第2流入管路12之间的内角θ这侧，因此，两种液体1、2形成层流而流入流出管路13这样的现象也不会发生。
如图2(a)～(c)、及图3所例示的那样，即使是2个管路单纯地进行合流的流路结构，如果是通过两方的液体进行碰撞而产生紊流的合流，则第1液体与第2液体也能成为良好的混合状态而被混合。这些流路结构只不过是合流的代表例，进行合流的管路的数目、相互之间的角度不受这些例子的限制，优选加以选择以使得第1液体与第2液体成为良好的混合状态而被混合。
图4为例示在本发明中的合流管路结构内的、第1、第2液体的优选的碰撞状态的示意图。图4(a)对应于图2(a)，图4(b)对应于图3。为了得到两种液体的良好的混合状态，优选的是，如图4(a)所示那样，第1液体1与第2液体2相互朝向正相反的方向进行碰撞，或者，如图4(b)所示那样，以相互成为V形的方向进行碰撞。在任意情况下，第1液体1的液流与混合液3的液流所成的角度θ1、及第2液体2的液流与混合液3的液流所成的角度θ2均分别优选为30度～90度。例如，在图4(a)的T形流路中，角度θ1、θ2优选为90度。在图4(b)的V形流路中，V形的内角为θ1与θ2的和，θ1、θ2优选为10度～60度，优选θ1＝θ2。
如图2(c)所示的Y形的流路结构那样，角度θ1、θ2超过90度时，两种液体彼此顺畅地进行合流，容易形成层流，因此，有时不会成为良好的混合状态。
合流管路结构也可以具有以产生旋流的方式使从第1、第2流入管路流入的两种液体1、2合流而将其混合的结构(未图示)。
例如，在流出管路内，若以该一方的液体成为在周围包围在中心流动的另一方的液体的旋流的方式，使一方的液体与另一方的液体合流，则能将2种液体有效地混合，能成为良好的混合状态。作为替代方案，合流管路结构可以按照以下方式构成：2种液体以相互对等的角度进行合流，两方的液体以双螺旋的方式形成旋流。另外，也可以是多个第1流入管路、与多个第2流入管路合流成1个管路从而产生旋流的结构。
产生旋流时的第1、第2液体的流速、流量的比率可根据第1液体的特定化合物的浓度、第2液体的连接物质的浓度适当确定，以得到良好的混合状态。
图5是例示合流管路结构的又一方式的截面图，示出了2个流入管路成为双层管路而进行合流的例子。图5的方式中，按照以下方式构成：以第1液体1成为中央的液流、第2液体2成为以同心状包围前述中央的液流的外侧液流的方式，使两方的液体合流。该方式中，两种液体的液流的方向相互相同。中央的液流可以是第1液体与第2液体中的一方的液体，另一方的液体可以是外侧的液流。
即使是这样的同心状的合流，也能通过增大两种液体的速度的差异、在流路内配置产生紊流的构件等操作，来阻碍两方的液体保持层流的状态，由此得到良好的混合状态。
本发明的特殊的方式中，将一方的流入管路的顶端的合流部分(开口端部)缩窄成为喷嘴状，由此，可通过使一方的液体高速地向在另一方的流入管路中流动的另一方的液体射出从而使两种液体合流来将其混合。例如，图5所示的合流管路结构中，将第1流入管路1的顶端的流出口缩窄成喷嘴状。由此，第1液体作为细且流量的比率合适的、第2液体2的流速的2～50倍左右的极高流速的液流，以同方向冲入第2液体的液流中，两种液体发生合流。通过使两种液体以这样大的速度差相互冲击性地接触，也能在流出管路13中在使两种液体合流的同时将其良好地混合。流出管路的长度为能通过合流而得到充分的混合、并且能成为稳定的液流的那样的充分的长度即可。
例如，图5所示的合流管路结构中，第1液体的流量为0.5mL/分钟～10L/分钟左右、第2液体的流量为10mL/分钟～10L/分钟左右时，为了以上述那样大的流速差使两种液体合流，喷嘴部的截面积(垂直于喷嘴部的中心轴线(液流方向的轴线)而切断时的流路的截面的面积)根据流量确定即可，可举出例如0.01mm2～5.00mm2左右、优选0.05mm2～2.00mm2左右、更优选为0.10mm2～0.70mm2左右。所谓喷嘴部的截面，是指垂直于该喷嘴部的中心轴线而切断时的截面。在通过喷嘴部的出口的液体的流量Q、喷嘴部的截面积S、与通过喷嘴部的液体的流速V之间，有Q＝S×V的关系。
前述这样的以大的流速差进行合流的特殊的方式中，第1液体的特定化合物的浓度、及第2液体的连接物质的浓度也没有特别限制，可以为上述的范围。
第1、第2流入管路、及流出管路优选为液体能在不与外界气体接触的情况下流动的流路。第1、第2流入管路、及流出管路不仅可以是图2(a)～(c)、及图3所例示的那样的管的形态，也可以是局部包含大空间的形态，另外，也可以是在由结构用的材料形成的团块状物中形成的流路。
作为合流管路结构的材料，可利用金属、玻璃(硅酸盐玻璃等)、塑料等具有耐腐蚀性并且不对两种液体造成影响的结构用材料。
通过使两种液体合流而将其混合时，优选对第1液体中的特定化合物的浓度、第2液体中的连接物质的浓度、两种液体的流量的比率、流速的比率进行适当选择以使得混合液容易成为良好的混合状态。
