WO2019039485A1 - 細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法 - Google Patents

細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法 Download PDF

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WO2019039485A1
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cell sheet
forming member
cell
sheet forming
flat
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PCT/JP2018/030896
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寿子 得能
弘毅 本郷
啓 篠塚
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王子ホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a cell sheet forming member for forming a cell sheet, a method of manufacturing a cell sheet forming member, and a method of manufacturing a cell sheet.
  • a cell culture substrate provided with a plurality of space structures partitioned by fine side walls is used to extend the cells in a direction in which the space structures communicate with each other. Control the orientation of the cells by aligning the orientation.
  • the flat surface such as the side wall surface or the upper surface of the sidewall functions as a pseudo scaffold for cell culture, whereby the extension direction of the cells cultured in the cell culture substrate is flat. Aligned in the extension direction of the face.
  • the bottom surface of the space structure is also a flat surface, and the bottom surface of the space structure is a surface continuous with the side wall surface. It also spreads in different directions. Therefore, in the above-described cell culture substrate, the cell extending direction is easily aligned in the direction in which the flat surfaces are continuous and in the direction in which the flat surfaces extend, that is, in the direction other than the extending direction of the side wall surface. By the way, in terms of aligning the cell extension direction, the problem still remains.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a cell sheet-forming member capable of improving the orientation of cells in the cell sheet, a method for producing the cell sheet-forming member, and a cell sheet It is to provide a manufacturing method of
  • the cell sheet formation member for solving the said subject is equipped with the surface for forming a cell sheet, and the said surface is equipped with several flat parts and several uneven parts.
  • Each flat portion has a shape extending in a first direction, and the plurality of flat portions are aligned in a second direction intersecting the first direction on the entire surface.
  • any one of a convex part and a crevice is a level difference structure, each concavo-convex part includes a plurality of the above-mentioned level difference structure which fills between the flat parts which adjoin each other, and a pitch of the level difference structure is 100 nm or more It is below.
  • the manufacturing method of a cell sheet formation member for solving the above-mentioned subject includes forming an intaglio and forming the surface of the cell sheet formation member for forming a cell sheet by transfer of the above-mentioned intaglio.
  • the intaglio plate has a shape extending in a first direction, and a plurality of flat portions aligned in a second direction crossing the first direction across the entire surface, and any one of a protrusion and a recess are steps
  • the uneven structure includes a plurality of the step structures filling the space between the flat portions adjacent to each other, and the pitch of the step structures is 100 nm or more and 10 ⁇ m or less.
  • forming the intaglio includes forming the uneven portion using at least one of a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method.
  • the method for producing a cell sheet for solving the above problems comprises using the cell sheet-forming member to form a cell sheet in which adhesion to one of the flat portion and the uneven portion is more dominant than adhesion to the other. Adhering to the surface of the member, forming a cell sheet on the surface of the cell sheet forming member, and exfoliating the cell sheet from the surface of the cell sheet forming member.
  • the flat portion and the uneven portion constitute a surface for forming a cell sheet, and have a relationship in which one is divided by the other. Therefore, even in cells in which adhesion to a flat portion is dominant or in cells to which adhesion to a concavo-convex portion is dominant, cells adhere preferentially to one structure while adhesion to the other structure is inferior It becomes. Therefore, the structure of the cell sheet forming member in which one structure defines the other structure is combined with the cell property that the adhesiveness differs between the flat portion and the uneven portion, and the extension direction of both structures In the first direction, the cell extension direction is aligned.
  • the cell sheet spreading in a two-dimensional direction it is possible to align the cell extension direction in a one-dimensional direction, that is, to improve the cell orientation.
  • the surface of a cell sheet formation member is provided with the flat part and the uneven part, the cell sheet formation common to both the cell in which adhesion to the flat part is dominant and the cell in which the adhesion to the uneven part is dominant It is also possible to apply the member, that is, to improve the versatility of the cell sheet forming member.
  • the step structure is a convex portion
  • the concavo-convex portion includes a plurality of the convex portions on a bottom surface of a concave portion sandwiched by the flat portions adjacent to each other, and a tip of each convex portion
  • the surface may be flush with the flat portion.
  • the difference between the height of the tip end surface of the uneven portion and the height of the flat portion may be 0.5 ⁇ m or less, preferably 0.3 ⁇ m or less.
  • the top surface of the uneven portion is flush with the flat portion, or the difference in height between the end surface of the uneven portion and the flat portion is 0.5 ⁇ m or less, preferably 0.3 ⁇ m or less Therefore, in the cell sheet formed so as to cover the uneven portion and the flat portion, it is also possible to improve the flatness of the cell sheet.
  • the step structure has a circular shape when viewed from the direction opposite to the surface, and the diameter of the step structure is 50% or more and 100% or less of the pitch,
  • the aspect ratio of the structure may be 0.1 or more and 10 or less.
  • the cells cultured in the cell sheet-forming member are not particularly limited, but at least one of myoblasts, fibroblasts and cardiomyocytes, which are present with particular orientation in vivo, is more suitable.
  • the length in the short side direction of the flat portion may be 10 ⁇ m to 50 ⁇ m, and the length in the short side direction between the flat portions adjacent to each other may be 10 ⁇ m to 50 ⁇ m. According to this configuration, the length of the flat portion in the short side direction and the length of the uneven portion in the short side direction are large enough to control the orientation of myoblasts, fibroblasts and cardiomyocytes. Have Therefore, in the sheet of myoblasts, the sheet of fibroblasts, and the sheet of cardiomyocytes, it is possible to improve the orientation of each.
  • the surface of the cell sheet forming member may have hydrophilicity or hydrophobicity.
  • the surface of the cell sheet forming member may be made of metal or organic matter.
  • FIG. 7 is a process diagram for describing an example of a method for producing the cell sheet forming member of FIG. 1.
  • A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet using the cell sheet formation member of FIG.
  • FIG. (A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet using the cell sheet formation member of FIG.
  • (A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet using the cell sheet formation member of FIG.
  • a cell sheet forming member a method of manufacturing the cell sheet forming member, and a method of manufacturing the cell sheet will be described.
  • the configuration of the cell sheet forming member will be described, and then, a method of manufacturing the cell sheet forming member and a method of manufacturing the cell sheet will be described.
  • the cell sheet formation member 100 is a sheet material mounted in the culture dish 110 of a petri dish, for example.
  • the petri dish holds the cell suspension in the space surrounded by the culture dish 110 and the lid 120.
  • Examples of cells contained in the cell suspension are myoblasts, fibroblasts and cardiomyocytes.
  • the surface 111 of the cell sheet formation member 100 is equipped with the several flat part 130 and the several uneven part 140.
  • the concavo-convex portion 140 is configured to include a plurality of step structures, and the plurality of step structures fill in between the flat portions 130 adjacent to each other.
  • the step structure is a protrusion or a recess.
  • the step structure in the present embodiment is a convex portion 141.
  • the uneven portion 140 includes a concave portion sandwiched by the flat portions 130 adjacent to each other, and a plurality of convex portions 141 located on the bottom surface of the concave portion.
  • the plurality of convex portions 141 are provided on the bottom surface of the concave portion corresponding to the portion sandwiched between the flat portions 130 adjacent to each other in the cell sheet forming member 100.
  • each flat part 130 is a flat surface extended in the 1st direction (up-down direction of FIG.1 (c)) which is one direction.
  • the plurality of flat portions 130 are arranged in the second direction (the left-right direction in FIG. 1C) orthogonal to the first direction on the entire surface 111.
  • Each uneven portion 140 also extends in the first direction.
  • the plurality of concavo-convex portions 140 are arranged in the second direction on the entire surface 111.
  • Each convex part 141 which is a component of the uneven part 140 is located in each vertex of a triangular lattice, for example, seeing from the direction which opposes the surface 111.
  • Each uneven portion 140 repeats such an arrangement of the convex portions 141 in the first direction and the second direction. If it is the concavo-convex part 140 in which the convex part 141 is located at each vertex of the triangular lattice, the master for forming the convex part 141 is a mask suitable for forming a minute repetitive structure, for example, a single particle film It is possible to form by the etching method.
  • each convex portion 141 When viewed from the direction opposite to the surface 111, each convex portion 141 has, for example, a circular shape.
  • the mode of the distance between the centers of the convex portions 141 adjacent to each other is the pitch of the convex portions 141.
  • the maximum width of the convex portion in the plan view shape of the convex portion 141 is the diameter of the convex portion 141.
  • the configuration in which the pitch of the convex portion 141 satisfies the following (A) and (B) is suitable in terms of aligning the extending direction of animal cells, particularly the above-mentioned myoblasts, fibroblasts and cardiomyocytes in the first direction. . That is, the configuration in which the pitch of the convex portion 141 satisfies the following (A) and (B) corresponds to the flat portion 130 and the uneven portion 140 with respect to adhesion of animal cells, in particular, myoblasts, fibroblasts and cardiomyocytes described above. Superiority and inferiority are preferable in the viewpoint of being clearly divided between the flat part 130 and the uneven part 140.
