WO2007049576A1

WO2007049576A1 - 細胞培養容器及び細胞培養方法

Info

Publication number: WO2007049576A1
Application number: PCT/JP2006/321095
Authority: WO
Inventors: Taiji Nishi; Go Tazaki; Motohiro Fukuda
Original assignee: Kuraray Co., Ltd.
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2007-05-03
Also published as: JPWO2007049576A1; TW200804588A; JP5161581B2

Abstract

　本発明は、これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる細胞培養容器を提供することを目的とする。本発明にかかる細胞培養容器は、２段以上の凹凸パターンを有する細胞培養容器１０であって、凹凸パターンにより形成される凹部１４の幅が培養細胞の相当直径の１．０倍～４０倍である。２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部１４が、少なくとも１つ以上の隣接する他の凹部１４と互いに連通している。

Description

明細書

細胞培養容器及び細胞培養方法

技術分野

[0001] 本発明は、細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法に関する。

背景技術

[0002] 細胞死は、アポトーシス (apoptosis)と、ネクローシス (necrosis)に大別される。ァポトーシス（apoptosis)とは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良、状態に保っために積極的に弓 Iき起こされる、管理 ·調節された細胞の自殺のことを意味する。生体内では、癌化した細胞 (そのほか内部に異常を起こした細胞）のほとんどは、アポトーシスによって取り除かれ続けており、これにより、ほとんどの腫瘍の成長は未然に防がれていることが知られている。また、生物の発生過程では、あら力じめ決まった時期、決まった場所で細胞死が起こり（プログラムされた細胞死）、これが生物の形態変化などの原動力として働いている力この細胞死もアポト一シスの仕組みによって起こる。例えば、オタマジャクシカも力エルに変態する際に尻尾がなくなるのはアポトーシスによる。線虫では発生において起こるアポトーシスが全て記載されている。さらに免疫系でも自己抗原に反応する細胞の除去など重要な役割を果たすことが知られて、る。

[0003] これに対し、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪ィ匕によって起こる細胞死は、ネクローシス（necrosis)または壊死（えし）と呼ばれ、これと区別される。 Apop tosisの語源はギリシャ語の「apo— (離れて）」と「ptosis (下降）」に由来し、「(枯れ葉などが木から）落ちる」、う意味である。

[0004] 壊死（えし）は、生物の組織の一部分が死ぬことである。通常の死とは違、、体の一部分を構成する細胞だけが死滅する。感染、物理的破壊、化学的損傷、血流の減少などが原因となる。血流減少によるものを特に梗塞と呼ぶ。細胞の死ではあっても、血球、皮膚、消化管の粘膜上皮のように正常な細胞、組織が次々に補充され機能的な障害、組織学的な異常を残さないものは壊死と呼ばない。壊死した組織は、生体の免疫系によって最終的には取り除かれ、欠損部分は元の糸且織が再生したり線維化したりすることで補われる。

[0005] このような細胞を検査、試験するためには、通常、組織から単離した細胞を培養する必要がある。組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くは細胞培養の方法により培養皿や試験管の中で培養が行われている。この培養系の中で種々の検査が行われる。

[0006] これらのアツセィは、通常均一な培養系を設定し、評価する薬物等の量、濃度などを変えてその効果をみるものである。そのため培養に用いる培養容器も一定の均一に形成されたものが用いられる。この培養容器は、培養皿 (細胞培養ディッシュ）というものが一般的に用いられる。培養皿として一般的に用いられているものには、シャーレ、または 6ゥエルプレート、 12ゥエル、 48ゥエル、 96ゥエルの各プレートがある（特許文献 1)。最近の微量化への流れから、更に小口径で多数の培養皿力なる 384ゥエルプレートも使用され始めてヽる。これらの培養皿の底部は平坦な平板状である。

[0007] このように、現在、メディカル、バイオテクノロジー分野などで、培養試験、組織培養を目的に使用されている細胞培養ディッシュ（シャーレ）、プレートなどは、その底面の平板部分を培養面として使用されている。

[0008] しカゝしながら、組織細胞の培養は、底部が平板状の培養皿で行うと、細胞が薄く伸びて方向性のない形状となり、生体内で本来観られる形状や機能を示さなくなつてしまう問題を有していた。例えば、平板状の培養皿や培養容器で脂肪細胞前駆細胞を培養し、分化誘導を行っても目的の脂肪細胞の形状に分化しないという問題を有していた。また、肝細胞ではスフエロイド状の細胞塊を形成しないという問題を有していた。

[0009] 従って平板状では、目的とする効率の良い細胞増殖や細胞分ィ匕が困難なため、平板状表面にサイト力インや細胞外マトリックスを固定ィ匕する方法、特殊な装置を使用する方法が試みられている (特許文献 2、特許文献 3)。