以下，为了进行说明，对于上述特定化合物(i)为DAG、第1液体为含有该脱酰基结冷胶的水溶液，上述连接物质(ii)为钙离子、第2液体为含有钙离子的液体培养基的情况，例示两种液体的浓度、流量、流速的优选的组合。
首先，通过混合而形成的液态培养基组合物中的DAG的浓度优选为0.01％(w/v)～0.05％(w/v)左右，更优选为0.01％(w/v)～0.03％(w/v)。作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的钙离子浓度为DAG形成结构体的浓度，通常为0.1～2.0mM左右。
第1液体与第2液体的体积混合比根据上述的特定化合物的浓度和连接物质的浓度而以能得到作为目标的液态培养基组合物中的DAG的浓度的方式适当确定即可。本发明中，两方的液体在流动的同时被混合，因此，体积混合比也可作为流量(每单位时间流过的液体的体积)的比率来表示。
例如，对于第2液体的流量(FV2)相对于第1液体的流量(FV1)的比而言，将第1液体的流量(FV1)作为100时，第2液体的流量(FV2)通常为10～9900，优选为100～4900。
第1液体中的DAG浓度是上述的作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的DAG浓度乘以(FV1+FV2)/FV1(即，110/100～10000/100，优选为200/100～5000/100)而得到的浓度。
第2液体中的钙离子浓度是上述的作为混合的结果而得到的液态培养基组合物中的钙离子浓度乘以(FV1+FV2)/FV2(即，110/10～10000/9900，优选为200/100～5000/4900)而得到的浓度。
第1、第2流入管路、流出管路的各自的截面积(垂直于各管路的中心轴线(液流方向的轴线)而切断时的该管路(流路)的截面的面积)、第1、第2液体的流量和流速、混合液的流速没有特别限制，从实验用的少量、至产业用(在大容量的容器中填充液态培养基组合物而进行销售的情况，在商业的细胞培养的现场，当场在大容量的培养容器中形成液态培养基组合物而进行供给的用途等)的大量，根据液态培养基组合物的需要量适当确定即可。
举出通用的具体例。第1、第2流入管路的各截面积为0.0075mm2～20mm2左右(截面形状为圆形时，内径为0.1mm～5mm左右)，第1液体的流量为0.5mL/分钟～10L/分钟左右，第2液体的流量为10mL/分钟～10L/分钟左右。流出管路的截面积可根据前述第1、第2流入管路的截面积确定，为0.0075mm2～400mm2左右(截面形状为圆形时，内径为0.1mm～200mm左右)，混合液的流量为前述的第1、第2液体的各流量的合计。各液体的流量可根据送出各液体的各泵的能力(排出量)确定。另外，可以并列使用多个泵来提高流量。
前述的第1、第2流入管路、流出管路的各自的截面积是整体的平均值，需要局部提高流速或降低流速时，可以适当改变该部分的管路的截面积。
第1、第2液体、混合液的各自的流速由在上述的各管路中流过的液体的流量和各管路的截面积确定(流速＝流量/截面积)。本申请发明中，第1、第2液体在流动的同时进行合流而相互混合在一起，因此，需要一定程度的高的流速。对于这样的高的流速而言，例如，第1液体的流量为0.5mL/分钟～10L/分钟左右、第2液体的各流量为10mL/分钟～10L/分钟左右时，可通过使第1、第2流入管路的各截面积为0.01mm2～1.0mm2左右而达成。利用按照上述方式得到的高的流速，两种液体良好地相互碰撞而混合在一起。
在图6所示的方式中，以下述方式构成：减小图2(a)所示的T形的合流管路结构10中的第1管路11、第2管路12、流出管路13的各自的合流部分的管路(11a、12a、13a)的截面积，两种液体1、2高速地碰撞并且高速地流出至流出管路13。这样的形态也能应用于图3所示的V形的合流管路结构10等。通过这样的形态，两种液体1、2剧烈碰撞而被混合，形成良好的混合状态的混合液3。
需要说明的是，对于即将合流之前的两种液体的流速之比而言，将第1液体的流速作为100时，相对于第1液体的流速而言的第2液体的流速可以为100～10000左右。另外，合流后的流出管路中的混合液的流速可根据合流管路结构的各自的流路结构适当确定。
作为能以成为较高混合度的方式使两种液体合流的结构，可利用静态混合器(不具有可动的搅拌子，以通过流路结构而将液体混合的方式构成的混合器。也被称为流动混合器、流动反应器、微型反应器)。静态混合器可以是合流管路结构自身，也可以被追加设置在合流管路结构的后段。流入管路与流出管路合流的部分也可成为属于第1、第2流入管路和流出管路中的哪种尚不明确的过渡部分。
图5的例子中，第1液体1和第2液体2合流后(即，在流出管路13中)，为了进一步提高合流的液体3的混合度，配置了静态混合器单元20，流出管路13自身成为静态混合器(即，合流管路结构包含静态混合器)。作为替代方案，也可在流出管路13的后段连接静态混合器。在这样的代替方案中，也可将静态混合器视为流出管路。如图5所示那样，合流的液体(混合液)3从静态混合器单元20通过，由此，该混合液3可由于该流路结构而成为良好的混合状态。
