WO2020158482A1 - 細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法 - Google Patents

細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法 Download PDF

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WO2020158482A1
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cell sheet
forming member
flat
pitch
convex
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寿子 得能
啓 篠塚
紘太郎 大
凌峰 沈
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王子ホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/22—Petri dishes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present disclosure relates to a cell sheet forming member for forming a cell sheet, a method for manufacturing the cell sheet forming member, and a method for manufacturing the cell sheet.
  • Patent Document 1 Various methods for culturing cells have been conventionally proposed. For example, in the method for culturing cells described in Patent Document 1, a plurality of spatial structures partitioned by fine sidewalls are provided in a cell culture substrate, and the directions in which the spatial structures communicate with each other and the cell extension direction are defined. By aligning, the orientation of cells in the cell sheet is controlled (see Patent Document 1).
  • An object of the present disclosure is to provide a cell sheet forming member that facilitates peeling of a cell sheet, a method of manufacturing the cell sheet forming member, and a method of manufacturing the cell sheet.
  • a cell sheet forming member includes a surface for forming a cell sheet, the surface being located outside a culturing section for culturing cells and the culturing section, and the cell sheet. And a peeling assisting portion that forms a peeling start site from the surface, the culture portion includes a plurality of first flat portions and a plurality of first uneven portions, and each of the first flat portions, The first flat portions have a shape extending in a first direction, the first flat portions are arranged in a second direction intersecting the first direction, and the first uneven portions are adjacent to each other.
  • a first step structure for filling the space is provided, wherein the first step structure is composed of convex parts arranged at a first pitch, and the peeling auxiliary part is composed of convex parts arranged at a second pitch. And a second flat portion having a second stepped structure.
  • the cell sheet forming member is provided with the peeling auxiliary portion outside the culture portion, so that the cell sheet can be peeled easily. That is, when the detachment assisting portion is formed of the second uneven portion having the second step structure, the contact area of the detachment assisting portion with respect to the cell sheet is smaller than the contact area of the culture portion with respect to the cell sheet. , The adhesive strength is also low. Therefore, the outer peripheral portion of the cell sheet is easily peeled off from the surface of the cell sheet forming member. Further, when the peeling assisting portion is formed of the second flat portion, the strength of the outer peripheral portion of the cell sheet is increased, and the outer peripheral portion of the cell sheet is less likely to be damaged when peeled from the surface.
  • the cells cultured in the cell sheet forming member are at least one kind selected from the group consisting of myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes. According to the above configuration, it is possible to easily produce a cell sheet having orientation such as myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes, and easily from the cell sheet forming member without damaging the cell sheet. Can be peeled off.
  • the peeling assisting portion is formed of a second uneven portion having a second step structure that is formed of convex portions arranged at a second pitch, and the second pitch is It is preferably the same as the first pitch or larger than the first pitch. According to the above configuration, the contact area of the peeling assisting portion with respect to the cell sheet is smaller than the contact area of the culturing portion with respect to the cell sheet, and the adhesive force is also reduced. Therefore, the outer peripheral portion of the cell sheet is easily peeled off from the surface of the cell sheet forming member.
  • the first pitch is preferably 10 nm or more and 10 ⁇ m or less
  • the second pitch is preferably 100 nm or more and 10 ⁇ m or less.
  • the peeling assisting portion is a single annular portion that surrounds the culturing portion. According to the above configuration, the cell sheet can be easily peeled from the peeling auxiliary portion formed of the single annular portion.
  • the peeling assisting portion is composed of a second uneven portion having a second step structure composed of convex portions arranged at a second pitch
  • the peeling assisting portion is An annular portion that is a double or more annular portion that surrounds the culture portion, the annular portion that is located on the outside is provided with a concavo-convex structure that is the same as the annular portion that is located on the inside or that has a larger pitch than the annular portion that is located on the inside. It is preferable.
  • the adhesive force of the cell sheet can be weakened toward the outside. Accordingly, the cell sheet can be easily peeled from the outside in the peeling assisting portion.
  • the surface is coated with a temperature responsive polymer. According to the above-mentioned composition, exfoliation and collection of a cell sheet can be made easy.
  • the peeling assisting portion is formed of a second uneven portion having a second step structure that is formed of convex portions arranged at a second pitch, and is parallel to the surface. It is preferable that the area of contact between the virtual plane and the peeling auxiliary portion per unit area is smaller than the area of contact between the virtual plane and the first uneven portion per unit area. According to the above configuration, the area in which the virtual plane parallel to the surface and the peeling assisting portion make contact per unit area is smaller than the area in which the virtual plane and the first uneven portion make contact per unit area. Therefore, the adhesive strength is also low. Therefore, the outer peripheral portion of the cell sheet is easily peeled off from the surface of the cell sheet forming member.
  • the peeling assisting portion is composed of a second flat portion, and an area where a virtual plane parallel to the surface and the peeling assisting portion contact each other per unit area is the virtual. It is preferable that the area is larger than the area where the flat surface and the first uneven portion are in contact with each other per unit area. According to the above configuration, the area in which the virtual plane parallel to the surface and the peeling assisting portion contact per unit area is larger than the area in which the virtual plane and the first uneven portion contact per unit area. The strength of the outer peripheral portion of the cell sheet is increased, and the outer peripheral portion of the cell sheet is less likely to be damaged when peeled from the surface.
  • a cell sheet forming member includes a surface for forming a cell sheet, the surface is a culture section for culturing cells, and the cell sheet is located at an edge of the surface.
  • a separation assisting part that forms a separation initiation site from the surface, the culturing part includes a plurality of first flat parts, and a plurality of first concavo-convex parts, and each of the first flat parts is a first part.
  • Direction, and the first flat portion is arranged in a second direction intersecting with the first direction, and an imaginary plane parallel to the surface and the peeling auxiliary portion per unit area. The area of contact is smaller than the area of contact between the virtual plane and the first uneven portion per unit area.
  • the area in which the virtual plane parallel to the surface and the peeling assisting portion make contact per unit area is smaller than the area in which the virtual plane and the first uneven portion make contact per unit area. Therefore, the adhesive strength is also low. Therefore, the outer peripheral portion of the cell sheet is easily peeled off from the surface of the cell sheet forming member.
  • a cell sheet forming member includes a surface for forming a cell sheet, the surface being a culture portion for culturing cells, and the cell sheet being located at an edge of the surface. And a peeling assisting portion that forms a peeling start site from the surface, the culture portion includes a plurality of first flat portions and a plurality of first uneven portions, and each of the first flat portions, The first flat portion has a shape extending in a first direction, and the first flat portion is arranged in a second direction intersecting the first direction, and a virtual plane parallel to the surface and the peeling auxiliary portion have a unit area. The area in contact with the contact is larger than the area in contact with the virtual plane and the first uneven portion per unit area.
  • the area in which the virtual plane parallel to the surface and the peeling assisting portion contact per unit area is larger than the area in which the virtual plane and the first uneven portion contact per unit area.
  • the strength of the outer peripheral portion of the cell sheet is increased, and the outer peripheral portion of the cell sheet is less likely to be damaged when peeled from the surface.
  • a method for manufacturing a cell sheet-forming member for solving the above-mentioned problems includes forming an intaglio plate, and forming the surface of a cell sheet-forming member for forming a cell sheet by transferring the intaglio plate,
  • the surface comprises a culture unit for culturing cells, and a peeling auxiliary unit that is located outside the culture unit and forms a peeling start site from the surface of the cell sheet, and the culture unit has a plurality of A first flat portion and a plurality of first uneven portions are provided, each of the first flat portions has a shape extending in a first direction, and the first flat portion intersects with the first direction.
  • each of the first uneven portions includes a first step structure that fills a space between the first flat portions that are adjacent to each other, and the first step structures are arranged at a first pitch.
  • the peeling assisting portion is formed of a second uneven portion having a second step structure including convex portions arranged at a second pitch, or a second flat portion.
  • the intaglio plate has a first flat forming portion that forms the first flat portion, a first uneven forming portion that forms the first uneven portion, and a second flat portion that forms the second uneven portion or the second flat portion.
  • Forming the intaglio plate with two molding parts includes forming the first flat molding part, the first concavo-convex molding part, and the second molding part by photolithography, colloidal lithography, anodization, And forming using at least one kind of interference exposure method.
  • a method for producing a cell sheet according to an aspect of the present disclosure uses the cell sheet forming member as described above, and adhesion to any one of the first flat portion and the first uneven portion is superior to adhesion to the other. Adhering a certain cell to the surface of the cell sheet forming member to form a cell sheet on the surface of the cell sheet forming member, and the cell from the peeling start portion on the peeling auxiliary portion of the cell sheet forming member. Peeling the sheet from the surface.
  • FIG. 1A is a perspective view showing the structure of a cell sheet forming member according to the present disclosure together with a petri dish
  • FIG. 1B is a plan view showing the entire surface of the cell sheet forming member of FIG. 1A
  • FIG. 1B is an enlarged perspective view showing a part of the surface of the culture part of the cell sheet forming member of FIG. 1B
  • FIG. 6F is a cell sheet forming member of FIG. 1B.
  • the image of the surface of the product taken by a scanning electron microscope.
  • FIG. 2A is a plan view of a first cell sheet forming member
  • FIG. 2B is a cross-sectional view of a main part of the first cell sheet forming member of FIG. 3A is a plan view of a second cell sheet forming member
  • FIG. 3B is a cross-sectional view of a main part of the second cell sheet forming member of FIG. 4A is a plan view of a third cell sheet forming member
  • FIG. 4B is a cross-sectional view of a main part of the third cell sheet forming member of FIG. 4A
  • 5A is a plan view of a fourth cell sheet forming member
  • FIG. 5B is a cross-sectional view of an essential part of the fourth cell sheet forming member of FIG. 5A.
  • FIG. 3 is a process drawing for explaining an example of a method for manufacturing the cell sheet forming member shown in FIGS. 2A and 2B.
  • (A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet. A fluorescence-stained image of myoblasts cultured using the cell sheet forming member according to the present disclosure. Fluorescent staining image of myoblasts cultured using a cell culture dish as a reference example.
  • (A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet.
  • A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet.
  • (A) is a diagram showing cultured cells
  • (b) is a diagram showing a state in which the cultured cells are covered with an adhesive film
  • (c) is a diagram showing a state in which the cultured cells are three-dimensionally organized
  • (D) is a fluorescence-stained image of myoblasts cultured using the cell sheet forming member.
  • the cell sheet forming member 100 is, for example, a sheet material arranged on a culture dish 110 of a petri dish.
  • the cell sheet forming member 100 may be placed on the culture dish 110 or may be provided by directly processing a petri dish.
  • the cell sheet forming member 100 is shaped by injection molding the petri dish, for example.
  • the petri dish holds the cell suspension in the space surrounded by the culture dish 110 and the lid 120.
  • the cells contained in the cell suspension are, for example, at least one selected from the group consisting of myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes, but are not limited thereto.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 includes a culture section 101 for culturing cells, and a separation assisting section 102 for facilitating separation of the cell sheet from the surface 111.
  • the peeling auxiliary portion 102 is configured as an annular portion that surrounds the culture portion 101 outside the culture portion 101.
  • the peeling assisting portion 102 is located at the edge of the surface 111.
  • the adhesive force of the cell sheet to the peeling assisting section 102 is set to be lower than the adhesive force of the cell sheet to the culture section 101, and the outer peripheral portion of the cell sheet serves as a peeling start site. It is configured to be easily peeled off from the surface 111.
  • the adhesive force of the cell sheet to the peeling assisting section 102 is made higher than the adhesive force of the cell sheet to the culture section 101, and the strength of the outer peripheral portion of the cell sheet is increased.
  • the outer peripheral portion of the cell sheet is peeled from the surface 111, it is less likely to be damaged.
  • the culture unit 101 includes a plurality of first flat portions 130 and a plurality of first uneven portions 140.
  • Each first concave-convex portion 140 has a step structure (first step structure), and the plurality of step structures fill the space between the first flat portions 130 adjacent to each other.
  • the step structure is a convex portion or a concave portion.
  • the step structure in the present embodiment is the convex portion 141, and the first concave-convex portion 140 includes the concave portion sandwiched between the first flat portions 130 adjacent to each other and the plurality of convex portions 141 located on the bottom surface of the concave portion.
  • each first flat portion 130 is a flat surface extending in one direction, which is one direction (vertical direction in FIG. 1(d)).
  • the first flat portions 130 are arranged in the second direction (the left-right direction in FIG. 1D) orthogonal to the first direction on the entire surface 111.
  • Each of the first uneven portions 140 also extends in the first direction, and the first uneven portions 140 are arranged in the second direction on the entire surface 111. This is clear from an image obtained by photographing the surface of the cell sheet forming member 100 with a scanning electron microscope as shown in FIG. 1(f).
  • Each of the convex portions 141 forming the first concave-convex portion 140 is located at, for example, each vertex of a triangular lattice when viewed from the direction facing the surface 111.
  • Each first concave-convex portion 140 repeats such an arrangement of the convex portions 141 in the first direction and the second direction.
  • a master suitable for forming the convex portion 141 is a mask suitable for forming a minute repeating structure, for example, a single particle film. It becomes possible to form by the etching method which used as a mask.
  • Each protrusion 141 has, for example, a circular shape when viewed from the direction facing the surface 111.