  • a Pitch of convex portion 141 100 nm or more and 10 ⁇ m or less
  • B Diameter of convex portion 141: 50% or more and 100% or less of pitch of convex portion 141: length of each flat portion 130 in the second direction (short side direction) Is the width of the flat portion 130.
  • the length in the second direction (short side direction) between the flat portions 130 adjacent to each other is the width of the uneven portion 140.
  • the width of the flat portion 130 and the width of the concavo-convex portion 140 are, for example, at least 1/10 times and at most 10 times the size (5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less) of cells to be cultured.
  • the configuration in which the width of the flat portion 130 and the width of the concavo-convex portion 140 satisfy the following (C) and (D) is the first extension direction of animal cells, in particular, myoblasts, fibroblasts and cardiomyocytes described above. It is suitable from the viewpoint of making it easy to align in the direction.
  • the uneven portion 140 has convex portions 141 adjacent to each other and The concave portion 142 may be provided between the flat portion 130 and the convex portion 141 adjacent thereto. Since the plurality of convex portions 141 are scattered in the concavo-convex portion 140, the concave portions 142 which are spaces between the convex portions 141 are continuous in the first direction and the second direction in the concavo-convex portion 140.
  • the length between the bottom of the recess 142 and the flat portion 130 is the height of the flat portion 130.
  • the height difference between the tip end surface of each convex portion 141 and the flat portion 130 is a boundary level difference.
  • the height difference between the bottom surface of the concave portion 142 and the tip end surface of each convex portion 141 is the height of the convex portion 141.
  • the height of the flat portion 130 and the height of the convex portion 141 are equal to each other.
  • the ratio of the pitch of the projections 141 to the height of the projections 141 is the aspect ratio of the projections 141.
  • the configuration in which the boundary step satisfies the following (E) is suitable from the viewpoint of enhancing the flatness of the cell sheet.
  • the stability on the structure of the concavo-convex portion 140 can be enhanced; It is suitable in the viewpoint of making formation of the uneven part 140 easy.
  • the uneven portion 140 constitute a surface for forming a cell sheet, and have a relationship in which one is divided by the other. And if it is the structure which satisfy
  • the cell extension direction is aligned with the first direction, which is the extension direction of both structures, by combining these cell features.
  • the cell sheet spreading in a two-dimensional direction along the surface 111 it is possible to align the cell extension direction in a one-dimensional direction, that is, to improve the cell orientation.
  • the configuration satisfying the above (E), in particular, the configuration in which the tip end surface of each convex portion 141 and the flat portion 130 are flush with each other is a cell sheet formed to cover the uneven portion 140 and the flat portion 130. , It is possible to increase the flatness of it. Furthermore, the configuration satisfying the above (F) can further enhance the flatness of the cell sheet.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 is provided with the flat portion 130 and the uneven portion 140, both the cell in which adhesion to the flat portion 130 is dominant and the cell in which adhesion to the uneven portion 140 is dominant. It is also possible to apply a common cell sheet forming member 100. That is, it is also possible to enhance the versatility of the cell sheet forming member 100.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 may be coated with an organic substance containing an adhesion factor such as an extracellular matrix, a polymer, and a gel for the purpose of enhancing the adhesion of cells, or a metal It may be a surface composed of Examples of extracellular matrices include, but are not limited to, laminin, collagen, gelatin, fibronectin, poly-lysine (PDL or PLL), hyaluronic acid and the like.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 may have hydrophilicity or hydrophobicity for the purpose of enhancing the adhesiveness of cells and the flatness of the cell sheet.
  • a stimulus-responsive material may be applied.
  • a temperature responsive polymer whose water affinity changes with temperature change is preferable.
  • PIPAAm poly-N-isopropyl acrylamide
  • the stimulus responsive material may be applied to the substrate using conventional coating methods, or the structure may be processed into the substrate treated with the stimulus responsive material using the methods described below.
  • the method of manufacturing the cell sheet forming member includes the steps of forming the intaglio 150 and forming the surface 111 of the cell sheet forming member 100 by transferring the intaglio 150.
  • the lower surface of the intaglio 150 has a shape extending in a first direction (direction orthogonal to the paper surface), and a plurality of flat portions aligned in a second direction (horizontal direction on the paper surface) intersecting the first direction And an uneven portion formed of a plurality of step structures filling the space between the adjacent flat portions.
  • the flat portion of the intaglio 150 is a portion for forming the flat portion 130 of the cell sheet forming member 100 by transfer.
  • the uneven portion of the intaglio 150 is a portion for forming the uneven portion 140 of the cell sheet forming member 100 by transfer.
  • the step structure of the intaglio 150 is a convex portion or a concave portion.
  • the step structure of the intaglio 150 in the present embodiment is the concave portion 151 for forming the convex portion 141, and the pitch of the concave portion 151 is 100 nm or more and 10 ⁇ m or less.
  • the concavo-convex portion is formed on the silicon substrate for forming the intaglio 150 using at least one of photolithography, colloidal lithography, anodization, and interference exposure. Be done.
  • the intaglio 150 itself may be obtained by one or more transfer from the master.
  • a shape corresponding to the surface shape of the intaglio 150 is formed by using at least one of a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method on a silicon substrate.
  • the lower surface of the intaglio 150 is made to face the surface 111 of the base material 160 for forming the cell sheet forming member 100.
  • the forming material of the base 160 is, for example, a thermoplastic resin or a photocurable resin.
  • the lower surface of the intaglio 150 is pressed against the surface 111 of the substrate 160 in a state where the substrate 160 has fluidity.
  • the intaglio 150 is released from the surface 111 of the substrate 160 in a state where the flowability of the substrate 160 is suppressed. Thereby, the concave portion 151 of the intaglio 150 is transferred to the surface 111 of the base 160, and the flat portion 130 and the uneven portion 140 are formed.
  • An organic substance including an adhesion factor such as an extracellular matrix, a polymer, or a gel is applied to the surface of the thermoplastic resin or the photocurable resin of the forming material of the substrate 160 for the purpose of enhancing the adhesiveness of cells.
  • extracellular matrices include, but are not limited to, laminin, collagen, gelatin, fibronectin, poly-lysine (PDL or PLL), hyaluronic acid and the like.
  • a biomaterial such as polysaccharide or protein may be used as a forming material of the substrate 160.
  • the cell suspension located on the surface 111 of the cell sheet forming member 100 includes, for example, the cell S1 adhering to the flat portion 130.
  • each flat portion 130 extends in the long side direction (first direction) of the uneven portion 140, and the width of each flat portion 130 is about several times the size of a general cell. Therefore, as shown in FIG. 3B, the position of the cell S1 is preferentially distributed within the range of the flat portion 130, and the cell S1 is linearly arranged with the long axis direction of the cell arranged in the first direction. To be connected.
  • FIG. 6 shows an example of myoblasts cultured using the cell sheet forming member 100. In the example shown in FIG. 6, the myoblasts are controlled to extend in one direction.
  • FIG. 7 shows an example of myoblasts cultured using a commercially available cell culture petri dish as a reference example. In the example shown in FIG. 7, the extension directions of the myoblasts are randomly arranged.
  • the cell suspension located on the surface 111 of the cell sheet formation member 100 contains cell S2 adhere
  • each uneven portion 140 extends in the long side direction (first direction) of the uneven portion 140, and the width of each uneven portion 140 is about several times the size of a general cell. Therefore, as shown in FIG. 4B, the position of the cell S2 is preferentially distributed within the range of the concavo-convex portion 140, and the cell S2 is linearly arranged with the long axis direction of the cell arranged in the first direction. To be connected. That is, the extension direction of the cell S2 is controlled to align with the long side direction of the uneven portion 140.
  • the long axis direction of the cell S2 exists in a random direction.
  • the cells of the cell suspension held by the cell sheet forming member 100 have priority over the flat portion 130.
  • the cell S ⁇ b> 1 adheres to the cell S ⁇ b> 1 and is a cell S ⁇ b> 2 which is inferior to the flat part 130 but is permitted to adhere to the uneven part 140.
  • the cell suspension of the cell suspension held by the cell sheet forming member 100 is the cell S2 that adheres preferentially to the concavo-convex part 140 and is inferior to the concavo-convex part 140 but adheres to the flat part 130 Is also a permissive cell S1.
  • the flat portions 130 and the concavo-convex portions 140 extend in the first direction and are alternately arranged in the second direction. Therefore, on the surface 111 of the cell sheet forming member, for example, the orientation of the cell S1 adhered preferentially to the flat portion 130 is controlled by the structure of the flat portion 130 and the structure of the concavo-convex portion 140 which divides it. Be done.
  • the orientation of the cell S2 preferentially attached to the uneven portion 140 is controlled by the structure of the uneven portion 140 and the structure of the flat portion 130 that divides it.
  • the flat portion 130 sandwiched between the uneven portions 140 adjacent to each other is inferior to the uneven portion 140, but the cell S1 adhered to the flat portion 130 reflects the control of the orientation by the uneven portion 140. Be done.