需要说明的是，对于静态混合器单元，图5所示那样的同轴状的合流可成为两种液体均匀分布的良好的输入流。因此，在合流部的后段使用静态混合器单元时，优选适当选择图2、图3所示的流路结构。
静态混合器单元或静态混合器的混合原理、为了进行混合的流路结构本身可参照现有已知的各种结构。
例如，日本特开2010—264348号公报等中记载的“混合叶片构件”是反复进行液流的分割和合流而进行混合的典型的静态混合器单元，为了将混合液更充分地混合，可以合适地利用。另外，作为将混合液的液流细分、使其合流而进行混合的静态混合器单元，可举出被称为MSE(Multi Stacked Element，多层堆叠单元)的多层结构。
如上述的静态混合器单元或静态混合器的流路结构那样，合流管路结构可以具有下述的(i)～(iii)的结构中的至少1种。
(i)以通过第1流入管路与第2流入管路的合流而进行了混合的第1液体与第2液体的混合液的液流在流出管路中经过1次以上分割和合流的方式构成的结构。
(ii)以通过第1流入管路与第2流入管路的合流而进行了混合的第1液体与第2液体的混合液的液流在第1流入管路与第2流入管路的合流部分中成为紊流或旋流的方式构成的结构。
(iii)以下述方式构成的结构：第1流入管路和第2流入管路分别在合流前分支成2个以上的流入管路，分支的各第1流入管路和分支的各第2流入管路相互合流，依次进行合流直至最终成为1个流出管路。对于这样的结构而言，2种液体在合流前被细分，分割成的微量的2种液体彼此在多个合流部进行合流，从而提高混合度。对于细微的多个合流而言，反复进行多少数量的合流而成为1个流出管路可适当确定。作为这样的结构，可举出例如日本特开2007—296452号公报中记载的微型混合器。
此外，作为仅用少量即可将第1液体和第2液体良好地混合的静态混合器，可举出已知的微型反应器用混合器(例如，株式会社YMC公司制，Y字型、Helix型、Static型等)。对于这些微型反应器用混合器而言，在基板中形成有管路，是紧凑的。
第1液体供给源至少具有收容有第1液体的容器，同样地，第2液体供给源也至少具有收容有第2液体的容器。容器为可分别适当地收容第1、第2液体的容器即可，可例举由可适当地收容各自的液体的材料形成的、具有刚性的槽、柔软的袋等。第1液体供给源及第2液体供给源分别优选具有用于送出液体的泵。泵可以是可仅在使该制造装置运转时安装的输送装置。
关于泵，可利用已知的液体输送装置，例如，优选使用了活塞和筒体(cylinder)的泵(注射泵、容积泵等)、蠕动泵等能精度良好地控制流量、流速、输送压力等的装置。泵的能力(排出量、排出压力等)可根据上述的两种液体的混合适当选择。
若使用蠕动泵，则不会使各管路内的液体与外界气体接触，另外，蠕动泵自身也没有管路，不需要进行洗涤，因此，若将使用后的管路丢弃，则不需要进行管路内的洗涤等维护。对于蠕动泵而言，如作为代表的管道泵(也被称为辊泵)那样，是具有通过使将具有弹性及柔软性的泵管压扁的位置沿输送方向移动从而使该管路内的液体移动的作用的泵。
对于蠕动泵的输送能力(在管道内移动的液体的每分钟的流量)而言，在市售的蠕动泵中，为从微小流量至大流量的宽范围，可例举0.01(mL/分钟)～10(L/分钟)左右。对于蠕动泵的输送能力而言，从实验用至产业用，可根据合流的各液体的流量确定。蠕动泵可以是构成本发明的制造装置的一部分的部件，也可以是本发明的装置所应利用的外部装置。
另外，在利用蠕动泵时，图1所示的制造装置中的连接管C1、C2(分别将第1、第2液体供给源S1、S2的各容器、与合流管路结构10连接的管路)优选为具备可作为泵管被安装于蠕动泵、并且具有可作为泵管发挥功能·进行运转的形状和柔软性的部分的管道。这样的管道优选具有与使用的蠕动泵匹配的管道的内径、外形、及长度，并且具有被蠕动泵的促动器(辊等)挤压而被压扁的柔软性、从基于该促动器的挤压被释放时能恢复原形的弹性。该连接管C1、C2可以是所有部分均可成为泵管的连接管，也可以是仅被安装于蠕动泵的部分可成为泵管的连接管。
实施例
实施例1
通过使用图1所示的制造装置来实施本发明的制造方法，从而以各种浓度、及各种流速将第1、第2液体混合，对得到的培养基组合物的混合状态(通过2种液体的混合而形成的结构体的分散状态)进行评价。
〔制造装置的结构〕
作为第1、第2液体供给源S1、S2的泵，使用柱塞泵(未图示)，使用PTFE制管道(内径为1.0mm，外径为1.6mm，长度为300mm)，将各柱塞泵与合流管路结构10的第1、第2流入管路11、12连接。在流出管路13的出口，连接PTFE制管道(内径为1.0mm，外径为1.6mm，长度为500mm)。