[0010] し力しながら、平板状表面に細胞増殖因子や細胞外マトリックスを固定ィ匕する方法では、初期のみ効率化が上がるが、それを維持できないことや、固定ィ匕方法が煩雑で安定的に製造できず、さらにコストが掛カる問題がある。また、特殊な装置を使用する方法は細胞種により結果が異なり、安定した効率ィ匕が見込めないことや、大掛かりな装置を使用するため操作性が悪いこと、さらにコストが掛カる等の問題がある。

[0011] また、細胞培養ディッシュ (シャーレ）、プレートを用いた培養試験や組織培養において、培養細胞カゝら排出される炭酸ガスなどによる PH変化は、培養細胞の活性に大きな影響を及ぼすことが知られている。このため、長期間培養においては、研究者が定期的 (例えば 2日ごとに)培養液を交換することで、培養細胞の活性を保ってヽる。更に最新の研究例では、常に新鮮な培養液を循環可能なノィオリアクターを作製し、新規な人工臓器代替モデルが提案されている。

[0012] し力しながら、神経細胞や心筋、骨格筋のように再生しない組織のネクローシス (ne crosis)や、皮膚、消化管の粘膜上皮のような再生可能な組織の細胞死を抑制するための因子は明らかにされておらず、新鮮な培養液の交換だけでは、細胞死の抑制が実現できて、な、のが現状である。

[0013] 特に、培養が難しいとされる培養種である、ラットの心筋細胞、神経細胞、角膜細胞などは、新鮮な培養液の交換を行っても、最初に分散 (配置)した細胞数に対する生存率は 20〜40%であるのが現状である。

[0014] 近年、シリコンを材料とした半導体カ卩ェ技術や、フォトリソグラフ法による Ni製スタンパー (原盤)を用いた成形技術の発達によって、ミリからマイクロ、更にはナノレベルの微細化が試みられている。しかしながら、これらの微細加工技術によって製造された細胞培養多ゥエルプレートなどは、サンプルの微量化、集積ィ匕が可能になるものの、培養が難ヽとされる細胞種に対する提案はされてヽなヽ。

特許文献 1：特開平 8— 322593号公報

特許文献 2 :特開 2003— 189843公報

特許文献 3 :特開 2005— 143343公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0015] このように、従来の細胞培養容器では、細胞が薄く伸びた形状をとり，生体内で本来発現する形状や機能を示さなくなってしまい、効率よく，生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分化させることが困難であるという問題があった。さらに、培養が困難な細胞種があるという問題点があった。

本発明が解決しょうとする課題は、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分化させることができる細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法を提供することである。

課題を解決するための手段

[0016] 本発明の第 1の態様に力かる細胞培養容器は、凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、前記凹凸パターンの凹凸により形成される凹部の大きさが培養細胞の相当直径の 1. 0倍〜 40倍であるものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分化させることができる

[0017] 本発明の第 2の態様に力かる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹部が 2段以上の凹凸により形成されることを特徴とするものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分ィ匕させることがでさる。

[0018] 本発明の第 3の態様に力かる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記 2段以上の凹凸により形成される凹部の底部の大きさが培養細胞の相当直径の 1 . 5倍〜 10倍であるものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分化させることができる。

[0019] 本発明の第 4の態様に力かる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器にお!、て、前記 2段以上の凹凸のうち少なくとも 1段以上で形成される凹部が、少なくとも 1つ以上の隣接する他の凹部と互いに連通することを特徴とするものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分ィ匕させることができる。

[0020] 本発明の第 5の態様に力かる細胞培養容器トは、上記の細胞培養容器において、前記 2段以上の凹凸により形成される凹部の最下段の高さが 1 μ πι〜100/ζ mであることを特徴とするものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または zおよび分化させることができる。

[0021] 本発明の第 6の態様に力かる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹凸により形成される凹部の底部に培養細胞の相当直径の 0. 001〜0. 9倍の大きさの凹みを複数有することを特徴とするものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分化させることができる。

[0022] 本発明の第 7の態様に力かる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器にお!、て、前記凹みの高さが 0. 1 111〜50 111でぁることを特徴とするものでぁる。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分ィ匕させることができる。

[0023] 本発明の第 8の態様に力かる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器にお!、て、前記凹凸により形成される凹部の高さが 1 μ πι〜200/ζ mであることを特徴とするものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または/および分ィ匕させることができる。

[0024] 本発明の第 9の態様に力かる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器にお!、て、前記凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とするものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分ィ匕させることができる。

[0025] 本発明の第 10の態様に力かる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、容器素材が透明材料であることを特徴とするものである。これにより、観察を容易に行うことができる。

[0026] 本発明の第 11の態様に力かる細胞の培養方法は、上記の細胞培養容器において、細胞培養容器に設けられた凹部に、細胞を注入して、前記細胞を培養するものである。これにより、効率よぐ生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または/および分ィ匕させることができる。

発明の効果

[0027] 本発明によれば、効率よく，生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または Zおよび分化させることができる細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法を提供することである。