  • the mode of the distance between the centers of the convex portions 141 adjacent to each other is the pitch of the convex portions 141.
  • the maximum width of the convex portion 141 in the plan view shape is the diameter of the convex portion 141.
  • the configuration in which the first pitch, which is the pitch of the convex portions 141, satisfies the following (A) and (B) is an extension direction of animal cells such as human and mouse, particularly the myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes described above. Is suitable from the viewpoint of aligning in the first direction. That is, the configuration in which the pitch (first pitch) of the convex portions 141 satisfies the following (A) and (B) is superior or inferior to the adhesion of animal cells, particularly the above-described myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes. It is preferable in that it is clearly divided between the first flat portion 130 and the first uneven portion 140.
  • the pitch of the convex portions 141 is 500 nm or more, it is easy to form a fine structure on the resin surface.
  • the pitch of the protrusions 141 is preferably 500 nm or more and 10 ⁇ m or less.
  • each first flat portion 130 in the second direction is the width of the first flat portion 130. Is. Further, the length in the second direction (short side direction) between the flat portions 130 adjacent to each other is the width of the first uneven portion 140.
  • the width of the first flat portion 130 and the width of the first uneven portion 140 are, for example, 1/10 times or more and 10 times or less of the size of cells to be cultured (5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less).
  • the configuration in which the width of the first flat portion 130 and the width of the first concave-convex portion 140 satisfy the following (C) and (D) is that of animal cells, particularly the above-described myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes. It is suitable from the viewpoint of facilitating the alignment of the extension direction with the first direction.
  • a concave portion 142 may be provided between the convex portions 141 adjacent to each other, and between the first flat portion 130 and the convex portion 141 adjacent thereto. Since the plurality of convex portions 141 are scattered on the first concave-convex portion 140, the concave portions 142 that are spaces between the convex portions 141 are continuous in the first concave-convex portion 140 in the first direction and the second direction.
  • the length between the bottom surface of the concave portion 142 and the first flat portion 130 is the height of the first flat portion 130.
  • the height difference between the tip end surface of each convex portion 141 and the first flat portion 130 is a boundary step.
  • the height difference between the bottom surface of the concave portion 142 and the tip surface of each convex portion 141 is the height of the convex portion 141.
  • the height of the first flat portion 130 and the height of the convex portion 141 are equal to each other.
  • the ratio of the pitch of the protrusions 141 to the height of the protrusions 141 is the aspect ratio of the protrusions 141.
  • the configuration in which the boundary step satisfies the following (E) is suitable from the viewpoint of improving the flatness of the cell sheet.
  • the configuration in which the height of the convex portion 141 satisfies the following (F), and the configuration in which the aspect ratio of the convex portion 141 satisfies the following (G), can increase the structural stability of the first uneven portion 140, Further, it is preferable from the viewpoint of facilitating the formation of the first uneven portion 140.
  • the cells preferentially adhere to one of the structures, regardless of whether the cells are predominantly adherent to the first flat portion 130 or the first concavo-convex portion 140.
  • the cells are aligned in the first direction, which is the extending direction of both structures, and as a result, spread in the two-dimensional direction along the surface 111.
  • the cell sheet it is possible to align the cell elongation direction in a one-dimensional direction, that is, to improve the orientation of the cell. It is also possible to form a three-dimensional structure by stacking in the thickness direction in the state of having a property.
  • the structure satisfying the above (F) can further enhance the flatness of the cell sheet.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 includes the first flat portion 130 and the first concave-convex portion 140, the cells that are predominantly adhered to the first flat portion 130 are adhered to the first concave-convex portion 140. It is also possible to apply the common cell sheet forming member 100 to both the predominant cells. That is, the versatility of the cell sheet forming member 100 can be enhanced.
  • Stimulus-responsive material may be applied to facilitate peeling and recovery of the cell sheet after the cell sheet is formed.
  • the stimulus-responsive material a temperature-responsive polymer whose water affinity changes with temperature changes is preferable. Specifically, poly-N-isopropylacrylamide (PIPAAm) is preferable.
  • PIPAAm poly-N-isopropylacrylamide
  • the stimuli-responsive material may be applied to the substrate using a conventional application method.
  • the cell sheet forming member on which the cell sheet is formed may be subjected to ultrasonic treatment in order to facilitate peeling and recovery of the cell sheet.
  • the peeling assisting portion 102 of the first cell sheet forming member which is an embodiment of the cell sheet forming member 100, is configured as an annular portion that surrounds the culture portion 101.
  • the second uneven portion 121 is formed.
  • the second uneven portion 121 is located on the outer peripheral portion of the cell sheet forming member 100.
  • the second uneven portion 121 has a single step structure (second step structure) that surrounds the culture section 101.
  • the step structure in the peeling auxiliary section 102 is a convex section 122, and the second concave-convex section 121 includes a concave section adjacent to the first flat section 130 and a plurality of convex sections 122 located on the bottom surface of the concave section.
  • Each of the convex portions 122 forming the second concave-convex portion 121 is located at, for example, each vertex of a triangular lattice when viewed from the direction facing the surface 111.
  • the second concave-convex portion 121 is a mask suitable for forming a master for forming the convex portions 122 and a minute repeating structure, for example, It can be formed by an etching method using a single particle film as a mask.
  • the second uneven portion 121 can be formed simultaneously with the first uneven portion 140.
  • the width of the second uneven portion 121 is preferably 0.5 mm or more and 20 mm or less.
  • Each of the convex portions 122 has, for example, a circular shape when viewed from the direction facing the surface 111.
  • the mode of the distance between the centers of the convex portions 122 adjacent to each other is the pitch of the convex portions 122.
  • the maximum width of the convex portion 122 in the plan view shape is the diameter of the convex portion 122.
  • the configuration in which the second pitch, which is the pitch of the convex portions 122, satisfies the following (H) is from the viewpoint of enhancing the detachability of animal cells such as human and mouse, particularly the above-mentioned myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes. It is suitable.
  • Second pitch of the convex portions 122 100 nm or more and 10 ⁇ m or less (preferably 300 nm or more and 5 ⁇ m or less, more preferably 500 nm or more and 1 ⁇ m or less)
  • the second pitch is preferably the same as the first pitch or larger than the second pitch. That is, it is preferable that the second pitch is larger than the first pitch.
  • the area in which the virtual plane parallel to the surface 111 and the second uneven portion 121 of the peeling assisting portion 102 contact per unit area is the contact between the virtual plane and the first uneven portion 140 per unit area. It is smaller than the area.
  • the cell sheet has a smaller adhesive force to the peeling assisting section 102 than to the culturing section 101.
  • the cell sheet is easily peeled off from the outer peripheral edge (peeling start site) of the surface 111 and is less likely to be damaged.
  • the contact area of the second uneven portion 121 with respect to the cell sheet is the first flat portion 130 when adjacent to the outer peripheral side of the first flat portion 130.
  • the height between the bottom surface of the concave portion and the convex portion 122 is the height of the convex portion 122.
  • the peeling assisting portion 102 of the second cell sheet forming member which is another embodiment of the cell sheet forming member 100, has an inner ring shape as the second uneven portion 121.
  • a portion 123 and an outer annular portion 124 are provided. That is, the second uneven portion 121 has a double step structure (second step structure) surrounding the culture section 101, the inner annular section 123 is located adjacent to the culture section 101, and the outer annular section 124 is The inner side is adjacent to the inner annular portion 123, and the outer side constitutes the outer peripheral edge of the cell sheet forming member 100.
  • each of the inner annular portion 123 and the outer annular portion 124 is a convex portion or a concave portion.
  • the step structure of the inner annular portion 123 is a convex portion 123a, and the inner annular portion 123 includes a concave portion adjacent to the first flat portion 130 and a plurality of convex portions 123a located on the bottom surface of the concave portion.
  • the step structure of the outer annular portion 124 is a convex portion 124a, and the outer annular portion 124 includes a plurality of convex portions 124a located on the bottom surface of the concave portion.
  • Each of the convex portions 123a and 124a is located, for example, at each vertex of a triangular lattice when viewed from the direction facing the surface 111.
  • the master for forming the protrusions 123a and 124a is formed into a minute repeating structure. It can be formed by an etching method using a suitable mask, for example, a single particle film as a mask.
  • the annular portions 123 and 124 can be formed simultaneously with the first uneven portion 140.
  • the configuration in which the inner second pitch that is the pitch of the convex portions 123a and the outer second pitch that is the pitch of the convex portions 124a satisfy the following (I) and (J) is used for animal cells such as human and mouse, especially the myoblasts described above. It is suitable from the viewpoint of enhancing the detachability of cells, fibroblasts, and cardiomyocytes. Further, this configuration is preferable from the viewpoint that the outer annular portion 124 makes the cell sheet easier to peel off than the inner annular portion 123.
  • the cell sheet has a smaller adhesive force to the peeling assisting section 102 than to the culturing section 101. Therefore, the cell sheet is easily peeled off from the outer peripheral edge (peeling start site) of the surface 111 and is less likely to be damaged.
  • the inner second pitch is preferably the same as the first pitch or larger than the first pitch.
  • the contact force of the cell sheet is weakened because the contact area of the peeling assisting section 102 is smaller than the contact area of the culturing section 101 per unit area.
  • the contact area of the inner annular portion 123 with respect to the cell sheet is the first. The smaller the contact area of the 1 flat part 130 with the cell sheet, the weaker the adhesive force. As a result, the inner annular portion 123 has a weaker adhesive force of the cell sheet than the first flat portion 130, and is easily peeled off.
  • the inner second pitch of the convex portions 123a of the inner annular portion 123 is smaller than the outer second pitch of the convex portions 124a of the outer annular portion 124. That is, the outer second pitch is larger than the inner second pitch.
  • the contact area of the outer annular portion 124 with respect to the cell sheet per unit area is smaller than that of the inner annular portion 123, and the adhesive force of the cell sheet is weakened and the cell sheet is easily peeled off.
  • the length between the bottom surface of the concave portion and the convex portions 123a and 124a is the height of the convex portions 123a and 124a.
  • the peeling assisting portion 102 of the third cell sheet forming member is the second uneven portion 121.
  • An inner annular portion 125 and an outer annular portion 126 are provided. That is, the second concave-convex portion 121 has a double step structure surrounding the culture portion 101, the inner annular portion 125 is located adjacent to the culture portion 101, and the outer annular portion 126 is an inner annular portion inside. It is adjacent to the portion 125 and constitutes the outer peripheral edge of the cell sheet forming member 100 on the outer side.
  • Each step structure of the inner annular portion 125 and the outer annular portion 126 is a convex portion or a concave portion.
  • the stepped structure (second stepped structure) of the inner annular portion 125 is a convex portion 125a having a truncated cone shape, and the inner annular portion 125 has a concave portion adjacent to the first flat portion 130 and a bottom surface of the concave portion. And a plurality of convex portions 125a located therein.
  • the step structure of the outer annular portion 126 is a convex portion 126a having a conical shape, and the outer annular portion 126 includes a plurality of convex portions 126a located on the bottom surface of the concave portion.
  • Each of the convex portions 125a and 126a is located, for example, at each apex of the triangular lattice when viewed from the direction facing the surface 111.
  • the master for forming the convex portions 125a and 126a is formed into a minute repeating structure. It can be formed by an etching method using a suitable mask, for example, a single particle film as a mask.
  • the annular portions 125 and 126 can be formed simultaneously with the first uneven portion 140.
  • the configuration in which the inner second pitch that is the pitch of the convex portion 125a and the outer second pitch that is the pitch of the convex portion 126a satisfy the following (K) is defined as animal cells, particularly the above-described myoblasts, fibroblasts, and myocardium. It is suitable from the viewpoint of enhancing the detachability of cells.
  • the area where the virtual plane parallel to the surface 111 and the annular portions 125 and 126 of the peeling assisting portion 102 contact each other per unit area is the virtual plane and the first uneven portion 140. It is smaller than the contact area.
  • the cell sheet has a smaller adhesive force to the peeling assisting section 102 than to the culturing section 101. Therefore, the cell sheet is easily peeled off from the outer peripheral edge (peeling start site) of the surface 111 and is less likely to be damaged.
  • the inner second pitch is preferably the same as the first pitch or larger than the first pitch.
  • the contact force of the cell sheet is weakened because the contact area of the peeling assisting section 102 is smaller than the contact area of the culturing section 101 per unit area.
  • the contact area of the inner annular portion 125 with respect to the cell sheet is the cells of the first flat portion 130 when adjacent to the outer peripheral side of the first flat portion 130. The smaller the contact area with the sheet, the weaker the adhesive force.
  • the inner annular portion 125 has a weaker adhesive force of the cell sheet than the first flat portion 130, and is easily peeled off.
  • each protrusion 126a of the outer annular portion 126 has a conical shape
  • each protrusion 125a of the inner annular portion 125 has a truncated cone shape. Therefore, the inner annular portion 125 has a larger contact area per unit area than the outer annular portion 124. As a result, the outer annular portion 126 is easier to peel off the cell sheet than the inner annular portion 125.
  • the length between the bottom surface of the concave portion and the convex portions 125a, 126a is the height of the convex portions 125a, 126a.
  • the flatness of the cell sheet can be improved in the configuration in which the tip surfaces of the respective convex portions 125a and 126a are flush with the convex portion 141 and the first flat portion 130.