  • the cells S1 and S2 whose orientation is controlled in the first direction form a cell sheet SA which spreads over the entire surface 111.
  • Example 1 Provided ⁇ Production of Cell Sheet Forming Member> First, a nickel intaglio plate for producing the concavo-convex portion 140 of the cell sheet forming member 100 by transfer was produced. Then, using the nickel intaglio plate as a stamper, the concavo-convex portion 140 was processed into a polystyrene sheet by a nanoimprinting method, whereby the cell sheet forming member 100 of Example 1 was produced.
  • the flat portion 130 in the cell sheet forming member 100 of Example 1 has a shape extending in the first direction, and is aligned in a second direction intersecting the first direction on the entire surface of the cell sheet forming member 100. .
  • the width (length in the second direction) of each flat portion 130 was 10 ⁇ m.
  • Each uneven portion 140 is composed of a plurality of step structures filling the space between adjacent flat portions 130, and the length in the second direction between adjacent flat portions 130 is 10 ⁇ m.
  • the pitch of the convex portions 141 was 300 nm. As a result of measuring the height of each convex part in the uneven part 140 using AFM, the average of the height from the bottom of the concave part to the tip of the convex part was 446 nm.
  • the average of the height from the bottom of a recessed part to a flat part was 455 nm. Then, the cell sheet forming member 100 of Example 1 was cut into 10 mm squares, UV irradiation was performed on the cell sheet forming member 100 after cutting, and after this sterilization processing was performed, it was used for a cell culture test.
  • mouse-derived myoblasts (C2C12 cells, manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) were cultured in a cell culture flask (25 cm 2 ). Culturing was carried out at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere using DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum). For recovery of cells, trypsin was used according to a standard method. After counting the number of cells of the collected cells using a hemocytometer, a cell suspension at a concentration of 3.8 ⁇ 10 4 cells / ml was prepared.
  • the cell sheet forming member 100 of Example 1 cut into 10 mm squares was placed on the bottom of the cell culture multiwell plate (24 holes). After 0.5 ml of phosphate buffered saline was dispensed to a multiwell plate, the phosphate buffered saline was removed to wash the cell sheet forming member 100 of Example 1. Subsequently, 0.5 ml of the previously prepared cell suspension was dispensed to seed cells. The multiwell plate seeded with cells was cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere, and medium exchange was performed every two days until reaching confluence. After confirmation of confluence, the tube was replaced with myotube induction medium (DMEM medium, FBS-free) to induce myotube differentiation. As a result, myotube formation was confirmed 2 days after induction of myotube differentiation.
  • myotube induction medium DMEM medium, FBS-free
  • the cells are fixed for 10 minutes at room temperature using 4% paraformaldehyde (phosphate buffered saline), and the solution used for fixation is removed After that, it was washed with phosphate buffered saline. Subsequently, the membrane was treated with phosphate buffered saline containing 0.5% Triton X-100 for 5 minutes at room temperature to perform permeabilization. After washing with phosphate buffered saline, staining was carried out by soaking for 30 minutes in a solution of acti-stain 488 phalloidin (manufactured by Cytoskeleton) diluted to 100 nM.
  • acti-stain 488 phalloidin manufactured by Cytoskeleton
  • the stained cell sheet forming member 100 was washed with phosphate buffered saline and then attached to a slide glass to which a mounting agent (Antifade mounting medium, manufactured by Fluka) was dropped, to prepare a slide glass for observation. Then, the orientation of the cells was observed using a confocal laser microscope (manufactured by Olympus). As a result, in the cell sheet forming member 100 of Example 1, it was observed that the cell extending direction was aligned in one dimension.
  • a mounting agent Antifade mounting medium, manufactured by Fluka
  • Example 2 A cell sheet forming member 100 of Example 2 was produced in the same manner as in Example 1 except that a nickel intaglio plate different from the nickel intaglio plate of Example 1 was used.
  • the width of each flat portion 130 in the cell sheet forming member 100 of Example 2 is 30 ⁇ m, and the length in the second direction between the flat portions 130 adjacent to each other is 30 ⁇ m.
  • the pitch was 600 nm.
  • the average of the height from the bottom of the concave part to the tip of the convex part was 724 nm.
  • the average of the height from the bottom of a recessed part to a flat part was 900 nm.
  • Myoblasts are cultured using the cell sheet forming member 100 of Example 2 in the same manner as in Example 1, and after confirmation of formation of myotubes, the cells are fixed, and a slide glass for observation is produced. did. Then, the orientation of the cells was observed using a fluorescence microscope. As a result, in the cell sheet forming member 100 of Example 2, it was observed that the cell extending direction was aligned in one dimension.
  • Example 3 A cell sheet forming member 100 of Example 3 was produced in the same manner as in Example 1 except that a nickel intaglio plate different from the nickel intaglio plate of Examples 1 and 2 was used.
  • the width of each flat portion 130 in the cell sheet forming member 100 of Example 3 is 50 ⁇ m, and the length in the second direction between the flat portions 130 adjacent to each other is 50 ⁇ m.
  • the pitch was 600 nm.
  • the average of the height from the bottom of the concave part to the tip of the convex part was 717 nm.
  • the average of the height from the bottom of a recessed part to a flat part was 900 nm.
  • Myoblasts are cultured using the cell sheet forming member 100 of Example 3 in the same manner as in Example 1, and after confirmation of the formation of myotubes, the cells are fixed to prepare a slide glass for observation. did. Then, the orientation of the cells was observed using a fluorescence microscope. As a result, in the cell sheet forming member 100 of Example 3, it was observed that the cell extending direction was aligned in one dimension.
  • Comparative Example 1 The polystyrene sheet was cut into a square of 10 mm to obtain a cell sheet-forming member of a comparative example which is a sheet material having a flat surface without the concavo-convex portion 140. Then, after the cell sheet forming member of Comparative Example 1 was subjected to sterilization treatment by UV irradiation as in Example 1, it was used for a cell culture test.
  • Example 4 First, the cell sheet forming member 100 of Example 1 was cut into 10 mm squares and subjected to sterilization treatment by UV irradiation. Then, the cell sheet forming member 100 was placed on the bottom of the cell culture multiwell plate (24 holes), and fibronectin was further applied. At this time, after immersing in a defined amount of fibronectin coating solution and leaving it to stand overnight at 37 ° C., the cell sheet forming member 100 is washed twice with distilled water, and this is used as the cell sheet forming member 100 of Example 4; Used for cell culture.
  • a cell suspension at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / ml was prepared using a cardiomyocyte culture kit (manufactured by Cosmo Bio Inc.) as cardiac muscle cells derived from a mouse, and the prepared cell suspension was treated with 0. The cells were seeded in 5 ml aliquots. The multiwell plate seeded with cells was cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere, and medium exchange was performed every two days until reaching confluence.
  • a cardiomyocyte culture kit manufactured by Cosmo Bio Inc.
  • the stained cell sheet forming member 100 was washed with phosphate buffered saline and then attached to a slide glass to which a mounting agent (Antifade mounting medium, manufactured by Fluka) was dropped, to prepare a slide glass for observation. Then, the orientation of the cardiomyocytes was observed using a confocal laser microscope (manufactured by Olympus). As a result, in the cell sheet forming member 100 of Example 4, a state in which the cell extending direction was aligned in one dimension was observed.
  • a mounting agent Antifade mounting medium, manufactured by Fluka
  • Comparative Example 2 The cell sheet-forming member of Comparative Example 1 is placed on the bottom of a cell culture multiwell plate (24 holes), and the fibronectin coating is performed on the cell sheet-forming member in the same manner as in Example 4; Was used for cell culture as a cell sheet forming member. That is, cardiomyocytes were cultured in the same manner as in Example 4, and a slide glass for observation was prepared on the sixth day after the start of the culture, and the orientation of the cells was observed. As a result, in the cell sheet forming member of Comparative Example 2, it was recognized that the directions in which the cells were stretched were random.
  • Example 5 A petri dish (product name: UpCell (registered trademark), Cellseed Co., Ltd.) having a thermoresponsive polymer added to the surface of a polystyrene cell sheet-forming member was prepared in the same manner as the cell sheet-forming member of Example 1
  • grooved part 140 was transcribe
  • the width of each flat portion 130 in the cell sheet forming member 100 of Example 5 is 10 ⁇ m
  • the height from the bottom of the concave part to the tip of the convex part was 432 nm. Further, the height from the bottom of the recess to the flat portion was 440 nm. Then, the cell sheet forming member 100 of Example 5 was cut into 10 mm squares, and the cut cell sheet forming member 100 was subjected to a sterilization treatment by UV irradiation, and after this sterilization treatment was used, it was used for a cell culture test. .
  • Example 5 Two types of tests were carried out as culture of myoblasts using the cell sheet forming member 100 of Example 5.