図面の簡単な説明

[0028] [図 1]本発明の実施の形態 1にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。

[図 2]本発明の実施の形態 1にかかる細胞培養容器の構成を示す断面図である。

[図 3]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。

[図 4]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の構成を拡大して示す平面図である。

[図 5]本発明の実施の形態 2にかかる細胞培養容器の構成を断面図である。

[図 6]本発明の実施例 1にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。

[図 7]本発明の実施例 2にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。

[図 8]本発明の実施例 3にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。

[図 9]本発明の実施例 4にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。

符号の説明

[0029] 10 細胞培養容器、 11 第 1の凸部、 12 第 2の凸部、 13 凸部、 14 凹部、

15 第 1の凸部の側壁、 16 第 2の凸部の側壁、 17 凹み

発明を実施するための最良の形態

[0030] 組織細胞の培養を現在、市販されて!ヽる細胞培養皿 (シャーレ、またはゥエルプレート）上で行うと、培養細胞は薄く伸びて方向性のない形状となる。研究者は、細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出による PHの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等によって、生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データとを比較することを試みている力生体組織のデータを示す値が、培養皿では再現できていないのが現状である。したがって、市販されている細胞培養皿上での培養では、生体内では持って、た機能を培養細胞が示して、な、と判断されて、る

[0031] そこで、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持って、た機能を発現せしめるための研究が開始されたところである。さらなる課題は、その細胞を効率良く増殖および Zまたは分化させることである。 [0032] 本発明に係る細胞培養容器を用いた培養方法によると、微細凹凸パターンを設けることにより、生体内と同様な立体的な生育が可能であることに加え、微細凹凸により形成された立体的区画により細胞自身が産生する細胞増殖因子および Zまたは分化誘導因子等の生理活性ィ匕物質を生体内と類似した濃度で培養できるため、生体内の細胞周囲の環境を模倣することが可能である。微細凹凸パターンは、例えば、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間を有し、さらに、側壁に開口部を設けることで、複数の空間が連通した連結構造を形成することにより、実現可能である。側壁を複数有することで、複数の空間を作製し、要求される用途に応じて空間の大きさを設定する。

[0033] 培養する細胞種に応じ、側壁、空間、開口部の寸法を設定することにより、多様な培養系において適用可能になると推測される。開口部とは、側壁によって形成された空間（凹部）同士が、連通するための構造を開口部とする。

[0034] 側壁によって形成される空間の寸法は、細胞を培養する目的にお!、て最適な範囲であることが必要である。側壁によって形成される空間が、大きすぎると、細胞は平板上での培養と同様、薄く伸びて立体的な構造を示さず、空間が小さすぎると、その空間に細胞が入ることができなくなる。従って、空間の寸法は、培養する細胞種に応じて、単一、または複数個が収納できる範囲とすることが望ましい。

[0035] 本発明者らは、鋭意研究した結果、特定のマイクロパターン形状にお!、て、細胞が産生する物質を拡散防止することによって、培養細胞の生存率を飛躍的に向上可能であることを見出し、本発明に至った。

[0036] 細胞は、その培養過程にお!、て、フイブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチンと、つた物質を産生して、る。炭酸ガスの排出による PH変化は培養細胞にぉ、て、その活性低下の要因になる反面、これらの産生物質は基質材料に使用されるなど、細胞の基質表面の接着、および分化'増殖に欠かすことのできない材料でもある。

[0037] 本発明者らは、細胞培養容器に複数のマイクロパターンを形成し、そのパターンの側壁下部で細胞を培養することにより、細胞の産生物質の拡散を防止し、細胞の生存率を高めることに成功した。

[0038] 細胞の産生物質の拡散を防止し、細胞の生存率を高めることが目的であり、更に将来には、細胞培養株の生産性を高めることが期待される。したがって、本発明におけるマイクロパターンは、培養面積内における側壁下部の長さをいかに確保するかが課題となる。

[0039] 側壁間の下部の幅は、単一細胞の最小サイズ力〜 5 μ mであることから、例えば、

2 μ m以上であることが望ま Uヽ。

[0040] 側壁の幅は、培養面積内における側壁下部の長さを確保するために、できるだけ狭いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、例えば、： L m以上とすることが望ましい。

[0041] 側壁の高さは、産生物質の拡散を抑制する観点から、例えば、 1 μ m以上であることが望ましい。

[0042] 各段の凸部の幅と高さの比は、産生物質の拡散を防止する目的で、できるだけ高いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、高さ Z幅の比は、 1Z1〜2 OZlのな力から選択することが望ましい。

[0043] さらに、本発明にかかる細胞培養容器は、人工臓器の代替となるバイオリアクターなどに対しても有効である。基板を重ね合わせることで、培養液を還流する空間を形成する際、培養細胞の産生物質の拡散を防止するための側壁よりも高い橋梁を、側壁と直行するように設け、培養液を側壁と直行する向きに流すことで、培養細胞からの炭酸ガスの放出による ΡΗ変化を防止し、かつ培養細胞の産生物質の拡散が可能となる。

[0044] 以下に、本発明の実施の形態にカゝかる細胞培養容器について図を参照して説明する。

[0045] 発明の実施の形態 1.