  • the peeling assisting portion 102 of the fourth cell sheet forming member which is still another embodiment of the cell sheet forming member 100, includes a second flat portion 127. ing.
  • the second flat portion 127 is a flat surface. In the thickness direction of the cell sheet forming member 100, the length between the bottom surface of the concave portion 142 and the second flat portion 127 is the height of the second flat portion 127. The height difference between the bottom surface of the concave portion 142 and the tip end surface of the second flat portion 127 is the height of the second flat portion 127.
  • each convex portion 141 and the first flat portion 130 and the second flat portion 127 are flush with each other.
  • a surface 111 makes it possible to form a master for forming the convex portions 122 by a mask suitable for forming a minute repeating structure, for example, an etching method using a single particle film as a mask. ..
  • the second flat portion 127 can be formed simultaneously with the first uneven portion 140.
  • the width of the second flat portion 127 is preferably 0.5 mm or more and 20 mm or less.
  • the area in which the virtual flat surface parallel to the surface 111 and the second flat portion 127 of the peeling assisting portion 102 contact per unit area is such that the virtual flat surface and the first uneven portion 140 are the unit area. It is larger than the contact area.
  • the adhesive force of the cell sheet to the peeling assisting portion 102 is higher than the adhesive force of the cell sheet to the culture portion 101. Therefore, it is possible to increase the strength of the outer peripheral portion of the cell sheet and prevent the outer peripheral portion of the cell sheet from being damaged when peeled from the surface 111.
  • the peeling assisting portion 102 may be configured such that the second flat portion 127 is formed of a second uneven portion having a step structure.
  • the second concavo-convex portion may be smaller than the pitch of the first concavo-convex portion 140 so that the contact area with the cell sheet per unit area is larger than that of the culture section 101.
  • the strength of the cell sheet in the peeling assisting portion 102 can be increased.
  • the outer annular portion is configured to have a smaller pitch of the concavo-convex structure than the inner annular portion. With such a configuration, the strength of the cell sheet can be increased as it approaches the edge of the surface 111.
  • the manufacturing method of the cell sheet forming member includes a step of forming the intaglio plate 150 and a step of forming the surface 111 of the cell sheet forming member 100 by transferring the intaglio plate 150.
  • the lower surface of the intaglio plate 150 has a shape extending in a first direction (a direction orthogonal to the paper surface), and a plurality of first flat forming portions 151 arranged in a second direction (left-right direction of the paper surface) intersecting the first direction. And a first concavo-convex molding part 152 having a plurality of step structures that fills the space between the first flat molding parts 151 adjacent to each other.
  • the first flat forming portion 151 is a portion for forming the first flat portion 130
  • the first uneven forming portion 152 is a portion for forming the first uneven portion 140.
  • the portion of the intaglio 150 outside the first flat forming portion 151 is a portion that forms the peeling assisting portion 102, and in the example of FIG. 6, the second uneven forming portion for forming the second uneven portion 121. 153 is provided.
  • the concavo-convex structure of the first concavo-convex shaped portion 152 has a pitch, a height, etc. corresponding to the concavo-convex structure of the first concavo-convex portion 140.
  • the concavo-convex structure of the second concavo-convex shaped portion 153 has a pitch and a height corresponding to the concavo-convex structure of the second concavo-convex portion 121.
  • the concavo-convex portion is formed using, for example, at least one of a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method on a silicon substrate for forming the intaglio plate 150.
  • the intaglio plate 150 itself may be obtained by transferring the master plate once or plural times.
  • a shape corresponding to the surface shape of the intaglio plate 150 is formed on the master by using at least one of a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method for a silicon substrate.
  • the lower surface of the intaglio plate 150 is opposed to the surface 111 of the base material 160 for forming the cell sheet forming member 100.
  • the forming material of the base material 160 is, for example, a thermoplastic resin or a photocurable resin. Then, the lower surface of the intaglio plate 150 is pressed against the surface 111 of the base material 160 while the base material 160 has fluidity. Next, the intaglio plate 150 is released from the surface 111 of the base material 160 with the fluidity of the base material 160 suppressed.
  • the first flat molding portion 151, the first concave-convex molding portion 152, and the second concave-convex molding portion 153 of the intaglio plate 150 are transferred to the surface 111 of the base material 160, and the first flat portion 130 and the first concave-convex portion 140. , The second uneven portion 121 and the like are formed.
  • the base material 160 For the purpose of enhancing the adhesiveness of cells on the surface of the thermoplastic resin or the photocurable resin forming the base material 160, for example, laminin, collagen, gelatin, fibronectin, polylysine (PDL or PLL), hyaluronic acid, etc.
  • An organic substance containing an adhesion factor such as extracellular matrix, polymer, or gel may be applied.
  • a biomaterial such as a polysaccharide or a protein may be used as a material for forming the base material 160.
  • the cell suspension located on the surface 111 of the cell sheet forming member 100 includes, for example, cells S1 that adhere to the first flat portion 130.
  • each first flat portion 130 extends in the long side direction (first direction) of the first concavo-convex portion 140, and the width of each first flat portion 130 is 1 to several times the size of a general cell. It is a degree. Therefore, as shown in FIG. 7B, the positions of the cells S1 are preferentially distributed within the range of the first flat portion 130, and the cells S1 are arranged with the long axis direction of the cells arranged in the first direction.
  • FIG. 8 shows an example of myoblasts cultured using the cell sheet forming member 100. In the example shown in FIG. 8, the myoblasts are controlled so that their extending directions are aligned in one direction.
  • FIG. 9 shows an example of myoblasts cultivated using a commercially available cell culture dish as a reference example, and in the example shown in the figure, the extending direction of myoblasts is randomly arranged.
  • the cell suspension located on the surface 111 of the cell sheet forming member 100 contains, for example, the cells S2 that adhere to the first uneven portion 140.
  • each first concavo-convex portion 140 extends in the long side direction (first direction) of the first concavo-convex portion 140, and the width of each first concavo-convex portion 140 is 1 to several times the size of a general cell. It is a degree. Therefore, as shown in FIG. 10B, the cells S2 are preferentially distributed within the range of the first concavo-convex portion 140, and the cells S2 are linear with the long axis direction of the cells arranged in the first direction. Connected to. That is, the extension direction of the cell S2 is controlled so as to be aligned with the long side direction of the first uneven portion 140.
  • the orientation of the cells S1 is not controlled, and thus the long axis direction of the cells exists in a random direction.
  • the cell sheet forming base material that satisfies the above (A) as shown in FIG. It is the cell S1 that preferentially adheres, and is also the cell S2 that is allowed to adhere to the first uneven portion 140, although it is inferior to the first flat portion 130.
  • the cells of the cell suspension retained on the cell sheet forming member 100 are cells S2 that preferentially adhere to the first uneven portion 140, which is inferior to the first uneven portion 140 but flat.
  • the cell S1 is also allowed to adhere to the portion 130.
  • the first flat portions 130 and the first uneven portions 140 extend in the first direction and are alternately arranged in the second direction. Therefore, on the surface 111 of the cell sheet forming member, for example, the orientation of the cells S1 preferentially adhered to the flat portion 130 has the structure of the flat portion 130 and the structure of the first uneven portion 140 partitioning the flat portion 130. Controlled by.
  • the orientation by the flat portion 130 is reflected.
  • the cells S1 and S2 whose orientation is controlled in the first direction form a cell sheet SA that spreads over the entire surface 111.
  • the orientation of the cells S2 preferentially adhered to the first uneven portion 140 is controlled by the structure of the first uneven portion 140 and the structure of the first flat portion 130 partitioning the cell S2. Then, in the first flat portion 130 sandwiched between the first uneven portions 140 adjacent to each other, although it is inferior to the first uneven portion 140, the cells S1 adhered to the first flat portion 130 The control of the orientation by the uneven portion 140 is reflected. As a result, as shown in FIG. 11C, the cells S1 and S2 whose orientation is controlled in the first direction form a cell sheet SA that spreads over the entire surface 111.
  • Example 1 ⁇ Production of cell sheet forming member> The first flat portion 130, the first uneven portion 140, and the annular portions 123 and 124 of the second uneven portion 121 of the cell sheet forming member 100 including the peeling assisting portion 102 shown in FIGS. A nickel intaglio plate to be formed by transfer was produced.
  • a ring-shaped first flat portion 130, first concave-convex portion 140 and second concave-convex portion 121 is formed on a polystyrene sheet having a temperature-responsive polymer (PIPAAm) fixed on the surface of the substrate by a nanoimprint method.
  • PIPAAm temperature-responsive polymer
  • the parts 123 and 124 were processed, and thereby the cell sheet forming member 100 of Example 1 was produced.
  • Each of the first flat portions 130 in the culture section 101 has a shape that extends in the first direction, is arranged in a second direction that intersects the first direction, and has a width (in the second direction) of each first flat portion 130. The length) was 10 ⁇ m.
  • the first concavo-convex portion 140 includes a plurality of step structures that fill the spaces between the flat portions 130 adjacent to each other, and the length in the second direction between the first flat portions 130 adjacent to each other is 10 ⁇ m.
  • the pitch of the convex portions 141 in the concave-convex portion 140 was 300 nm.
  • the height of each convex portion in the first concave-convex portion 140 was measured using an AFM, and the average height from the bottom surface of the concave portion to the tip of the convex portion was 446 nm.
  • the average height from the bottom of the recess to the first flat portion 130 was 455 nm.
  • the width of the outer annular portion 124 located at the outer edge portion of the cell sheet forming member 100 was 5 mm, and the outer second pitch of the convex portions 124a was 600 nm.
  • the height of each convex portion in the outer annular portion 124 was measured using an AFM, and the average height from the bottom surface of the concave portion to the tip of the convex portion was 763 nm.
  • the inner second pitch of the convex portions 123a in the inner annular portion 123 located inside the outer annular portion 124 and outside the culture portion 101 was 300 nm.
  • the height of the convex portion 123a in the inner annular portion 123 was measured using an AFM, and the average height from the bottom surface of the concave portion to the tip of the convex portion was 446 nm.
  • mice-derived myoblasts (C2C12 cells, manufactured by DS Pharma Biomedical) were cultured in a cell culture flask (25 cm 2 ).
  • the culture conditions are FBS (fetal bovine serum) 1
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • Trypsin was used to recover the cells, and the cells were collected according to a standard method. The number of cells in the collected cells was measured using a hemocytometer.
  • the cell sheet forming member 100 of Example 1 cut into a circle having a diameter of 8.8 mm was placed on the bottom surface of the multi-well plate for cell culture (48 holes), and 1 ml of myoblast was seeded. After culturing for 24 hours or more in a CO 2 incubator, the medium was exchanged, and the medium was exchanged every day. Seven days after the start of culture, the cultured cell sheet was collected.
  • the medium was removed leaving the cells soaked, and the multiwell plate was allowed to stand in an incubator at -20°C for 30 minutes.
  • a PDVF membrane as a cell support was placed on the cell sheet to adhere the cell sheet. With the cell sheet attached to the PDVF membrane, the PDVF membrane was lifted and moved onto the collagen gel. The medium was added dropwise to remove only the PDVF membrane. It was confirmed by microscopic observation that the recovered cell sheet did not tear or fall off the cells.
  • the cell sheet forming member 100 shown in FIGS. 2(a) to 4(b) is provided with a peeling assisting portion 102 including a second uneven portion 121 on the outside of the culture portion 101.
  • the peeling assisting part 102 can weaken the adhesive force by making the contact area of the cell sheet smaller than that of the culturing part 101. As a result, the cell sheet can be easily separated in the separation assisting unit 102.
  • the cell sheet forming member 100 including the peeling assisting portion 102 including the second uneven portion 121 is suitable for culturing cells having relatively strong adhesiveness, for example. That is, even when a cell sheet having a relatively strong adhesiveness is peeled off, the peeling assisting portion 102 can weaken the adhesive force of the cell sheet, so that the cell sheet is easily peeled off.
  • the cell sheet forming member 100 shown in FIGS. 5(a) and 5(b) is provided with the peeling assisting portion 102 including the second flat portion 127 on the outer side of the culture portion 101.
  • the strength of the outer peripheral portion of the cell sheet is increased and the outer peripheral portion of the cell sheet is covered with the surface. It can be made less likely to be damaged when peeled from 111.
  • the cell sheet forming member 100 including the peeling assisting portion 102 including the second flat portion 127 is suitable for culturing cells having relatively weak adhesiveness, for example.
  • a cell sheet having orientation such as myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes can be easily manufactured, and easily peeled from the cell sheet forming member 100 without damaging the cell sheet. can do.
  • the second pitch of the step structure in the second uneven portion 121 in the peeling assisting portion 102 is the same as or larger than the first pitch of the step structure in the first uneven portion 140.
  • the contact area of the second uneven portion 121 with respect to the cell sheet is smaller than the contact area of the first uneven portion 140 with respect to the cell sheet, and the adhesive force is also reduced. Therefore, the outer peripheral portion of the cell sheet can be easily peeled from the surface 111.
  • the peeling assisting portion 102 shown in FIG. 2A is a second uneven portion 121 formed of a single annular portion surrounding the culture portion 101. Therefore, the contact area of the cell sheet on the second concave-convex portion 121 is smaller than that on the culture section 101, and thus the adhesive force is weakened. As a result, the cell sheet can be easily separated in the separation assisting unit 102.