  • myoblasts were cultured using the same method as in Example 1. Then, after confirming the formation of myotubes, a slide glass for observation was prepared, and the orientation of the cells was observed. As a result, it was observed that the cell extension direction was aligned in one dimension.
  • the cell sheet was recovered using the temperature responsive function of the cell sheet forming member 100. That is, the myoblasts after seeding were cultured until they became confluent, and the cell sheet forming member 100 to which the cells were attached was cooled for a predetermined time. Subsequently, the support (product name: CellShifter, manufactured by Cellseed) was adhered to the culture surface of the cell sheet forming member 100, and the cell sheet was peeled from the cell sheet forming member 100 in a state where the cells were attached to the support. The detached cell sheet was allowed to stand on a collagen gel in a state of being attached to a support, and after a certain period of time, only the support was removed. Then, the cell sheet forming member 100 was peeled off, and the cell sheet moved to the collagen gel was observed with a microscope. As a result, it was found that the cell sheet can be recovered in an area of 70% or more of the culture area.
  • Comparative Example 3 A petri dish (product name: UpCell (registered trademark), Cellseed Co., Ltd.) with a thermoresponsive polymer added to the surface of a polystyrene cell sheet-forming member is cut into 10 mm squares and has a flat surface without the uneven portion 140.
  • the cell sheet forming member of Comparative Example 3 was produced.
  • the cell sheet forming member of Comparative Example 3 was placed on the bottom of a multiwell plate for cell culture (24 holes), and in the same manner as in Example 5, the first culture test and the second using myoblasts The culture test was performed. In the first culture test, in the cell sheet forming member of Comparative Example 3, it was found that the directions in which the cells were stretched were random. In the second culture test, it was found that the cell sheet can be recovered in an area of 70% or more of the culture area.
  • the effect listed below is acquired. (1) Whether the cell in which the adhesion to the flat portion 130 is dominant or the cell in which the adhesion to the concavo-convex portion 140 is dominant, the cell preferentially adheres to one structure and adheres to the other structure
  • the cell extension direction is aligned with the first direction which is the extension direction of both structures. As a result, in the cell sheet spreading in a two-dimensional direction, it is possible to align the cell extension direction in a one-dimensional direction, that is, to improve the cell orientation.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 includes the flat portion 130 and the uneven portion 140, both of the cells in which the adhesion to the flat portion 130 is dominant and the cells in which the adhesion to the uneven portion 140 is dominant It is also possible to apply the common cell sheet forming member 100, that is, to improve the versatility of the cell sheet forming member 100.
  • the step between the tip end surface of the uneven portion 140 and the flat portion 130 is 0.5 ⁇ m or less, preferably 0.3 ⁇ m or less, and more preferably flush, the flatness of the cell sheet can be enhanced. It also becomes possible.
  • the orientation of the cell sheet can be further enhanced as long as the height of the tip end surface of the uneven portion is equal to or less than the height of the flat portion. Become.
  • the aspect ratio of the step structure is 0.1 or more and 10 or less, the superiority of adhesion to the flat portion 130 and the superiority of adhesion to the concavo-convex portion 140 are appropriate according to the adhesiveness of the cells. Is easily expressed. Therefore, the effect of improving the orientation of cells is further easily obtained. In addition, mechanical strength in the stepped structure is also secured.
  • the above embodiment may be modified as follows.
  • the shape of the convex portion 141 may be any one of a cone shape such as a cone and a pyramid, a column shape such as a cylinder and a prism, a frustum shape such as a frustum and a frustum, and a hemisphere. is there.
  • the position of the convex portion 141 may be irregular in each lattice point on the square lattice, each lattice point on the hexagonal lattice, and further in the concavo-convex portion 140.
  • the shape of the concavo-convex portion 140 is not limited to a linear shape extending in the first direction, but may be changed to a broken line shape extending in the first direction or a curved shape extending in the first direction.
  • the structure which makes the front end surface of the uneven part 140 and the flat part 130 flush is suitable in the viewpoint which improves the flatness of a cell sheet.
  • the concavo-convex portion 140 may have a side surface continuous with the flat portion 130 and may be changed to a structure in which a plurality of concave portions are formed on the side surface.
  • the width of one uneven portion 140 and the width of another uneven portion 140 may be different from each other or may be equal to each other. If the width of one uneven portion 140 and the width of the other uneven portion 140 are equal to each other, it is possible to improve the uniformity in the second direction with respect to the characteristics of the cell sheet. .
  • the width of one flat portion 130 and the width of another flat portion 130 may be different from each other or may be equal to each other. If the width of one flat portion 130 and the width of another flat portion 130 are equal to each other, it is possible to improve the uniformity in the second direction with respect to the characteristics of the cell sheet. .