以下、本発明の実施の形態 1にかかる細胞培養容器の具体的な形状について図 1 及び図 2を用いて説明する。図 1は、本実施の形態に力かる細胞培養容器の構成の一例を示す平面図であり、図 2は図 1の Α— A'断面図である。もちろん、図 1及び図 2 に示す構成は、本発明にかかる細胞培養容器の一例であり、図示した構成に限定されるものではない。

[0046] 細胞培養容器には、凹凸パターンが形成されている。凹凸パターンは 2段の階段状に形成されている。従って、細胞培養容器の培養面には、 2段の凸部 13が形成される。すなわち、格子状に形成された第 1の凸部 11の上に直方体状の第 2の凸部 12 がマトリクス状に形成されている。この第 1の凸部 11及び第 2の凸部 12によって形成される空間が凹部 14となる。すなわち、隣接する第 1の凸部 11の間の空間及び第 2 の凸部の間の空間が凹部 14になる。第 1の凸部 11の側壁 15と隣接する第 1の凸部 11の側壁との間及び第 2の凸部 12の側壁 16と隣接する第 2の凸部 12の側壁 16との間の空間により、細胞を培養するための凹部 14が形成される。第 1の凸部 11の側壁 15及び第 2の凸部 12の側壁 16は底面に対して略垂直に形成されている。従って、凹部 14は 2段の凹凸を有する階段状となる。

[0047] 第 1の凸部 11は、図 1に示すように矩形状の凹部 14の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第 2の凸部 12は、隣接する凹部 14の間の第 1の凸部 11の上に島状に配置されている。第 2の凸部 12は、矩形状の凹部 14の四辺のそれぞれに対して設けられている。なお、凹部 14の形状は矩形状に限らず、多角形状、円形状、楕円形状又はこれらの複合形状等であってもよ!/ヽ。

[0048] なお、凹凸パターンを 2段以上とし、凹部 14を 2段以上の凹凸力も形成することが好ましい。すなわち、凹部 14を 2段以上の階段状としてもよい。もちろん、凹部 14は 1 段であってもよぐ 3段以上であってもよい。これにより、培養に好適な形状とすることができる。

[0049] 凹凸パターンの凹凸により形成される凹部 14の大きさ（幅、奥行き）は培養細胞の相当直径の 1. 0倍〜 40倍であることが好ましい。すなわち、隣接する凸部 13の間の間隔が培養細胞の相当直径の 1. 0〜40倍であること好ましい。換言すると、凹部 14 の幅が培養細胞の相当直径の 1. 0〜40倍であることが好ましい。また、隣接する第 1の凸部 11の側壁 15間の幅は、単一細胞の最小サイズ力〜5 μ mであることから、例えば、 2 m以上であることが望ましい。さらに、凹部 14の底部の大きさ（幅、奥行き）を培養細胞の相当直径の 1. 5倍〜 10倍とすることが好ましい。すなわち、第 1の凸部 11で形成される空間の幅を培養細胞の相当直径の 1. 5倍〜 10倍とすることが好ましい。換言すると、隣接する第 1の凸部 11で形成される間の間隔を培養細胞の相当直径の 1. 5〜： LO倍とすることが好ましい。これにより、培養に好適な大きさとすることができる。

[0050] また、 2段の凹部 14は、少なくとも 1つ以上の隣接する 2段の凹部 14と互いに連通することが好ましい。ここでは、第 1の凸部 11の上側で隣接する 2段の凹部 14が連通している。すなわち、隣接する第 2の凸部 12の側壁 16間の空間で隣接する 2段の凹部 14とを連通させている。具体的には、第 1の凸部 11を格子状に設けて、その上に島状の第 2の凸部 12を点在させる。これにより、第 2の凸部 12によって空間が完全に隔てられることがなくなるため、第 1の凸部 11の上の空間によつて隣接する 2段の凹部 14が連通する。また、凹部 14を 2段以上とした場合、 1段以上で形成される空間が、少なくとも隣接する凹部 14で互いに連通していることが好ましい。すなわち、 2段以上の凹凸のうち少なくとも 1段以上で形成される凹部が、隣接する他の凹部と互いに連通することが好ましい。この場合、最も上側の凸部を下側の凸部の上に島状に形成することによって、凹部 14を連通させることができる。凹部 14を形成する少なくとも 1段の高さで、隣接する凹部 14が連通する。このように、凹凸パターンに開口部を設け、凹部を互いに連通させることが好ましい。もちろん、凹部は、 1つ以上の他の凹部と連通していればよい。これにより、培養に好適な形状とすることができる。

[0051] また、凹部 14の高さを 1〜200 /ζ πιとすることが好ましい。すなわち、第 1の凸部 11 の高さと第 2の凸部 12の高さの和を 1〜200 mとすることが好ましい。これにより、培養に好適な大きさとすることができる。