合流管路结构中，作为图6所示的T形的流路结构，使用(株)三幸精机工业制的T形混合器(不锈钢制，合流部分的第1、第2流入管路的截面积均为0.20mm2)，按照第1、第2液体在一条线上以相互正相反的方向碰撞的方式设置。
〔第1液体、第2液体的调整〕
作为第1液体，制备脱酰基结冷胶的水溶液500mL。作为第2液体，制备DMEM液体培养基(含有作为连接物质的钙离子的液体培养基)的浓缩液500mL。将第1液体中的脱酰基结冷胶浓度、及第2液体中的DMEM液体培养基的浓缩率示于表1。
〔混合〕
分别以规定的流量(mL/分钟)将第1、第2液体输送至合流管路结构内并进行混合，将得到的混合液分配注入至50mL锥形管(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.制)中。需要说明的是，对于合流管路结构及与合流管路结构连接的流路，浸渍于25℃的恒温槽中来调节温度。
通过聚苯乙烯珠的悬浮性对得到的混合液(液态培养基组合物)中的结构体的分散状态进行评价。
下述表1中，示出第1液体与第2液体的体积混合比、第1液体的DAG浓度(％(W/v)、作为第2液体的液体培养基的浓度、两种液体的体积混合比、两种液体的混合时的流量。表中，将第1液体表示为A，将第2液体表示为B。
需要说明的是，对于第2液体的浓度而言，将标准的浓度作为1倍，如“×2”(2倍的浓度)那样来表示浓度的倍率。
[表1]
上述试样1为低浓度的第1液体与高浓度的第2液体的合流的例子，上述试样2为中浓度的第1液体与中浓度的第2液体的合流的例子，上述试样3、4为高浓度的第1液体与标准程度的浓度的第2液体的合流的例子。两种液体总计均为1000mL。
本实施例中，为了使混合的各液体的体积(即，混合体积比)变得明确，形成为下述结构：在第1供给源、第2供给源的各自的容器中，预先收容规定量的第1、第2液体(A∶B＝500∶500、250∶750、100∶900)，用柱塞泵输送各液体，直至各容器排空。
〔混合状态的评价〕
悬浮性：在两种液体刚混合后，立即将聚苯乙烯珠(直径600μm，Polysciences公司制)10mg放入锥形管中的培养基组合物中，进行倒转混合，调查该倒转混合刚结束后的悬浮状态；和该倒转混合结束后在经过24小时后再次进行倒转混合、该倒转混合刚结束后的悬浮状态。
悬浮状态的评价的基准如下所述。
×：全部的珠均发生了沉降。
△：全部的珠均浮起，但整体从液面向下方沉降。
○：全部的珠均悬浮，不存在向下方沉降的倾向。
视觉辨认性：调查在混合后经1天后的透光率，作为视觉辨认性。
将混合时的温度、混合后的悬浮性、视觉辨认性示于下述表2中。
[表2]
表2的结果中，试样1的刚混合后的悬浮性不良，考虑是因为结构体的形成需要时间。然而，可知随着时间的经过，其成为能利用的液态培养基组合物。
另外，由表2的结果可知，即使在使第1液体为高浓度而增大两种液体的体积的差异(流量的差异)时，也能稳定地制备经良好地混合的液态培养基组合物。
实施例2
本实施例中，在第1液体中进一步添加了甲基纤维素(纯性化学公司制)，除此之外，与上述实施例1同样地进行混合，与上述实施例1同样地对得到的培养基组合物的悬浮性和视觉辨认性进行评价。
作为第1液体，制备含有脱酰基结冷胶0.04wt％、甲基纤维素0.63wt％的水溶液500mL。
下述表3中，示出第1液体与第2液体的体积混合比、第1液体中的DAG浓度(％(W/v)/甲基纤维素浓度(MC浓度(％(W/v)))、作为第2液体的液体培养基的浓度、两种液体的体积混合比、两种液体的混合时的流量。表3中，与表1同样地，将第1液体表示为A，将第2液体表示为B。另外，对于第2液体的浓度而言，将标准的浓度作为1倍，如“×2”(2倍的浓度)那样来表示浓度的倍率。
[表3]
将混合时的温度、混合后的悬浮性、视觉辨认性示于下述表4。
[表4]
由表4的结果可知，即使在第1液体中进一步添加甲基纤维素，也能制备经良好地混合的液态培养基组合物。
在以下的实施例3～5中，使用与上述实施例1同样的制造装置，并且，使用同样的第1、第2液体，将对培养基的悬浮性有影响的因子中重要的、第1、第2液体的体积混合比和流量变更为各种值而进行混合，对结果得到的液态培养基组合物的悬浮性及视觉辨认性进行确认。
关于悬浮性，与实施例1同样地，使用聚苯乙烯珠(直径600μm，Polysciences公司制)进行评价。
关于视觉辨认性，通过目视来判断是否成为通过2种液体的混合而形成的结构体均匀地分散在培养基组合物中的状态。以下，将成为该结构体在培养基组合物中局部地聚集、能目视确认的状态的培养基组合物称为“凝胶样体”。
对于第2液体的浓度而言，将标准的浓度作为1倍，如“2倍”的浓度那样，表示浓度的倍率。
在以下的实施例3～5中，将得到要制造的液态培养基组合物100mL所需要的时间称为“回收时间”。
实施例3
本实施例中，对于被认为是能最容易成为良好的混合状态的体积混合比1∶1，调查了改变流量时的混合状态。