  • the peeling assisting portion 102 shown in FIGS. 3(a) to 4(b) is the second concave-convex portion 121 formed of a double annular portion surrounding the culture portion 101, and the annular portion positioned outside.
  • the pitch of the concavo-convex structure of the part is the same as the pitch of the concavo-convex structure of the annular part located inside, or larger than the pitch of the concavo-convex structure of the annular part located inside.
  • the surface of the base material 160 is coated with a temperature-responsive polymer. This makes it easy to peel off and collect the cell sheet.
  • the cell suspension located on the surface 111 of the cell sheet forming member 100 is the first solution containing the cell adhesion first component and the first solution. It comprises cultured cells 1 coated alternately with a component and a second solution containing a cell-adhesive second component that interacts. That is, the cultured cell 1 shown in FIG. 12( a) is covered with the adhesive film 2 as shown in FIG. 12( b ).
  • the adhesive film 2 is composed of a first film 2a containing a first component and a second film 2b containing a second component (FIG. 12(b)).
  • the combination of the first component and the second component is, for example, a combination of a polymer containing an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence to which an integrin binds and a polymer interacting with a polymer containing the RGD sequence. is there.
  • the polymer containing the RGD sequence containing the first component may be a protein having the RGD sequence or a protein chemically bound to the RGD sequence. Further, it may have a RGD sequence, and may be a naturally-occurring polymer other than protein or a synthetic polymer. Examples of the polymer containing an RGD sequence composed of a protein include conventionally known adhesive proteins such as fibronectin (molecular weight of about 500,000), vitronectin, laminin, cadherin and collagen.
  • both substances are capable of, for example, binding, adhering, adsorbing, and electron transfer due to the interaction with the polymer containing the RGD sequence.
  • the substance is not particularly limited as long as it is a substance that can be brought into close proximity, and it is any one of a protein that interacts with a polymer containing an RGD sequence, a naturally-occurring polymer, and a synthetic polymer.
  • the protein that interacts with the polymer containing the RGD sequence include water-soluble proteins, and specific examples thereof include collagen, gelatin (molecular weight of 100,000 as an example), proteoglycan, integrin, enzyme, antibody, etc. is there.
  • Examples of naturally-occurring polymers that interact with polymers containing RGD sequences include water-soluble polypeptides, low-molecular peptides, polyamino acids such as ⁇ -polylysine and ⁇ -polylysine (molecular weight 5,000), heparin and heparan sulfate, Examples include sugars such as dextran sulfate (molecular weight 500,000) and hyaluronic acid (molecular weight 1,000,000).
  • the combination of the first component and the second component is, for example, any of fibronectin and gelatin, fibronectin and heparin, fibronectin and dextran sulfate, and laminin and collagen.
  • a cultured cell 1 is prepared, and the entire surface thereof is coated with an adhesive film 2 to prepare a coated cell. Specifically, the prepared cultured cells 1 are put into a test tube.
  • the first component is brought into contact with the cultured cell 1.
  • the method for contacting the cultured cells with the first component include, for example, a method of directly adding the first component, a method of immersing the cell in a liquid containing the first component, and a dropping of the liquid containing the first component into the cultured cells 1.
  • the contact conditions can be appropriately determined depending on the contact method and the concentration of the contained liquid used.
  • the contact time is, for example, 15 seconds to 60 minutes, preferably 15 seconds to 15 minutes, more preferably 15 seconds to 5 minutes, and further preferably 15 seconds to 1 minute.
  • the contact temperature is not particularly limited, but is, for example, 4 to 60° C., preferably 20 to 40° C., more preferably 30 to 37° C., and further preferably 37° C.
  • the solvent may be an aqueous solvent such as water or a buffer
  • the buffer may be, for example, a Tris buffer such as Tris-HCl buffer, a phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, Britton-Robinson buffer, GTA buffer and the like can be mentioned.
  • the released first component is removed.
  • centrifugation is performed using the above solvent, the cultured cells 1 and the liquid containing the first component are separated, and the supernatant is removed. A method of removing is mentioned. As a result, the cultured cells 1 covered with the first film 2a composed of the first component can be obtained.
  • the cultured cells 1 coated with the first component are brought into contact with the second component.
  • the second film 2b made of the second component is coated.
  • the method of contacting with the second component can be carried out in the same manner as the first component.
  • it is carried out in the same manner as the method for preparing the liquid containing the first component.
  • a liquid containing the second component can be prepared.
  • the cultured cells 1 coated with the adhesive film 2 including the first film 2a including the first component and the second film 2b including the second component can be obtained.
  • a laminated film composed of the first film 2a of the first component and the second film 2b of the second component can be repeatedly coated to form a plurality of coating film layers.
  • the non-peritoneal layer is, for example, 1 to 20 layers, preferably 1 to 10 layers, and more preferably 1 to 5 layers.
  • the cell suspension containing the cultured cells 1 is dropped on the surface 111 of the cell sheet forming member 100, and the cultured cells 1 are seeded. Then, the cultured cell 1 is cultured.
  • the culture conditions for completing the three-dimensional cell sheet of the cultured cells 1 are appropriately determined according to the cells to be cultured.
  • the culture temperature is, for example, 4 to 60° C., preferably 20 to 40° C., more preferably 30 to 37° C.
  • the culture time is, for example, 1 to 168 hours, preferably 3 to 24 hours. Time, more preferably 3 to 12 hours.
  • the cell sheets 10 having a three-dimensional tissue can be manufactured by adhering the cultured cells 1 to each other or the proliferated cultured cells 1 to each other via the adhesive film 2 (see FIG. 12 ( See c).).
  • the cell sheet 10 other cultured cells extending in the one-dimensional direction are cultivated so as to overlap the cultured cells extending in the one-dimensional direction. Therefore, the size and shape of the cultured cells extending in the one-dimensional direction are , Not only in the first direction, but also in the second direction and in the direction orthogonal to the first and second directions. As a result, in the three-dimensional tissue, the space between the cultured cells that extend in the first direction and are adjacent to each other in the second direction is smaller than the cells and filled with other cells that extend in the first direction. Therefore, in the three-dimensional tissue, a layer structure is recognized in the first layer constituting the first surface adjacent to the surface 111 or a position close to the first layer.
  • the layer structure collapses as it moves away from the first surface) and approaches the second surface facing the first surface, and the other cultured cells 1 are stacked so that another cultured cell 1 enters the gap between the cultured cells 1.
  • the three-dimensional tissue having orientation can culture cells in a state close to a living body. Further, as shown in FIG. 12D, the orientation has an inclination in the second direction with respect to the first direction in which the extending direction of the cultured cells 1 is the specific direction. In the three-dimensional tissue having such an orientation, cells are cultured in a state close to that of a living body, so that drug responsiveness and the like can be made closer to that of the living body.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 is, for the purpose of enhancing the adhesiveness of cells, for example, an extracellular matrix such as laminin, collagen, gelatin, fibronectin, polylysine (PDL or PLL), hyaluronic acid, a polymer, a gel.
  • An organic substance containing an adhesion factor such as the above may be applied, or the surface may be made of metal.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 may have hydrophilicity or hydrophobicity for the purpose of enhancing the adhesiveness of cells and the flatness of the cell sheet.
  • An extracellular matrix production promoting factor may be added to the cell suspension.
  • the extracellular matrix production promoting factor include TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 3, ascorbic acid, ascorbic acid diphosphate or a derivative thereof or a salt thereof.
  • ascorbic acid, ascorbic acid diphosphate or derivatives thereof and salts thereof are preferable.
  • Ascorbic acid is preferably L-form.
  • the shape of the convex portion 141 can be any one of a cone shape such as a cone and a pyramid, a columnar shape such as a cylinder and a prism, a truncated cone shape such as a truncated cone and a truncated pyramid, and a hemispherical shape. is there.
  • the position of the convex portion 141 may be irregular at each lattice point on the square lattice, at each lattice point on the hexagonal lattice, and further at the first irregular portion 140.
  • the shape of the first concavo-convex portion 140 is not limited to the linear shape extending in the first direction, but may be changed to a polygonal line extending in the first direction or a curved shape extending in the first direction.
  • the step structure that constitutes the first concavo-convex portion 140 can be changed to a concave portion or both a concave portion and a convex portion.
  • the first concavo-convex portion 140 can be changed to a structure in which one side surface that is continuous with the first flat portion 130 is provided and a plurality of concave portions are formed on the side surface.
  • the width of one first concavo-convex portion 140 and the width of the other first concavo-convex portion 140 may be different from each other or may be equal to each other. If the width of one first concavo-convex portion 140 and the width of the other first concavo-convex portion 140 are equal to each other, it is possible to enhance the uniformity of the characteristics of the cell sheet in the second direction. Is possible.
  • the width of one first flat portion 130 and the width of another first flat portion 130 may be different from each other or may be equal to each other. If the width of one first flat portion 130 and the width of another first flat portion 130 are equal to each other, the uniformity of the characteristics of the cell sheet in the second direction can be improved. Is possible.
  • the width of the first flat portion 130 and the width of the first uneven portion 140 may be different from each other or may be equal to each other.
  • the width of the first flat portion 130 is within a range in which the orientation can be controlled and is larger than the width of the first uneven portion 140. It is suitable.
  • the width of the first uneven portion 140 is within a range in which the orientation can be controlled and is larger than the width of the first flat portion 130. It is suitable.
  • the second direction in which the first flat portions 130 and the first concavo-convex portions 140 are alternately arranged is not limited to the direction orthogonal to the first direction, and if the second direction intersects the first direction, for example, the first direction It is also possible to set the direction in which the angle formed is 45°.
  • the cell sheet forming member is not limited to a transfer body using an intaglio plate, but may be a transfer body using a relief plate, and can also be a molded body by injection molding. That is, it is also possible to manufacture a cell sheet molding member using injection molding.
  • the height of the convex portion is preferably 50 nm or more and 5 ⁇ m or less. Further, the aspect ratio of the convex portion is preferably 0.1 or more and 10 or less. Such a configuration is suitable from the viewpoint that the structural stability of the second uneven portion 121 can be improved and that the second uneven portion 121 can be easily formed.
  • the shape of the convex portion is any one of a cone shape such as a cone and a pyramid, a columnar shape such as a cylinder and a prism, a truncated cone shape such as a truncated cone and a truncated pyramid, and a hemispherical shape. It is possible to
  • the positions of the convex portions in the second concave-convex portion 121 may be irregular at the lattice points on the square lattice, the lattice points on the hexagonal lattice, and the first concave-convex portion 140.
  • the height of the second uneven portion 121 may be the same as the height of the first flat portion 130 and/or the first uneven portion 140, may be higher, or may be lower.
  • the second concave-convex portion 121 of the peeling assisting portion 102 may be formed of an annular portion having three or more layers. In this case, it is preferable to increase the pitch of the step structure and weaken the adhesive force toward the outer peripheral annular portion. In the step structure in the adjacent annular portions, the pitch may be the same and there may be a portion.
  • the cell sheet forming member can be applied to a multi-well plate, a petri dish, a flask, a chamber slide or the like as long as it can hold a cell suspension.