[0052] また、第 1の凸部 11の高さを 1〜： LOO /z mとすることが好ましい。すなわち、階段状の凹部 14の最下段の高さを 1〜： LOO /z mとすることが好ましい。これにより、凹部 14 の底部の高さが 1〜： LOO /z mとなり、培養に好適な大きさとすることができる。

[0053] 凸部 13の幅は、培養面積内における側壁の長さを確保するために、できるだけ狭いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、例えば、： L m以上とすることが望ましい。具体的には、第 2の凸部 12の幅を 1 m以上とする。換言すると、第 2の凸部 12を構成する 2つの側壁 16間の間隔を l /z m以上とする。また、第 1の凸部 11の幅は、第 2の凸部 12以上であればよい。すなわち、第 2の凸部 12が第 1の凸部 11の上で、第 1の凸部 11よりもはみ出ていなければよい。

[0054] 凹部 14の高さは、産生物質の拡散を抑制する観点から、例えば、 1 μ m以上であることが望ましい。すなわち、第 1の凸部 11と第 2の凸部 12のの高さの和が 1 μ m以上であることが好ましい。さらに、凹部 14の高さを 200 m以下とすることが好ましい。

[0055] 第 2の凸部 12の幅と高さの比は、産生物質の拡散を防止する目的で、できるだけ高いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、高さ Z幅の比は、 1/1 〜20Zlのな力から選択することが望ましい。すなわち、第 2の凸部 12の高さが第 2 の凸部 12の幅の 1〜20倍とすることが望ましい。さらに、第 1の凸部の高さ Ζ幅も 1Z l〜20Zlとすることが好ましい。これにより、精度よく細胞培養容器を生産することができる。

[0056] さらに凹凸パターンが設けられた領域に表面処理を行うことが好ましい。すなわち、凸部 13の上面及び側面、並びに、隣接する凸部 13の間の底面に表面処理を行うことが好ましい。表面処理としては、例えば、有機材料または無機材料のコーティング処理を行うことができる。有機材料または無機材料は目的によって適宜公知の材料を選択すればよい。また、紫外線、電子線などの活性エネルギー線で処理したり、その他薬品により直接表面を改質しても良、。

[0057] 細胞培養容器上の凹凸パターンは、シリコンを材料とした半導体加工技術や、フォトリソグラフ法による Ni製スタンパー (原盤)を用いた成形技術によって形成することができる。例えば、シリコンを材料とした半導体加工技術の場合、シリコン基板上にレジストを塗布し、レジストを露光、現像してレジストをパターユングする。このレジストの上力シリコンをエッチングすることによって、シリコン基板がパターユングされ、凹凸パターンが形成される。そして、レジストを剥離することにより、所望の凹凸パターンを有するシリコン製細胞培養容器が完成する。もちろん、細胞培養容器用の基板はシリコン基板に限らず、ガラス基板ゃ榭脂基板であってもよい。このように半導体加工技術を用いることによって、精度よく凹凸パターンを形成することができる。

[0058] また、 Niスタンパを用いた成形技術の場合、まず、基板上に第 1のレジスト層を塗布、露光し、さらにその上力第 2のレジスト層を塗布、露光する。この第 1のレジスト層及び第 2のレジストを一括原像することによって基板上に凹凸パターンを形成することができる。そして、この凹凸パターンが形成された基板に導電性膜を蒸着法ゃスノッタリング法によって付着する。そして、導電性薄膜の上力金属をメツキにより堆積して金属構造体を形成する。金属構造体を基板から剥離することによってスタンパを形成することができる。このスタンパを用いて成形することによって、高精度の細胞培養溶液を高い生産性で製造することができる。この場合、細胞培養容器は、例えば、榭脂材料により形成される。もちろん、金属構造体を作成するための構造体をシリコン基板やガラス基板などによって形成してもよい。さら〖こ、細胞培養容器の製造方法は、上記の方法に限定されるものではない。具体的には、機械切削や、ガラスへのエッチング処理法などにより、細胞培養容器 10を製造してもよい。これによつて、大面積 '細胞培養株製造も可能となる。また、細胞培養容器の素材をガラスゃ榭脂などの透明材料とすることによって、細胞の観察を容易に行うことができる。

[0059] 上記の構造を有する細胞培養容器 10によって、生体内で本来発現する形状や類似機能を示し，効率よく増殖および Zまたは分化させることができる。さらに、培養細胞の生存率を向上することができる。すなわち、凹部 14に細胞を注入して、培養液を供給することによって、効率よぐ細胞を培養することができる。さらに、安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。

[0060] また、微細凹凸パターンにより形成された空間内で細胞培養を行うことで，生体内で本来発現する立体形状を示すことができ、微細凹凸の立体的区画により細胞自身が産生する細胞増殖因子や分化誘導因子等の生理活性物質の細胞周囲濃度が向上する。このため，効率よく増殖および zまたは分化させる細胞培養容器を提供することができ。さらに透明榭脂素材で作製することで安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。