在将第1液体与第2液体的体积混合比保持为1∶1的情况下(即，在保持第1液体与第2液体的流量相互相同的情况下)，将2种液体的流量变更为50mL/分钟(运行1)、1mL/分钟(运行2)、0.1mL/分钟(运行3)而进行混合。将经混合得到的液态培养基组合物的悬浮性和视觉辨认性示于下述表5。
[表5]
如上述表5所示，将第1液体与第2液体的体积混合比固定为1∶1时，即使将2种液体的流量变更为50mL、1mL、0.1mL/分钟，也未发现凝胶样体，并且也未发现珠的悬浮性的恶化。需要说明的是，在运行1～3中，虽然珠在刚混合后有若干发生沉降，但在经过24小时后的倒转混合之后均成为良好的分散状态。
实施例4
本实施例中，对于被认为是较容易产生凝胶样体的体积混合比〔(第1液体∶第2液体)＝(1∶19)〕，调查了改变流量时的混合状态。
以第1液体与第2液体的体积混合比保持为1∶19的方式，将2种液体的各流量(mL/分钟)变更为2.6/50(运行1)、0.1/1.9(运行2)、0.4/7.6(运行3)、0.8/15.2(运行4)、0.5/9.5(运行5)、0.6/11.4(运行6)、0.7/13.3(运行7)而进行混合。将经混合得到的液态培养基组合物的悬浮性和视觉辨认性示于下述表6。另外，将运行1与运行2中的锥形管底部的珠的分散情形示于图7的照片图中。
[表6]
实验编号：KM-2991-126
如上述表6所示，将第1液体与第2液体的体积混合比固定为1∶19时，在所有的条件下均未发现凝胶样体，但在运行2～运行3中，液态培养基整体稍微不透明。关于悬浮性，在运行2、运行3、运行5、运行6中，评价为“△”，观察到珠整体从液面向下方沉降的倾向。在运行2、运行3中，与运行5、运行6相比，呈现珠进一步沉降的倾向。运行2与运行3相比，呈现进一步沉降的倾向。
实施例5
本实施例中，将混合的第1液体与第2液体的总流量固定为2.0mL/分钟，对将体积混合比变更为1∶2～1∶9的情况下的混合状态进行调查。在本发明的2种液体的混合中，降低DAG在总流量中所占的比例，认为越提高液体培养基的比例，经混合得到的液态培养基组合物的悬浮性越会恶化，因此，本实施例中，对珠的沉降和悬浮的边界进行调查。将经混合得到的液态培养基组合物的悬浮性和视觉辨认性示于下述表7。另外，将运行2与运行5中的锥形管底部的珠的分散情形示于图8的照片图。
[表7]
实验编号：KM-2991-129
如上述表7所示可知，在运行1～3的体积混合比的情况下，呈现珠发生沉降的倾向，在运行4、5的体积混合比的情况下，珠悬浮。由本实施例的结果表明，总流量为2.0mL/分钟时，体积混合比1∶4与1∶3之间为珠的沉降与悬浮的边界。
如由上述实施例3～5所表明的那样，在全部条件下均未发现明确的凝胶样体。另一方面可知，将体积混合比固定为1∶19时，在流量0.1/1.9～0.6/11.4(mL/分钟)的范围内，确认到珠的悬浮性的恶化(评价△)，在将总流量固定为2.0mL/分钟时，在体积混合比1∶4与1∶3之间，存在珠的悬浮性的好坏(评价○和评价△)的边界。
产业上的可利用性
通过本发明的制造方法及制造装置，能无菌且简单并且良好地将包含2价金属阳离子等连接物质的任意液体和包含特定化合物的液体混合，能廉价并且大量地得到分散有微细的结构体的液态培养基组合物。
本申请以在日本提出申请的日本特愿2016—144953(申请日：2016年7月22日)为基础，本说明书中包含其全部内容。
附图标记说明
1 第1液体
2 第2液体
3 混合液(液态培养基组合物)
10 合流管路结构
11 第1流入管路
12 第2流入管路
13 流出管路
S1 第1液体供给源
S2 第2液体供给源
C1 连接管
C2 连接管
C3 供给管

Claims (8)

1.液态培养基组合物的制造方法，其特征在于，包括下述工序：
使用具有第1流入管路与第2流入管路合流而形成流出管路的结构的合流管路结构，
使含有下述特定化合物(i)的第1液体流入至所述第1流入管路，并且，使含有下述连接物质(ii)的第2液体流入至所述第2流入管路，使两种液体的液流合流，由此将两种液体混合，以在流出管路中流动的状态形成液态培养基组合物，所述液态培养基组合物中分散有所述特定化合物介由所述连接物质结合而成的结构体；
特定化合物(i)，其是具有阴离子性的官能团的高分子化合物，其能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体，
连接物质(ii)，其是2价金属阳离子。
2.如权利要求1所述的液态培养基组合物的制造方法，其中，所述特定化合物(i)为脱酰基结冷胶，第1液体为含有所述脱酰基结冷胶的水溶液，
所述连接物质(ii)为钙离子及镁离子中的一方或两方，第2液体为含有钙离子及镁离子中的一方或两方的液体培养基、或所述液体培养基的浓缩液。
3.如权利要求2所述的培养基组合物的制造方法，其中，所述液态培养基组合物中的脱酰基结冷胶的浓度为0.001％(w/v)～1.0％(w/v)。
4.如权利要求1～3中任一项所述的培养基组合物的制造方法，其中，在所述合流管路结构中，