  • the width of the flat portion 130 and the width of the uneven portion 140 may be different from each other or may be equal to each other.
  • the width of the flat portion 130 be in a range in which the orientation can be controlled and larger than the width of the uneven portion 140.
  • the width of the uneven portion 140 is preferably in the range in which the orientation can be controlled and is larger than the width of the flat portion 130.
  • the second direction in which the flat portions 130 and the concavo-convex portions 140 are alternately arranged is not limited to the direction orthogonal to the first direction, and in the direction intersecting the first direction, for example, an angle formed with the first direction is It is also possible for the direction to be 45 °.
  • the cell sheet forming member is not limited to a transfer body using an intaglio, but may be a transfer body using a relief, and may be a molded body by injection molding. That is, it is also possible to manufacture a cell sheet molded member using injection molding.
  • -A cell sheet formation member can be applied to a microwell plate, a petri dish, a flask, a chamber slide, etc. as long as it can hold a cell suspension.

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Abstract

細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、表面は、複数の平坦部と複数の凹凸部とを備える。各平坦部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、複数の平坦部は表面の全体で第１方向と交差する第２方向に並ぶ。凸部と凹部とのいずれか一方が段差構造であり、各凹凸部は、相互に隣り合う平坦部の間を埋める複数の段差構造を含み、段差構造のピッチが１００ｎｍ以上１０μｍ以下である。

Description

細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法
　本発明は、細胞シートを形成するための細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法に関する。
　細胞を培養するための方法は、従来から種々提案されている。例えば、特許文献１に記載の細胞の培養方法は、微細な側壁で区画された複数の空間構造が設けられた細胞培養用基材を用い、空間構造が相互に連通する方向と、細胞の伸長方向とを揃えることによって、細胞の配向性を制御する。
特開２００６－１９１８０９号公報
　上述した細胞培養用基材では、側壁の備える側壁面や上面などの平坦面が、細胞培養の疑似足場として機能し、それによって、細胞培養用基材で培養される細胞の伸長方向が、平坦面の延在方向に揃えられる。一方、側壁面や上面の他に、空間構造の底面もまた平坦面であり、しかも、空間構造の底面は、側壁面と連なる面であって、側壁面の延在方向や上面の延在方向とは異なる方向にも広がる。そのため、上述した細胞培養用基材では、各平坦面の連なる方向や、各平坦面の広がる方向、すなわち、側壁面の延在方向以外の他の方向にも細胞の伸長方向が揃いやすく、結局のところ、細胞の伸長方向を揃える観点において、依然として課題の残されたものとなっている。
　本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞シートにおける細胞の配向性を向上可能とした細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法を提供することにある。
　上記課題を解決するための細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、複数の平坦部と複数の凹凸部とを備える。各平坦部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記複数の平坦部は前記表面の全体で前記第１方向と交差する第２方向に並ぶ。そして、凸部と凹部とのいずれか一方が段差構造であり、各凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部の間を埋める複数の前記段差構造を含み、前記段差構造のピッチが１００ｎｍ以上１０μｍ以下である。
　上記課題を解決するための細胞シート形成部材の製造方法は、凹版を形成することと、細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することと、を含む。前記凹版は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記表面の全体で前記第１方向と交差する第２方向に並ぶ複数の平坦部と、凸部と凹部とのいずれか一方が段差構造であり、相互に隣り合う前記平坦部の間を埋める複数の前記段差構造を含み、前記段差構造のピッチが１００ｎｍ以上１０μｍ以下である凹凸部と、を備える。そして、前記凹版を形成することは、前記凹凸部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む。
　上記課題を解決するための細胞シートの製造方法は、上記細胞シート形成部材を用い、前記平坦部および前記凹凸部のいずれか一方に対する接着が他方に対する接着よりも優勢である細胞を前記細胞シート形成部材の表面に接着させて、前記細胞シート形成部材の表面に細胞シートを形成することと、前記細胞シート形成部材の表面から細胞シートを剥離することとを含む。
　上記各構成において、平坦部と凹凸部とは、細胞シートを形成するための表面を構成し、かつ、一方が他方によって区画される関係を有する。そのため、平坦部に対する接着が優勢である細胞であれ、凹凸部に対する接着が優勢である細胞であれ、一方の構造体に対して細胞が優先的に接着する一方、他方の構造体に対する接着が劣勢となる。したがって、一方の構造体が他方の構造体を区画する細胞シート形成部材の構造に、平坦部と凹凸部との間で接着性が異なるという細胞の性質が相まって、双方の構造体の延在方向である第１方向に、細胞の伸長方向が揃えられる。結果として、二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の伸長方向を一次元方向に揃えること、すなわち、細胞の配向性を向上させることが可能となる。なお、細胞シート形成部材の表面が、平坦部と凹凸部とを備えるため、平坦部に対する接着が優勢である細胞と、凹凸部に対する接着が優勢である細胞との両方に、共通する細胞シート形成部材を適用すること、すなわち、細胞シート形成部材の汎用性を高めることも可能となる。
　上記細胞シート形成部材において、前記段差構造は、凸部であり、前記凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部に挟まれた凹部の底面に複数の前記凸部を備え、各凸部の先端面が、前記平坦部と面一であってもよい。あるいは、前記細胞シート形成部材の厚み方向において、前記凹凸部における先端面の高さと、前記平坦部の高さとの差が０．５μｍ以下、好ましくは０．３μｍ以下であってもよい。この構成によれば、凹凸部の頂面と平坦部とが面一であるため、あるいは、凹凸部の先端面と平坦部との高低差が０．５μｍ以下、好ましくは０．３μｍ以下であるため、凹凸部と平坦部とを覆うように形成された細胞シートにおいて、それの平坦性を高めることが可能ともなる。
　上記細胞シート形成部材において、前記表面と対向する方向から見て、前記段差構造は円形状を有し、かつ、前記段差構造の直径が、前記ピッチの５０％以上１００％以下であり、前記段差構造のアスペクト比は、０．１以上１０以下であってもよい。この構成によれば、平坦部に対する接着の優位性と、凹凸部に対する接着の優位性とが、細胞の有する接着性に応じて、適切に発現されやすい。そのため、細胞の配向性を向上させる上記効果が、さらに得られやすい。
　上記細胞シート形成部材において培養される細胞は、特に限定されないが、生体内で特に配向性を持って存在する、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の少なくとも１種がより適する。前記平坦部の短辺方向での長さは、１０μｍ以上５０μｍ以下であり、相互に隣り合う前記平坦部の間の前記短辺方向での長さは、１０μｍ以上５０μｍ以下であってもよい。この構成によれば、平坦部の短辺方向での長さ、および、凹凸部の短辺方向での長さが、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の配向制御に適した大きさを有する。そのため、筋芽細胞のシート、線維芽細胞のシート、および、心筋細胞のシートにおいて、各々の配向性を向上させることが可能となる。
　上記細胞シート形成部材の表面は、親水性または疎水性を有してもよい。
　上記細胞シート形成部材の表面は、金属または有機物から構成されてもよい。
細胞シート形成部材の一実施形態における同部材の構成を示す図であり、（ａ）は細胞シート形成部材の構造をシャーレと共に示す斜視図であり、（ｂ）は細胞シート形成部材の表面の一部を拡大して示す斜視図であり、（ｃ）は細胞シート形成部材の表面の一部を拡大して示す平面図であり、（ｄ）は細胞シート形成部材の一部を拡大して示す部分断面図である。 図１の細胞シート形成部材の製造方法の一例を説明するための工程図。 （ａ）～（ｃ）は、図１の細胞シート形成部材を用いて細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 （ａ）～（ｃ）は、図１の細胞シート形成部材を用いて細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 （ａ）～（ｃ）は、図１の細胞シート形成部材を用いて細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 図１の細胞シート形成部材を用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。 参考例として細胞培養シャーレを用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。 図１の細胞シート形成部材の表面を走査電子顕微鏡によって撮影した画像。 図８の画像の一部を拡大して示す画像。
　以下、細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法の一実施形態について説明する。まず、細胞シート形成部材の構成を説明し、次いで、細胞シート形成部材の製造方法、細胞シートの製造方法を説明する。
　［細胞シート形成部材］
　図１（ａ）が示すように、細胞シート形成部材１００は、例えば、シャーレの培養皿１１０に載置されるシート材である。シャーレは、培養皿１１０と蓋１２０とに囲まれた空間に細胞懸濁液を保持する。細胞懸濁液に含まれる細胞の一例は、筋芽細胞、線維芽細胞、心筋細胞である。
　図１（ｂ）が示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、複数の平坦部１３０と、複数の凹凸部１４０とを備える。凹凸部１４０は、複数の段差構造を含んで構成され、複数の段差構造は、相互に隣り合う平坦部１３０の間を埋める。段差構造は、凸部、または、凹部である。なお、本実施形態における段差構造は、凸部１４１である。凹凸部１４０は、相互に隣り合う平坦部１３０に挟まれた凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１４１とを備える。換言すると、複数の凸部１４１は、細胞シート形成部材１００において相互に隣り合う平坦部１３０に挟まれた部分に相当する凹部の底面に設けられている。
　図１（ｃ）が示すように、各平坦部１３０は、１つの方向である第１方向（図１（ｃ）の上下方向）に延びる平坦面である。複数の平坦部１３０は、表面１１１の全体において、第１方向と直交する第２方向（図１（ｃ）の左右方向）に並ぶ。各凹凸部１４０もまた、第１方向に延びる。また、複数の凹凸部１４０は、表面１１１の全体において、第２方向に並ぶ。このことは、図８および図９に示すように、細胞シート形成部材１００の表面を走査電子顕微鏡によって撮影した画像からも明らかである。
　凹凸部１４０の構成要素である各凸部１４１は、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。各凹凸部１４０は、凸部１４１のこうした配列を、第１方向、および、第２方向に繰り返す。三角格子の各頂点に凸部１４１が位置する凹凸部１４０であれば、凸部１４１を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。
　表面１１１と対向する方向から見て、各凸部１４１は、例えば円形状を有する。相互に隣り合う凸部１４１の中心間の距離の最頻値は、凸部１４１のピッチである。また、凸部１４１の平面視形状における凸部の最大幅は、凸部１４１の直径である。
　凸部１４１のピッチが下記（Ａ）（Ｂ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃える観点において好適である。すなわち、凸部１４１のピッチが下記（Ａ）（Ｂ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞などの接着に対する平坦部１３０および凹凸部１４０の優劣が、平坦部１３０と凹凸部１４０との間で明確に区画される観点において好適である。
　（Ａ）凸部１４１のピッチ：１００ｎｍ以上１０μｍ以下
　（Ｂ）凸部１４１の直径　：凸部１４１のピッチの５０％以上１００％以下
　各平坦部１３０の第２方向（短辺方向）での長さは、平坦部１３０の幅である。また、相互に隣り合う平坦部１３０間の第２方向（短辺方向）での長さは、凹凸部１４０の幅である。
　平坦部１３０の幅、および、凹凸部１４０の幅は、例えば、培養の対象となる細胞の大きさ（５μｍ以上１００μｍ以下）の１／１０倍以上１０倍以下である。平坦部１３０の幅、および、凹凸部１４０の幅が下記（Ｃ）（Ｄ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃えることを容易なものとする観点において好適である。
　（Ｃ）平坦部１３０の幅　：１０μｍ以上５０μｍ以下
　（Ｄ）凹凸部１４０の幅　：１０μｍ以上５０μｍ以下
　図１（ｄ）に示すように、凹凸部１４０は、相互に隣り合う凸部１４１、および、平坦部１３０とそれに隣接する凸部１４１との間に、凹部１４２を備えても良い。複数の凸部１４１が凹凸部１４０に点在するため、凸部１４１間の空間である凹部１４２は、凹凸部１４０において、第１方向、および、第２方向に連なる。
　細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部１４２の底面と平坦部１３０との間の長さは、平坦部１３０の高さである。また、細胞シート形成部材１００の厚み方向において、各凸部１４１の先端面と平坦部１３０との間の高低差は、境界段差である。凹部１４２の底面と各凸部１４１の先端面の高低差は、凸部１４１の高さである。各凸部１４１の先端面と平坦部１３０とが面一である構成では、平坦部１３０の高さと、凸部１４１の高さとが、相互に等しい。凸部１４１の高さに対する凸部１４１のピッチの比は、凸部１４１のアスペクト比である。
　境界段差が下記（Ｅ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。凸部１４１の高さが下記（Ｆ）を満たす構成、また、凸部１４１のアスペクト比が下記（Ｇ）を満たす構成は、凹凸部１４０の構造上での安定性を高められる観点、また、凹凸部１４０の形成を容易なものとする観点において好適である。
　（Ｅ）境界段差　　　　　：０．５μｍ以下、好ましくは０．３μｍ以下
　（Ｆ）凸部１４１の高さ　：５０ｎｍ以上５μｍ以下
　（Ｇ）凸部１４１のアスペクト比：０．１以上１０以下
　平坦部１３０と凹凸部１４０とは、細胞シートを形成するための表面を構成し、かつ、一方が他方によって区画される関係を有する。そして、上記（Ａ）（Ｂ）を満たす構成であれば、平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞であれ、凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞であれ、当該細胞は一方の構造体に対して優先的に接着する一方、他方の構造体に対する接着が劣勢となる。よって、こうした細胞の特徴が相まって、双方の構造体の延在方向である第１方向に、細胞の伸長方向が揃えられる。結果として、表面１１１に沿った二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の伸長方向を一次元方向に揃えること、すなわち、細胞の配向性を向上させることが可能となる。
　また、上記（Ｅ）を満たす構成、特に、各凸部１４１の先端面と平坦部１３０とが面一である構成は、凹凸部１４０と平坦部１３０とを覆うように形成された細胞シートにおいて、それの平坦性を高めることを可能とする。さらに、上記（Ｆ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性をより一層に高めることが可能である。
　なお、細胞シート形成部材１００の表面１１１が、平坦部１３０と凹凸部１４０とを備えるため、平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞と、凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞との両方に、共通する細胞シート形成部材１００を適用することが可能ともなる。すなわち、細胞シート形成部材１００の汎用性を高めることも可能となる。
　また、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、細胞外マトリックス、ポリマー、およびゲル等の接着因子を含む有機物が塗布されてもよく、あるいは、金属から構成される面であってもよい。細胞外マトリックスの例としては、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリ－リシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、およびヒアルロン酸などが挙げられるが、これに限定されない。また、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞の接着性や細胞シートの平坦性を高めることを目的として、親水性、あるいは、疎水性を有してもよい。
　また、細胞シート形成後に細胞シートの剥離・回収を容易にするために、刺激応答性材料を塗布しても良い。刺激応答性材料としては、温度変化によって水親和性が変化する温度応答性ポリマーが好ましい。具体的にはポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）が好ましい。刺激応答性材料は慣用の塗布方法を用いて基材に塗布しても良いし、刺激応答性材料で処理した基材に下記に記載した方法を用いて構造を加工しても良い。
　［細胞シート形成部材の製造方法］
　次に、細胞シート形成部材の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ナノインプリント法を用いて、細胞シート形成部材の表面１１１を、凹版１５０の転写によって形成する例を説明する。
　図２が示すように、細胞シート形成部材の製造方法は、凹版１５０を形成する工程と、細胞シート形成部材１００の表面１１１を凹版１５０の転写によって形成する工程とを含む。
　凹版１５０の下面は、第１方向（紙面と直交する方向）に延びる形状を有し、かつ、第１方向と交差する第２方向（紙面の左右方向）に並ぶ複数の平坦部と、相互に隣り合う平坦部の間を埋める複数の段差構造から構成された凹凸部とを備える。凹版１５０の平坦部は、細胞シート形成部材１００の平坦部１３０を転写によって形成するための部分である。凹版１５０の凹凸部は、細胞シート形成部材１００の凹凸部１４０を転写によって形成するための部分である。
　凹版１５０の段差構造は、凸部、または、凹部である。なお、本実施形態における凹版１５０の段差構造は、凸部１４１を形成するための凹部１５１であり、凹部１５１のピッチは、１００ｎｍ以上１０μｍ以下である。凹版１５０を形成する工程では、例えば、凹版１５０を形成するためのシリコン基板に対する、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて、凹凸部が形成される。また、凹版１５０自体を原盤からの１回、あるいは複数回の転写によって得てもよい。原盤には、例えば、シリコン基板に対するフォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて凹版１５０の表面形状に対応する形状が作り込まれている。
　次に、細胞シート形成部材１００を形成するための基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を対向させる。基材１６０の形成材料は、例えば、熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂である。そして、基材１６０が流動性を有する状態で、基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を押し付ける。次いで、基材１６０の流動性を抑えた状態で、凹版１５０を基材１６０の表面１１１から離型する。これによって、基材１６０の表面１１１に凹版１５０の凹部１５１が転写され、平坦部１３０と凹凸部１４０とが形成される。
　基材１６０の形成材料の熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂の表面に、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、細胞外マトリックス、ポリマー、ゲルなどの接着因子を含む有機物が塗布されていてもよい。細胞外マトリックスの例としては、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリ－リシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、およびヒアルロン酸などが挙げられるが、これに限定されない。また、基材１６０の形成材料として、多糖類やタンパク質などの生体材料を用いてもよい。
　［細胞シートの製造方法］
　次に、細胞シート形成部材１００を用いて製造される細胞シートについて説明する。
　図３（ａ）が示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、平坦部１３０に接着する細胞Ｓ１を含む。この際、各平坦部１３０は、凹凸部１４０の長辺方向（第１方向）に延び、各平坦部１３０の幅は、一般的な細胞の大きさの数倍程度である。そのため、図３（ｂ）が示すように、細胞Ｓ１の位置は、平坦部１３０の範囲内に優先的に分布し、細胞Ｓ１は、第１方向に細胞の長軸方向が配置し直線状に連なる。すなわち、細胞Ｓ１の伸長方向は、平坦部１３０の長辺方向と揃うように制御される。図６は、細胞シート形成部材１００を用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、同図６に示す例では、筋芽細胞の伸長方向が一方向に揃うように制御されている。
　なお、図３（ｃ）が示すように、上記（Ａ）を満たさない細胞シート形成基材では、細胞Ｓ１の配行性が制御されないため、細胞Ｓ１の長軸方向はランダムな方向で配置する。図７は、参考例となる市販の細胞培養シャーレを用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、同図７に示す例では、筋芽細胞の伸長方向がランダムに配置されている。
　図４（ａ）が示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、凹凸部１４０に接着する細胞Ｓ２を含む。この際、各凹凸部１４０は、凹凸部１４０の長辺方向（第１方向）に延び、各凹凸部１４０の幅は、一般的な細胞の大きさの数倍程度である。そのため、図４（ｂ）が示すように、細胞Ｓ２の位置は、凹凸部１４０の範囲内に優先的に分布し、細胞Ｓ２は、第１方向に細胞の長軸方向が配置し直線状に連なる。すなわち、細胞Ｓ２の伸長方向は、凹凸部１４０の長辺方向と揃うように制御される。
　なお、図４（ｃ）が示すように、上記（Ａ）を満たさない細胞シート形成基材では、細胞Ｓ２の配行性が制御されないため、細胞Ｓ２の長軸方向はランダムな方向で存在する。
　一方、上記（Ａ）を満たす細胞シート形成基材では、図５（ａ）が示すように、細胞シート形成部材１００に保持された細胞懸濁液の細胞が、平坦部１３０に対して優先的に接着する細胞Ｓ１であり、平坦部１３０よりも劣勢ではあるが、凹凸部１４０に対する接着を許容された細胞Ｓ２でもある。あるいは、細胞シート形成部材１００に保持された細胞懸濁液の細胞が、凹凸部１４０に対して優先的に接着する細胞Ｓ２であり、凹凸部１４０よりも劣勢ではあるが、平坦部１３０に対する接着を許容された細胞Ｓ１でもある。
　この場合、図５（ｂ）に示すように、平坦部１３０、および、凹凸部１４０は、第１方向に延び、第２方向に交互に配置される。そのため、細胞シート形成部材の表面１１１には、例えば、平坦部１３０に優先的に接着された細胞Ｓ１の配向性が、平坦部１３０の構造、および、それを区画する凹凸部１４０の構造によって制御される。
　そして、相互に隣り合う平坦部１３０に挟まれた凹凸部１４０においては、平坦部１３０よりも劣勢ではあるが、凹凸部１４０に接着した細胞Ｓ２にて、平坦部１３０による配向性の制御が反映される。結果として、図５（ｃ）が示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる細胞シートＳＡを形成する。
　あるいは、凹凸部１４０に優先的に接着された細胞Ｓ２の配向性が、凹凸部１４０の構造、および、それを区画する平坦部１３０の構造によって制御される。そして、相互に隣り合う凹凸部１４０に挟まれた平坦部１３０においては、凹凸部１４０よりも劣勢ではあるが、平坦部１３０に接着した細胞Ｓ１にて、凹凸部１４０による配向性の制御が反映される。結果として、図５（ｃ）が示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる細胞シートＳＡを形成する。
　上記実施形態に記載の細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法における実施例を以下に説明する。
　＜実施例１＞
　＜細胞シート形成部材の作製＞
　まず、細胞シート形成部材１００の凹凸部１４０を転写によって形成するためのニッケル製凹版を作製した。次いで、ニッケル製凹版をスタンパーとして用い、ナノインプリント法によって、ポリスチレンシートに凹凸部１４０を加工し、それによって、実施例１の細胞シート形成部材１００を作製した。実施例１の細胞シート形成部材１００における平坦部１３０は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、細胞シート形成部材１００の表面における全体で、第１方向と交差する第２方向に並びる。各平坦部１３０の幅（第２方向での長さ）は１０μｍであった。各凹凸部１４０は、相互に隣り合う平坦部１３０の間を埋める複数の段差構造から構成され、相互に隣り合う平坦部１３０間の第２方向での長さは１０μｍであり、凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは３００ｎｍであった。凹凸部１４０における各凸部の高さを、ＡＦＭを用いて測定した結果、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、４４６ｎｍであった。また、凹部の底面から平坦部までの高さの平均は、４５５ｎｍであった。そして、実施例１の細胞シート形成部材１００を、１０ｍｍ角に裁断し、裁断後の細胞シート形成部材１００にＵＶ照射を行い、この滅菌処理を行った後に、細胞培養試験に使用した。
　＜細胞培養試験＞
　まず、マウス由来の筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を細胞培養用フラスコ（２５ｃｍ２）で培養した。培養は、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）１０％添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で行った。細胞の回収にはトリプシンを用い、定法に従い実施した。回収した細胞について血球計算版を用いて細胞数を計測した後、３．８×１０４細胞／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を調製した。
　次いで、細胞培養用マルチウェルプレート（２４孔）の底面に、１０ｍｍ角に裁断した実施例１の細胞シート形成部材１００を設置した。マルチウェルプレートにリン酸緩衝生理食塩水を０．５ｍｌずつ分注した後にリン酸緩衝整理食塩水を除去して、実施例１の細胞シート形成部材１００を洗浄した。続いて、先に調製した細胞懸濁液を０．５ｍｌずつ分注して、細胞を播種した。細胞を播種したマルチウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養し、コンフルエントに達するまで、２日毎に培地交換を行った。コンフルエントを確認した後、筋管誘導培地（ＤＭＥＭ培地、ＦＢＳ不含）に交換し、筋管分化誘導を行った。結果として、筋管分化誘導の２日後に筋管形成を確認した。
　次いで、筋管形成後の細胞を、細胞シート形成部材１００に接着した状態で、４％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝生理食塩水）を用い、室温で１０分間固定し、固定に用いた溶液を除去後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。続いて、０．５％トライトンＸ－１００を含むリン酸緩衝生理食塩水を用い、室温で５分間処理し、透過処理を行った。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、１００ｎＭに希釈したａｃｔｉ－ｓｔａｉｎ４８８ファロイジン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）溶液に３０分間浸し、染色を行った。染色後の細胞シート形成部材１００を、リン酸緩衝食塩水で洗浄した後、封入剤（Ａｎｔｉｆａｄｅ　ｍｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ，　Ｆｌｕｋａ社製）を滴下したスライドガラスに張り合わせ、観察用のスライドガラスを作製した。そして、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、細胞の配向性を観察した。結果として、実施例１の細胞シート形成部材１００において、細胞の伸長方向が一次元方向に揃った状態が認められた。
　＜実施例２＞
　実施例１のニッケル製凹版とは異なるニッケル製凹版を用い、実施例１と同様にして、実施例２の細胞シート形成部材１００を作製した。実施例２の細胞シート形成部材１００における各平坦部１３０の幅は３０μｍであり、相互に隣り合う平坦部１３０間の第２方向での長さは３０μｍであり、凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは６００ｎｍであった。凹凸部１４０における各凸部の高さを、ＡＦＭを用いて測定した結果、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、７２４ｎｍであった。また、凹部の底面から平坦部までの高さの平均は９００ｎｍであった。
　実施例２の細胞シート形成部材１００を用い、実施例１と同様の方法で、筋芽細胞の培養を行い、筋管細胞の形成を確認後、細胞を固定し、観察用のスライドガラスを作製した。そして、蛍光顕微鏡を用いて細胞の配向性を観察した。結果として、実施例２の細胞シート形成部材１００において、細胞の伸長方向が一次元方向に揃った状態が認められた。
　＜実施例３＞
　実施例１，２のニッケル製凹版とは異なるニッケル製凹版を用い、実施例１と同様にして、実施例３の細胞シート形成部材１００を作製した。実施例３の細胞シート形成部材１００における各平坦部１３０の幅は５０μｍであり、相互に隣り合う平坦部１３０間の第２方向での長さは５０μｍであり、凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは６００ｎｍであった。凹凸部１４０における各凸部の高さを、ＡＦＭを用いて測定した結果、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、７１７ｎｍであった。また、凹部の底面から平坦部までの高さの平均は９００ｎｍであった。
　実施例３の細胞シート形成部材１００を用い、実施例１と同様の方法で、筋芽細胞の培養を行い、筋管細胞の形成を確認後、細胞を固定し、観察用のスライドガラスを作製した。そして、蛍光顕微鏡を用いて細胞の配向性を観察した。結果として、実施例３の細胞シート形成部材１００において、細胞の伸長方向が一次元方向に揃った状態が認められた。
　＜比較例１＞
　ポリスチレンシートを１０ｍｍ角に裁断し、凹凸部１４０を有しない平坦な表面を有したシート材である比較例の細胞シート形成部材を得た。次いで、実施例１と同様に、比較例１の細胞シート形成部材にＵＶ照射による滅菌処理を行った後に、細胞培養試験に使用した。
　すなわち、比較例１の細胞シート形成部材を用い、実施例１と同様の方法で、筋芽細胞の培養を行い、筋管細胞の形成を確認後、細胞を固定し、観察用のスライドガラスを作製した。そして、蛍光顕微鏡を用いて細胞の配向性を観察した。結果として、比較例１の細胞シート形成部材において、細胞の伸張する方向がランダムであることが認められた。
　＜実施例４＞
　まず、実施例１の細胞シート形成部材１００を１０ｍｍ角に裁断し、ＵＶ照射による滅菌処理を行った。次いで、細胞シート形成部材１００を細胞培養用マルチウェルプレート（２４孔）の底面に設置し、さらに、フィブロネクチンコーティングを行った。この際、規定量のフィブロネクチンコート溶液に浸漬し、１晩３７℃で静置した後、細胞シート形成部材１００を蒸留水で２回洗浄し、これを実施例４の細胞シート形成部材１００として、細胞の培養に使用した。
　次いで、マウス由来の心筋細胞として、心筋細胞培養キット（コスモバイオ社製）を用い、２×１０５細胞／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を調製し、調製された細胞懸濁液を０．５ｍｌずつ分注して、細胞を播種した。細胞を播種したマルチウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養し、コンフルエントに達するまで、２日毎に培地交換を行った。６日目まで培養した後、細胞が細胞シート形成部材１００に接着した状態で、４％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝生理食塩水）を用い、室温で１０分間固定し、固定に用いた溶液を除去後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。続いて０．５％トライトンＸ－１００を含むリン酸緩衝生理食塩水を用い、室温で５分間処理し、透過処理を行った。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、１００ｎＭに希釈したａｃｔｉ－ｓｔａｉｎ４８８ファロイジン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）溶液に３０分間浸し、染色を行った。染色後の細胞シート形成部材１００を、リン酸緩衝食塩水で洗浄した後、封入剤（Ａｎｔｉｆａｄｅ　ｍｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ，　Ｆｌｕｋａ社製）を滴下したスライドガラスに張り合わせ、観察用のスライドガラスを作製した。そして、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、心筋細胞の配向性を観察した。結果として、実施例４の細胞シート形成部材１００において、細胞の伸長方向が一次元方向に揃った状態が認められた。
　＜比較例２＞
　比較例１の細胞シート形成部材を、細胞培養用マルチウェルプレート（２４孔）の底面に設置し、実施例４と同様の方法で、細胞シート形成部材に対するフィブロネクチンコーティングを行い、これを比較例２の細胞シート形成部材として、細胞の培養に使用した。すなわち、実施例４と同様の方法で、心筋細胞の培養を行い、培養の開始から６日目に、観察用のスライドガラスを作製し、細胞の配向性を観察した。結果として、比較例２の細胞シート形成部材において、細胞の伸張する方向がランダムであることが認められた。
　＜実施例５＞
　ポリスチレン製細胞シート形成部材の表面に温度応答性ポリマーが付加されたシャーレ（製品名：ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社製）に、実施例１の細胞シート形成部材の製法と同様の方法で、ナノインプリント法による凹凸部１４０の転写を行い、実施例５の細胞シート形成部材１００を作製した。なお、実施例５の細胞シート形成部材１００における各平坦部１３０の幅は１０μｍであり、相互に隣り合う平坦部１３０間の長さは１０μｍであり、凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは３００ｎｍであった。凹凸部１４０における凸部の高さを、ＡＦＭを用いて測定した結果、凹部の底面から凸部の先端までの高さは、４３２ｎｍであった。また、凹部の底面から平坦部までの高さは４４０ｎｍであった。そして、実施例５の細胞シート形成部材１００を、１０ｍｍ角に裁断し、裁断後の細胞シート形成部材１００にＵＶ照射による滅菌処理を行い、この滅菌処理を行った後に、細胞培養試験に使用した。
　実施例５の細胞シート形成部材１００を用い、筋芽細胞の培養として２種類の試験を実施した。
　第１の培養試験では、実施例１と同様の方法を用い、筋芽細胞の培養を行った。そして、筋管細胞の形成を確認後、観察用のスライドガラスを作製し、細胞の配向性を観察した。結果として、細胞の伸長方向が一次元方向に揃った状態が認められた。
　第２の培養試験では、細胞シート形成部材１００における温度応答性機能を利用して細胞シートの回収を実施した。すなわち、播種後の筋芽細胞を、コンフルエントになるまで培養し、細胞が付着した細胞シート形成部材１００を所定時間冷却した。次いで、支持体（製品名：ＣｅｌｌＳｈｉｆｔｅｒ、セルシード社製）を細胞シート形成部材１００の培養面に密着
させ、支持体に細胞を付着させた状態で、細胞シート形成部材１００から細胞シートを剥離した。剥離した細胞シートは、支持体に付着した状態で、コラーゲンゲル上に静置し、一定時間が経過した後に、支持体のみを除去した。そして、細胞シート形成部材１００から剥離し、コラーゲンゲルに移動させた細胞シートを、顕微鏡で観察した。結果として、培養面積に対する７０％以上の面積で、細胞シートを回収できることが認められた。
　＜比較例３＞
　ポリスチレン製細胞シート形成部材の表面に温度応答性ポリマーが付加されたシャーレ（製品名：ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社製）を１０ｍｍ角に裁断し、凹凸部１４０を有しない平坦な表面を有した比較例３の細胞シート形成部材を作製した。比較例３の細胞シート形成部材を、細胞培養用マルチウェルプレート（２４孔）の底面に設置し、実施例５と同様の方法で、筋芽細胞を用いた第１の培養試験と第２の培養試験とを行った。第１の培養試験において、比較例３の細胞シート形成部材では、細胞の伸張する方向がランダムであることが認められた。第２の培養試験においては、培養面積に対する７０％以上の面積で、細胞シートを回収できることが認められた。
　以上、上記実施形態によれば、以下に列挙する効果が得られる。
　（１）平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞であれ、凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞であれ、一方の構造体に対して細胞が優先的に接着し、他方の構造体に対する接着の劣勢と相まって、双方の構造体の延在方向である第１方向に、細胞の伸長方向が揃えられる。結果として、二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の伸長方向を一次元方向に揃えること、すなわち、細胞の配向性を向上させることが可能となる。
　（２）細胞シート形成部材１００の表面１１１が、平坦部１３０と凹凸部１４０とを備えるため、平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞と、凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞との両方に、共通する細胞シート形成部材１００を適用すること、すなわち、細胞シート形成部材１００の汎用性を高めることも可能となる。
　（３）凹凸部１４０の先端面と平坦部１３０との段差が０．５μｍ以下、好ましくは０．３μｍ以下、より好ましくは面一である構成であれば、細胞シートの平坦性を高めることが可能ともなる。
　（４）前記細胞シート形成部材の厚み方向において、前記凹凸部における先端面の高さが、前記平坦部の高さ以下である構成であれば、細胞シートの配向性をより高めることが可能ともなる。
　（５）段差構造のアスペクト比が０．１以上１０以下である場合、平坦部１３０に対する接着の優位性と、凹凸部１４０に対する接着の優位性とが、細胞が有する接着性に応じて、適切に発現されやすい。そのため、細胞の配向性を向上させる効果が、さらに得られやすい。また、段差構造における機械的な強度も確保される。
　（６）平坦部１３０の幅が１０μｍ以上５０μｍ以下であり、凹凸部１４０の幅が１０μｍ以上５０μｍ以下である場合、動物細胞のシート、特に筋芽細胞のシート、線維芽細胞のシート、および、心筋細胞のシートにおいて、各々の配向性を向上させることが可能となる。
　なお、上記実施形態は、以下のように変更して実施してもよい。
　［凹凸部］
　・凸部１４１の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状のいずれか１種とすることが可能である。
　・凸部１４１の位置は、四角格子上の各格子点、六角格子上の各格子点、さらには、凹凸部１４０において不規則とすることも可能である。
　・凹凸部１４０の有する形状は、第１方向に延びる直線状に限らず、第１方向に延びる折れ線状や、第１方向に延びる曲線状に変更することも可能である。
　・凹凸部１４０の底面と平坦部１３０とを面一に変更すること、すなわち、凸部１４１の基端部と平坦部１３０とを面一に変更することも可能である。なお、上述したように、凹凸部１４０の先端面と平坦部１３０とを面一とする構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。
　・凹凸部１４０を構成する段差構造を、凹部に変更することも可能であり、凹部と凸部との両方に変更することも可能である。例えば、凹凸部１４０は、平坦部１３０に連続する１つの側面を備え、該側面に複数の凹部が形成された構造に変更することも可能である。
　・１つの凹凸部１４０の幅と、他の凹凸部１４０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。なお、１つの凹凸部１４０の幅と、他の凹凸部１４０の幅とが、相互に等しい構成であれば、細胞シートが有する特性について、第２方向での均一性を高めることが可能となる。
　［平坦部］
　・１つの平坦部１３０の幅と、他の平坦部１３０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。なお、１つの平坦部１３０の幅と、他の平坦部１３０の幅とが、相互に等しい構成であれば、細胞シートが有する特性について、第２方向での均一性を高めることが可能となる。
　・平坦部１３０の幅と、凹凸部１４０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。例えば、細胞の接着が平坦部１３０において優勢である場合、平坦部１３０の幅は、配向性を制御できる範囲であって、かつ、凹凸部１４０の幅よりも大きいことが好適である。また、細胞の接着が凹凸部１４０において優勢である場合、凹凸部１４０の幅は、配向性を制御できる範囲であって、かつ、平坦部１３０の幅よりも大きいことが好適である。
　［その他］
　・平坦部１３０と凹凸部１４０とが交互に並ぶ第２方向は、第１方向と直交する方向に限らず、第１方向と交差する方向であれば、例えば、第１方向と形成する角度が４５°である方向とすることも可能である。
　・細胞シート形成部材は、凹版を用いた転写体に限らず、凸版を用いた転写体であってもよく、さらに、射出成形による成形体とすることも可能である。すなわち、射出成形を用いて細胞シート成形部材を製造することも可能である。
　・細胞シート形成部材は、マイクロウェルプレート、シャーレ、フラスコ、チェンバースライドなど、細胞懸濁液を保持可能なものであれば、それに適用することができる。

Claims (10)

  1. 　細胞シートを形成するための表面を備え、
    　前記表面は、複数の平坦部と複数の凹凸部とを備え、
    　各平坦部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記複数の平坦部は前記表面の全体で前記第１方向と交差する第２方向に並び、
    　凸部と凹部とのいずれか一方が段差構造であり、
    　各凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部の間を埋める複数の前記段差構造を含み、前記段差構造のピッチが１００ｎｍ以上１０μｍ以下である
    　細胞シート形成部材。
  2. 　前記段差構造は、凸部であり、
    　前記凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部に挟まれた凹部の底面に複数の前記凸部を備えた
    　請求項１に記載の細胞シート形成部材。
  3. 　前記細胞シート形成部材の厚み方向において、前記凹凸部における先端面の高さと、前記平坦部の高さとの差が０．５μｍ以下である
    　請求項２に記載の細胞シート形成部材。
  4. 　前記細胞シート形成部材の厚み方向において、前記凹凸部における先端面の高さが、前記平坦部の高さ以下である
    　請求項２または請求項３に記載の細胞シート形成部材。
  5. 　前記表面と対向する方向から見て、前記段差構造は円形状を有し、かつ、前記段差構造の直径が、前記ピッチの５０％以上１００％以下であり、
    　前記段差構造のアスペクト比は、０．１以上１０以下である
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞シート形成部材。
  6. 　前記細胞シート形成部材において培養される細胞は、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の少なくとも１種であり、
    　前記平坦部の短辺方向での長さは、１０μｍ以上５０μｍ以下であり、
    　相互に隣り合う前記平坦部の間の前記短辺方向での長さは、１０μｍ以上５０μｍ以下である
    　請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞シート形成部材。
  7. 　前記細胞シート形成部材の表面は、親水性または疎水性を有する
    　請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞シート形成部材。
  8. 　前記細胞シート形成部材の表面は、金属または有機物から構成される
    　請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞シート形成部材。
  9. 　凹版を形成することと、
    　細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することと、を含み、
    　前記凹版は、
    　第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記表面の全体で前記第１方向と交差する第２方向に並ぶ複数の平坦部と、
    　凸部と凹部とのいずれか一方が段差構造であり、相互に隣り合う前記平坦部の間を埋める複数の前記段差構造を含み、前記段差構造のピッチが１００ｎｍ以上１０μｍ以下である凹凸部と、を備え、
    　前記凹版を形成することは、
    　前記凹凸部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む
    　細胞シート形成部材の製造方法。
  10. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞シート形成部材を用い、前記平坦部および前記凹凸部のいずれか一方に対する接着が他方に対する接着よりも優勢である細胞を前記細胞シート形成部材の表面に接着させて、前記細胞シート形成部材の表面に細胞シートを形成することと、
    　前記細胞シート形成部材の表面から細胞シートを剥離することと
    　を含む
    　細胞シートの製造方法。
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