[0061] また、凹凸パターンを 2段とする細胞培養容器は、人工臓器の代替となるバイオリアクタ一などに対しても有効である。基板を重ね合わせることで、培養液を還流する空間を形成する際、培養細胞の産生物質の拡散を防止するための側壁よりも高い橋梁を、側壁と直行するように設け、培養液を側壁と直行する向きに流すことで、培養細胞からの炭酸ガスの放出による PH変化を防止し、かつ培養細胞の産生物質の拡散が可能となる。

[0062] なお、本実施の形態では、第 1の凸部 11の上に第 2の凸部 12が設けられている構成について説明した力本発明はこれに限るものではない。例えば、第 1の凸部 11 の上に第 2の凸部 12が設けられていない構成でもよい。すなわち、高さの異なる第 1 の凸部と第 2の凸部とが、それぞれ異なる位置に設けられていてもよい。この場合、 2 段以上の階段状の凸部ではなぐ高さの異なる 2種類以上の凸部が設けられている構成となる。

[0063] 発明の実施の形態 2.

本実施の形態に力かる細胞培養容器の構成について図 3、図 4及び図 5を用いて説明する。図 3は、本実施の形態にカゝかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図 4は、図 3に示された点線内の構成を拡大して示す平面図である。図 5は、図 4の B— B'断面図である。なお、実施の形態 1で説明した構成と同様の構成については、説明を省略する。

[0064] 本実施の形態に力かる細胞培養容器 10は実施の形態 1と同様の凹凸パターンが形成されている。従って、第 1の凸部 11及び第 2の凸部 12の形状、寸法については、実施の形態 1と同様であるため説明を省略する。さらに、本実施の形態に力かる細胞培養容器 10には、実施の形態 1で説明した構成に加え、凹部 14の底面に凹み 17 が形成されている。すなわち、隣接する第 1の凸部 11の間において、底面に凹み 17 が設けられている。凹み 17は隣接する第 1の凸部 11の間において、複数設けられている。従って、第 1の凸部 11の側壁 15の近傍において、細胞培養容器 10の断面形状は、 3段の階段状となる。凹み 17は凹部 14の底面にマトリクス状に配置されている

[0065] このように、本実施の形態にカゝかる細胞培養容器 10では、細胞培養容器 10の凹部 14の底面に複数の微細な凹み 17が形成されている。凹み 17の幅は、培養細胞の相当直径以下とすることが好ましい。さらに、凹み 17の幅を、培養細胞の相当直径の 0. 001〜0. 9倍とすること力好ましい。また、四み 17の深さは、 0. 1 /ζ πι〜50 /ζ mであることが好ましい。すなわち、凹み 17によって形成される空間の大きさを培養細胞の相当直径の 0. 001倍以上 0. 9倍以下とし、空間の高さを 0. 1〜50 /ζ πιとすることが好ましい。

[0066] また、凹凸パターンを 2段あるいは 3段以上としてもよい。凹凸パターンを 2段構成とする場合、凹部 14を設けるための第 1の凸部 11を形成する。そして、第 1の凸部 11 によって形成された凹部 14の底面に複数の凹み 17が配設される。

[0067] 第 1の凸部 11及び第 2の凸部 12は、実施の形態 1と同様の形状とすることができる。すなわち、凹部 14及び凸部 13の寸法は、実施の形態 1で示した範囲とすることが好ましい。凹凸パターンが設けられている領域に表面処理を行ってもよい。また、本実施の形態にカゝかる細胞培養容器 10は、実施の形態 1で示した製造方法と同様の方法により、製造することができる。

[0068] 上記の構造を有する細胞培養容器 10によって、生体内で本来発現する形状や類似機能を示し，効率よく増殖および Zまたは分化させることができる。さらに、安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。従って、実施の形態 1と同様の効果を得ることができる。

[0069] 次に本発明にかかる細胞培養容器の実施例について図 6〜図 9を用いて説明する

[0070] [実施例 1]

実施例 1にかかる細胞培養容器の形状について図 6を用いて説明する。図 6は、本実施例にカゝかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。図 6では、 2段の階段状の凸部 13がー列に並んで設けられて、る。凸部 13のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられて、る。隣接する凸部 13の間の凹部 14は培養液が流れる凹溝となる。隣接する凹部 14は、凸部 13の外側で互いに連通している。ここで、隣接する凸部 13 の間の凹部 14が細胞を培養するための培地 Sとなる。図 6に示す形状にすることによつて、飛躍的な培地の確保が可能となる。なお、細胞培養容器の表面上において、複数の凸部 13が配列されて、る方向を幅方向とし、それと直交する方向を奥行き方向とする。ここで、第 1の凸部 11と第 1の凸部 11の上に設けられた第 2の凸部 12の奥行き方向の大きさは略一致している。

[0071] 図 6に示すように、細胞培養容器 10の奥行き方向の大きさを A、細胞培養容器の幅を B、細胞培養容器 10の厚み（高さ）を C、第 1の凸部 11の奥行き方向の大きさを d 、第 1の凸部 11の幅を e、第 1の凸部 11の高さを f、隣接する第 1の凸部 11間の間隔を gとする。ここで、本実施例に力かる細胞培養容器 10における A、 B、 C、 d、 e、 f及び gの好適な値を表 1に示す。 [0072] [表 1]