(a)按照第1液体和第2液体相互朝向正相反的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路和第2流入管路排列成一条直线，并且，流出管路沿与第1流入管路及第2流入管路成直角的方向延伸；或者，
(b)按照第1液体和第2液体以相互成为V形的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路和第2流入管路排列成V形，并且，流出管路从合流部分起沿将所述V字的内角进行二等分的方向延伸。
5.用于制造液态培养基组合物的制造装置，所述制造装置中，
具备具有第1流入管路与第2流入管路合流而形成流出管路的结构的合流管路结构，
具有为了供给含有下述特定化合物(i)的第1液体而与所述第1流入管路连接的第1液体供给源，并且，
具有为了供给含有下述连接物质(ii)的第2液体而与所述第2流入管路连接的第2液体供给源，
在所述合流管路结构中，被供给至第1流入管路的第1液体与被供给至第2流入管路的第2液体合流，由此将两种液体混合，以在流出管路中流动的状态形成液态培养基组合物，所述液态培养基组合物中分散有所述特定化合物介由所述连接物质结合而成的结构体；
特定化合物(i)，其是具有阴离子性的官能团的高分子化合物，其能够通过介由2价金属阳离子结合从而形成能使细胞或组织悬浮的结构体，
连接物质(ii)，其是2价金属阳离子。
6.如权利要求5所述的制造装置，其中，所述特定化合物(i)为脱酰基结冷胶，第1液体为含有所述脱酰基结冷胶的水溶液，
所述连接物质(ii)为钙离子及镁离子中的一方或两方，第2液体为含有钙离子及镁离子中的一方或两方的液体培养基、或所述液体培养基的浓缩液。
7.如权利要求6所述的制造装置，其中，所述液态培养基组合物中的脱酰基结冷胶的浓度为0.001％(w/v)～1.0％(w/v)。
8.如权利要求5～7中任一项所述的制造装置，其中，在所述合流管路结构中，
(a)按照第1液体和第2液体相互朝向正相反的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路和第2流入管路排列成一条直线，并且，流出管路沿与第1流入管路及第2流入管路成直角的方向延伸；或者，
(b)按照第1液体和第2液体以相互成为V字的方向进行碰撞的方式，将第1流入管路和第2流入管路排列成V字状，并且，流出管路从合流部分起沿将所述V字的内角进行二等分的方向延伸。
CN201780043945.3A 2016-07-22 2017-07-21 液态培养基组合物的制造方法及制造装置 Pending CN109477053A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-144953 2016-07-22
JP2016144953 2016-07-22
PCT/JP2017/026454 WO2018016622A1 (ja) 2016-07-22 2017-07-21 液状の培地組成物の製造方法および製造装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109477053A true CN109477053A (zh) 2019-03-15

Family

ID=60992646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780043945.3A Pending CN109477053A (zh) 2016-07-22 2017-07-21 液态培养基组合物的制造方法及制造装置

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20190262785A1 (zh)
EP (1) EP3483254B1 (zh)
JP (2) JPWO2018016622A1 (zh)
KR (1) KR102387723B1 (zh)
CN (1) CN109477053A (zh)
TW (1) TWI763690B (zh)
WO (1) WO2018016622A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230235270A1 (en) 2020-06-26 2023-07-27 Astraveus Device for homogenization of a multicomponent fluid

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999007466A1 (en) * 1997-08-05 1999-02-18 Microfluidics International Corporation Multiple stream high pressure mixer/reactor