  • Convex part, 142 Recessed part, 150... Intaglio, 151... 1st flat shaping

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Abstract

細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、表面は、細胞を培養する培養部と、培養部に対して外側に位置し、細胞シートの表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備える。第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、第１平坦部は、第１方向と交差する第２方向に並び、第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備える。第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されている。剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されている。

Description

細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法
　本開示は、細胞シートを形成するための細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法に関する。
　細胞を培養するための方法は、従来から種々提案されている。例えば、特許文献１に記載の細胞の培養方法は、微細な側壁で区画された複数の空間構造を細胞培養用基材に設け、空間構造が相互に連通する方向と、細胞の伸長方向とを揃えることによって、細胞シートの細胞の配向性を制御する（特許文献１参照）。
特開２００６－１９１８０９号公報
　ところで、例えば特許文献１で記載されたような細胞シートは、脆弱であることから、細胞培養用基材から剥離する際に損傷してしまうおそれがある。
　本開示の目的は、細胞シートの剥離を容易とした細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法を提供することにある。
　本開示の一態様に係る細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記培養部に対して外側に位置し、前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されている。
　上記構成によれば、細胞シート形成部材は、培養部の外側に剥離補助部を備えているので、細胞シートを剥離し易くできる。すなわち、剥離補助部が第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されている場合には、剥離補助部での細胞シートに対する接触面積は、培養部での細胞シートに対する接触面積より小さくなり、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が細胞シート形成部材の表面から剥がれ易くなる。また、剥離補助部が第２平坦部で構成されている場合には、細胞シートの外周部の強度が高まり、細胞シートの外周部を表面から剥がすときに損傷しにくくなる。
　上記細胞シート形成部材において、例えば、前記細胞シート形成部材において培養される細胞は、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞からなる群から選ばれた少なくとも１種である。上記構成によれば、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞などの配向性を持たせた細胞シートを容易に製造することができ、細胞シートを損傷させることなく細胞シート形成部材から容易に剥離することができる。
　上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、前記第２ピッチは、前記第１ピッチと同じであるか、前記第１ピッチよりも大きいことが好ましい。上記構成によれば、剥離補助部での細胞シートに対する接触面積は、培養部での細胞シートに対する接触面積より小さくなり、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が細胞シート形成部材の表面から剥がれ易くなる。
　上記細胞シート形成部材において、例えば、前記第１ピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、前記第２ピッチは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下であることが好ましい。
　上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、前記培養部を包囲する一重の環状部であることが好ましい。上記構成によれば、一重の環状部で構成された剥離補助部から細胞シートを剥離し易くできる。
　上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、前記剥離補助部は、前記培養部を包囲する２重以上の環状部であって、外側に位置する環状部は、内側に位置する環状部と同じか、前記内側に位置する環状部よりも大きなピッチを有する凹凸構造を備えることが好ましい。上記構成によれば、外側に向かうほど、細胞シートの接着力を弱めることができる。これにより、剥離補助部において、外側から細胞シートを剥離し易くできる。
　上記細胞シート形成部材において、前記表面には、温度応答性ポリマーが塗布されていることが好ましい。上記構成によれば、細胞シートの剥離・回収を容易にすることができる。
　上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さいことが好ましい。上記構成によれば、表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積が、仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さいので、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が細胞シート形成部材の表面から剥がれ易くなる。
　上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、第２平坦部で構成されており、前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きいことが好ましい。上記構成によれば、表面に対して平行な仮想平面と剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積が、仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きいので、細胞シートの外周部の強度が高まり、細胞シートの外周部を表面から剥がすときに損傷しにくくなる。
　本開示の別の態様に係る細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記表面の縁に位置して前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さい。
　上記構成によれば、表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積が、仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さいので、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が細胞シート形成部材の表面から剥がれ易くなる。
　本開示の更なる別の態様に係る細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記表面の縁に位置して前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きい。
　上記構成によれば、表面に対して平行な仮想平面と剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積が、仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きいので、細胞シートの外周部の強度が高まり、細胞シートの外周部を表面から剥がすときに損傷しにくくなる。
　上記課題を解決するための細胞シート形成部材の製造方法は、凹版を形成することと、細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することとを含み、前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記培養部に対して外側に位置し、前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部で構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されており、前記凹版は、前記第１平坦部を成形する第１平坦成形部と、前記第１凹凸部を成形する第１凹凸成形部と、前記第２凹凸部または前記第２平坦部を成形する第２成形部とを備え、前記凹版を形成することは、前記第１平坦成形部、前記第１凹凸成形部、および、前記第２成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む。
　本開示の一態様に係る細胞シートの製造方法は、以上のような細胞シート形成部材を用い、前記第１平坦部および前記第１凹凸部の何れか一方に対する接着が他方に対する接着よりも優勢である細胞を前記細胞シート形成部材の表面に接着させて、前記細胞シート形成部材の表面に細胞シートを形成することと、前記細胞シート形成部材の前記剥離補助部上の前記剥離開始部位から前記細胞シートを前記表面から剥離することとを含む。
（ａ）は、本開示に係る細胞シート形成部材の構造をシャーレと共に示す斜視図、（ｂ）は、図１（ａ）の細胞シート形成部材の表面全体を示す平面図、（ｃ）は、図１（ｂ）の細胞シート形成部材の培養部表面の一部を拡大して示す斜視図、（ｄ）は、図１（ｂ）の細胞シート形成部材の培養部表面の一部を拡大して示す平面図、（ｅ）は、図１（ｂ）の細胞シート形成部材の培養部の一部を拡大して示す部分断面図、（ｆ）は、図１（ｂ）の細胞シート形成部材の表面を走査電子顕微鏡によって撮影した画像。 （ａ）は、第１細胞シート形成部材の平面図であり、（ｂ）は、図２（ａ）の第１細胞シート形成部材の要部断面図。 （ａ）は、第２細胞シート形成部材の平面図であり、（ｂ）は、図３（ａ）の第２細胞シート形成部材の要部断面図。 （ａ）は、第３細胞シート形成部材の平面図であり、（ｂ）は、図４（ａ）の第３細胞シート形成部材の要部断面図。 （ａ）は、第４細胞シート形成部材の平面図であり、（ｂ）は、図５（ａ）の第４細胞シート形成部材の要部断面図。 図２（ａ）および図２（ｂ）に示す細胞シート形成部材の製造方法の一例を説明するための工程図。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 本開示に係る細胞シート形成部材を用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。 参考例としての細胞培養シャーレを用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 （ａ）は培養細胞を示す図であり、（ｂ）は、培養細胞が接着膜で被覆された状態を示す図、（ｃ）は、培養細胞が三次元組織化された状態を示す図、（ｄ）は、細胞シート形成部材を用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。
　以下、細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法の実施形態について説明する。まず、細胞シート形成部材の構成を説明し、次いで、細胞シート形成部材の製造方法、細胞シートの製造方法を説明する。
　［細胞シート形成部材］
　図１（ａ）に示すように、細胞シート形成部材１００は、例えば、シャーレの培養皿１１０に配置されるシート材である。細胞シート形成部材１００は、培養皿１１０に載置されるものであってもよいし、シャーレを直接加工して設けるものであってもよい。シャーレに直接加工して設ける場合、細胞シート形成部材１００は、例えばシャーレを射出成型して賦形される。シャーレは、培養皿１１０と蓋１２０とに囲まれた空間に細胞懸濁液を保持する。細胞懸濁液に含まれる細胞は、例えば、筋芽細胞、線維芽細胞、および心筋細胞からなる群から選ばれた少なくとも１種であるが、これに限定されるものではない。
　図１（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞培養する培養部１０１と、表面１１１からの細胞シートの剥離を行い易くする剥離補助部１０２とを備えている。剥離補助部１０２は、培養部１０１の外側において、培養部１０１を包囲する環状部として構成されている。また、剥離補助部１０２は、表面１１１の縁に位置している。剥離補助部１０２では、一例として、剥離補助部１０２に対する細胞シートの接着力が培養部１０１に対する細胞シートの接着力よりも低くなるようにし、細胞シートの外周部が剥離開始部位となるように、表面１１１から剥がれ易くなるように構成されている。また、剥離補助部１０２では、別の例として、剥離補助部１０２に対する細胞シートの接着力が培養部１０１に対する細胞シートの接着力よりも高くなるようにし、細胞シートの外周部の強度を高め、細胞シートの外周部を表面１１１から剥がすときに損傷しにくくしている。
　［培養部］
　図１（ｃ）に示すように、培養部１０１は、複数の第１平坦部１３０と、複数の第１凹凸部１４０とを備える。各第１凹凸部１４０は、段差構造（第１段差構造）を備え、複数の段差構造は、相互に隣り合う第１平坦部１３０の間を埋める。段差構造は、凸部、または、凹部である。なお、本実施形態における段差構造は、凸部１４１であり、第１凹凸部１４０は、相互に隣り合う第１平坦部１３０に挟まれた凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１４１とを備える。
　図１（ｄ）に示すように、各第１平坦部１３０は、１つの方向である第１方向（図１（ｄ）の上下方向）に延びる平坦面である。第１平坦部１３０は、表面１１１の全体において、第１方向と直交する第２方向（図１（ｄ）の左右方向）に並ぶ。各第１凹凸部１４０もまた、第１方向に延び、かつ、第１凹凸部１４０は、表面１１１の全体において、第２方向に並ぶ。このことは、図１（ｆ）に示すように、細胞シート形成部材１００の表面を走査電子顕微鏡によって撮影した画像からも明らかである。
　第１凹凸部１４０を構成する各凸部１４１は、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。各第１凹凸部１４０は、凸部１４１のこのような配列を、第１方向、および、第２方向に繰り返す。三角格子の各頂点に凸部１４１が位置する第１凹凸部１４０であれば、凸部１４１を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。
　表面１１１と対向する方向から見て、各凸部１４１は、例えば円形状を有する。相互に隣り合う凸部１４１の中心間の距離の最頻値は、凸部１４１のピッチである。また、凸部１４１の平面視形状における凸部の最大幅は、凸部１４１の直径である。
　凸部１４１のピッチである第１ピッチが下記（Ａ）および（Ｂ）を満たす構成は、ヒト・マウスなどの動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃える観点において好適である。すなわち、凸部１４１のピッチ（第１ピッチ）が下記（Ａ）および（Ｂ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞などの接着に対する優劣が、第１平坦部１３０と第１凹凸部１４０との間で明確に区画される観点において好適である。
　（Ａ）凸部１４１の第１ピッチ：１０ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下）
　なお、凸部１４１のピッチが、たとえば３００ｎｍ以下であれば、細胞シートを透過した可視光が、凸部１４１によって干渉されにくい。凸部１４１の干渉によって表示される色は、顕微鏡を使用した細胞シートの観察を複雑にする。こうした視認性の観点において、凸部１４１のピッチは１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下が好ましい。一方、凸部１４１のピッチが大きいほど、射出成形等によって樹脂表面に凸部の微細構造を正確に形成することができる。たとえば、凸部１４１のピッチが５００ｎｍ以上であれば、樹脂表面への微細構造の形成は容易である。こうした加工性の観点において、凸部１４１のピッチは５００ｎｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
　（Ｂ）凸部１４１の直径：凸部１４１のピッチの５０％以上、１００％以下
　各第１平坦部１３０の第２方向（短辺方向）での長さは、第１平坦部１３０の幅である。また、相互に隣り合う平坦部１３０間の第２方向（短辺方向）での長さは、第１凹凸部１４０の幅である。
　第１平坦部１３０の幅、および、第１凹凸部１４０の幅は、例えば、培養の対象となる細胞の大きさ（５μｍ以上、１００μｍ以下）の１／１０倍以上、１０倍以下である。第１平坦部１３０の幅、および、第１凹凸部１４０の幅が下記（Ｃ）および（Ｄ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃えることを容易なものとする観点において好適である。
　（Ｃ）第１平坦部１３０の幅：１０μｍ以上、５０μｍ以下
　（Ｄ）第１凹凸部１４０の幅：１０μｍ以上、５０μｍ以下
　図１（ｅ）に示すように、第１凹凸部１４０は、相互に隣り合う凸部１４１、および、第１平坦部１３０とそれに隣接する凸部１４１との間に、凹部１４２を備えても良い。複数の凸部１４１が第１凹凸部１４０に点在するため、凸部１４１間の空間である凹部１４２は、第１凹凸部１４０において、第１方向、および、第２方向に連なる。