[0073] 表 1には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表 1に示す寸法の範囲に凸部 13及び細胞培養容器 10の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、 fZeが 1/1〜20/1とする。すなわち、第 1の凸部 11の高さを幅の 1倍〜 20倍とする。さらに、第 2の凸部 12の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第 2の凸部 12の間隔も d〜gと同様の範囲に設定する。なお、第 1の凸部 11が第 2の凸部 12よりも小さくなるように設定する。すなわち、第 2の凸部 12の奥行き方向の大きさ及び幅が第 1の凸部 11の奥行き方向の大きさ及び幅よりもそれぞれ大き、値になるように設定すればょ、。

[0074] [実施例 2]

実施例 2にかかる細胞培養容器の形状について図 7を用いて説明する。図 7は、本実施例にカゝかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。図 7では、 2段の階段状の凸部 13がマトリクス状に配列されている。すなわち、本実施例では、細胞培養容器 10が第 1の凸部 11の上に、第 1の凸部 11よりも小さい第 2の凸部 12が配置された構成を有している。この第 1の凸部 11及び第 2の凸部 12からなる凸部 13がマトリクス状に配列されている。隣接する凹部 14は、第 1の凸部 11の上側で互いに連通している。凸部 13と凸部 13との間の凹部 14において、細胞が培養される。すなわち、凹部 1 4が細胞の培地となる。図 7に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。

[0075] 図 7に示すように、細胞培養容器 10の奥行き方向の大きさを A、細胞培養容器の幅を B、細胞培養容器 10の厚み（高さ）を C、第 1の凸部 11の奥行き方向の大きさを d 、第 1の凸部 11の幅を e、第 1の凸部 11の高さを f、隣接する第 1の凸部 11間の間隔を gとする。ここで、本実施例に力かる細胞培養容器 10における A、 B、 C、 d、 e、 f及び gの好適な値を表 2に示す。

[0076] [表 2] 寸法（ im)

培 ¾試験培養株製造、組織培楚

A 3,000〜 150,000 150,000〜 2,000,000 B 3,000〜 150,000 150,000-2,000,000

C 100〜 100,000 100〜 20,000 d 1〜150,000 1〜 2,000,000

e 1〜 1 ,500 1〜 2,000

1〜1 '500 1〜 2,000

g 2〜 3,000 2〜 3,000 f/e 1 /1 ~20/1 1/1〜20/1

[0077] 表 2には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表 2に示す寸法の範囲に凸部 13及び細胞培養容器 10の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、 fZeが 1/1〜20/1とする。すなわち、第 1の凸部 11の高さを幅の 1倍〜 20倍とする。さらに、第 2の凸部 12の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第 2の凸部 12の間隔も d〜gと同様の範囲に設定する。なお、第 1の凸部 11が第 2の凸部 12よりも小さくなるように設定する。すなわち、第 2の凸部 12の奥行き方向の大きさ及び幅が第 1の凸部 11の奥行き方向の大きさ及び幅よりもそれぞれ大き、値になるように設定すればょ、。

[0078] [実施例 3]

実施例 3にかかる細胞培養容器の形状について図 8を用いて説明する。図 8は、本実施例にカゝかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。本実施例では、人口臓器代替などを目的とした、バイオリアクターなど、培養液を循環させることができるモデルについて説明する。図 8では、第 1の凸部 11と第 1の凸部 11よりも高い第 2の凸部 12がそれぞれ異なる箇所に設けられている。すなわち、高さの異なる第 1の凸部 1 1と第 2の凸部 12とが別々に設けられている。具体的には、第 2の凸部 12が細胞培養容器 10の両端にそれぞれ設けられ、その間に複数の第 1の凸部 11が設けられている。第 2の凸部 12は、細胞培養容器 10の端縁に沿って設けられている。細胞培養容器 10の両端に設けられた第 2の凸部 12は、中央に設けられた第 1の凸部 11よりも高くなつている。すなわち、第 2の凸部 12が第 1の凸部 11の側壁 16よりも高い橋梁となる。これにより、 PHの維持、細胞力もの産出物質の拡散防止が可能となる。

[0079] 第 1の凸部 11は、第 2の凸部 12が設けられている方向に沿って 1列に配列されている。そして、各々の第 1の凸部 11は、第 2の凸部 12が設けられている方向と直交する方向に設けられて、る。凸部 13のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられて、る。隣接する凸部 13の間の凹部 14は培養液が流れる凹溝となる。これにより、第 2の凸部 12と直交する方向に培養液が流れる。すなわち、細胞培養容器 10の中央部を介して一端力他端へ、培養液が流れる。これにより、産出物質の拡散防止が可能となる。また、隣接する凹部 14は、第 1の凸部 11の上側で互いに連通している。これにより、培養液を循環させることができる。