JP2000060450A (ja) * 1998-08-21 2000-02-29 Morinaga Milk Ind Co Ltd 多層ゲル化食品の製造方法
JP2005080607A (ja) * 2003-09-10 2005-03-31 National Food Research Institute 細胞培養プレートおよびその製造方法
EP1634640A2 (en) * 2004-09-10 2006-03-15 M-Il.L.C., Apparatus and method for homogenizing two or more fluids of different densities
EP1645954A2 (en) * 2004-10-08 2006-04-12 Böwe Bell + Howell Company Multi-print stream processing module optimizer for document processing
CN102046518A (zh) * 2008-04-23 2011-05-04 微射流国际公司 产生纳米颗粒的装置和方法及输运和反应系统的过程强化
CN104640974A (zh) * 2012-07-24 2015-05-20 日产化学工业株式会社 培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法
TW201619375A (zh) * 2014-09-25 2016-06-01 日產化學工業股份有限公司 抗癌劑的篩選方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL79052A0 (en) * 1986-06-06 1986-11-30 Univ Ramot Device and process for production of alginate-shell beads containing biologically active material
JP2742684B2 (ja) * 1987-01-10 1998-04-22 小林製薬株式会社 微生物用培地の調製法およびそのための装置
KR101574355B1 (ko) * 2007-04-26 2015-12-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 고농도 아미노산 함유 배지를 사용한 세포의 배양 방법
US9664671B2 (en) 2012-07-24 2017-05-30 Nissan Chemical Industries, Ltd. Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof
KR102282265B1 (ko) * 2014-01-23 2021-07-26 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 배양 배지 조성물의 제조 방법
JP6642439B2 (ja) * 2014-09-09 2020-02-05 日産化学株式会社 細胞回収に関する方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999007466A1 (en) * 1997-08-05 1999-02-18 Microfluidics International Corporation Multiple stream high pressure mixer/reactor
JP2000060450A (ja) * 1998-08-21 2000-02-29 Morinaga Milk Ind Co Ltd 多層ゲル化食品の製造方法
JP2005080607A (ja) * 2003-09-10 2005-03-31 National Food Research Institute 細胞培養プレートおよびその製造方法
EP1634640A2 (en) * 2004-09-10 2006-03-15 M-Il.L.C., Apparatus and method for homogenizing two or more fluids of different densities
EP1645954A2 (en) * 2004-10-08 2006-04-12 Böwe Bell + Howell Company Multi-print stream processing module optimizer for document processing
CN102046518A (zh) * 2008-04-23 2011-05-04 微射流国际公司 产生纳米颗粒的装置和方法及输运和反应系统的过程强化