　細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部１４２の底面と第１平坦部１３０との間の長さは、第１平坦部１３０の高さである。また、細胞シート形成部材１００の厚み方向において、各凸部１４１の先端面と第１平坦部１３０との間の高低差は、境界段差である。凹部１４２の底面と各凸部１４１の先端面の高低差は、凸部１４１の高さである。各凸部１４１の先端面と平坦部１３０とが面一である構成では、第１平坦部１３０の高さと、凸部１４１の高さとが、相互に等しい。凸部１４１の高さに対する凸部１４１のピッチの比は、凸部１４１のアスペクト比である。
　境界段差が下記（Ｅ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。凸部１４１の高さが下記（Ｆ）を満たす構成、また、凸部１４１のアスペクト比が下記（Ｇ）を満たす構成は、第１凹凸部１４０の構造上での安定性を高められる観点、また、第１凹凸部１４０の形成を容易なものとする観点において好適である。
　（Ｅ）境界段差：０．５μｍ以下（好ましくは０．３μｍ以下）
　（Ｆ）凸部１４１の高さ：５ｎｍ以上、５μｍ以下（好ましくは、５０ｎｍ以上、５μｍ以下
　（Ｇ）凸部１４１のアスペクト比：０．１以上、１０以下
　そして、上記（Ａ）および（Ｂ）を満たす構成であれば、第１平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞であれ、第１凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞であれ、一方の構造体に対して細胞が優先的に接着し、他方の構造体に対する接着の劣勢と相まって、双方の構造体の延在方向である第１方向に、細胞の伸長方向が揃えられる。結果として、表面１１１に沿った二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の伸長方向を一次元方向に揃えること、すなわち、細胞の配向性を向上させることが可能となる。なお、細胞シートは、培養細胞が一次元方向に揃った状態、すなわち配向性を有する状態で厚さ方向に積み上がって三次元組織を形成することも可能である。
　また、上記（Ｅ）を満たす構成、特に、各凸部１４１の先端面と第１平坦部１３０とが面一である構成は、第１凹凸部１４０と第１平坦部１３０とを覆うように形成された細胞シートにおいて、それの平坦性を高めることを可能とする。さらに、上記（Ｆ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性をより一層に高めることが可能である。
　なお、細胞シート形成部材１００の表面１１１が、第１平坦部１３０と第１凹凸部１４０とを備えるため、第１平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞と、第１凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞との両方に、共通する細胞シート形成部材１００を適用することが可能ともなる。すなわち、細胞シート形成部材１００の汎用性を高めることも可能となる。
　細胞シート形成後に細胞シートの剥離・回収を容易にするために、刺激応答性材料を塗布しても良い。刺激応答性材料としては、温度変化によって水親和性が変化する温度応答性ポリマーが好ましい。具体的にはポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）が好ましい。刺激応答性材料は慣用の塗布方法を用いて基材に塗布しても良い。なお、細胞シートの剥離・回収を容易にするために、細胞シートが形成された細胞シート形成部材は、超音波処理を施されてもよい。
　［剥離補助部］
　［第１細胞シート形成部材］
　図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の一実施形態である第１細胞シート形成部材の剥離補助部１０２は、培養部１０１を包囲する環状部として構成された第２凹凸部１２１を備える。第２凹凸部１２１は、細胞シート形成部材１００の外周部に位置している。第２凹凸部１２１は、培養部１０１を囲む一重の段差構造（第２段差構造）を備える。剥離補助部１０２における段差構造は、凸部１２２であり、第２凹凸部１２１は、第１平坦部１３０に対して隣接する凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１２２とを備える。
　第２凹凸部１２１を構成する各凸部１２２は、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。第２凹凸部１２１は、三角格子の各頂点に凸部１２２が位置するものであれば、凸部１２２を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、第２凹凸部１２１は、第１凹凸部１４０と同時に形成することができる。第２凹凸部１２１の幅は、０．５ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であることが好ましい。
　表面１１１と対向する方向から見て、各凸部１２２は、例えば円形状を有する。相互に隣り合う凸部１２２の中心間の距離の最頻値は、凸部１２２のピッチである。また、凸部１２２の平面視形状における凸部の最大幅は、凸部１２２の直径である。
　凸部１２２のピッチである第２ピッチが下記（Ｈ）を満たす構成は、ヒト・マウスなどの動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の剥離性を高める観点において好適である。
　（Ｈ）凸部１２２の第２ピッチ：１００ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、３００ｎｍ以上、５μｍ以下、より好ましくは、５００ｎｍ以上、１μｍ以下）
　第２ピッチは第１ピッチと同じであるか、第２ピッチよりも大きいことが好ましい。すなわち、第２ピッチは、第１ピッチ以上の大きさを有することが好ましい。換言すると、表面１１１に対して平行な仮想平面と剥離補助部１０２の第２凹凸部１２１とが単位面積当たりに接触する面積は、当該仮想平面と第１凹凸部１４０とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さくなる。これにより、細胞シートは、培養部１０１に対する接着力よりも剥離補助部１０２に対する接着力が小さくなる。したがって、細胞シートは、表面１１１の外周縁（剥離開始部位）から剥離が容易となり、損傷しにくくなる。また、第２ピッチが第１ピッチと同じ場合であっても、第１平坦部１３０の外周側に隣接しているときは、第２凹凸部１２１の細胞シートに対する接触面積が第１平坦部１３０の細胞シートに対する接触面積よりも小さくなることで、接着力が弱まり、表面１１１の外周縁から剥離が容易となる。
　細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部の底面と凸部１２２との間の長さが凸部１２２の高さである。各凸部１２２の先端面と凸部１４１および第１平坦部１３０とが面一である構成では、細胞シートの平坦性を高めることができる。
　［第２細胞シート形成部材］
　図３（ａ）および図３（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の別の実施形態である第２細胞シート形成部材の剥離補助部１０２は、第２凹凸部１２１として、内側環状部１２３と外側環状部１２４とを備えている。すなわち、第２凹凸部１２１は、培養部１０１を囲む二重の段差構造（第２段差構造）を有し、内側環状部１２３は、培養部１０１に隣接して位置し、外側環状部１２４は、内側において、内側環状部１２３と隣接し、外側において、細胞シート形成部材１００の外周縁を構成する。
　内側環状部１２３および外側環状部１２４の各々の段差構造は、凸部、または、凹部である。内側環状部１２３の段差構造は、凸部１２３ａであり、内側環状部１２３は、第１平坦部１３０に対して隣接する凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１２３ａとを備える。外側環状部１２４の段差構造は、凸部１２４ａであり、外側環状部１２４は、凹部の底面に位置する複数の凸部１２４ａを備える。
　各凸部１２３ａ，１２４ａは、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。環状部１２３，１２４の各々は、三角格子の各頂点に凸部１２３ａ，１２４ａが位置するものであれば、凸部１２３ａ，１２４ａを形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、環状部１２３，１２４は、第１凹凸部１４０と同時に形成することができる。
　凸部１２３ａのピッチである内側第２ピッチおよび凸部１２４ａのピッチである外側第２ピッチが下記（Ｉ）および（Ｊ）を満たす構成は、ヒト・マウスなどの動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の剥離性を高める観点において好適である。さらに、この構成は、外側環状部１２４の方が内側環状部１２３よりも細胞シートが剥がれ易くする観点において好適である。
　（Ｉ）内側環状部１２３における凸部１２３ａの内側第２ピッチ：１００ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、３００ｎｍ以上、１μｍ以下）
　（Ｊ）外側環状部１２４における凸部１２４ａの外側第２ピッチ：５００ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、７００ｎｍ以上、２μｍ以下）
　このような構成により、表面１１１に対して平行な仮想平面と剥離補助部１０２の環状部１２３，１２４とが単位面積当たりに接触する面積は、当該仮想平面と第１凹凸部１４０とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さくなる。これにより、細胞シートは、培養部１０１に対する接着力よりも剥離補助部１０２に対する接着力が小さくなる。したがって、細胞シートは、表面１１１の外周縁（剥離開始部位）から剥離が容易となり、損傷しにくくなる。
　さらに具体的には、内側第２ピッチは、第１ピッチと同じであるか、第１ピッチよりも大きいことが好ましい。細胞シートは、培養部１０１に対する単位面積当たりの接触面積よりも剥離補助部１０２に対する接触面積が小さくなることで、接触力が弱まる。内側第２ピッチが第１凹凸部１４０の第１ピッチと同じ場合であっても、第１平坦部１３０の外周側に隣接しているときは、内側環状部１２３の細胞シートに対する接触面積が第１平坦部１３０の細胞シートに対する接触面積よりも小さくなることで、接着力が弱まる。これにより、内側環状部１２３の方が第１平坦部１３０よりも細胞シートの接着力が弱まり剥がれ易くなる。内側環状部１２３の凸部１２３ａの内側第２ピッチは、外側環状部１２４の凸部１２４ａの外側第２ピッチよりも小さい。すなわち、外側第２ピッチは、内側第２ピッチよりも大きい。これにより、外側環状部１２４の方が細胞シートに対する単位面積当たりの接触面積が内側環状部１２３よりも小さくなり、細胞シートの接着力が弱まり剥がれ易くなる。
　細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部の底面と凸部１２３ａ，１２４ａの間の長さが凸部１２３ａ，１２４ａの高さである。各凸部１２３ａ，１２４ａの先端面と凸部１４１および第１平坦部１３０とが面一である構成では、細胞シートの平坦性を高めることができる。
　［第３細胞シート形成部材］
　図４（ａ）および図４（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の更なる別の実施形態である第３細胞シート形成部材の剥離補助部１０２は、第２凹凸部１２１として、内側環状部１２５と外側環状部１２６とを備えている。すなわち、第２凹凸部１２１は、培養部１０１を囲む二重の段差構造を有し、内側環状部１２５は、培養部１０１に隣接して位置し、外側環状部１２６は、内側において、内側環状部１２５と隣接し、外側において、細胞シート形成部材１００の外周縁を構成する。
　内側環状部１２５および外側環状部１２６の各々の段差構造は、凸部、または、凹部である。内側環状部１２５の段差構造（第２段差構造）は、円錐台形状を有した凸部１２５ａであり、内側環状部１２５は、第１平坦部１３０に対して隣接する凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１２５ａとを備える。外側環状部１２６の段差構造は、円錐形状を有した凸部１２６ａであり、外側環状部１２６は、凹部の底面に位置する複数の凸部１２６ａを備える。
　各凸部１２５ａ，１２６ａは、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。環状部１２５，１２６の各々は、三角格子の各頂点に凸部１２５ａ，１２６ａが位置するものであれば、凸部１２５ａ，１２６ａを形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、環状部１２５，１２６は、第１凹凸部１４０と同時に形成することができる。
　凸部１２５ａのピッチである内側第２ピッチおよび凸部１２６ａのピッチである外側第２ピッチが下記（Ｋ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の剥離性を高める観点において好適である。
　（Ｋ）環状部１２５，１２６における凸部１２５ａ，１２６ａの内側第２ピッチおよび外側第２ピッチ：１００ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、３００ｎｍ以上、１μｍ以下）
　このような構成により、表面１１１に対して平行な仮想平面と剥離補助部１０２の環状部１２５，１２６とが単位面積当たりに接触する面積は、当該仮想平面と第１凹凸部１４０とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さくなる。これにより、細胞シートは、培養部１０１に対する接着力よりも剥離補助部１０２に対する接着力が小さくなる。したがって、細胞シートは、表面１１１の外周縁（剥離開始部位）から剥離が容易となり、損傷しにくくなる。
　さらに具体的には、内側第２ピッチは、第１ピッチと同じであるか、第１ピッチよりも大きいことが好ましい。細胞シートは、培養部１０１に対する単位面積当たりの接触面積よりも剥離補助部１０２に対する接触面積が小さくなることで、接触力が弱まる。内側第２ピッチが第１ピッチと同じ場合であっても、第１平坦部１３０の外周側に隣接しているときは、内側環状部１２５の細胞シートに対する接触面積が第１平坦部１３０の細胞シートに対する接触面積よりも小さくなることで、接着力が弱まる。これにより、内側環状部１２５の方が第１平坦部１３０よりも細胞シートの接着力が弱まり剥がれ易くなる。また、外側環状部１２６は、各凸部１２６ａが円錐形状で、内側環状部１２５は、各凸部１２５ａが円錐台形状である。したがって、内側環状部１２５の方が外側環状部１２４よりも単位面積当たりの接触面積が大きくなる。これにより、外側環状部１２６の方が内側環状部１２５よりも細胞シートが剥がれ易くなる。
　細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部の底面と凸部１２５ａ，１２６ａとの間の長さが凸部１２５ａ，１２６ａの高さである。各凸部１２５ａ，１２６ａの先端面と凸部１４１および第１平坦部１３０とが面一である構成では、細胞シートの平坦性を高めることができる。
　［第４細胞シート形成部材］
　図５（ａ）および図５（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の更なる別の実施形態である第４細胞シート形成部材の剥離補助部１０２は、第２平坦部１２７を備えている。第２平坦部１２７は、平坦面である。細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部１４２の底面と第２平坦部１２７との間の長さは、第２平坦部１２７の高さである。凹部１４２の底面と第２平坦部１２７の先端面の高低差は、第２平坦部１２７の高さである。各凸部１４１の先端面と第１平坦部１３０と第２平坦部１２７とが面一である構成が好ましい。このような表面１１１は、凸部１２２を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、第２平坦部１２７は、第１凹凸部１４０と同時に形成することができる。第２平坦部１２７の幅は、０．５ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であることが好ましい。
　このような構成により、表面１１１に対して平行な仮想平面と剥離補助部１０２の第２平坦部１２７とが単位面積当たりに接触する面積は、当該仮想平面と第１凹凸部１４０とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きくなる。これにより、第２平坦部１２７は、一例として、剥離補助部１０２に対する細胞シートの接着力が培養部１０１に対する細胞シートの接着力よりも高くなる。したがって、細胞シートの外周部の強度を高め、細胞シートの外周部を表面１１１から剥がすときに損傷しにくくできる。
　なお、剥離補助部１０２は、第２平坦部１２７を段差構造を有する第２凹凸部で構成するようにしてもよい。この場合の第２凹凸部は、第１凹凸部１４０のピッチより小さくして、単位面積当たりの細胞シートとの接触面積が培養部１０１より大きくなるようにしてもよい。このような構成によって、剥離補助部１０２での細胞シートの強度を高めることができる。そして、第２凹凸部を２以上の多重の環状部で構成するときには、外側に位置する環状部が、内側に位置する環状部よりも凹凸構造のピッチ小さくなるように構成する。このような構成によって、表面１１１の縁に近づくほど、細胞シートの強度を高めることができる。
　［細胞シート形成部材の製造方法］
　次に、細胞シート形成部材の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ナノインプリント法を用いて、細胞シート形成部材の表面１１１を、凹版１５０の転写によって形成する例を説明する。ここでは、一例として、上述した第１細胞シート形成部材（図２（ａ）および図２（ｂ））の製造方法を説明する。
　図６に示すように、細胞シート形成部材の製造方法は、凹版１５０を形成する工程と、細胞シート形成部材１００の表面１１１を凹版１５０の転写によって形成する工程とを含む。
　凹版１５０の下面は、第１方向（紙面と直交する方向）に延びる形状を有し、かつ、第１方向と交差する第２方向（紙面の左右方向）に並ぶ複数の第１平坦成形部１５１と、相互に隣り合う第１平坦成形部１５１の間を埋める複数の段差構造を有する第１凹凸成形部１５２とを備える。第１平坦成形部１５１は、第１平坦部１３０を形成するための部分であって、第１凹凸成形部１５２は、第１凹凸部１４０を形成するための部分である。さらに、凹版１５０における第１平坦成形部１５１の外側の部分は、剥離補助部１０２を形成する部分であって、図６の例では、第２凹凸部１２１を形成するための第２凹凸成形部１５３を備えている。第１凹凸成形部１５２の凹凸構造は、第１凹凸部１４０の凹凸構造に対応したピッチや高さなどを有している。また、第２凹凸成形部１５３の凹凸構造は、第２凹凸部１２１の凹凸構造に対応したピッチや高さなどを有している。なお、図２示すような第２平坦部１２７を成形するときには、これに対応する第２平坦成形部を凹版１５０の下面に設けることになる。
　凹版１５０を形成する工程では、例えば、凹版１５０を形成するためのシリコン基板に対する、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて、凹凸部が形成される。また、凹版１５０自体を原盤からの１回、あるいは複数回の転写によって得てもよい。原盤には、例えば、シリコン基板に対するフォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて凹版１５０の表面形状に対応する形状が作り込まれている。
　次に、細胞シート形成部材１００を形成するための基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を対向させる。基材１６０の形成材料は、例えば、熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂である。そして、基材１６０が流動性を有する状態で、基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を押し付ける。次いで、基材１６０の流動性を抑えた状態で、凹版１５０を基材１６０の表面１１１から離型する。これによって、基材１６０の表面１１１に凹版１５０の第１平坦成形部１５１、第１凹凸成形部１５２、および、第２凹凸成形部１５３が転写され、第１平坦部１３０、第１凹凸部１４０、第２凹凸部１２１などが形成される。
　基材１６０の形成材料の熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂の表面に、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリーリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲルなどの接着因子を含む有機物が塗布されていてもよい。また、基材１６０の形成材料として、多糖類やタンパク質などの生体材料を用いてもよい。
　［細胞シートの製造方法］
　次に、細胞シート形成部材１００を用いて製造される細胞シートについて説明する。
　図７（ａ）に示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、第１平坦部１３０に接着する細胞Ｓ１を含む。この際、各第１平坦部１３０は、第１凹凸部１４０の長辺方向（第１方向）に延び、各第１平坦部１３０の幅は、一般的な細胞の大きさの１～数倍程度である。そのため、図７（ｂ）に示すように、細胞Ｓ１の位置は、第１平坦部１３０の範囲内に優先的に分布し、細胞Ｓ１は、第１方向に細胞の長軸方向が配置されて直線状に連なる。すなわち、細胞Ｓ１の伸長方向は、第１平坦部１３０の長辺方向と揃うように制御される。図８は、細胞シート形成部材１００を用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、同図に示す例では、筋芽細胞の伸長方向が一方向に揃うように制御されている。
　なお、図７（ｃ）に示すように、上記（Ａ）を満たさない細胞シート形成基材では、細胞Ｓ１の配向性が制御されないため、細胞の長軸方向はランダムな方向で配置される。図９は、参考例となる市販の細胞培養シャーレを用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、同図に示す例では、筋芽細胞の伸長方向がランダムに配置されている。
　図１０（ａ）に示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、第１凹凸部１４０に接着する細胞Ｓ２を含む。この際、各第１凹凸部１４０は、第１凹凸部１４０の長辺方向（第１方向）に延び、各第１凹凸部１４０の幅は、一般的な細胞の大きさの１～数倍程度である。そのため、図１０（ｂ）に示すように、細胞Ｓ２は、第１凹凸部１４０の範囲内に優先的に分布し、細胞Ｓ２は、第１方向に細胞の長軸方向が配置されて直線状に連なる。すなわち、細胞Ｓ２の伸長方向は、第１凹凸部１４０の長辺方向と揃うように制御される。
　なお、図１０（ｃ）が示すように、上記（Ａ）を満たさない細胞シート形成基材では、細胞Ｓ１の配向性が制御されないため、細胞の長軸方向はランダムな方向で存在する。
　一方、上記（Ａ）を満たす細胞シート形成基材では、図１１（ａ）に示すように、細胞シート形成部材１００に保持された細胞懸濁液の細胞が、第１平坦部１３０に対して優先的に接着する細胞Ｓ１であり、第１平坦部１３０よりも劣勢ではあるが、第１凹凸部１４０に対する接着を許容された細胞Ｓ２でもある。あるいは、細胞シート形成部材１００に保持された細胞懸濁液の細胞が、第１凹凸部１４０に対して優先的に接着する細胞Ｓ２であり、第１凹凸部１４０よりも劣勢ではあるが、平坦部１３０に対する接着を許容された細胞Ｓ１でもある。
　この場合、図１１（ｂ）に示すように、第１平坦部１３０、および、第１凹凸部１４０は、第１方向に延び、第２方向に交互に配置される。そのため、細胞シート形成部材の表面１１１には、例えば、平坦部１３０に優先的に接着された細胞Ｓ１の配向性が、平坦部１３０の構造、および、それを区画する第１凹凸部１４０の構造によって制御される。
　そして、相互に隣り合う平坦部１３０に挟まれた第１凹凸部１４０においては、平坦部１３０よりも劣勢ではあるが、第１凹凸部１４０に接着した細胞Ｓ２にて、平坦部１３０による配向性の制御が反映される。結果として、図１１（ｃ）に示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる細胞シートＳＡを形成する。
　あるいは、第１凹凸部１４０に優先的に接着された細胞Ｓ２の配向性が、第１凹凸部１４０の構造、および、それを区画する第１平坦部１３０の構造によって制御される。そして、相互に隣り合う第１凹凸部１４０に挟まれた第１平坦部１３０においては、第１凹凸部１４０よりも劣勢ではあるが、第１平坦部１３０に接着した細胞Ｓ１にて、第１凹凸部１４０による配向性の制御が反映される。結果として、図１１（ｃ）に示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる細胞シートＳＡを形成する。
　上記実施形態に記載の細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法における実施例を以下に説明する。
　＜実施例１＞
　＜細胞シート形成部材の作製＞
　図３（ａ）および図３（ｂ）に示す剥離補助部１０２を備えた細胞シート形成部材１００の第１平坦部１３０、第１凹凸部１４０および第２凹凸部１２１の環状部１２３，１２４を転写によって形成するためのニッケル製凹版を作製した。次いで、ニッケル製凹版をスタンパーとして用い、ナノインプリント法によって、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を基材表面に固定したポリスチレンシートに第１平坦部１３０、第１凹凸部１４０および第２凹凸部１２１の環状部１２３，１２４を加工し、それによって、実施例１の細胞シート形成部材１００を作製した。培養部１０１における各第１平坦部１３０は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、第１方向と交差する第２方向に並び、各第１平坦部１３０の幅（第２方向での長さ）は１０μｍであった。第１凹凸部１４０は、相互に隣り合う平坦部１３０の間を埋める複数の段差構造を備え、相互に隣り合う第１平坦部１３０間の第２方向での長さは１０μｍであり、第１凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは３００ｎｍであった。第１凹凸部１４０における各凸部の高さはＡＦＭを用いて測定し、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、４４６ｎｍであった。また、凹部の底面から第１平坦部１３０までの高さの平均は４５５ｎｍであった。
　また、第２凹凸部１２１において、細胞シート形成部材１００の外縁部に位置する外側環状部１２４の幅は、５ｍｍであり、凸部１２４ａの外側第２ピッチは、６００ｎｍであった。外側環状部１２４における各凸部の高さは、ＡＦＭを用いて測定し、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、７６３ｎｍであった。外側環状部１２４の内側であって培養部１０１の外側に位置する内側環状部１２３における凸部１２３ａの内側第２ピッチは、３００ｎｍであった。内側環状部１２３における凸部１２３ａの高さは、ＡＦＭを用いて測定し、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、４４６ｎｍであった。
　そして、実施例１の細胞シート形成部材１００に、温度応答性ポリマーを固定し、ＵＶ照射を行い、この滅菌処理を行った後に、細胞培養試験に使用した。
　＜細胞培養試験＞
　まず、マウス由来の筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を細胞培養用フラスコ（２５ｃｍ２）で培養した。培養条件は、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）１
０％添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で行った。細胞の回収にはトリプシンを用い、定法に従い実施した。回収した細胞について血球計算版を用いて細胞数を計測した。
　次いで、細胞培養用マルチウェルプレート（４８孔）の底面に、直径８．８ｍｍの円形に裁断した実施例１の細胞シート形成部材１００を設置し、筋芽細胞を１ｍｌずつ播種した。ＣＯ２インキュベーターで２４時間以上培養した後に培地交換を行い、１日ごとに培地交換を行った。培養開始７日後に、培養した細胞シートを回収した。
　細胞シートの回収方法は、まず、培地を細胞が浸る程度を残して除去し、マルチウェルプレートを－２０℃のインキュベーターで３０分静置した。次に、細胞支持体としてＰＤＶＦ膜を細胞シート上に載せ、細胞シートを接着させた。ＰＤＶＦ膜に細胞シートが付着した状態でＰＤＶＦ膜を持ち上げ、コラーゲンゲル上に移動させた。培地を滴下し、ＰＤＶＦ膜のみを取り除いた。回収した細胞シートは、顕微鏡観察により、シートの破れや細胞の脱落が無い事を確認した。
　上記実施形態によれば、以下に列挙する効果が得られる。
　（１）図２（ａ）～図４（ｂ）に示す細胞シート形成部材１００は、培養部１０１の外側に、第２凹凸部１２１から構成された剥離補助部１０２を備えている。剥離補助部１０２は、細胞シートの接触面積を、培養部１０１に対してよりも小さくすることで、接着力を弱めることができる。これにより、剥離補助部１０２において、細胞シートを剥離し易くできる。こうした第２凹凸部１２１から構成された剥離補助部１０２を備えた細胞シート形成部材１００は、例えば、比較的強い接着性を有する細胞の培養に適する。すなわち、比較的強い接着性を有する細胞シートを剥離する場合であっても、剥離補助部１０２によって、細胞シートの接着力を弱めることができるので、細胞シートが剥離し易くなる。
　一方、図５（ａ）および図５（ｂ）に示す細胞シート形成部材１００は、培養部１０１の外側に、第２平坦部１２７からなる剥離補助部１０２を備えている。このように剥離補助部１０２に対する細胞シートの接着力が培養部１０１に対する細胞シートの接着力よりも高くなるようにしたときには、細胞シートの外周部の強度が高められ、細胞シートの外周部を表面１１１から剥がすときに損傷しにくくできる。こうした第２平坦部１２７からなる剥離補助部１０２を備えた細胞シート形成部材１００は、例えば、比較的弱い接着性を有する細胞の培養に適する。弱い接着性を有する細胞では、細胞培養中および細胞シートの回収時（剥離時）に、意図しないタイミングでの細胞の剥離や、細胞シートの破れが生じやすいという課題がある。この点、こうした第２平坦部１２７からなる剥離補助部１０２を備えた細胞シート形成部材１００を用いると、剥離補助部１０２（外周部）の第２平坦部１２７は細胞に対する接着性が比較的高いので、高い力学的強度を有する細胞シートを形成することができ、細胞シートが剥離しやすくなる。
　（２）筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞などの配向性を持たせた細胞シートを容易に製造することができ、細胞シートを損傷させることなく細胞シート形成部材１００から容易に剥離することができる。
　（３）剥離補助部１０２における第２凹凸部１２１での段差構造の第２ピッチは、第１凹凸部１４０における段差構造の第１ピッチと同じであるか、第２ピッチよりも大きい。これにより、第２凹凸部１２１での細胞シートに対する接触面積は、第１凹凸部１４０での細胞シートに対する接触面積より小さくなり、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が表面１１１から剥がれ易くできる。
　（４）図２（ａ）に示す剥離補助部１０２は、培養部１０１を包囲する一重の環状部で構成された第２凹凸部１２１である。したがって、第２凹凸部１２１は、細胞シートの接触面積が培養部１０１に対して小さくなることで、接着力が弱くなる。これにより、剥離補助部１０２において、細胞シートを剥離し易くできる。
　（５）図３（ａ）～図４（ｂ）に示す剥離補助部１０２は、培養部１０１を包囲する二重の環状部で構成された第２凹凸部１２１であり、外側に位置する環状部の凹凸構造のピッチは、内側に位置する環状部の凹凸構造のピッチと同じであるか、内側に位置する環状部の凹凸構造のピッチよりも大きい。これにより、剥離補助部１０２においても、外側に向かうほど、細胞シートの接着力を弱めることができる。これにより、剥離補助部１０２において、細胞シートを剥離し易くできる。
　（６）基材１６０の表面には、温度応答性ポリマーが塗布されている。これにより、細胞シートの剥離・回収を容易にすることができる。
　なお、上記実施形態は、以下のように変更して実施してもよい。
　・上述した細胞外マトリックスによるコーティング方法によって配向性を有する三次元組織が構成された細胞シートを形成することもできる。図１２（ａ）～図１２（ｃ）に示すように、この場合、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、細胞接着第１成分を含有する第１溶液と第１成分と相互作用する細胞接着第２成分を含有する第２溶液とを交互にコーティングした培養細胞１を含んでいる。すなわち、図１２（ａ）に示す培養細胞１は、図１２（ｂ）に示すように、接着膜２で被覆されている。接着膜２は、第１成分を含む第１膜２ａと第２成分を含む第２膜２ｂとで構成されている（図１２（ｂ））。第１成分と第２成分との組み合わせは、例えば、インテグリンが結合するアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子とＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子との組み合わせである。
　第１成分を含むＲＧＤ配列を含む高分子は、ＲＧＤ配列を有するタンパク質でもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたタンパク質であってもよい。また、ＲＧＤ配列を有していればよく、タンパク質以外の天然由来高分子であってもよいし、合成高分子であってもよい。タンパク質からなるＲＧＤ配列を含む高分子としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質が挙げられ、フィブロネクチン（分子量約５０万）、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲンなどである。
　第２成分を含むＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子としては、ＲＧＤ配列を含む高分子との相互作用により、両物質が、例えば、結合、接着、吸着、電子の授受が可能な程度近接できる物質であれば特に制限されないが、ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用するタンパク質、天然由来高分子及び合成高分子の何れか１種である。ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が挙げられ、具体例として、コラーゲン、ゼラチン（一例として分子量１０万）、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、抗体などの何れかである。ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α－ポリリジン，ε－ポリリジン（分子量５千）等のポリアミノ酸、ヘパリンやヘパラン硫酸、デキストラン硫酸（分子量５０万）、ヒアルロン酸（分子量１００万～）などの糖などである。
　第１成分と第２成分との組み合わせは、例えば、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、および、ラミニンとコラーゲンの何れかである。
　次に、三次元組織を備えた細胞シートの製造方法を説明する。
　先ず、培養細胞１を用意し、その表面全体を接着膜２で被覆して被覆細胞を作製する。具体的には、用意した培養細胞１を試験管に入れる。
　次いで、第１成分を培養細胞１に接触させる。培養細胞と第１成分との接触方法としては、例えば、第１成分を直接添加する方法、第１成分の含有液に細胞を浸漬する方法、培養細胞１に第１成分の含有液を滴下または噴霧する方法などがある。好ましくは、操作が容易であることから浸漬である。接触の条件は、接触方法や使用する含有液の濃度などによって適宜決定できる。具体的には、接触時間は、例えば、１５秒～６０分であり、好ましくは１５秒～１５分、より好ましくは１５秒～５分であり、更に好ましくは１５秒～１分である。接触温度は、特に制限されないが、例えば、４～６０℃であり、好ましくは２０～４０℃、より好ましくは３０～３７℃であり、更に好ましくは３７℃である。
　第１成分の含有液を調製する場合、溶媒としては、水や緩衝液などの水性溶媒が挙げられ、緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、グリシルグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、ＧＴＡ緩衝液などが挙げられる。
　このようにして培養細胞１を第１成分からなる第１膜２ａにより被覆した後、遊離している第１成分を除去する。第１成分を除去する方法としては、上記の溶媒を用いて遠心分離を行い、培養細胞１と第１成分の含有液とを分離して上澄みを取り除くことで、遊離している第１成分を除去する方法が挙げられる。これにより、第１成分からなる第１膜２ａで被覆された培養細胞１を得ることができる。
　接着膜２として、第１成分の第１膜２ａと第２成分からなる第２膜２ｂとからなる積層膜を形成させる場合、第１成分で被覆された培養細胞１を第２成分と接触させることにより、第２成分からなる第２膜２ｂで被覆する。第２成分との接触方法は、第１成分と同様な方法で行うことができ、第２成分の含有液を用いて接触させる場合は、第１成分の含有液を調製する方法と同様にして第２成分の含有液を調製することができる。これにより、第１成分からなる第１膜２ａと、第２成分からなる第２膜２ｂとからなる接着膜２で被覆された培養細胞１が得られる。第１成分の第１膜２ａと第２成分からなる第２膜２ｂとからなる積層膜は、繰り返し被覆をすることで、複数の被覆膜層を形成することが可能である。非腹膜層は、例えば１～２０層であり、好ましくは１～１０層であり、より好ましくは１～５層である。培養細胞１を含む細胞懸濁液は、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に滴下され、培養細胞１が播種される。その後、培養細胞１は、培養される。
　培養細胞１の三次元細胞シートを完成させるための培養条件は、培養する細胞に応じて適宜決定される。例えば、培養温度が、例えば、４～６０℃であり、好ましくは２０～４０℃、より好ましくは３０～３７℃であり、培養時間は、例えば、１～１６８時間であり、好ましくは３～２４時間、より好ましくは３～１２時間である。これにより、接着膜２を介して、培養細胞１同士を接着させたり、増殖した培養細胞１同士を接着させたりして、三次元組織を有する細胞シート１０を製造することができる（図１２（ｃ）参照。）。
　細胞シート１０では、一次元方向に延在した培養細胞に重なるように、一次元方向に延在した他の培養細胞が培養されるため、一次元方向に延在した培養細胞の大きさと形状は、第１方向のみならず、第２方向、および、第１方向と第２方向とに直交する方向において、区々となる。結果として、三次元組織では、第１方向に延在して第２方向で隣り合う培養細胞間が、当該細胞よりも小さく、かつ、第１方向に延在した他の細胞で埋められる。したがって、三次元組織は、表面１１１に隣接する第１面を構成する１層目やその近い位置では、層構造が認められるが、培養細胞１の大きさや形状などのばらつきによって、表面１１１（第１面）から離れ、第１面と対向する第２面に近づくほど層構造は崩れ、培養細胞１の間の隙間に別の培養細胞１が入り込むように積み上がって構成される。配向性を有した三次元組織は、生体に近い状態で細胞を培養することができる。また、図１２（ｄ）に示すように、配向性は、培養細胞１の伸長方向が特定方向である第１方向に対して前記第２方向に傾きを有する。このような配向性を有した三次元組織は、生体に近い状態に細胞が培養されるため、薬剤応答性などを生体に近づけることができる。
　・細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリーリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲル等の接着因子を含む有機物が塗布されてもよく、あるいは、金属から構成される面であってもよい。また、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞の接着性や細胞シートの平坦性を高めることを目的として、親水性、あるいは、疎水性を有してもよい。
　・細胞懸濁液中には、細胞外基質産生促進因子を添加するようにしてもよい。細胞外基質産生促進因子としては、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはそれらの塩を挙げることができる。コラーゲン産生の観点から、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはそれらの誘導体およびその塩（例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩など）とすることが好ましい。アスコルビン酸としては、Ｌ体であることが好ましい。
　［細胞シート形成部材の培養部］
　・凸部１４１の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか１種とすることが可能である。
　・凸部１４１の位置は、四角格子上の各格子点、六角格子上の各格子点、さらには、第１凹凸部１４０において不規則とすることも可能である。
　・第１凹凸部１４０の有する形状は、第１方向に延びる直線状に限らず、第１方向に延びる折れ線状や、第１方向に延びる曲線状に変更することも可能である。
　・第１凹凸部１４０の底面と平坦部１３０とを面一に変更すること、すなわち、凸部１４１の基端部と第１平坦部１３０とを面一に変更することも可能である。なお、上述したように、第１凹凸部１４０の先端面と第１平坦部１３０とを面一とする構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。
　・第１凹凸部１４０を構成する段差構造を、凹部に変更することも可能であり、凹部と凸部との両方に変更することも可能である。例えば、第１凹凸部１４０は、第１平坦部１３０に連続する１つの側面を備え、該側面に複数の凹部が形成された構造に変更することも可能である。
　・１つの第１凹凸部１４０の幅と、他の第１凹凸部１４０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。なお、１つの第１凹凸部１４０の幅と、他の第１凹凸部１４０の幅とが、相互に等しい構成であれば、細胞シートが有する特性について、第２方向での均一性を高めることが可能となる。
　・１つの第１平坦部１３０の幅と、他の第１平坦部１３０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。なお、１つの第１平坦部１３０の幅と、他の第１平坦部１３０の幅とが、相互に等しい構成であれば、細胞シートが有する特性について、第２方向での均一性を高めることが可能となる。
　・第１平坦部１３０の幅と、第１凹凸部１４０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。例えば、細胞の接着が第１平坦部１３０において優勢である場合、第１平坦部１３０の幅は、配向性を制御できる範囲であって、かつ、第１凹凸部１４０の幅よりも大きいことが好適である。また、細胞の接着が第１凹凸部１４０において優勢である場合、第１凹凸部１４０の幅は、配向性を制御できる範囲であって、かつ、第１平坦部１３０の幅よりも大きいことが好適である。
　・第１平坦部１３０と第１凹凸部１４０とが交互に並ぶ第２方向は、第１方向と直交する方向に限らず、第１方向と交差する方向であれば、例えば、第１方向と形成する角度が４５°である方向とすることも可能である。
　・細胞シート形成部材は、凹版を用いた転写体に限らず、凸版を用いた転写体であってもよく、さらに、射出成形による成形体とすることも可能である。すなわち、射出成形を用いて細胞シート成形部材を製造することも可能である。
　［細胞シート形成部材の剥離補助部］
　・第２凹凸部１２１において、凸部の高さは、５０ｎｍ以上、５μｍ以下であることが好ましい。また、凸部のアスペクト比は、０．１以上、１０以下であることが好ましい。このような構成は、第２凹凸部１２１の構造上での安定性を高められる観点、また、第２凹凸部１２１の形成を容易なものとする観点において好適である。
　・第２凹凸部１２１において、凸部の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか１種とすることが可能である。
　・第２凹凸部１２１において、凸部の位置は、四角格子上の各格子点、六角格子上の各格子点、さらには、第１凹凸部１４０において不規則とすることも可能である。
　・第２凹凸部１２１の高さは、第１平坦部１３０および／または第１凹凸部１４０の高さと同じであってもよいし、高くてもよいし、低くてもよい。培養部１０１と剥離補助部１０２との間に高低差を形成する場合には、高低差が形成された位置およびその周辺で、隙間が形成され易く、細胞シートと表面１１１との接着力を弱めることが可能となる。
　・剥離補助部１０２における第２凹凸部１２１は、３重以上の環状部で構成してもよい。この場合外周の環状部になるほど、段差構造のピッチを大きくするようにして、接着力を弱めていくことが好ましい。なお、隣接する環状部における段差構造において、ピッチが同じで箇所があってもよい。
　［その他］
　・細胞シート形成部材は、マルチウェルプレート、シャーレ、フラスコ、チェンバースライドなど、細胞懸濁液を保持可能なものであれば、それに適用することができる。
　１…培養細胞、２…接着膜、２ａ…第１膜、２ｂ…第２膜、１０…細胞シート、１００…細胞シート形成部材、１０１…培養部、１０２…剥離補助部、１１０…培養皿、１１１…表面、１２０…蓋、１２１…第２凹凸部、１２２…凸部、１２３…内側環状部、１２３ａ…凸部、１２４…外側環状部、１２４ａ…凸部、１２５…内側環状部、１２５ａ…凸部、１２６…外側環状部、１２６ａ…凸部、１２７…第２平坦部、１３０…第１平坦部、１４０…第１凹凸部、１４１…凸部、１４２…凹部、１５０…凹版、１５１…第１平坦成形部、１５２…第１凹凸成形部、１５３…第２凹凸成形部、１６０…基材。

Claims (13)

  1. 　細胞シートを形成するための表面を備え、
    　前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記培養部に対して外側に位置し、前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、
    　前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、
    　前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、
    　前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、
    　前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されている
    　細胞シート形成部材。
  2. 　前記細胞シート形成部材において培養される細胞は、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞からなる群から選ばれた少なくとも１種である
    　請求項１に記載の細胞シート形成部材。
  3. 　前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、
    　前記第２ピッチは、前記第１ピッチと同じであるか、前記第１ピッチよりも大きい
    　請求項１または２に記載の細胞シート形成部材。
  4. 　前記第１ピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、
    　前記第２ピッチは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下である、
    　請求項３に記載の細胞シート形成部材。
  5. 　前記剥離補助部は、前記培養部を包囲する一重の環状部である
    　請求項１ないし４のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
  6. 　前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、
    　前記剥離補助部は、前記培養部を包囲する２重以上の環状部であって、
    　外側に位置する環状部は、内側に位置する環状部と同じか、前記内側に位置する環状部よりも大きなピッチを有する凹凸構造を備える
    　請求項１ないし４のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
  7. 　前記表面には、温度応答性ポリマーが塗布されている
    　請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
  8. 　前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、
    　前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さい
    　請求項１ないし７のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
  9. 　前記剥離補助部は、第２平坦部で構成されており、
    　前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きい
    　請求項１，２，および７のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
  10. 　細胞シートを形成するための表面を備え、
    　前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記表面の縁に位置して前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、
    　前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、
    　前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、
    　前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さい
    　細胞シート形成部材。
  11. 　細胞シートを形成するための表面を備え、
    　前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記表面の縁に位置して前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、
    　前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、
    　前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、
    　前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きい
    　細胞シート形成部材。
  12. 　凹版を形成することと、
    　細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することと、を含み、
    　前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記培養部に対して外側に位置し、前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、
    　前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、
    　前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、
    　前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、
    　前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部で構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されており、
    　前記凹版は、前記第１平坦部を成形する第１平坦成形部と、
    　前記第１凹凸部を成形する第１凹凸成形部と、
    　前記第２凹凸部または前記第２平坦部を成形する第２成形部とを備え、
    　前記凹版を形成することは、前記第１平坦成形部、前記第１凹凸成形部、および、前記第２成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む、
    　細胞シート形成部材の製造方法。
  13. 　請求項１ないし１１のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材を用い、前記第１平坦部および前記第１凹凸部の何れか一方に対する接着が他方に対する接着よりも優勢である細胞を前記細胞シート形成部材の表面に接着させて、前記細胞シート形成部材の表面に細胞シートを形成することと、
    　前記細胞シート形成部材の前記剥離補助部上の前記剥離開始部位から前記細胞シートを前記表面から剥離することと、を含む
    　細胞シートの製造方法。
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