[0080] 図 8に示すように、細胞培養容器 10の奥行き方向の大きさを A、細胞培養容器 10 の幅を B、細胞培養容器 10の厚み（高さ）を C、第 1の凸部 11の奥行き方向の大きさを d、第 1の凸部 11の幅を e、第 1の凸部 11の高さを f、隣接する第 1の凸部 11間の間隔を gとする。本実施例にカゝかる細胞培養容器 10における A、 B、 C、 d、 e、 f及び gの好適な値を表 3に示す。

[0081] [表 3] 寸法（ m)

培養試験培養株製造、組織培養

A 3,000〜 150,000 150,000〜2,000,000

B 3,000〜 150,000 150,000〜2,000,000

C 100〜 100,000 100〜200,000 d 1〜1，500 1〜 2,000,000

e 1〜1，500 1〜 2,000

f 1〜 1 ,500 1〜 2,000

g 2〜3,000 2〜 3,000 f/e 1 /1〜2(V1 1 /1〜20/1

[0082] 表 3には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表 3に示す寸法の範囲に凸部 13及び細胞培養容器 10の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、 fZeが 1/1〜20/1とする。すなわち、第 1の凸部 11の高さを幅の 1倍〜 20倍とする。さらに、第 2の凸部 12の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第 2の凸部 12の間隔も d〜gと同様の範囲に設定する。

[0083] [実施例 4]

実施例 4にかかる細胞培養容器の形状について図 9を用いて説明する。図 9は、本実施例にカゝかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。本実施例では、人口臓器代替などを目的とした、バイオリアクターなど、培養液を循環させることができるモデルについて説明する。本実施例では、実施の形態 2に対応する細胞培養容器 10 の構成について説明する。図 9に示すように、細胞培養容器 10には、第 1の凸部 11 によって形成される凹部 14の底面に複数の凹み 17が設けられている。

[0084] 細胞培養容器 10の両端には、それぞれ第 1の凸部 11が設けられている。すなわち、 2つの第 1の凸部 11はそれぞれ細胞培養容器 10の端辺に沿って設けられている。そして、隣接する第 1の凸部 11の間には、複数の凹み 17がマトリクス状に配列されている。第 1の凸部 11は凹み 17の側壁よりも高い橋梁となる。 [0085] 図 9に示すように、細胞培養容器 10の奥行き方向の大きさを A、細胞培養容器 10 の幅を B、細胞培養容器 10の厚み（高さ）を C、凹み 17の奥行き方向の大きさを d、凹み 17の幅を e、凹み 17の高さを f、隣接する凹み 17の間の間隔を gとする。ここで、本実施例にカゝかる細胞培養容器 10における A、 B、 C、 d、 e、 f及び gの好適な値を表 3に示す。

[0086] [表 4]

[0087] 表 4には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表 4に示す寸法の範囲に凸部 13及び細胞培養容器 10の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、 fZeが 1/1〜20/1とすることが好ましい。すなわち、凹み 17の深さを幅の 1倍〜 20倍とする。さらに、第 1の凸部 1 1の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第 1の凸部 11の間隔も d〜 gと同様の範囲に設定する。

産業上の利用可能性

[0088] 本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。

Claims

請求の範囲 [I] 凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、前記凹凸パターンの凹凸により形成される凹部の大きさが培養細胞の相当直径の

1. 0倍〜 40倍である細胞培養容器。

[2] 前記凹部が 2段以上の凹凸により形成されることを特徴とする請求項 1記載の細胞培養容器。

[3] 前記 2段以上の凹凸により形成される凹部の底部の大きさが培養細胞の相当直径の 1. 5倍〜 10倍である請求項 2記載の細胞培養容器。

[4] 前記 2段以上の凹凸のうち少なくとも 1段以上で形成される凹部が、少なくとも 1つ以上の隣接する他の凹部と互いに連通することを特徴とする請求項 2又は 3記載の細胞培養容器。

[5] 前記 2段以上の凹凸により形成される凹部の最下段の高さが： L m〜100 μ mであることを特徴とする請求項 2〜4記載の細胞培養容器。

[6] 前記凹凸により形成される凹部の底部に培養細胞の相当直径の 0. 001〜0. 9倍の大きさの凹みを複数有することを特徴とする請求項 1乃至 5のいずれかに記載の細胞培養容器。

[7] 前記凹みの高さが 0. 1 μ m〜50 μ mであることを特徴とする請求項 6記載の細胞培養容器。

[8] 前記凹凸により形成される凹部の高さが: L m〜200 mであることを特徴とする請求項 1乃至 7のいずれかに記載の細胞培養容器。

[9] 前記凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とする請求項 1乃至 8 ヽずれかに記載の細胞培養容器。

[10] 容器素材が透明材料であることを特徴とする請求項 1〜9のいずれかに記載の細胞培養容器。

[II] 請求項 1乃至 10のいずれかに記載の細胞培養容器に設けられた前記凹部に、細胞を注入して、前記細胞を培養する細胞培養方法。