CN104640974A (zh) * 2012-07-24 2015-05-20 日产化学工业株式会社 培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法
TW201619375A (zh) * 2014-09-25 2016-06-01 日產化學工業股份有限公司 抗癌劑的篩選方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱苏文等: "栝楼细胞悬浮系的建立", 《安徽农业科学》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022130591A (ja) 2022-09-06
TW201809267A (zh) 2018-03-16
WO2018016622A1 (ja) 2018-01-25
EP3483254A4 (en) 2019-07-17
KR20190027924A (ko) 2019-03-15
EP3483254B1 (en) 2021-03-10
JPWO2018016622A1 (ja) 2019-05-16
TWI763690B (zh) 2022-05-11
US20190262785A1 (en) 2019-08-29
EP3483254A1 (en) 2019-05-15
KR102387723B1 (ko) 2022-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Andersen et al. 3D cell culture in alginate hydrogels
Nagahama et al. Living functional hydrogels generated by bioorthogonal cross-linking reactions of azide-modified cells with alkyne-modified polymers
US20090011033A1 (en) Process for the manufacture of cellulose sulfate with improved characteristics
US20110280914A1 (en) Hydrogels crosslinked with gold nanoparticles and methods of making and using thereof
KR102447714B1 (ko) 액상의 배지 조성물의 제조 방법 및 그것에 이용되는 제조 장치
US20220267480A1 (en) Method for preparing liquid medium composition, and preparation device and kit therefor
Patel et al. Self‐assembly of multiscale anisotropic hydrogels through interfacial polyionic complexation
JP2022130591A (ja) 液状の培地組成物の製造方法および製造装置
CN104225624A (zh) 一种阳离子魔芋多糖核酸药物纳米制剂及制备方法和应用
Eqbal et al. Microfluidics-based generation of cell encapsulated microbeads in the presence of electric fields and spatio-temporal viability studies
JP7010233B2 (ja) 高品質な３次元培養用培地組成物の製造方法、及び３次元培養用培地組成物の保存安定性の評価方法
Heggnnavar Modification of Chitosan Based on Computer Simulation and Its Application as Biomaterial
Morrison Synthesis and Characterization of Double Network Hydrogels Containing Norbornene-Modified Carboxymethyl Cellulose and Cellulose Nanofibrils
CN108752488A (zh) 一种卡拉胶接枝苯硼酸疏水性纳米颗粒的制备方法
Liu et al. Controlled-release of materials in calcium alginate microbeads prepared by microfluidic device

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination