WO2024010020A1

WO2024010020A1 - 培養細胞シートおよびその製造方法、化合物または薬物の評価方法、並びに培養細胞シートの品質評価方法

Info

Publication number: WO2024010020A1
Application number: PCT/JP2023/024866
Authority: WO
Inventors: 由紀子八塚; 秀雄早乙女; 治美野輪; 勝晴土田; 康司岡▲崎▼; 寿子得能; 紘太郎大; 啓篠塚
Original assignee: 王子ホールディングス株式会社
Priority date: 2022-07-08
Filing date: 2023-07-05
Publication date: 2024-01-11

Abstract

本発明の課題は、特定の薬剤を使用することなく、心筋細胞から構成された成熟化した培養細胞シートおよびその製造方法を提供することである。また、該培養細胞シートを使用した化合物または薬物の評価方法を提供すること、さらに、心筋細胞から構成された培養細胞シートの品質評価方法を提供することである。　本発明の培養細胞シートは、心筋細胞から構成される培養細胞シートであって、心筋細胞が配向性を有して配置され、前記培養細胞シートに対して、抗α－アクチニン抗体を使用して免疫染色を行い顕微鏡観察で得られる画像において画面水平方向を０°とした際、測定範囲（７１．６μｍ×７１．６μｍ）内にあるα－アクチニン抗体で検出される棒状構造体の長手方向の角度を計測し、その最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の頻度を、下記式（１）により求める配向度が２３％以上である。　配向度（％）＝（最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の数）／（棒状構造体の総数）×１００　（１）

Description

培養細胞シートおよびその製造方法、化合物または薬物の評価方法、並びに培養細胞シートの品質評価方法

　本発明は、心筋細胞から構成される培養細胞シートおよびその製造方法、該培養細胞シートを用いた化合物または薬物の評価方法、並びに培養細胞シートの品質評価方法に関する。

　薬剤開発のコスト削減や期間短縮、動物実験代替の視点から、ヒトｉＰＳ細胞等の幹細胞から分化誘導された細胞を創薬開発に利用することが期待されている。開発の初期段階からこれらのヒト細胞を対象とした試験が可能であり、従来、動物実験で実施されてきた試験をヒトｉＰＳ細胞等の幹細胞由来細胞による試験に置き換え、種差による薬剤応答性の差異を解消できることが利点である。特に、生体由来の細胞の入手が難しい、心筋細胞等において、ヒトｉＰＳ細胞等の幹細胞由来心筋細胞の利用が求められている。
　しかし、現在、入手可能なヒトｉＰＳ細胞等の幹細胞由来心筋細胞は、生理活性や運動機能が胎児心筋に近く、未成熟であることがわかっている。そのため、薬剤への反応性に関しても、生体とは乖離があることが報告されており、ヒトｉＰＳ細胞等の幹細胞由来心筋細胞を成熟化させる手法が求められている。

　例えば、特許文献１には、それ自体インビトロ培養で多能性胚性幹細胞に由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟を促進させる既知組成培地組成物、およびより効率的であり、心臓研究および臨床用途に対する一般的要件を満たす成体様心筋細胞の大規模産生を助けるインビトロ培養で成体様心筋細胞を作製するための方法を提供することにより当業界の主要な制限を解消することを目的として、水性培地組成物が無血清であり、甲状腺ホルモン様化合物、脂質混合物およびカルニチン化合物を含む、前記水性培地組成物が開示されている。

特開２０２０－０２２４６０号公報

　特許文献１は、特定の培地を使用することで、成体様心筋細胞に成熟させるものであり、当該培地が含有する成分が、心筋細胞に対して、成熟以外の影響を与える可能性が否定できない。

　本発明の目的は、特定の薬剤を使用することなく、心筋細胞から構成された成熟化した培養細胞シートおよびその製造方法を提供することである。また、本発明は、該培養細胞シートを使用した化合物または薬物（タンパク質、ペプチド、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の評価方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、心筋細胞から構成された培養細胞シートの品質評価方法を提供することを目的とする。

　本発明の上記課題は、以下の＜１＞～＜１９＞の構成によって解決することができる。
　＜１＞　心筋細胞から構成される培養細胞シートであって、心筋細胞が配向性を有して配置され、前記培養細胞シートに対して、抗α－アクチニン抗体を使用して免疫染色を行い顕微鏡観察で得られる画像において画面水平方向を０°とした際、測定範囲（７１．６μｍ×７１．６μｍ）内にあるα－アクチニン抗体で検出される棒状構造体の長手方向の角度を計測し、その最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の頻度を、下記式（１）により求める配向度が２３％以上である、培養細胞シート。
　配向度（％）＝（最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の数）／（棒状構造体の総数）×１００　（１）
　＜２＞　ライブセルイメージングにおいて、動きベクトルの最頻値の角度から±５°の角度を示すベクトルの数（配向度）が１２％以上である、＜１＞に記載の培養細胞シート。
　＜３＞　前記心筋細胞が、幹細胞由来の心筋細胞である、＜１＞または＜２＞に記載の培養細胞シート。
　＜４＞　以下の要件Ａ１および要件Ａ２の少なくともいずれかを満たす、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　要件Ａ１：ＭＹＬ３（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　３）遺伝子の発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＭＹＬ３／ＡＣＴＢ）が１２．０以上である。
　要件Ａ２：ＭＹＨ７（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　７）遺伝子の発現量と、ＭＹＨ６（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　６）遺伝子の発現量との比（ＭＹＨ７／ＭＹＨ６）が６．０以上である。
　＜５＞　以下の要件Ｂ１および要件Ｂ２の少なくともいずれかを満たす、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　要件Ｂ１：ＣＫＭ（Ｃｒｅａｔｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ，Ｍ－ｔｙｐｅ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＣＫＭ／ＡＣＴＢ）が、１．８０以上である。
　要件Ｂ２：ＬＤＨＡ（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢの遺伝子発現量との比（ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢ）が０．８０以上である。
　＜６＞　以下の要件Ｃ１～要件Ｃ４の少なくともいずれかを満たす、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　要件Ｃ１：ＣＡＣＮＡ２Ｄ１（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｕｘｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ２ｄｅｌｔａ１）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．０８５以上である。
　要件Ｃ２：ＫＣＮＪ２（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｉｎｗａｒｄｌｙ　Ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｊ　Ｍｅｍｂｅｒ２）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＫＣＮＪ２／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．０３８以上である。
　要件Ｃ３：ＫＣＮＥ１（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　１）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＫＣＮＥ１／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．００３以上である。
　要件Ｃ４：ＳＣＮ５Ａ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｌｐｈａ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　５）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＳＣＮ５Ａ／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．８７以上である。
　＜７＞　以下の要件Ｄ１～要件Ｄ４の少なくともいずれかを満たす、＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　要件Ｄ１：ＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｐａｓｅ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＬＰＬ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．４５以上である。
　要件Ｄ２：ＡＣＡＴ１（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＡＣＡＴ１／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．４３以上である。
　要件Ｄ３：ＨＡＤＨＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＨＡＤＨＡ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．７５以上である。
　要件Ｄ４：ＨＡＤＨＢ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＨＡＤＨＢ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．９５以上である。
　＜８＞　以下の要件Ｅ１～要件Ｅ８の少なくともいずれかを満たす、＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　要件Ｅ１：ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｇａｍｍａ）　Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．８０以上である。
　要件Ｅ２：ＥＳＲＲＡ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＳＲＲＡ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．５５以上である。
　要件Ｅ３：ＶＥＧＦＡ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＶＥＧＦＡ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．６５以上である。
　要件Ｅ４：ＡＰＬＮ（Ａｐｅｌｉｎ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＡＰＬＮ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．００５以上である。
　要件Ｅ５：ＦＡＢＰ３（Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＦＡＢＰ３／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において５．０以上である。
　要件Ｅ６：ＥＳＭ１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＳＭ１／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．００２以上である。
　要件Ｅ７：ＥＭＣＮ（Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＭＣＮ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養の７日目以降のいずれかの日において０．００２以上である。
　要件Ｅ８：ＢＣＬ２（ＢＣＬ２　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＢＣＬ２／ＨＩＦ１Ａ）が、培養７日目以降のいずれかの日において０．０１３以上である。
　＜９＞　細胞１個あたりのミトコンドリアの面積が２００μｍ^２以上である、＜１＞～＜８＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　＜１０＞　ライブセルイメージングにおいて検出された収縮速度をＣＶ（ｍ／ｓｅｃ）とし、弛緩速度をＲＶ（ｍ／ｓｅｃ）としたとき、下記式（２）を満たす、＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　　１．０≦ＣＶ／ＲＶ≦２．８　　　　　（２）
　＜１１＞　カルシウムイメージング解析において、カルシウムトランジェントの波形ピーク高さを１００％としたとき、２０％の高さの波形幅をＤｕｒａｔｉｏｎ（秒）とし、ピーク間の間隔をＩｎｔｅｒｖａｌ（秒）としたとき、下記式（３）を満たす、＜１＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　　Ｄｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２≧０．６８　　　（３）
　＜１２＞　培養細胞シートを構成する細胞が、２５℃溶液中でのパッチクランプ試験における活動電位８０％再分極持続時間が６００ｍｓｅｃ以上であり、かつ、最大拡張期電位が－６０ｍＶ以下である、＜１＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　＜１３＞　細胞が培養液に含まれる酸素を使用する速度を測定する酸素消費速度測定において、脂肪酸のβ酸化活性を阻害するβ酸化阻害剤の添加により、酸素消費速度がβ酸化阻害剤の添加前と比較して２０％以下に減少する＜１＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　＜１４＞　再生医療用である、＜１＞～＜１３＞のいずれか１つに記載の培養細胞シート。
　＜１５＞　＜１＞～＜１４＞のいずれか１つに記載の培養細胞シートの製造方法であって、培養細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、複数の平坦部と複数の凹凸部とを備え、各平坦部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記複数の平坦部は前記表面の全体で前記第１方向と交差する第２方向に並び、各凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部の間を埋める複数の段差構造を含み、前記段差構造のピッチが１００ｎｍ以上１０μｍ以下であり、前記段差構造は、凸部であり、前記凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部に挟まれた凹部の底面に複数の前記凸部を備えており、細胞シート形成部材の厚み方向において、前記凹凸部における先端面の高さと、前記平坦部の高さとの差が０．５μｍ以下である細胞シート形成部材を用いて、心筋細胞を培養することを含む、培養細胞シートの製造方法。
　＜１６＞　＜１＞～＜１４＞のいずれか１つに記載の培養細胞シートに対して、評価対象である化合物または薬物を作用させる、化合物または薬物の評価方法。
　＜１７＞　培養細胞シートの生理学的特性の変化および運動機能の変化から選択される少なくとも１つの変化を評価する、＜１６＞に記載の化合物または薬物の評価方法。
　＜１８＞　前記評価対象である化合物または薬物が、ＩＮａ遮断薬、Ｉｋｒ遮断薬、Ｉｋｓ遮断薬、ＩＣａ遮断薬、５－ＨＴ４受容体作動薬、α受容体遮断薬、β受容体遮断薬、α受容体作動薬、およびβ受容体作動薬、毒劇物、抗がん剤、脂質代謝阻害剤、およびその他の生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１つの既存化合物またはその候補化合物である、＜１６＞または＜１７＞に記載の化合物または薬物の評価方法。
　＜１９＞　心筋細胞から構成される培養細胞シートの品質評価方法であって、下記（ｉ）～（xii）のいずれかを評価する、品質評価方法。
　（ｉ）　前記培養細胞シートに対して、抗α－アクチニン抗体を使用して免疫染色を行い顕微鏡観察で得られる画像において画面水平方向を０°とした際、測定範囲（７１．６μｍ×７１．６μｍ）内にあるα－アクチニン抗体で検出される棒状構造体の長手方向の角度を計測し、その最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の頻度を、下記式（１）により求める配向度が２３％以上である。
　配向度（％）＝（最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の数）／（棒状構造体の総数）×１００　（１）
　（ii）　ライブセルイメージングにおいて、動きベクトルの最頻値の角度から±５°の角度を示すベクトルの数（配向度）が１２％以上である。
　（iii）　以下の要件Ａ１および要件Ａ２の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ａ１：ＭＹＬ３（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　３）遺伝子の発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＭＹＬ３／ＡＣＴＢ）が１２．０以上である。
　要件Ａ２：ＭＹＨ７（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　７）遺伝子の発現量と、ＭＹＨ６（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　６）遺伝子の発現量との比（ＭＹＨ７／ＭＹＨ６）が６．０以上である。
　（iv）　以下の要件Ｂ１および要件Ｂ２の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｂ１：ＣＫＭ（Ｃｒｅａｔｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ，Ｍ－ｔｙｐｅ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＣＫＭ／ＡＣＴＢ）が、１．８０以上である。
　要件Ｂ２：ＬＤＨＡ（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢの遺伝子発現量との比（ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢ）が０．８０以上である。
　（ｖ）　以下の要件Ｃ１～要件Ｃ４の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｃ１：ＣＡＣＮＡ２Ｄ１（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｕｘｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ２ｄｅｌｔａ１）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．０８５以上である。
　要件Ｃ２：ＫＣＮＪ２（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｉｎｗａｒｄｌｙ　Ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｊ　Ｍｅｍｂｅｒ２）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＫＣＮＪ２／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．０３８以上である。
　要件Ｃ３：ＫＣＮＥ１（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　１）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＫＣＮＥ１／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．００３以上である。
　要件Ｃ４：ＳＣＮ５Ａ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｌｐｈａ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　５）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＳＣＮ５Ａ／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．８７以上である。
　（vi）　以下の要件Ｄ１～要件Ｄ４の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｄ１：ＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｐａｓｅ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＬＰＬ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．４５以上である。
　要件Ｄ２：ＡＣＡＴ１（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＡＣＡＴ１／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．４３以上である。
　要件Ｄ３：ＨＡＤＨＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＨＡＤＨＡ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．７５以上である。
　要件Ｄ４：ＨＡＤＨＢ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＨＡＤＨＢ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．９５以上である。
　（vii）　以下の要件Ｅ１～要件Ｅ８の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｅ１：ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｇａｍｍａ）　Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．８０以上である。
　要件Ｅ２：ＥＳＲＲＡ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＳＲＲＡ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．５５以上である。
　要件Ｅ３：ＶＥＧＦＡ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＶＥＧＦＡ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．６５以上である。
　要件Ｅ４：ＡＰＬＮ（Ａｐｅｌｉｎ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＡＰＬＮ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．００５以上である。
　要件Ｅ５：ＦＡＢＰ３（Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＦＡＢＰ３／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において５．０以上である。
　要件Ｅ６：ＥＳＭ１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＳＭ１／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．００２以上である。
　要件Ｅ７：ＥＭＣＮ（Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＭＣＮ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養の７日目以降のいずれかの日において０．００２以上である。
　要件Ｅ８：ＢＣＬ２（ＢＣＬ２　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＢＣＬ２／ＨＩＦ１Ａ）が、培養７日目以降のいずれかの日において０．０１３以上である。
　（viii）　細胞１個あたりのミトコンドリアの面積が２００μｍ^２以上である。
　（ix）　ライブセルイメージングにおいて検出された収縮速度をＣＶ（ｍ／ｓｅｃ）とし、弛緩速度をＲＶ（ｍ／ｓｅｃ）としたとき、下記式（２）を満たす。
　　１．０≦ＣＶ／ＲＶ≦２．８　　　　　（２）
　（ｘ）　カルシウムイメージング解析において、カルシウムトランジェントの波形ピーク高さを１００％としたとき、２０％の高さの波形幅をＤｕｒａｔｉｏｎ（秒）とし、ピーク間の間隔をＩｎｔｅｒｖａｌ（秒）としたとき、下記式（３）を満たす。
　　Ｄｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２≧０．６８　　　（３）
　（xi）　培養細胞シートを構成する細胞が、２５℃溶液中でのパッチクランプ試験における活動電位８０％再分極持続時間が６００ｍｓｅｃ以上であり、かつ、最大拡張期電位が－６０ｍＶ以下である。
　（xii）　細胞が培養液に含まれる酸素を使用する速度を測定する酸素消費速度測定において、脂肪酸のβ酸化活性を阻害するβ酸化阻害剤の添加により、酸素消費速度がβ酸化阻害剤の添加前と比較して２０％以下に減少する。

　本発明によれば、特定の薬剤を使用することなく、心筋細胞から構成された成熟化した培養細胞シートおよびその製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、該培養細胞シートを使用した化合物または薬物の評価方法を提供することができる。さらに、本発明によれば、心筋細胞から構成された培養細胞シートの品質評価方法を提供することができる。

細胞シート形成部材の一実施形態における同部材の構成を示す図であり、（ａ）は細胞シート形成部材の構造をシャーレとともに示す斜視図であり、（ｂ）は細胞シート形成部材の表面の一部を拡大して示す斜視図であり、（ｃ）は細胞シート形成部材の表面の一部を拡大して示す平面図であり、（ｄ）は細胞シート形成部材の一部を拡大して示す部分断面図である。細胞シート形成部材の製造方法の一例を説明するための工程図である。（ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図である。培養日数１５日目、３０日目、４５日目、６０日目における配向度を示すグラフである。ＭＹＬ３（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　３）遺伝子の発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＭＹＬ３／ＡＣＴＢ）の経時変化を示すグラフである。ＭＹＨ７（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　７）遺伝子の発現量と、ＭＹＨ６（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　６）遺伝子の発現量との比（ＭＹＨ７／ＭＹＨ６）の経時変化を示すグラフである。ＣＫＭ（Ｃｒｅａｔｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ，Ｍ－ｔｙｐｅ）遺伝子、ＣＯＸ６Ａ２（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　Ｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　６Ａ２）遺伝子、ＣＫＭＴ２（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　２）遺伝子、およびＬＤＨＡ（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子の発現量の経時変化を示すグラフである。ＣＫＭ遺伝子の発現量とＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＣＫＭ／ＡＣＴＢ）、ＣＯＸ６Ａ２遺伝子の発現量とＡＣＴＢ遺伝子の発現量との比（ＣＯＸ６Ａ２／ＡＣＴＢ）、ＣＫＭＴ２遺伝子の発現量とＡＣＴＢ遺伝子の発現量との比（ＣＫＭＴ２／ＡＣＴＢ）、およびＬＤＨＡ遺伝子の発現量とＡＣＴＢ遺伝子の発現量との比（ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢ）の経時変化を示すグラフである。ＣＡＣＮＡ２Ｄ１（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｕｘｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ２ｄｅｌｔａ１）遺伝子、ＫＣＮＪ２（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｉｎｗａｒｄｌｙ　Ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｊ　Ｍｅｍｂｅｒ２）遺伝子、ＫＣＮＥ１（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　１）遺伝子およびＳＣＮ５Ａ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｌｐｈａ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　５）遺伝子の発現量の経時変化を示すグラフである。ＣＡＣＮＡ２Ｄ１遺伝子の発現量とＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）遺伝子の発現量との比（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１／ＡＴＰ１Ａ１）、ＫＣＮＪ２遺伝子の発現量とＡＴＰ１Ａ１遺伝子の発現量との比（ＫＣＮＪ２／ＡＴＰ１Ａ１）、ＫＣＮＥ１遺伝子の発現量とＡＴＰ１Ａ１遺伝子の発現量との比（ＫＣＮＥ１／ＡＴＰ１Ａ１）およびＳＣＮ５Ａ遺伝子の発現量とＡＴＰ１Ａ１遺伝子の発現量との比（ＳＣＮ５Ａ／ＡＴＰ１Ａ１）の経時変化を示すグラフである。ＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｐａｓｅ）遺伝子、ＡＣＡＴ１（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１）遺伝子、ＨＡＤＨＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ）遺伝子およびＨＡＤＨＢ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量の経時変化を示すグラフである。ＬＰＬ遺伝子の発現量とＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＬＰＬ／ＡＣＴＢ）、ＡＣＡＴ１遺伝子の発現量とＡＣＴＢ遺伝子の発現量との比（ＡＣＡＴ１／ＡＣＴＢ）、ＨＡＤＨＡ遺伝子の発現量とＡＣＴＢ遺伝子の発現量との比（ＨＡＤＨＡ／ＡＣＴＢ）、およびＨＡＤＨＢ遺伝子の発現量とＡＣＴＢ遺伝子の発現量との比（ＨＡＤＨＢ／ＡＣＴＢ）の経時変化を示すグラフである。ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｇａｍｍａ）　Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）遺伝子、ＥＳＲＲＡ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｌｐｈａ）遺伝子、ＶＥＧＦＡ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａ）遺伝子およびＡＰＬＮ（Ａｐｅｌｉｎ）遺伝子の発現量の経時変化を示すグラフである。ＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現量とＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）遺伝子の発現量との比（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ／ＨＩＦ１Ａ）、ＥＳＲＲＡ遺伝子の発現量とＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現量との比（ＥＳＲＲＡ／ＨＩＦ１Ａ）、ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現量とＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現量との比（ＶＥＧＦＡ／ＨＩＦ１Ａ）、およびＡＰＬＮ遺伝子の発現量とＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現量との比（ＡＰＬＮ／ＨＩＦ１Ａ）の経時変化を示すグラフである。ＦＡＢＰ３（Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３）遺伝子、ＥＳＭ１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）遺伝子、ＥＭＣＮ（Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）遺伝子およびＢＣＬ２（ＢＣＬ２　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）遺伝子の発現量の経時変化を示すグラフである。ＦＡＢＰ３遺伝子の発現量とＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現量との比（ＦＡＢＰ３／ＨＩＦ１Ａ）、ＥＳＭ１遺伝子の発現量とＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現量との比（ＥＳＭ１／ＨＩＦ１Ａ）、ＥＭＣＮ遺伝子の発現量とＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現量との比（ＥＭＣＮ／ＨＩＦ１Ａ）、およびＢＣＬ２遺伝子の発現量とＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現量との比（ＢＣＬ２／ＨＩＦ１Ａ）の経時変化を示すグラフである。細胞１つあたりのミトコンドリア面積およびミトコンドリア活性を示すグラフである。核およびミトコンドリアを染色した蛍光画像である。ライブセルイメージング装置における動きベクトルの角度による頻度を示すグラフである。ライブセルイメージング装置を用いて測定した心拍数（ＢＲ）、収縮速度（ＣＶ）、弛緩速度（ＲＶ）、心拍時間（ＣＲＤ）および配向度の経時変化を示すグラフである。ライブセルイメージング装置を用いて測定した収縮速度と弛緩速度との比（ＣＶ／ＲＶ）の経時変化を示すグラフである。カルシウムイメージング解析で測定した、培養５日目におけるＤｕｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｖａｌ、およびＤｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２を示すグラフである。パッチクランプ試験の結果を示すグラフである。ライブセルイメージング解析で測定した各化合物の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである。カルシウムイメージング解析で測定した化合物（Ｅ－４０３１）の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである。カルシウムイメージング解析で測定した化合物（Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ）の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである。カルシウムイメージング解析で測定した化合物（Ｃｉｓａｐｒｉｄｅ）の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである。カルシウムイメージング解析で測定した化合物（Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ）の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである。カルシウムイメージング解析で測定した化合物（ＤＭＳＯ）の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである。ライブセルイメージング解析で測定した化合物（Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ）の培養１５日目の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである。ライブセルイメージング解析で測定した化合物（Ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ）の培養１５日目の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである。ライブセルイメージング解析で測定した化合物（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）の培養１５日目の培養細胞シートに対する影響を示すグラフである β酸化阻害剤であるＥｔｏｍｏｘｉｒの添加による酸素消費速度の変化を示すグラフである。

　以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。数値範囲が段階的に記載されている場合、各数値範囲の上限および下限は任意に組み合わせることができる。

［培養細胞シート］
　本発明の培養細胞シートは、心筋細胞から構成される培養細胞シートであって、心筋細胞が配向性を有して配置され、前記培養細胞シートに対して、抗α－アクチニン抗体を使用して免疫染色を行い顕微鏡観察で得られる画像において画面水平方向を０°とした際、測定範囲　７１．６μｍ×７１．６μｍの面積内にあるα－アクチニン抗体で検出される棒状構造体（筋原線維のＺ帯）の長手方向の角度を計測し、その最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の頻度である、下記式（１）により求める配向度が２３％以上である。
　配向度（％）＝（最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の数）／（棒状構造体の総数）×１００　（１）
　棒状構造体とは、α－アクチニンによって検出される筋原線維のＺ帯を指す。Ｚ帯は、筋原線維の向きに対して直行して存在する。心筋細胞が、長軸方向を揃えて一方向に配向した場合、Ｚ帯は細胞の長軸方向に対して９０°の角度を示す。
　棒状構造体の画像解析は、取得した画像を縦に三等分、横に三等分の９区画に分け（１区画は７１．６μｍ×７１．６μｍの面積）、３区画（左上、中央、右下の区画）を用いた。取得した画像が３個以上の場合は、それぞれの画像の左上の１区画を測定し（ｎ＝３以上）、取得した画像が２個以下の場合は、代表的な１個の画像から３区画（左上、中央、右下の区画）を測定した。１区画には細胞が平均して１０個含まれる。画像上の棒状構造体は、画像解析ソフトウェア（Ａ像くん、旭化成エンジニアリング株式会社製）等の角度分布解析を使用して、α－アクチニンで検出された棒状構造体を検出し、画像の水平方向を０°として、α－アクチニンで検出された棒状構造体の角度分布（０～１８０°）を求めることができる。また、画像解析ソフト（例えばＰｈｏｔｏｓｈｏｐ、Ａｄｏｂｅ社製）等を使用して、棒状構造体を直線でマークし、次にマークした直線のみを画像として保存し、解析ソフトウェア（Ａ像くん、旭化成エンジニアリング株式会社製）等を使用して、直線の角度分布を解析することもできる。
　角度分布は０～１８０°間の１０°毎の頻度として表した。
　なお、培養細胞シートとは、細胞シートが生体内に存在するものではなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて製造されたものであることを意味する。

　心筋細胞を成熟化させる手段として、細胞を生体に近い状態で培養する方法が有効であると考えられている。生体内の心筋は、一方向に配向した状態で存在し、細胞間結合を介して細胞間の電気伝導が行われ、収縮・弛緩といった機能を発揮している。
　本実施形態では、配向性培養基材を使用し、心筋細胞を配向した状態で培養することで、心筋細胞の成熟化（生理活性や運動機能の改善）が促進されることを見出した。この方法で培養した細胞を使用することで、創薬分野での毒性試験や有効性試験へヒトｉＰＳ細胞等由来心筋細胞の利用が可能になることを見出した。また、当該培養細胞シートは、成熟化が進んでおり、より生体内に近い状態であることから、再生医療にも応用が期待される。

　上記式（１）で表される配向度は、心筋細胞の成熟化を促進させる観点から、２３％以上であり、好ましくは２４％以上、より好ましくは２５％以上であり、さらに好ましくは２６％以上であり、そして、上限は特に限定されないが、製造容易性の観点から、５０％以下である。
　なお、いずれかの培養日数において、上記式（１）で表される配向度が上記の範囲を満たしていればよい。

＜心筋細胞＞
　本実施形態の培養細胞シートは、心筋細胞から構成される。
　前記心筋細胞としては、無脊椎動物、ヒトおよび非ヒトを含む脊椎動物の心筋細胞が例示され、脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、および哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類としては、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、またはウサギ等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、または、アカゲザル、チンパンジー、オランウータン、ヒト等を含む霊長類等であってもよい。また、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。
　これらの中でも、ヒトやマウスを含む哺乳類の心筋細胞であることが好ましく、ヒトの心筋細胞であることがより好ましい。

　本実施形態において、心筋細胞は、各種の中胚葉系への分化誘導因子等を用いた手法により多能性幹細胞（幹細胞）から分化誘導された心筋細胞であってもよい。加えて、本実施形態において、心筋細胞は、患者等の線維芽細胞や血液細胞に転写因子を導入して誘導されるｉｎｄｕｃｅｄ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ（ｉＣＭ、ダイレクトリプログラミングにより得られた心筋細胞）であってもよい。さらに加えて、本実施形態の心筋細胞は、患者等の心臓から得られた初代培養（Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）心筋細胞であってもよい。
　これらの中でも、心筋細胞は、幹細胞由来の心筋細胞であることが好ましい。
　ここで、幹細胞は、例えば、ヒトを含む霊長類、霊長類以外のほ乳類等の生物で各種細胞に分化可能な、多分化能を備える幹細胞（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ）を含む。幹細胞は、継代可能であり、継代しても分化が進まない状態を保ち、核型等が変化しにくく、またはエピジェネティックな表現型が変化しにくい性質を有することが好適である。また、幹細胞は、これに関連して、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で十分な増殖能力を備えていることが好適である。このような幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、以下、「ＥＳ細胞」という。）、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、以下、「ｉＰＳ細胞」という。）、その他の人工的に生成され若しくは選択された多能性を備える幹細胞等が挙げられる。これらの幹細胞は、特定の遺伝子を含むレトロウイルスやアデノウイルスやプラスミド等の各種ベクター、ＲＮＡ、低分子化合物等により、体細胞を再プログラミングして作製された幹細胞であってもよい。
　なお、幹細胞としては、必ずしも全能性（万能性、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）に近い多分化能を備えている細胞である必要はないものの、通常より多分化能が高い多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）な細胞を用いることが好ましい。また、幹細胞は、疾患の患者から得られた細胞から作製された細胞、その他の疾患のモデルとなる細胞、レポーター遺伝子が組み込まれた細胞（レポーター細胞）、コンディショナルノックアウトが可能な細胞、その他の遺伝子組み換えされた細胞等であってもよい。この遺伝子組み換えは、染色体内の遺伝子の追加や修飾や削除、各種ベクターや人工染色体による遺伝子等の付加、エピジェネティック制御の変更、ＰＮＡ等の人工遺伝物質の付加、その他の遺伝子組み換えを含む。
　これらの中でも、本実施形態において、心筋細胞は、入手容易性および心筋細胞への分化誘導性の観点から、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来の心筋細胞であることが好ましい。

＜遺伝子発現＞
　本実施形態の培養細胞シートは、心筋細胞の成熟化に伴う特徴的な遺伝子発現量の変化が生じていることが好ましい。当該特徴的な遺伝子発現量の変化は、例えば、参考文献１（Circ.　Res.　2020　Apr　10:　126(8),　1086-1106）、参考文献２（Nat　Rev　Cardiol.　2020　Jun;17(6):341-359）に記載されている。
　本発明の方法において、遺伝子発現量は、ＲＮＡの発現情報によって測定され、ＲＮＡの発現情報の取得方法は特に限定されないが、例えば、試料中に含まれるＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡまたはその増幅産物を測定することにより取得することが挙げられる。発現レベルを測定する手段としては、マイクロアレイ、定量ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ等が挙げられ、好ましくはＲＮＡ－Ｓｅｑである。
　ＲＮＡの発現量は、マイクロアレイ解析を用いる場合にはシグナル強度比によって定量され、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析ではゲノムにマッピングされたシーケンスリードの数（リードカウント値）により定量される。各転写物にマッピングされたリード数を、転写物の長さや当該解析で得られた総リード数等により補正する正規化と呼ばれる作業を経て、解析に使用される。具体的な正規化の手法としては、例えばサンプル間で総リード数の違いを補正するため、総リード数を１００万に補正した、ＣＰＭ（Ｃｏｕｎｔｓ　Ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ）、さらに転写物の長さを１ｋｂ、総リード数を１００万とし、各遺伝子の遺伝子長で補正されたリード数であるＲｅａｄｓ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅａｄｓ（ＲＰＫＭ）値を挙げることができる。同様に総リード数を１００万とし、各遺伝子の遺伝子長で補正されたフラグメント数であるＦｒａｇｍｅｎｔｓ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅａｄｓ（ＦＰＫＭ）値や、各転写産物のリード数を遺伝子長で補正し、総リード数を１００万とした場合の転写産物数を表すＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　Ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）値等も汎用される。本実施形態では、ＣＰＭおよびＴＰＭを使用しているが、これに限定されるものではない。

　本実施形態の培養細胞シートは、ＭＹＬ３（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　３）の遺伝子発現量が多いことが好ましく、組織や培養期間に関わらず一定量の遺伝子発現量が想定されるＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＭＹＬ３／ＡＣＴＢ）は、好ましくは１２．０以上、より好ましくは１２．５以上である。また、培養日数に依存するが、さらに好ましくは１５．０以上である。上限は特に限定されないが、一般に３０．０以下、好ましくは２５．０以下である。なお、本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養日数によって遺伝子発現量の変化が認められるが、いずれかの培養日数において、上記の遺伝子発現量の比が達成されていればよい。

　また、心筋細胞では、成熟化に伴うアイソフォームの変化が生じることが報告されている（上記参考文献１参照）、このようなアイソフォームの変化として、ＭＹＨ６（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　６）からＭＹＨ７（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　７）へのアイソフォームスイッチングが知られている。
　本実施形態の培養細胞シートにおいて、ＭＹＨ７遺伝子の発現量と、ＭＹＨ６遺伝子の発現量との比（ＭＹＨ７／ＭＹＨ６）は、好ましくは６．０以上、より好ましくは７．０以上である。また、上限は特に限定されないが、一般に１５．０以下、好ましくは１０．０以下である。なお、本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養日数によって遺伝子発現量の変化が認められるが、いずれかの培養日数において、上記の遺伝子発現量の比が達成されていればよい。

　さらに、培養細胞シートにおいて、心筋の収縮に関連するＣＫＭ（Ｃｒｅａｔｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ，Ｍ－ｔｙｐｅ）の遺伝子発現量が増加することが好ましい。本実施形態の培養細胞シートにおいて、いずれかの培養日数において、ＣＫＭ遺伝子の発現量が、好ましくは９００ＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　Ｍｉｌｌｉｏｎ）以上、より好ましくは１０００ＴＰＭ以上、さらに好ましくは１１００ＴＰＭ以上である。また、その上限は特に限定されないが、一般に１５００ＴＰＭ以下である。
　ＣＫＭ遺伝子とＡＣＴＢ遺伝子との発現量の比（ＣＫＭ／ＡＣＴＢ）は、いずれかの培養日数において、好ましくは１．８０以上、より好ましくは２．００以上、さらに好ましくは２．１０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に５．０以下、好ましくは４．５以下である。

　培養細胞シートにおいて、ミトコンドリアに局在するタンパク質であるＣＯＸ６Ａ２（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　Ｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　６Ａ２）の遺伝子発現量が増加することが好ましい。本実施形態の培養細胞シートにおいて、いずれかの培養日数において、ＣＯＸ６Ａ２遺伝子の発現量は、好ましくは８５０ＴＰＭ以上、より好ましくは８７５ＴＰＭ以上、さらに好ましくは９００ＴＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば２０００ＴＰＭ以下、好ましくは１５００ＴＰＭ以下である。
　ＣＯＸ６Ａ２遺伝子とＡＣＴＢ遺伝子との発現量の比（ＣＯＸ６Ａ２／ＡＣＴＢ）は、いずれかの培養日数において、好ましくは１．９５以上、より好ましくは２．２０以上、さらに好ましくは２．４０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に５．００以下、好ましくは３．５０以下である。

　培養細胞シートにおいて、ミトコンドリアに局在するタンパク質であるＣＫＭＴ２（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　２）の遺伝子発現量が増加することが好ましい。本実施形態の培養細胞シートにおいて、いずれかの培養日数において、ＣＫＭＴ２遺伝子の発現量は、好ましくは３３０ＴＰＭ以上、より好ましくは３５０ＴＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば１０００ＴＰＭ以下、好ましくは８００ＴＰＭ以下である。
　ＣＫＭＴ２遺伝子とＡＣＴＢ遺伝子との発現量の比（ＣＫＭＴ２／ＡＣＴＢ）は、培養１５～３０日目において、好ましくは０．６０以上、より好ましくは０．６５以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に３．０以下、好ましくは１．５以下である。また、いずれかの培養日数において、ＣＫＭＴ２／ＡＣＴＢは、好ましくは０．８０以上である。

　培養細胞シートにおいて、解糖系の酵素であるＬＤＨＡ（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）の遺伝子発現量が増加することが好ましい。細胞の活性化に伴い、エネルギー生産量が高まることで、ＬＤＨＡの遺伝子発現量が増加するものと考えられる。
　本実施形態の培養細胞シートにおいて、いずれかに培養日数において、ＬＤＨＡ遺伝子の発現量は、好ましくは５５０ＴＰＭ以上、より好ましくは６００ＴＰＭ以上、さらに好ましくは６５０ＴＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば２０００ＴＰＭ以下、好ましくは１５００ＴＰＭ以下である。
　ＬＤＨＡ遺伝子とＡＣＴＢ遺伝子との発現量の比（ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢ）は、好ましくは０．８０以上、より好ましくは１．００以上、さらに好ましくは１．２０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に５．０以下、好ましくは４．０以下である。

　培養細胞シートにおいて、心筋のカルシウムイオンチャネル形成に関連するＣＡＣＮＡ２Ｄ１（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｕｘｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ２ｄｅｌｔａ１）、心筋のカリウムイオンチャネル形成に関連するＫＣＮＪ２（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｉｎｗａｒｄｌｙ　Ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｊ　Ｍｅｍｂｅｒ２）、ＫＣＮＥ１（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　１）、心筋のナトリウムイオンチャネル形成に関連するＳＣＮ５Ａ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｌｐｈａ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　５）の発現量が経時的に増加することが好ましい。心筋細胞の成熟に伴い、心筋細胞の収縮弛緩運動も活性化するが、これに伴い、イオンチャネルの形成に関連する遺伝子の発現量が増加するものと考えられる。
　なお、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１遺伝子、ＫＣＮＪ２遺伝子、ＫＣＮＥ１遺伝子、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の場合には、前述のＡＣＴＢの代わりに、細胞膜内外でのＮａ＋およびＫ＋勾配の生成に関与するＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）を使用する。その理由としては、ＡＴＰ１Ａ１は恒常的に発現する心筋細胞膜タンパク質であるとされており、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞、胎児心筋、成人心筋での発現量の変動が少ないことが報告されていることから選択した（Okai,　et　al.,　Video-based　assessment　of　drug-induced　effects　on　contractile　motion　properties　using　human　induced　pluripotent　stem　cell-derived　cardiomyocytes,　Journal　of　Pharmacological　and　Toxicological　Methods,　Volume　105,　September　2020,　106893参照）。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、いずれかの培養日数において、心筋のカルシウムイオンチャネル形成に関連するＣＡＣＮＡ２Ｄ１遺伝子の発現量は、好ましくは２１００ＣＰＭ以上、より好ましくは２２００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは２３００ＣＰＭ以上、よりさらに好ましくは２４００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、３５００ＣＰＭ以下、好ましくは３０００ＣＰＭ以下である。
　ＣＡＣＮＡ２Ｄ１遺伝子とＡＴＰ１Ａ１遺伝子との発現量の比（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１／ＡＴＰ１Ａ１）は、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において、好ましくは０．０８以上、より好ましくは０．０８５以上、さらに好ましくは０．０９以上、よりさらに好ましくは０．０９５以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に０．５０以下、好ましくは０．２０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、いずれかの培養日数において、ＫＣＮＪ２遺伝子の発現量は、好ましくは９５０ＣＰＭ以上、より好ましくは１０００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは１２００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、３０００ＣＰＭ以下、好ましくは２０００ＣＰＭ以下である。
　ＫＣＮＪ２遺伝子とＡＴＰ１Ａ１遺伝子との発現量の比（ＫＣＮＪ２／ＡＴＰ１Ａ１）は、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、好ましくは０．０３８以上、より好ましくは０．０４０以上、さらに好ましくは０．０４５以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に０．１５以下、好ましくは０．１０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、ＫＣＮＥ１遺伝子の発現量は、好ましくは５０ＣＰＭ以上、より好ましくは６０ＣＰＭ以上、さらに好ましくは７０ＣＰＭ以上、よりさらに好ましくは７５ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、２００ＣＰＭ以下、好ましくは１５０ＣＰＭ以下である。
　ＫＣＮＥ１遺伝子とＡＴＰ１Ａ１遺伝子との発現量の比（ＫＣＮＥ１／ＡＴＰ１Ａ１）は、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、好ましくは０．００２５以上、より好ましくは０．００３以上、さらに好ましくは０．００３５以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に０．０１以下、好ましくは０．００７以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の発現量は、好ましくは２２０００ＣＰＭ以上、より好ましくは２３０００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは２３５００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、５００００ＣＰＭ以下、好ましくは４００００ＣＰＭ以下である。
　ＳＣＮ５Ａ遺伝子とＡＴＰ１Ａ１遺伝子との発現量の比（ＳＣＮ５Ａ／ＡＴＰ１Ａ１）は、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、好ましくは０．８５以上、より好ましくは０．９０以上、さらに好ましくは０．９５以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に５．０以下、好ましくは２．０以下である。

　培養細胞シートにおいて、細胞表面に存在して細胞内への脂質の取り込みを促進するＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｐａｓｅ）や細胞内ミトコンドリアに局在し、脂肪酸のβ酸化に関連するＡＣＡＴ１（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１）、ＨＡＤＨＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ）、ＨＡＤＨＢ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｂｅｔａ）の発現量が経時的に増加することが好ましい。心筋細胞の成熟に伴い、運動機能が向上し、ＡＴＰ消費量が増大する。より効率のよいＡＴＰ産生のため、これらの遺伝子の発現が増加すると考えられる。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、ＬＰＬ遺伝子の発現量は、好ましくは３１００ＣＰＭ以上、より好ましくは３５００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは４０００ＣＰＭ以上、よりさらに好ましくは４５００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、９０００ＣＰＭ以下、好ましくは７５００ＣＰＭ以下である。
　ＬＰＬ遺伝子とＡＣＴＢ遺伝子との発現量の比（ＬＰＬ／ＡＣＴＢ）は、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、好ましくは０．４５以上、より好ましくは０．５０以上、さらに好ましくは０．６０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に２．０以下、好ましくは１．５以下、より好ましくは１．０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養３０日目～４５日目のいずれかの日において、ＡＣＡＴ１遺伝子の発現量は、好ましくは３５００ＣＰＭ以上、より好ましくは３８００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、８０００ＣＰＭ以下、好ましくは６０００ＣＰＭ以下である。
　ＡＣＡＴ１遺伝子とＡＣＴＢ遺伝子との発現量の比（ＡＣＡＴ１／ＡＣＴＢ）は、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において、好ましくは０．４３以上、より好ましくは０．４５以上、さらに好ましくは０．５０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に２．０以下、好ましくは１．５以下、より好ましくは１．０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養３０日目～４５日目のいずれかの日において、ＨＡＤＨＡ遺伝子の発現量は、好ましくは６０００ＣＰＭ以上、より好ましくは６２００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは６５００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、１２０００ＣＰＭ以下、好ましくは１００００ＣＰＭ以下である。
　ＨＡＤＨＡ遺伝子とＡＣＴＢ遺伝子との発現量の比（ＨＡＤＨＡ／ＡＣＴＢ）は、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において、好ましくは０．７５以上、より好ましくは０．８０以上、さらに好ましくは０．９０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に２．５以下、好ましくは２．０以下、より好ましくは１．５以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、ＨＡＤＨＢ遺伝子の発現量は、好ましくは８２００ＣＰＭ以上、より好ましくは８３００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは８５００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、２００００ＣＰＭ以下、好ましくは１５０００ＣＰＭ以下である。
　ＨＡＤＨＢ遺伝子とＡＣＴＢ遺伝子との発現量の比（ＨＡＤＨＢ／ＡＣＴＢ）は、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において、好ましくは０．９５以上、より好ましくは１．００以上、さらに好ましくは１．１０以上、よりさらに好ましくは１．２０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に２．５以下、好ましくは２．０以下、より好ましくは１．８以下である。

　培養細胞シートにおいて、ミトコンドリア生合成のマスターレギュレーターとして働く転写因子ＰＧＣ－１αをコードするＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子（ＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｇａｍｍａ）　Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）、心筋細胞の成熟化に関連するエストロゲン関連受容体ＥＲＲ－αをコードするＥＳＲＲＡ遺伝子（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｌｐｈａ）、血管増殖因子をコードするＶＥＧＦＡ遺伝子（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａ）、心筋において心臓の収縮を刺激するマイオカインをコードするＡＰＬＮ遺伝子（Ａｐｅｌｉｎ）、心筋において長鎖脂肪酸の取込を制御するマイオカインをコードするＦＡＢＰ３遺伝子（Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３）、内皮細胞特異的に発現するＥＳＭ１遺伝子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）、上皮細胞などから分泌されるムチン様糖タンパク質をコードするＥＭＣＮ遺伝子（Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）の発現量が経時的に増加することが好ましく、また、心筋細胞の分化に関わるＢＣＬ２遺伝子（ＢＣＬ２　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の発現量が維持されていることが好ましい。
　心筋細胞の成熟に伴い、運動機能が亢進することにより、ミトコンドリアの機能化に関与するＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子や血管新生に関与するＶＥＧＦＡ遺伝子の発現量が増加すると考えられ、また、これに伴い、ＡＰＬＮ、ＦＡＢＰ３等のマイオカインをコードする遺伝子の発現量が増加すると考えられる。さらに、内皮細胞に特異的なＥＳＭ１やＥＭＣＮ等の遺伝子の発現量が増加すると考えられる。また、心筋細胞の分化に関わるＢＣＬ２遺伝子の発現が維持されると考えられる。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現量は、好ましくは４５００ＣＰＭ以上、より好ましくは４７００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは５０００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、２００００ＣＰＭ以下、好ましくは１５０００ＣＰＭ以下、より好ましくは８０００ＣＰＭ以下である。
　ＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子とＨＩＦ１Ａ遺伝子との発現量の比（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ／ＨＩＦ１Ａ）は、培養のいずれかの日において、好ましくは０．８０以上、より好ましくは０．８５以上、さらに好ましくは０．９０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に２．５以下、好ましくは２．０以下、より好ましくは１．５以下である。
　なお、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子、ＥＳＲＲＡ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＡＰＬＮ遺伝子、ＦＡＢＰ３遺伝子、ＥＳＭ１遺伝子、ＥＭＣＮ遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子の場合には、前述のＡＣＴＢの代わりに、細胞の低酸素状態下で誘導される転写因子であるＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）を使用する。その理由としては、本項目で述べる血管新生の亢進は、低酸素症または運動刺激によって誘導されることが報告されているためである。細胞培養条件下ではどちらの環境も取りうるが、状態のよい（機能的に成熟した）心筋細胞では、運動刺激による各因子の発現上昇が起きていると考えられる（Arany,　et　al.,　HIF-independent　regulation　of　VEGF　and　angiogenesisby　the　transcriptional　coactivator　PGC-1a,　Vol　451|　21　February　2008参照）。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において、ＥＳＲＲＡ遺伝子の発現量は、好ましくは２７５０ＣＰＭ以上、より好ましくは２９００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは３０００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、１００００ＣＰＭ以下、好ましくは６０００ＣＰＭ以下、より好ましくは４０００ＣＰＭ以下である。
　ＥＳＲＲＡ遺伝子とＨＩＦ１Ａ遺伝子との発現量の比（ＥＳＲＲＡ／ＨＩＦ１Ａ）は、培養のいずれかの日において、好ましくは０．５５以上、より好ましくは０．５７以上、さらに好ましくは０．６０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に２．０以下、好ましくは１．５以下、より好ましくは１．０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養のいずれかの日において、ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現量は、好ましくは３３００ＣＰＭ以上、より好ましくは３７００ＣＰＭ以上、さらに好ましくは４５００ＣＰＭ以上、よりさらに好ましくは６０００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、２５０００ＣＰＭ以下、好ましくは１５０００ＣＰＭ以下、より好ましくは１００００ＣＰＭ以下である。
　ＶＥＧＦＡ遺伝子とＨＩＦ１Ａ遺伝子との発現量の比（ＶＥＧＦＡ／ＨＩＦ１Ａ）は、培養のいずれかの日において、好ましくは０．６５以上、より好ましくは０．７０以上、さらに好ましくは０．９０以上、よりさらに好ましくは１．２以上、特に好ましくは１．５以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に５．０以下、好ましくは３．０以下、より好ましくは２．０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養のいずれかの日において、ＡＰＬＮ遺伝子の発現量は、好ましくは１００ＣＰＭ以上、より好ましくは１５０ＣＰＭ以上、さらに好ましく２００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、５００００ＣＰＭ以下、好ましくは３０００ＣＰＭ以下、より好ましくは２０００ＣＰＭ以下である。
　ＡＰＬＮ遺伝子とＨＩＦ１Ａ遺伝子との発現量の比（ＡＰＬＮ／ＨＩＦ１Ａ）は、培養のいずれかの日において、好ましくは０．００５以上、より好ましくは０．０２０以上、さらに好ましくは０．０３０以上、よりさらに好ましくは０．０４０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に１．０以下、好ましくは０．５０以下、より好ましくは０．３０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養のいずれかの日において、ＦＡＢＰ３遺伝子の発現量は、好ましくは３００００ＣＰＭ以上、より好ましくは３１０００ＣＰＭ以上、さらに好ましく３２０００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、１０００００ＣＰＭ以下、好ましくは６００００ＣＰＭ以下、より好ましくは４００００ＣＰＭ以下である。
　ＦＡＢＰ３遺伝子とＨＩＦ１Ａ遺伝子との発現量の比（ＦＡＢＰ３／ＨＩＦ１Ａ）は、培養のいずれかの日において、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．５以上、さらに好ましくは６．０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に１５．０以下、好ましくは１２．０以下、より好ましくは８．０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養のいずれかの日において、ＥＳＭ１遺伝子の発現量は、好ましくは５ＣＰＭ以上、より好ましくは２５ＣＰＭ以上、さらに好ましく４０ＣＰＭ以上、よりさらに好ましくは１００ＣＰＭ以上、特に好ましくは２００ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、３０００ＣＰＭ以下、好ましくは１０００ＣＰＭ以下、より好ましくは５００ＣＰＭ以下である。
　ＥＳＭ１遺伝子とＨＩＦ１Ａ遺伝子との発現量の比（ＥＳＭ１／ＨＩＦ１Ａ）は、培養のいずれかの日において、好ましくは０．００２以上、より好ましくは０．００５以上、さらに好ましくは０．０１０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に０．２００以下、好ましくは０．１５０以下、より好ましくは０．１００以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養の７日目以降のいずれかの日において、ＥＭＣＮ遺伝子の発現量は、好ましくは１０ＣＰＭ以上、より好ましくは２０ＣＰＭ以上、さらに好ましく４０ＣＰＭ以上、よりさらに好ましくは６０ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、１０００ＣＰＭ以下、好ましくは５００ＣＰＭ以下、より好ましくは３００ＣＰＭ以下である。
　ＥＭＣＮ遺伝子とＨＩＦ１Ａ遺伝子との発現量の比（ＥＭＣＮ／ＨＩＦ１Ａ）は、培養の７日目以降のいずれかの日において、好ましくは０．００２以上、より好ましくは０．００４以上、さらに好ましくは０．００５以上、よりさらに好ましくは０．０１０以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に０．１００以下、好ましくは０．０７０以下、より好ましくは０．０５０以下である。

　本実施形態の培養細胞シートにおいて、培養の７日目以降のいずれかの日において、ＢＣＬ２遺伝子の発現量は、好ましくは６０ＣＰＭ以上、より好ましくは７０ＣＰＭ以上、さらに好ましく８０ＣＰＭ以上、よりさらに好ましくは９０ＣＰＭ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、例えば、１０００ＣＰＭ以下、好ましくは５００ＣＰＭ以下、より好ましくは３００ＣＰＭ以下である。
　ＢＣＬ２遺伝子とＨＩＦ１Ａ遺伝子との発現量の比（ＢＣＬ２／ＨＩＦ１Ａ）は、培養の７日目以降のいずれかの日において、好ましくは０．０１３以上、より好ましくは０．０１５以上、さらに好ましくは０．０１７以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に０．１００以下、好ましくは０．０７０以下、より好ましくは０．０５０以下である。

＜ミトコンドリア量＞
　心筋細胞は、成熟に伴い、ミトコンドリア量およびミトコンドリア活性が増加する傾向にある。
　本実施形態の培養細胞シートを、膜電位に基づいてミトコンドリアを選択的に標識する蛍光色素、および核を選択的に標識する蛍光色素を用いて染色し、蛍光画像を取得することで、ミトコンドリアおよび核の面積と、輝度とが測定される。
　膜電位に基づいて、ミトコンドリアを選択的に標識する蛍光色素としては、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＭｉｔｏ－ｔｒａｃｋｅｒシリーズ等が例示される。また、核を選択的に標識する蛍光色素としては、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２等が例示される。
　この時、核数、すなわち、細胞数で除することにより、細胞１個あたりのミトコンドリアの面積（Ａｒｅａ）および輝度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）が算出される。なお、細胞１個あたりの面積は、ミトコンドリアの数を反映しており、細胞１個あたりの輝度は、ミトコンドリア活性を反映している。
　細胞１個あたりのミトコンドリアの面積は、好ましくは２００μｍ^２以上、より好ましくは３００μｍ^２以上、さらに好ましくは４００μｍ^２以上、よりさらに好ましくは４５０μｍ^２以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に１０００μｍ^２以下、好ましくは８００μｍ^２以下である。
　細胞１個あたりのミトコンドリアの輝度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、好ましくは２×１０^６以上、より好ましくは３×１０^６以上、さらに好ましくは４×１０^６以上であり、そして、上限は特に限定されないが、一般に１０×１０^６以下、好ましくは８×１０^６以下である。なお、細胞１個あたりの輝度は、実施例に記載の方法により測定した輝度である。
　また、上記の細胞１個あたりのミトコンドリアの面積およびミトコンドリアの輝度を測定する際の細胞播種条件は、６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培養日数９日目（５日目以降）、９６ウェルの面積（０．３３ｃｍ^２）である。

＜ライブセルイメージング＞
　心筋細胞から構成される培養細胞シートは、心筋細胞の収縮・弛緩に伴う動き変化が検出可能である。生体内では、心筋細胞は一方向に配向しており、配向方向に収縮・弛緩を行うことが観察される。
　ライブセルイメージング装置（例えば、ＳＩ８０００、ソニー株式会社製）を用いて、培養細胞シート（生細胞）を、培養条件下で撮影することで得られた動画データから、心筋細胞の収縮・弛緩に伴う動きベクトル（速度、方向、数量）を検出することで、心拍数（ＢＲ：ｂｅａｔｉｎｇ　ｒａｔｅ）、収縮速度（ＣＶ：ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、弛緩速度（ＲＶ：ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、心拍時間（ＣＲＤ：ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｄｕｒａｔｉｏｎ）、および配向度の解析が可能である。ライブセルイメージングによるＢＲ、ＣＶ、ＲＶ、ＣＲＤ等の測定については、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２３２０，Ｃｈａｐｔｅｒ　１５が参照される。
　また、これらの測定方法については、実施例に記載の方法が参照される。
　ここで、配向度は、画面水平方向を０°としたとき、動きベクトルの角度を求め、ベクトル角度の最頻値の角度から±５°を示すベクトルの数と、検出されたベクトル数の総和の比を求めることで算出される。ライブセルイメージング装置から得られた配向度は、下記式で求められる。
　配向度（％）
　＝（最頻値の±５°の範囲に含まれるベクトルの数）／（ベクトルの総数）×１００
　本実施形態の培養細胞シートのライブセルイメージングを用いて測定される配向度は、好ましくは１０％以上、より好ましくは１２％以上、さらに好ましくは１６％以上、よりさらに好ましくは１８％以上、特に好ましくは２０％以上である。配向度の上限は特に限定されない。

　ライブセルイメージングにおいて、成人の心拍数は平均６０回／分であり、心拍数（ＢＲ）が６０回／分に近い方が正常の成熟化心筋細胞に近く、収縮速度（ＣＶ）が速い方が正常の成熟化心筋細胞に近く、弛緩速度（ＲＶ）が速い方が成熟化心筋細胞に近く、拍動時間（ＣＲＤ）が短い方が正常の成熟化心筋細胞に近い傾向にある。
　また、収縮速度（ＣＶ）と弛緩速度（ＲＶ）の比（ＣＶ／ＲＶ）は、小さい方が好ましい。本実施形態の培養細胞シートは、ＣＶ／ＲＶは、好ましくは２．８以下であり、より好ましくは２．６以下であり、そして、好ましくは１．０以上である。すなわち、ＣＶ／ＲＶは、以下の式（２）を満たすことが好ましい。
　　１．０≦ＣＶ／ＲＶ≦２．８　　　（２）

＜Ｃａ－イメージング解析＞
　心筋細胞では、心筋収縮に伴い、活動電位によって惹起された全細胞質のＣａ濃度がほぼ同時に上昇する、カルシウムトランジェントという現象が観察される。本実施形態の培養細胞シートを蛍光Ｃａ指示薬で処理し、共焦点定量イメージサイトメトリーで観察（Ｃａ－イメージング解析）することで、カルシウムトランジェントを経時的に観察することが可能である。カルシウムトランジェントのシグナル情報から、波形グラフを作成し、下記に記すパラメータを解析する方法としては、専用の解析ソフトを使用する。
　未熟な心筋細胞や病気により何らかの異常が現れた心筋細胞では、正常な成熟化心筋細胞に比べて、カルシウムトランジェントの波形ピークの２０％高さの線幅（Ｄｕｒａｔｉｏｎ）が延長する傾向がある。２０％高さの線幅（Ｄｕｒａｔｉｏｎ）は心拍数により変動するため、Ｄｕｒａｔｉｏｎ（秒）とＩｎｔｅｒｖａｌ（秒）の１／２乗との関係は、以下の式（３）を満たすことが好ましい。
　　Ｄｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２≧０．６８　　　（３）
　なお、カルシウムトランジェント持続時間を反映する２０％高さの線幅（Ｄｕｒａｔｉｏｎ）と、活動電位持続時間には相関があることが報告されている。心筋細胞では、成熟化が進むほど、活動電位持続時間は長い傾向にある。Ｉｎｔｅｒｖａｌは、心拍によって影響を受ける。通常、心電図の解析では、活動電位持続時間は心拍数で補正した値が使用されることに従い、式（３）のように、Ｄｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２を採用した。

　本実施形態において、培養細胞シートを構成する細胞が、２５℃溶液中でのパッチクランプ試験における活動電位８０％再分極持続時間が６００ｍｓｅｃ以上であり、かつ、最大拡張期電位が－６０ｍＶ以下であることが好ましい。
　パッチクランプ試験は、２５℃のＴｙｒｏｄｅ溶液中の心筋細胞をカレントクランプ下、０．２Ｈｚで、２０ｐＡ～１００ｐＡの電流を細胞内に投入して、活動電位を発生させて、電位の変化を測定する。なお、電流は、適切な活動電位を発生させることができる範囲で、適宜選択すればよい。
　なお、活動電位持続時間の指標として、活動電位８０％再分極持続時間を採用した。これは、電流を与えてから、第１相として示される活動電位のピークの高さと、最大拡張期電位との差を１００％とした場合に、８０％再分極に相当する電位となるまでに必要な時間である。すなわち、活動電位の立ち上がり時間から、活動電位が８０％再分極に相当する電位となるまでに必要な時間である。
　心筋細胞が成熟化すると、未成熟の心筋細胞に比べて、活動電位持続時間が長く、また、最大拡張期電位が深くなる傾向にある。
　本実施形態の培養細胞シートを構成する細胞の活動電位８０％再分極持続時間は、好ましくは６００ｍｓｅｃ以上、より好ましくは６５０ｍｓｅｃ以上、さらに好ましくは７００ｍｓｅｃ以上、よりさらに好ましくは７５０ｍｓｅｃ以上であり、そして、上限は特に限定されないが、生体内の心筋細胞と同程度の活動電位持続時間であることが好ましい観点から、好ましくは１２００ｍｓｅｃ以下、より好ましくは１０５０ｍｓｅｃ以下、さらに好ましくは９００ｍｓｅｃ以下である。
　また、本実施形態の培養細胞シートを構成する細胞の最大拡張期電位は、生体内の新規細胞により近い値であることが好ましい観点から、好ましくは－６０ｍＶ以下、より好ましくは－６２．５ｍＶ以下、さらに好ましくは－６５ｍＶ以下、よりさらに好ましくは－６７．５ｍＶ以下である。また、下限は特に限定されないが、成人の心室心筋細胞は約－８０ｍＶのため、－８０ｍＶに近い値であることが好ましい。
　なお、ヒト由来の正常単離心室筋細胞での活動電位持続時間および最大拡張期電位（静止膜電位）については、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１３；１２７：５７５－５８４が参照される。

＜酸素消費速度のβ酸化阻害剤による低下＞
　本実施形態において、培養細胞シートを構成する細胞が、培養液に含まれる酸素を使用する速度を測定する酸素消費速度測定において、脂肪酸のβ酸化活性を阻害するβ酸化阻害剤の添加により、酸素消費速度がβ酸化阻害剤の添加前と比較して２０％以下に減少することが好ましい。
　培養液に含まれる酸素は、細胞に取り込まれた後、ミトコンドリアの酸化的リン酸化によりＡＴＰが産出される経路で消費されるため、培養液の酸素消費速度（ＯＣＲ：Oxygen　Consumption　Rate）はミトコンドリア機能解析の指標とすることができる。ミトコンドリアにおける代謝は、主にグルコース、脂肪酸、グルタミンを使用する経路があり、それぞれの代謝に関与する酵素の阻害薬剤を添加することで、代謝経路を推測することが可能である。
　酸素消費量の測定は、市販の酸素消費速度プレートアッセイキット（同仁化学株式会社製）等を使用して測定することができる。
　成熟化した心筋細胞は、未成熟の心筋細胞よりも脂肪酸代謝への依存度が高い。
　本実施形態の培養細胞シートを構成する細胞が、培養液に含まれる酸素を使用する速度を測定する酸素消費速度測定において、脂肪酸のβ酸化活性を阻害するβ酸化阻害剤の添加による酸素消費速度が、β酸化阻害剤の添加前を１００％とした時に、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下である。

＜培養細胞シートの用途＞
　本実施形態の培養細胞シートは、種々の用途に使用することができ、例えば、再生医療用途に使用できる。培養細胞シートは、１層の細胞から形成された単層シートでもよく、また、２層以上の細胞から形成された複層シートであってもよい。
　具体的には、心筋梗塞、狭心症等の虚血性疾患により障害を受けた心臓（以下、「障害心臓」ともいう）の心筋組織の障害部位へ心臓組織の収縮と同じ方向になるように培養細胞シートを直接貼付、貼付後に縫合、挿入等の方法が例示できる。再生医療に使用する際、単層の細胞シートまたは複層の細胞シートを数枚重ね合わせて積層化した後に、再生医療に使用してもよい。なお、積層する場合には、配向方向を揃えて積層することが好ましく、具体的には、培養細胞シートの収縮の方向、または配向の方向を揃えて積層すればよい。
　また、本実施形態の培養細胞シートは、後述するように、評価対象である化合物または薬物を作用させることで、心筋細胞に対する化合物または薬物の作用を評価するために使用してもよい。

［培養細胞シートの製造方法］
　本実施形態の心筋細胞から構成される培養細胞シートの製造方法は、特定の細胞シート形成部材を用いて、心筋細胞を培養することを含み、細胞シート形成部材が、培養細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、複数の平坦部と複数の凹凸部とを備え、各平坦部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記複数の平坦部は前記表面の全体で前記第１方向と交差する第２方向に並び、各凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部の間を埋める複数の段差構造を含み、前記段差構造のピッチが１００ｎｍ以上１０μｍ以下であり、前記段差構造は、凸部であり、前記凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部に挟まれた凹部の底面に複数の前記凸部を備えており、細胞シート形成部材の厚み方向において、前記凹凸部における先端面の高さと、前記平坦部の高さとの差が０．５μｍ以下である。
　図１（ａ）が示すように、細胞シート形成部材１００は、例えば、シャーレの培養皿１１０に載置されるシート材である。シャーレは、培養皿１１０と蓋１２０とに囲まれた空間に細胞懸濁液を保持する。なお、シャーレの底部が、上記した、特定の平坦部と凹凸部とを有する表面形状に加工されていてもよく、その場合には、シャーレ自体が、細胞シート形成部材である。
　図１（ｂ）が示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、複数の平坦部１３０と、複数の凹凸部１４０とを備える。凹凸部１４０は、複数の段差構造から構成され、複数の段差構造は、相互に隣り合う平坦部１３０の間を埋める。段差構造は、凸部である。なお、凹凸部１４０は、相互に隣り合う平坦部１３０に挟まれた凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１４１とを備える。

　図１（ｃ）が示すように、各平坦部１３０は、１つの方向である第１方向（図１（ｃ）の上下方向）に延びる平坦面である。各平坦部１３０は、表面１１１の全体において、第１方向と直交する第２方向（図１（ｃ）の左右方向）に並ぶ。各凹凸部１４０もまた、第１方向に延び、かつ、表面１１１の全体において、第２方向に並ぶ。

　凹凸部１４０を構成する各凸部１４１は、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。各凹凸部１４０は、凸部１４１のこうした配列を、第１方向、および、第２方向に繰り返す。三角格子の各頂点に凸部１４１が位置する凹凸部１４０であれば、凸部１４１を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。

　表面１１１と対向する方向から見て、各凸部１４１は、例えば円形状を有する。相互に隣り合う凸部１４１の中心間の距離の最頻値は、凸部１４１のピッチである。また、凸部１４１の平面視形状における凸部の最大幅は、凸部１４１の直径である。

　凸部１４１のピッチが下記（Ａ）および（Ｂ）を満たす構成は、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃える観点において好適である。すなわち、凸部１４１のピッチが下記（Ａ）および（Ｂ）を満たす構成は、心筋細胞の接着に対する優劣が、平坦部１３０と凹凸部１４０との間で明確に区画される観点において好適である。
　（Ａ）凸部１４１のピッチ：１００ｎｍ以上１０μｍ以下
　（Ｂ）凸部１４１の直径：凸部１４１のピッチの５０％以上１００％以下

　各平坦部１３０の第２方向（短辺方向）での長さは、平坦部１３０の幅である。また、相互に隣り合う平坦部１３０間の第２方向（短辺方向）での長さは、凹凸部１４０の幅である。
　平坦部１３０の幅、および、凹凸部１４０の幅は、例えば、培養の対象となる細胞の大きさ（５μｍ以上１００μｍ以下）の１／１０倍以上１０倍以下である。平坦部１３０の幅、および、凹凸部１４０の幅が下記（Ｃ）および（Ｄ）を満たす構成は、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃えることを容易なものとする観点において好適である。
　（Ｃ）平坦部１３０の幅：１０μｍ以上５０μｍ以下
　（Ｄ）凹凸部１４０の幅：１０μｍ以上５０μｍ以下

　図１（ｄ）に示すように、凹凸部１４０は、相互に隣り合う凸部１４１、および、平坦部１３０とそれに隣接する凸部１４１との間に、凹部１４２を備えてもよい。複数の凸部１４１が凹凸部１４０に点在するため、凸部１４１間の空間である凹部１４２は、凹凸部１４０において、第１方向、および、第２方向に連なる。

　細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部１４２の底面と平坦部１３０との間の長さは、平坦部１３０の高さである。また、細胞シート形成部材１００の厚み方向において、各凸部１４１の先端面と平坦部１３０との間の高低差は、境界段差である。凹部１４２の底面と各凸部１４１の先端面の高低差は、凸部１４１の高さである。各凸部１４１の先端面と平坦部１３０とが面一である構成では、平坦部１３０の高さと、凸部１４１の高さとが、相互に等しい。凸部１４１の高さに対する凸部１４１のピッチの比は、凸部１４１のアスペクト比である。

　境界段差が下記（Ｅ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。凸部１４１の高さが下記（Ｆ）を満たす構成、また、凸部１４１のアスペクト比が下記（Ｇ）を満たす構成は、凹凸部１４０の構造上での安定性を高められる観点、また、凹凸部１４０の形成を容易なものとする観点において好適である。
　（Ｅ）境界段差：０．５μｍ以下、好ましくは０．３μｍ以下
　（Ｆ）凸部１４１の高さ：５０ｎｍ以上５μｍ以下
　（Ｇ）凸部１４１のアスペクト比：０．１以上１０以下

　そして、上記（Ａ）（Ｂ）を満たす構成であれば、平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞であれ、凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞であれ、一方の構造体に対して細胞が優先的に接着し、他方の構造体に対する接着の劣勢と相まって、双方の構造体の延在方向である第１方向に、細胞の伸長方向が揃えられる。結果として、表面１１１に沿った二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の伸長方向を一次元方向に揃えること、すなわち、細胞の配向性を向上させることが可能となる。

　また、上記（Ｅ）を満たす構成、特に、各凸部１４１の先端面と平坦部１３０とが面一である構成は、凹凸部１４０と平坦部１３０とを覆うように形成された細胞シートにおいて、それの平坦性を高めることを可能とする。さらに、上記（Ｆ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性をより一層に高めることが可能である。

　なお、細胞シート形成部材１００の表面１１１が、平坦部１３０と凹凸部１４０とを備えるため、平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞と、凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞との両方に、共通する細胞シート形成部材１００を適用することが可能ともなる。すなわち、細胞シート形成部材１００の汎用性を高めることも可能となる。

　また、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲル等の接着因子を含む有機物が塗布されてもよく、あるいは、金属から構成される面であってもよい。また、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞の接着性や細胞シートの平坦性を高めることを目的として、親水性、あるいは、疎水性を有してもよい。

　また、細胞シート形成後に細胞シートの剥離・回収を容易にするために、刺激応答性材料を塗布してもよい。刺激応答性材料としては、温度変化によって水親和性が変化する温度応答性ポリマーが好ましい。具体的にはポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）が好ましい。刺激応答性材料は慣用の塗布方法を用いて基材に塗布してもよいし、刺激応答性材料を処理した基材に下記に記載した方法を用いて構造を加工してもよい。

＜細胞シート形成部材の製造方法＞
　細胞シート形成部材の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ナノインプリント法を用いて、細胞シート形成部材の表面１１１を、凹版１５０の転写によって形成する例を説明する。
　図２が示すように、細胞シート形成部材の製造方法は、凹版１５０を形成する工程と、細胞シート形成部材１００の表面１１１を凹版１５０の転写によって形成する工程とを含む。

　凹版１５０の下面は、第１方向（紙面と直交する方向）に延びる形状を有し、かつ、第１方向と交差する第２方向（紙面の左右方向）に並ぶ複数の平坦部と、相互に隣り合う平坦部の間を埋める複数の段差構造から構成された凹凸部とを備える。凹版１５０の平坦部は、細胞シート形成部材１００の平坦部１３０を転写によって形成するための部分である。凹版１５０の凹凸部は、細胞シート形成部材１００の凹凸部１４０を転写によって形成するための部分である。

　凹版１５０の段差構造は、凸部、または、凹部である。なお、本実施形態における凹版１５０の段差構造は、凸部１４１を形成するための凹部１５１であり、凹部１５１のピッチは、１００ｎｍ以上１０μｍ以下である。凹版１５０を形成する工程では、例えば、凹版１５０を形成するためのシリコン基板に対する、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて、凹凸部が形成される。また、凹版１５０自体を原盤からの１回、あるいは複数回の転写によって得てもよい。原盤には、例えば、シリコン基板に対するフォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて凹版１５０の表面形状に対応する形状が作り込まれている。

　次に、細胞シート形成部材１００を形成するための基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を対向させる。基材１６０の形成材料は、例えば、熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂である。そして、基材１６０が流動性を有する状態で、基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を押し付ける。次いで、基材１６０の流動性を抑えた状態で、凹版１５０を基材１６０の表面１１１から離型する。これによって、基材１６０の表面１１１に凹版１５０の凹部１５１が転写され、平坦部１３０と凹凸部１４０とが形成される。

　基材１６０の形成材料の熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂の表面に、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲルなどの接着因子を含む有機物が塗布されていてもよい。また、基材１６０の形成材料として、多糖類やタンパク質などの生体材料を用いてもよい。

＜培養細胞シートの製造方法＞
　細胞シート形成部材１００を用いて製造される細胞シートについて説明する。
　上記（Ａ）を満たす細胞シート形成基材では、図３（ａ）が示すように、細胞シート形成部材１００に保持された細胞懸濁液の細胞が、平坦部１３０に対して優先的に接着する細胞Ｓ１であり、平坦部１３０よりも劣勢ではあるが、凹凸部１４０に対する接着を許容された細胞Ｓ２でもある。あるいは、細胞シート形成部材１００に保持された細胞懸濁液の細胞が、凹凸部１４０に対して優先的に接着する細胞Ｓ２であり、凹凸部１４０よりも劣勢ではあるが、平坦部１３０に対する接着を許容された細胞Ｓ１でもある。
　この場合、図３（ｂ）に示すように、平坦部１３０、および、凹凸部１４０は、第１方向に延び、第２方向に交互に配置される。そのため、細胞シート形成部材の表面１１１には、例えば、平坦部１３０に優先的に接着された細胞Ｓ１の配向性が、平坦部１３０の構造、および、それを区画する凹凸部１４０の構造によって制御される。
　そして、相互に隣り合う平坦部１３０に挟まれた凹凸部１４０においては、平坦部１３０よりも劣勢ではあるが、凹凸部１４０に接着した細胞Ｓ２にて、平坦部１３０による配向性の制御が反映される。結果として、図３（ｃ）が示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる培養細胞シートＳＡを形成する。

　あるいは、凹凸部１４０に優先的に接着された細胞Ｓ２の配向性が、凹凸部１４０の構造、および、それを区画する平坦部１３０の構造によって制御される。そして、相互に隣り合う凹凸部１４０に挟まれた平坦部１３０においては、凹凸部１４０よりも劣勢ではあるが、平坦部１３０に接着した細胞Ｓ１にて、凹凸部１４０による配向性の制御が反映される。結果として、図３（ｃ）が示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる培養細胞シートＳＡを形成する。

［化合物または薬物の評価方法］
　本実施形態の化合物または薬物の評価方法は、上述した培養細胞シートに対して、評価対象である化合物または薬物を作用させる。
　評価対象である化合物または薬物を培養細胞シートに作用させ、培養細胞シートの生理学的特性の変化および運動機能の変化から選択される少なくとも１つの変化を評価することにより、化合物または薬物を評価することが好ましい。生理学的特性の変化としては、上述したカルシウムトランジェントの観察におけるＢＲ、Ｄｕｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｖａｌ、カルシウムトランジェントのピーク高さ（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）等の変化が例示され、運動機能の変化としては、上述したライブセルイメージング観察によるＢＲ、ＣＶ、ＲＶ、ＣＲＤ、収縮時間（Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ　ｄｕｒａｔｉｏｎ）、弛緩時間（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｄｕｒａｔｉｏｎ）等の変化が例示される。
　評価を行う際の培養細胞シートの培養日数は特に限定されないが、１５日程度の培養日数の培養細胞シートを用いて評価を行うことが、心筋細胞の成熟度がより高いことから、好適である。

　評価対象とする化合物または薬物としては、特に限定されないが、心筋細胞に対しての作用を有することが知られている既知化合物またはその候補化合物であることが好ましく、例えば、ＩＮａ遮断薬、Ｉｋｒ遮断薬、Ｉｋｓ遮断薬、ＩＣａ遮断薬、５－ＨＴ４受容体作動薬、α受容体遮断薬、β受容体遮断薬、α受容体作動薬、β受容体作動薬、毒劇物、抗がん剤、脂質代謝阻害剤、ホスホジエステラーゼ３阻害剤、およびその他の生理活性物質（例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）からなる群より選択される少なくとも１つの既存化合物またはその候補化合物であることが好ましい。
　既存のＩＮａ遮断薬としては、Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ、Ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌが例示される。
　既存のＩｋｒ遮断薬としては、Ｅ－４０３１、Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ、Ｓｏｔａｒｏｌ、Ｃｉｓａｐｒｉｄｅ、Ｂｅｐｒｉｄｉｌが例示される。
　既存のＩｋｓ遮断薬としては、Ｂｅｐｒｉｄｉｌ、Ｃｈｒｏｍａｎｏｌが例示される。
　既存のβ遮断薬としては、Ｓｏｔａｒｏｌ、Ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ、Ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌが例示される。
　既存のα遮断薬としては、Ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌが例示される。
　既存のβ受容体作動薬としては、Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌが例示される。
　既存のホスホジエステラーゼ３阻害剤としては、Ｍｉｌｒｉｎｏｎｅが例示される。

［培養細胞シートの品質評価方法］
　本実施形態の培養細胞シートの品質評価方法によれば、心筋細胞から構成される培養細胞シートが、成熟化が進み、再生医療用の培養細胞シートや、化合物または薬物の評価方法に好適に使用できる培養細胞シートであるのかについての品質評価方法が提供される。また、培養細胞シートの製造方法において、一工程として、上記品質評価方法を有することにより、より品質に優れた培養細胞シートが提供される。すなわち、本実施形態において、培養細胞シートの製造方法の一工程として、上記品質評価方法を組み入れることも好ましい。
　下記（ｉ）～（xii）の少なくとも１つを満たすことが好ましく、少なくとも（ｉ）と（ii）～（xii）の少なくとも１つとを満たすことがより好ましく、（ｉ）～（xii）の全ても満たすことがさらに好ましい。
　（ｉ）　前記培養細胞シートに対して、抗α－アクチニン抗体を使用して免疫染色を行い顕微鏡観察で得られる画像において画面水平方向を０°とした際、測定範囲（７１．６μｍ×７１．６μｍ）内にあるα－アクチニン抗体で検出される棒状構造体の長手方向の角度を計測し、その最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の頻度を、下記式（１）により求める配向度が２３％以上である。
　配向度（％）＝（最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の数）／（棒状構造体の総数）×１００　（１）
　（ii）　ライブセルイメージングにおいて、動きベクトルの最頻値の角度から±５°の角度を示すベクトルの数（配向度）が１２％以上である。
　（iii）　以下の要件Ａ１および要件Ａ２の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ａ１：ＭＹＬ３（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　３）遺伝子の発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＭＹＬ３／ＡＣＴＢ）が１２．０以上である。培養７日目以降においてＭＹＬ３／ＡＣＴＢが１２．０以上であることが好ましい。
　要件Ａ２：ＭＹＨ７（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　７）遺伝子の発現量と、ＭＹＨ６（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　６）遺伝子の発現量との比（ＭＹＨ７／ＭＹＨ６）が６．０以上である。培養７日目以降において、ＭＹＨ７／ＭＹＨ６が６．０以上であることが好ましい。
　（iv）　以下の要件Ｂ１および要件Ｂ２の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｂ１：ＣＫＭ（Ｃｒｅａｔｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ，Ｍ－ｔｙｐｅ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＣＫＭ／ＡＣＴＢ）が、１．８０以上である。培養１５日目～４５日目において、ＣＫＭ／ＡＣＴＢが１．８０以上であることが好ましい。
　要件Ｂ２：ＬＤＨＡ（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢの遺伝子発現量との比（ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢ）が０．８０以上である。培養７日目以降において、ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢが０．８０以上であることが好ましく、１．２以上であることがより好ましい。
　（ｖ）　以下の要件Ｃ１～要件Ｃ４の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｃ１：ＣＡＣＮＡ２Ｄ１（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｕｘｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ２ｄｅｌｔａ１）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．０８５以上である。
　要件Ｃ２：ＫＣＮＪ２（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｉｎｗａｒｄｌｙ　Ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｊ　Ｍｅｍｂｅｒ２）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＫＣＮＪ２／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．０３８以上である。
　要件Ｃ３：ＫＣＮＥ１（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　１）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＫＣＮＥ１／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．００３以上である。
　要件Ｃ４：ＳＣＮ５Ａ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｌｐｈａ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　５）の遺伝子発現量と、ＡＴＰ１Ａ１（ＡＴＰａｓｅ　Ｎａ＋／Ｋ＋　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ　１）の遺伝子発現量との比（ＳＣＮ５Ａ／ＡＴＰ１Ａ１）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．８７以上である。
　（vi）　以下の要件Ｄ１～要件Ｄ４の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｄ１：ＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｐａｓｅ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＬＰＬ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～４５日目のいずれかの日において０．４５以上である。
　要件Ｄ２：ＡＣＡＴ１（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＡＣＡＴ１／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．４３以上である。
　要件Ｄ３：ＨＡＤＨＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＨＡＤＨＡ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．７５以上である。
　要件Ｄ４：ＨＡＤＨＢ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＨＡＤＨＢ／ＡＣＴＢ）が、培養１５日目～３０日目のいずれかの日において０．９５以上である。
　（vii）　以下の要件Ｅ１～要件Ｅ８の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｅ１：ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｇａｍｍａ）　Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．８０以上である。
　要件Ｅ２：ＥＳＲＲＡ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＳＲＲＡ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．５５以上である。
　要件Ｅ３：ＶＥＧＦＡ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＶＥＧＦＡ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．６５以上である。
　要件Ｅ４：ＡＰＬＮ（Ａｐｅｌｉｎ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＡＰＬＮ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．００５以上である。
　要件Ｅ５：ＦＡＢＰ３（Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＦＡＢＰ３／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において５．０以上である。
　要件Ｅ６：ＥＳＭ１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＳＭ１／ＨＩＦ１Ａ）が、培養のいずれかの日において０．００２以上である。
　要件Ｅ７：ＥＭＣＮ（Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＥＭＣＮ／ＨＩＦ１Ａ）が、培養の７日目以降のいずれかの日において０．００２以上である。
　要件Ｅ８：ＢＣＬ２（ＢＣＬ２　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の遺伝子発現量と、ＨＩＦ１Ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）の遺伝子発現量との比（ＢＣＬ２／ＨＩＦ１Ａ）が、培養７日目以降のいずれかの日において０．０１３以上である。
　（viii）　細胞１個あたりのミトコンドリアの面積が２００μｍ^２以上である。
　（ix）　ライブセルイメージングにおいて検出された収縮速度をＣＶ（ｍ／ｓｅｃ）とし、弛緩速度をＲＶ（ｍ／ｓｅｃ）としたとき、下記式（２）を満たす。
　　１．０≦ＣＶ／ＲＶ≦２．８　　　　　（２）
　（ｘ）　カルシウムイメージング解析において、カルシウムトランジェントの波形ピーク高さを１００％としたとき、２０％の高さの波形幅をＤｕｒａｔｉｏｎ（秒）とし、ピーク間の間隔をＩｎｔｅｒｖａｌ（秒）としたとき、下記式（３）を満たす。
　　Ｄｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２≧０．６８　　　（３）
　（xi）　培養細胞シートを構成する細胞が、２５℃溶液中でのパッチクランプ試験における活動電位８０％再分極持続時間が６００ｍｓｅｃ以上であり、かつ、最大拡張期電位が－６０ｍＶ以下である。
　（xii）　細胞が培養液に含まれる酸素を使用する速度を測定する酸素消費速度測定において、脂肪酸のβ酸化活性を阻害するβ酸化阻害剤の添加により、酸素消費速度がβ酸化阻害剤の添加前と比較して、２０％以下に減少する。

　以下に、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（１）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞の培養－１（ＣＭ１）
　ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞として、ｉＣｅｌｌ心筋細胞（ｉＣｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　ｖ１．０、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）（以下ＣＭ１）を使用した。培養は以下の手順で実施した。
　凍結細胞サンプルは、３７℃のウォーターバスで３分間加温し、溶解した。細胞液は、５０ｍＬ遠沈管に移し、あらかじめ３７℃に加温したｐｌａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（ｉＣｅｌｌ　心筋細胞　解凍用培地、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）を９ｍＬ加えて混合し、細胞液を希釈した。
　希釈した細胞懸濁液を一部採取し、等量のトリパンブルーと混合し、血球計算盤を使用して生細胞数を測定した。細胞はｐｌａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍを使用して１×１０^６ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ（＝５×１０^５／ｍＬ）に濃度調整して２ｍＬずつあらかじめゼラチンでコーティングした６ウェルプレートに播種した。
　培養容器のゼラチンコーティングは、滅菌済みの０．１％ゼラチン溶液を容器に加え（２ｍＬ／ウェル）、３７℃で一時間静置した。使用前にゼラチン溶液を除去して細胞を播種した。
　播種後の細胞は、３７℃のＣＯ_２インキュベーターに静置し、播種当日を０日として、培養３日目に培地交換を行った。
　培養５日目に再播種を行うため、細胞をトリプシンで剥がして回収した。回収した細胞懸濁液を一部採取し、等量のトリパンブルーと混合し、生細胞数を測定した。細胞はｐｌａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍを使用して濃度調整し、８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルの濃度で、０．１ｍＬずつ、あらかじめフィブロネクチン０．０５ｍｇ／ｍＬを４０μＬ加えて２時間以上コーティングした９６ウェルプレートに播種した。９６ウェルプレートは、ＮＤ　Ｃｅｌｌ　Ａｌｉｇｎｅｒ（配向性プレート、９６ウェルプレートタイプ）、対照として、培養面が平坦形状の市販９６ウェルプレート（平面プレート）を使用した。
　播種後の細胞は、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで４時間静置し２日毎に、Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ｉＣｅｌｌ　心筋細胞　維持用培地、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）を使用して培地交換を行い、所定期間、維持培養を行った。

（２）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞の培養－２（ＣＭ２）
　ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞として、ｉＣｅｌｌ心筋細胞（ｉＣｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　ｖ２．０、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）（以下ＣＭ２）を使用した。培養は以下の手順で実施した。
　凍結細胞サンプルは、３７℃のウォーターバスで３分間加温し、溶解した。細胞液は、５０ｍＬ遠沈管に移し、あらかじめ３７℃に加温したｐｌａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍを９ｍＬ加えて混合し、細胞液を希釈した。希釈した細胞懸濁液を一部採取し、等量のトリパンブルーと混合し、血球計算盤を使用して生細胞数を測定した。
　細胞濃度をｐｌａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍを使用して調整し、６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で、あらかじめフィブロネクチンコーティングした９６ウェルプレートに播種した。９６ウェルプレートは、ＮＤ　Ｃｅｌｌ　Ａｌｉｇｎｅｒ（配向性プレート、９６ウェルプレートタイプ）、対照として、培養面が平坦形状の市販９６ウェルプレート（平面プレート）に播種した。
　３７℃のＣＯ_２インキュベーターで４時間静置した後、Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍを使用して培地交換を行った。培地交換後の細胞は、２日毎に培地交換を行い、所定期間、維持培養を行った。

　上記（１）および（２）で使用したＮＤ　Ｃｅｌｌ　Ａｌｉｇｎｅｒは、平坦部および凹凸部を有し、各平坦部は、第１方向に伸びる形状を有し、かつ、表面における全体で、第１方向と交差する第２方向に並び、各平坦部の幅（第２方向での長さ）は１０μｍであった。各凹凸部は、相互に隣り合う平坦部の間を埋める複数の段差構造から構成され、各平坦部間の第２方向での長さは１０μｍであり、凹凸部における凸部のピッチは３００ｎｍであった。凹凸部における各凸部の高さをＡＦＭを用いて測定した結果、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は４４６ｎｍであった。また、凹部の底面から平坦部の高さの平均は４５５ｎｍであった。

（３）配向性の解析
　維持培養したｉＣｅｌｌ心筋細胞ＣＭ２を使用し、１５日目、３０日目、４５日目、６０日目の細胞を、抗α－アクチニン抗体でサルコメア構造を免疫染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を使用して核を染色した。蛍光顕微鏡を使用し、蛍光画像を取得した。
　免疫染色は、次の手順で実施した。所定日数培養したウェルプレートから培地を除き、ＰＢＳで細胞を洗浄した。次に、４％－パラホルムアルデヒドを加えて固定した。ＰＢＳＴ（０．１％　ｔｗｅｅｎ２０）で細胞を洗浄後に、一次抗体として抗α－アクチニン抗体（ａｂｃａｍ社製、Ａｎｔｉ－Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　Ａｌｐｈａ　Ａｃｔｉｎｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　［ＥＡ－５３］）を加え、一晩、４℃で反応させた。ＰＢＳＴ（０．１％　ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄して一次抗体を除去後、二次抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識、ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）　６４７　Ｆ｛ａｂ｝_２　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を加えて反応させた。続いて、希釈したＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を添加して、核を染色した。
　蛍光画像の取得は６０倍（対物レンズ）で行い、サルコメアは励起波長６４０ｎｍ／蛍光波長６８５ｎｍ、核は励起波長４０５ｎｍ／蛍光波長４６１ｎｍで検出した。
　６０倍の対物レンズで観察した画像（サイズ：２１５μｍ×２１５μｍの面積）から画像解析ソフトウェア（Ａ像くん、旭化成エンジニアリング株式会社製）の角度分布解析を使用して、α－アクチニンで検出された棒状構造体を検出し、画像の水平方向を０°として、棒状構造体の角度分布（０～１８０°）を求めた。
　角度分布の最頻値の角度の±１５°の範囲に含まれる棒状構造体の数と測定範囲に含まれる棒状構造体の総数から、配向度を次の式で求めた。
　配向度（％）＝（最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の数）／（棒状構造体の総数）×１００
　画像解析はｎ＝３～６で実施し、平均値を求めた。培養日数１５日目と３０日目は異なる複数のウェルから取得した画像（９等分した区画のうち、左上の区画）を用いて解析を実施した。培養日数４５日目と６０日目は１個のウェルから取得した画像を９等分し、３区画（左上、中央、右下の区画）を用いて解析を実施した。
　角度分布解析の結果は、１０°毎に含まれる棒状構造体の配向度として示し、配向プレートと平面プレートの最高値を含む±１５°の範囲の配向度を比較した。統計検定は、配向プレートと平面プレートの配向度に対して、Ｔ－ｔｅｓｔを行い、培養３０日以降、配向プレートと平面プレートの配向度において、危険率５％で有意差があることを確認した。
　配向度の測定結果、培養１５日目以降において、配向プレートで培養したＣＭ２の配向度は、平面プレートで培養したＣＭ２より高かった。培養日数３０日目から６０日目において、配向プレートの配向度は２３％以上であった。一方、平面プレートの配向度は２１％未満であった。結果を図４に示す。

（４）成熟化確認試験（遺伝子発現）
　配向性プレートと平面プレートで培養したｉＣｅｌｌ心筋細胞（ＣＭ１）の培養日数１、７、１５、３０、４５日目における細胞を採取し、遺伝子発現解析を行った。
　採取した細胞は、破砕してＲＮＡを抽出し（タカラバイオ株式会社製、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　Ｐｌｕｓ　ＸＳを使用）、逆転写とライブラリ作成はＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ　ｖ４　Ｌｏｗ　Ｉｎｐｕｔ　Ｋｉｔを使用した。次に、ＲＮＡシーケンス（網羅的遺伝子発現解析）に供し、遺伝子発現データを得た。解析プログラムとしてＲａＮＡ－ｓｅｑを使用した（参考文献３：Bioinformatics,　2020　Mar　10:　36(6),　1955-1956）。ヒトｉＰＳ細胞由来心筋の成熟段階における特徴的な遺伝子発現変化（参考文献４：Circ.　Res.　2020　Apr　10:　126(8),　1086-1106）を評価指標として、配向性プレートと平面プレートで培養した心筋細胞の遺伝子発現量の経時的変化の比較を行った。
　下記（４－１）～（４－３）については、ＲＮＡシーケンスに使用したサンプルは、５ウェルから抽出したＲＮＡを（ＲＮＡの質量で）等量混合して、実験に用いた。ＲＮＡシーケンスによる遺伝子発現解析の結果は、５ウェルの平均値と考えられる。
　また、下記（４－４）～（４－６）については、ＲＮＡシーケンスに使用したサンプルは、３ウェルから抽出したＲＮＡについて、それぞれＲＮＡシーケンスを行い、発現量（ＣＰＭ）の平均値を求めた。各遺伝子の発現量（ＣＰＭ）は各培養日数において、平面プレートと配向プレートにおける遺伝子発現量の差を検出するためＴ検定を行い、Ｐ値が０．０１≦Ｐ＜０．０５の場合は図中に＊を記し、Ｐ値がＰ＜０．０１の場合は、図中に＊＊を記した。
　ＲＮＡシーケンスによる遺伝子発現解析の結果、次のような結果が得られた。

（４－１）ＭＹＬ３／ＡＣＴＢ
　配向性プレートで培養したＣＭ１は、平面プレートで培養したＣＭ１と比較して、成熟型心筋で発現する、ＭＹＬ３（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　３）の遺伝子発現量が増加した。一方で、組織や培養期間に関わらず一定量の発現が想定される、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ－β）遺伝子の発現量は配向性プレートで培養したＣＭ１と平面プレートで培養したＣＭ１とで同等レベルであった。
　各プレートにおいて、培養７日目以降における、ＭＹＬ３遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートでは１２．５以上、平面プレートは１１．４以下であった（図５）。

（４－２）ＭＹＨ７／ＭＹＨ６
　胎児型心筋から成人型心筋への成熟に伴うアイソフォームの変化として、ＭＹＨ６（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　６）からＭＹＨ７（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　７）へのアイソフォームスイッチングが顕著であることが確認された。各プレートにおいて、培養７日目以降における、ＭＹＨ７遺伝子の発現量／ＭＹＨ６遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では７．１以上、平面プレートで培養したＣＭ１は５．４以下であった（図６）。

（４－３）ＣＫＭ、ＣＫＭ／ＡＣＴＢ、ＣＯＸ６Ａ２、ＣＯＸ６Ａ２／ＡＣＴＢ、ＣＫＭＴ２、ＣＫＭＴ２／ＡＣＴＢ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢ
　配向性プレートで培養したＣＭ１は、平面プレートで培養したＣＭ１と比較して、心筋の収縮に関連するＣＫＭ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ，　Ｍ－ｔｙｐｅ）、ミトコンドリアに局在するタンパク質のＣＯＸ６Ａ２（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　Ｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　６Ａ２）、ＣＫＭＴ２（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ，　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　２）、解糖系の酵素であるＬＤＨＡ（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）の発現量が経時的に増加した（図７－１、図７－２）。

　ＣＫＭ遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では１１６１ＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　Ｍｉｌｌｉｏｎ）以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では８２４ＴＰＭ以下であった（図７－１（Ａ））。
　ＣＯＸ６Ａ２遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向プレートで培養したＣＭ１では８７５ＴＰＭ以上、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では８４２ＴＰＭ以下であった（図７－１（Ｂ））。
　ＣＭＫＴ２遺伝子の発現量は、培養３０日目以降において、配向プレートで培養したＣＭ１では３７７ＴＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では３２５ＴＰＭ以下であった（図７－１（Ｃ））。
　また、ＬＤＨＡ遺伝子の発現量は、培養７日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では６８２ＴＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では３７２ＴＰＭ以下であった（図７－１（Ｄ））。

　各プレートにおいて、培養１５日目以降における、ＣＫＭ遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では２．１以上、平面プレートで培養したＣＭ１では１．７以下であった（図７－２（Ａ））。
　培養１５日目以降における、ＣＯＸ６Ａ２遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では１．９５以上、平面プレートで培養したＣＭ１では１．９２以下であった（図７－２（Ｂ））。
　また、培養１５日目～３０日目における、ＣＫＭＴ２遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．６８以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．５７以下であった（図７－２（Ｃ））。
　さらに、培養７日目以降における、ＬＤＨＡ遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では１．３以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．６以下であった（図７－２（Ｄ））。

（４－４）ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１／ＡＴＰ１Ａ１、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ２／ＡＴＰ１Ａ１、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ１／ＡＴＰ１Ａ１、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ５Ａ／ＡＴＰ１Ａ１
　配向性プレートで培養したＣＭ１は、平面プレートで培養したＣＭ１と比較して、心筋のカルシウムイオンチャネル形成に関連するＣＡＣＮＡ２Ｄ１（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｕｘｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ２ｄｅｌｔａ１）、心筋のカリウムイオンチャネル形成に関連するＫＣＮＪ２（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｉｎｗａｒｄｌｙ　Ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｊ　Ｍｅｍｂｅｒ２）、ＫＣＮＥ１（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　１）、心筋のナトリウムイオンチャネル形成に関連するＳＣＮ５Ａ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｖｏｌｔａｇｅ－Ｇａｔｅｄ　Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｌｐｈａ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　５）の発現量が経時的に増加した（図７－３、図７－４）。

　ＣＡＣＮＡ２Ｄ１遺伝子の発現量は、培養１５日目～３０日目において、配向性プレートで培養したＣＭ１では２４６９ＣＰＭ（ｃｏｕｎｔ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ）以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では２００４ＣＰＭ以下であった（図７－３（Ａ））。
　ＫＣＮＪ２遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向プレートで培養したＣＭ１では１０２６ＣＰＭ以上、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では９２６ＣＰＭ以下であった（図７－３（Ｂ））。
　ＫＣＮＥ１遺伝子の発現量は、培養１５日目～４５日目において、配向プレートで培養したＣＭ１では７９ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では４２ＣＰＭ以下であった（図７－３（Ｃ））。
　また、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の発現量は、培養１５日目～４５日目において、配向性プレートで培養したＣＭ１では２３５８０ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では２１５７１ＣＰＭ以下であった（図７－３（Ｄ））。

　各プレートにおいて、培養１５日目～３０日目における、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１遺伝子の発現量／ＡＴＰ１Ａ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．０８５以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．２３以下であった（図７－４（Ａ））。
　培養１５日目～３０日目における、ＫＣＮＪ２遺伝子の発現量／ＡＴＰ１Ａ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．０３８以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．１１５以下であった（図７－４（Ｂ））。
　また、培養１５日目以降における、ＫＣＮＥ１遺伝子の発現量／ＡＴＰ１Ａ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．００３以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．００７以下であった（図７－４（Ｃ））。
　さらに、培養１５日目～３０日目における、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の発現量／ＡＴＰ１Ａ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．８７以上、平面プレートで培養したＣＭ１では２．６以下であった（図７－４（Ｄ））。

（４－５）ＬＰＬ、ＬＰＬ／ＡＣＴＢ、ＡＣＡＴ１、ＡＣＡＴ１／ＡＣＴＢ、ＨＡＤＨＡ、ＨＡＤＨＡ／ＡＣＴＢ、ＨＡＤＨＢ、ＨＡＤＨＢ／ＡＣＴＢ
　配向性プレートで培養したＣＭ１は、平面プレートで培養したＣＭ１と比較して、心筋のミトコンドリアに局在し、脂肪酸のβ酸化に関連するＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｐａｓｅ）、ＡＣＡＴ１（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１）、ＨＡＤＨＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａｌｐｈａ）、ＨＡＤＨＢ（Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｂｅｔａ）の発現量が経時的に増加した（図７－５、図７－６）。

　ＬＰＬ遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では３８３２ＣＰＭ（ｃｏｕｎｔ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ）以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では３０２４ＣＰＭ以下であった（図７－５（Ａ））。
　ＡＣＡＴ１遺伝子の発現量は、培養３０日目～４５日目において、配向プレートで培養したＣＭ１では３６６３ＣＰＭ以上、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では３３５７ＣＰＭ以下であった（図７－５（Ｂ））。
　ＨＡＤＨＡ遺伝子の発現量は、培養３０日目～４５日目において、配向プレートで培養したＣＭ１では６２４０ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では５９２０ＣＰＭ以下であった（図７－５（Ｃ））。
　また、ＨＡＤＨＢ遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では８５０５ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では８０７２ＣＰＭ以下であった（図７－５（Ｄ））。

　各プレートにおいて、培養１５日目以降における、ＬＰＬ遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．４６以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．４３以下であった（図７－６（Ａ））。
　培養１５日目～３０日目における、ＡＣＡＴ１遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．４７以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．４２以下であった（図７－６（Ｂ））。
　また、培養１５日目～３０日目における、ＨＡＤＨＡ遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．７９以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．７４以下であった（図７－６（Ｃ））。
　さらに、培養１５日目～３０日目における、ＨＡＤＨＢ遺伝子の発現量／ＡＣＴＢ遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では１．００以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．９１以下であった（図７－６（Ｄ））。

（４－６）ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ／ＨＩＦ１、ＥＳＲＲＡ、ＥＳＲＲＡ／ＨＩＦ１、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡ／ＨＩＦ１、ＡＰＬＮ、ＡＰＬＮ／ＨＩＦ１、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ３／ＨＩＦ１、ＥＳＭ１、ＥＳＭ１／ＨＩＦ１、ＥＭＣＮ、ＥＭＣＮ／ＨＩＦ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２／ＡＣＴＢ
　配向性プレートで培養したＣＭ１は、平面プレートで培養したＣＭ１と比較して、ミトコンドリア生合成と機能化に関するＰＧＣ－１αをコードするＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子（ＰＰＡＲＧ　Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　１　Ａｌｐｈａ）、心筋細胞の成熟化に関連するエストロゲン関連受容体ＥＲＲをコードするＥＳＲＲＡ遺伝子（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｌｐｈａ）、血管増殖因子をコードするＶＥＧＦＡ遺伝子（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａ）、心筋組織で心臓の収縮に関連するマイオカインをコードするＡＰＬＮ遺伝子（Ａｐｅｌｉｎ）、心筋において長鎖脂肪酸の取込を制御するマイオカインをコードするＦＡＢＰ３遺伝子（Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３）、内皮細胞特異的に発現するＥＳＭ１遺伝子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）、上皮細胞などから分泌されるムチン様糖タンパク質をコードするＥＭＣＮ遺伝子（Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）、ミトコンドリアの機能調整に関連するＢＣＬ２遺伝子（ＢＣＬ２　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の発現量が経時的に増加した（図７－７～図７－１０）。

　ＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では４５７７ＣＰＭ（ｃｏｕｎｔ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ）以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では４２８２ＣＰＭ以下であった（図７－７（Ａ））。
　ＥＳＲＲＡ遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向プレートで培養したＣＭ１では３０８１ＣＰＭ以上、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では３０６１ＣＰＭ以下であった（図７－７（Ｂ））。
　ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現量は、培養７日目以降において、配向プレートで培養したＣＭ１では３７３７ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では３２３７ＣＰＭ以下であった（図７－７（Ｃ））。
　また、ＡＰＬＮ遺伝子の発現量は、培養７日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では２８．７ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では２０．７ＣＰＭ以下であった（図７－７（Ｄ））。
　ＦＡＢＰ３遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では２８７８８ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では２８５２９ＣＰＭ以下であった（図７－９（Ａ））。
　ＥＳＭ１遺伝子の発現量は、培養３０日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では４０ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では１．３ＣＰＭ以下であった（図７－９（Ｂ））。
　ＥＭＣＮ遺伝子の発現量は、培養１５日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では２４．６ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では１ＣＰＭ以下であった（図７－９（Ｃ））。
　ＢＣＬ２遺伝子の発現量は、培養７日目以降において、配向性プレートで培養したＣＭ１では８３．３ＣＰＭ以上であり、一方、平面プレートで培養したＣＭ１では５８．３ＣＰＭ以下であった（図７－９（Ｄ））。

　各プレートにおいて、培養７日目以降における、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現量／ＨＩＦ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．８６以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．８０以下であった（図７－８（Ａ））。
　培養７日目以降における、ＥＳＲＲＡ遺伝子の発現量／ＨＩＦ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．５７以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．５４以下であった（図７－８（Ｂ））。
　また、培養７日目以降における、ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現量／ＨＩＦ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．７１以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．６４以下であった（図７－８（Ｃ））。
　さらに、培養７日目以降における、ＡＰＬＮ遺伝子の発現量／ＨＩＦ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．０１３以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．００４以下であった（図７－８（Ｄ））。
　さらに、培養７日目以降における、ＦＡＢＰ３遺伝子の発現量／ＨＩＦ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では５．３以上、平面プレートで培養したＣＭ１では５．２以下であった（図７－１０（Ａ））。
　さらに、培養７日目以降における、ＥＳＭ１遺伝子の発現量／ＨＩＦ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．００１以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．０００３以下であった（図７－１０（Ｂ））。
さらに、培養７日目以降における、ＥＭＣＮ遺伝子の発現量／ＨＩＦ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．００３以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．００１以下であった（図７－１０（Ｃ））。
　さらに、培養７日目～３０日目における、ＢＣＬ２遺伝子の発現量／ＨＩＦ１遺伝子の発現量の比は、配向性プレートで培養したＣＭ１では０．０１８以上、平面プレートで培養したＣＭ１では０．０１２以下であった（図７－１０（Ｄ））。

（５）成熟化確認試験　ミトコンドリア活性の確認
　維持培養したｉＣｅｌｌ心筋細胞ＣＭ２を使用し、９日目の細胞を、膜電位依存性蛍光色素のＭｉｔｏ－ｔｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、Ｍ７５１０）でミトコンドリア、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を使用して核を染色した。染色は、ウェルプレートから培地を除去し、維持培地で所定濃度に希釈したＭｉｔｏ－ｔｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄを加え、３０分間３７℃のＣＯ_２インキュベーターに静置した後、維持培地で所定濃度に希釈したＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を加え、３０分間３７℃のＣＯ_２インキュベーターに静置して行った。観察前に培地で洗浄し、共焦点蛍光顕微鏡（共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１、横河電機株式会社製）を使用し、蛍光画像を取得した。
　画像の取得は、倍率６０倍（対物レンズ）で行い、ミトコンドリアは励起波長５６１ｎｍ／蛍光波長６１７ｎｍ、核は励起波長４０５ｎｍ／蛍光波長４６１ｎｍで検出した。
　画像の解析は、解析ソフトウェア（ＣｅｌｌＰａｔｈｆｉｎｄｅｒセルパスファインダー、横河電機株式会社製）を使用した。対物レンズの倍率６０倍で観察した視野の測定範囲（サイズ：２１５μｍ×２１５μｍの面積）から蛍光波長６１７ｎｍで検出された面積と強度を測定し、蛍光波長４６１ｎｍで検出された核数を測定した。
　なお、蛍光波長６１７ｎｍの検出値は、ＣＱ１のカメラのディテクターが検出した値であり、面積（Ａｒｅａ）は蛍光波長６１７ｎｍが検出された面積の総和（単位：μｍ^２）、輝度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）はディテクターが検出した明るさの値の総和である。輝度（明るさ）はフルスケールで、同一条件で測定した。
　解析はｎ＝６～１０で実施した。面積（Ａｒｅａ）と輝度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は核数で補正し、細胞１個あたりの面積（Ａｒｅａ）と輝度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を比較した。統計検定は、Ｔ－ｔｅｓｔを行い、危険率１％で有意差があることを確認した。
　なお、面積（Ａｒｅａ）は、ミトコンドリアの数を表し、輝度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、ミトコンドリアの活性を表している。結果を図８に示す。エラーバーは標準誤差を示す。
　図８に示すように、培養９日目において、配向プレートで培養したＣＭ２では、ミトコンドリア数、ミトコンドリア活性が平面プレートで培養したＣＭ２より有意に上昇した。
　また、図９に、培養９日目の配向プレートで培養したＣＭ２と、培養９日目の平面プレートで培養したＣＭ２の蛍光画像を示す。青は核を示し、赤はミトコンドリアを示す。配向プレートで培養したＣＭ２では、ミトコンドリア数およびミトコンドリア活性が上昇していることが、写真からも明らかである。

（６）成熟化確認試験　ライブセルイメージング装置を使用した動き試験法による解析
　各培養プレートに播種した心筋細胞の収縮・弛緩に伴う動き変化を検出するため、ＳＩ８０００（ソニー株式会社製）にて動画データを取得した。測定条件は、位相差像、倍率１０倍（対物レンズ）、１５０フレーム／秒、解像度２０４８×２０４８ピクセル、８ビット深度で行った。画像取得時間は、１０秒で行った。細胞は、播種当日を０日目とし、１５日目、３１日目、４５日目、６１日目まで維持培養したＣＭ２を使用した。
　動画データから、心筋細胞の収縮・弛緩に伴う動きベクトル（速度、方向、数量）を検出し、各パラメータ（心拍数（ｂｅａｔｉｎｇ　ｒａｔｅ；ＢＲ）、収縮速度（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ；ＣＶ）、弛緩速度（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ；ＲＶ）、心拍時間（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｄｕｒａｔｉｏｎ；ＣＲＤ）、配向度）を解析した。

　配向度は、画面水平方向を０℃とした場合の、動きベクトルの角度を求め、ベクトル角度の最頻値の角度から±５°の角度を示すベクトルの数と、検出されたベクトル数の総和の比を求めることで、下記式に基づき算出した。
　配向度（％）
　＝（最頻値の±５°範囲に含まれるベクトルの数）／（ベクトルの総数）×１００
　図１０に、動きベクトルの角度と、その頻度の測定結果の一例を示した。
　細胞を各培養プレートに播種し、維持培養したＣＭ２の結果を図１１－１に示す。
　配向性プレートで培養したＣＭ２は、平面プレートで培養したＣＭ２と比較して、培養１５日目から６１日目において、心拍数（ＢＲ）、弛緩速度（ＲＶ）が有意に上昇し、培養３１日目以降は、心拍時間（ＣＲＤ）が短縮する傾向が確認された。細胞の配向度を示すベクトル方向分布度（最頻値の±５°）は、培養１５日目から６１日目において、有意に高く維持された。
　なお、心拍数（ＢＲ）が多いほど、成熟心筋細胞に近く、収縮速度（ＣＶ）および弛緩速度（ＲＶ）が速いほど、成熟心筋細胞に近く、拍動時間（ＣＲＤ）が少ないほど、成熟心筋細胞に近い傾向にある。
　この時の、収縮速度（ＣＶ）と弛緩速度（ＲＶ）との比を図１１－２に示す。配向プレートで培養したＣＭ２において、培養１５日目から培養４５日目の期間で、収縮速度（ＣＶ）と弛緩速度（ＲＶ）の比（ＣＶ／ＲＶ）は、１．８～２．５であった。一方、平面プレートで培養したＣＭ２では、３．１～３．５であった。
　以上の結果から、配向プレートで培養したＣＭ２において収縮速度（ＣＶ）と弛緩速度（ＲＶ）との比（ＣＶ／ＲＶ）は次の範囲に含まれる。
　（式）　１．０≦ＣＶ／ＲＶ≦２．８

　なお、ベクトル方向分布度について、１５日目における最頻値±１．２５°、±５°、±１０°における配向度を表１に示す。最頻値±１．２５°では、配向プレート／平面プレートの比は最も高いが、理論値に対する平面プレートの比が最も高く、解析対象の配向角が小さい場合は、ノイズの影響が大きくなると考えられた。最頻値±５°と±１０°の比較では、理論値に対する平面プレートの比は±５°＞±１０°であるが、配向プレート／平面プレートの比は、±５°＞±１０°であるため、配向度の傾向が現れやすい範囲として、最頻値±５°の配向度を評価した。

（７）成熟化確認試験　共焦点イメージング装置を使用したＣａ－イメージング解析
　各培養プレートに播種した心筋細胞の収縮に伴うＣａ蛍光強度の変化をＣＱ１（共焦点蛍光顕微鏡、横河電機株式会社製）にて測定した。
　Ｃａイオンフラックスを可視化するため、ＣＭ２に、蛍光Ｃａ指示薬（ＥａｒｌｙＴｏｘ　ｃａｒｄｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を添加し、３７℃で１５分間静置した。ＣＱ１の測定条件は、励起波長４８８ｎｍ／蛍光波長５２５ｎｍ、データ取得時間６０秒で行った。また、解析には、セルパスファインダーを使用した。
　細胞は、播種当日を０日目とし、５日目まで維持培養したＣＭ２を使用した。測定データから、パラメータとして、Ｃａトランジェント波形ピークの２０％高さの線幅（Ｄｕｒａｔｉｏｎ）、波形ピークの間隔（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）を選び、解析を行った。
　配向性プレートで培養したＣＭ２は、平面プレートで培養したＣＭ２と比較して、Ｃａトランジェントの波形ピークの２０％高さの線幅（Ｄｕｒａｔｉｏｎ）とＣａトランジェントの波形の間隔（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）が有意に延長した（図１２（Ａ））。
　また、ＤｕｒａｔｉｏｎとＩｎｔｅｒｖａｌの平方根との関係ついて、図１２（Ｂ）に示す。
　以上の結果から、配向プレートで培養したＣＭ２において、ピークの２０％高さの線幅（Ｄｕｒａｔｉｏｎ）と波形の間隔（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）の平方根との比は以下の範囲に含まれる。
　　Ｄｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２≧０．６８
　Ｃａトランジェント持続時間（２０％高さの線幅（Ｄｕｒａｔｉｏｎ））と活動電位持続時間には相関があることが報告されている。一般に、培養された心筋細胞では、分化度が高いほど活動電位持続時間は長い傾向がある。したがって、配向プレートでは平面プレートより成熟化が進んでいると考えられる。
　Ｉｎｔｅｒｖａｌの時間は、心拍によって影響を受けるため、通常心拍数に補正した値が使用されることに従い、Ｉｎｔｅｒｖａｌは（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２の数値を用いて計算した。

（８）成熟化確認試験　パッチクランプ法による細胞内電位の測定
　上記の手順で、ＣＭ２を配向プレート、平面プレートに６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した。この時、各プレートは９６ウェルプレートではなく、底面フィルムをサイズ４ｍｍ×４ｍｍに切り取った小片を、市販の９６ウェルプレートの底面に設置して使用した。パッチクランプ試験による細胞内電位の測定は、２５℃のＴｙｒｏｄｅ溶液中のＣＭ２をカレントクランプ下、０．２Ｈｚで２０ｐＡから１００ｐＡの電流を細胞内に投入して活動電位を発生させた。なお、与える電流は、正常な電位の変化が観察される電流を選択した。
　結果として、代表例２例を図１３に示した。配向プレートで培養したＣＭ２は培養８日目、平面プレートで培養したＣＭ２は培養２２日の細胞を使用した結果である。配向プレートで培養したＣＭ２の細胞内電位は、平面プレートで培養したＣＭ２と比べて、活動電位持続時間は長く、最大拡張期電位も深かった。
　配向プレートで培養したＣＭ２の活動電位８０％再分極持続時間は７９１ｍｓ、最大拡張期電位は－６８．６ｍＶであった。一方、平面プレートで培養したＣＭ２の活動電位８０％再分極持続時間は４７８ｍｓ、最大拡張期電位は－５７．９ｍＶであった。
　ヒト由来の正常単離心室筋細胞での活動電位は、持続時間が配向プレートで培養したＣＭ２と同程度に長く、最大拡張期電位（静止膜電位）は配向プレートで培養したＣＭ２よりさらに深い（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１３；１２７：５７５－５８４）。このことから、配向プレートで培養したＣＭ２は平面プレートで培養したＣＭ２より正常心筋細胞の活動電位により近いといえる。

（９）薬剤安全性試験－１
　ｉＣｅｌｌ心筋細胞ＣＭ２を使用し、心筋の副作用惹起として多く使われている４薬剤の容量依存作用を検討した。
　上記の手順で、ＣＭ２を配向プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ、ＮＤ　Ｃｅｌｌ　Ａｌｉｇｎｅｒ）、平面プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで維持培養を行い、播種当日を０日目として、５日目または６日目に薬剤を投与した。
　薬剤は、Ｅ－４０３１、Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ（キニジン）、Ｃｉｓａｐｒｉｄｅ（シサプリド）、Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（イソプロテレノール）を使用した。薬剤はＤＭＳＯに溶解し、累積投与を行った。初めに、ｄｏｓｅ０として、薬剤を添加しない状態で測定を行った。測定後直ちに、ｄｏｓｅ１の濃度になるように、ＤＭＳＯに溶解した薬剤を各ウェルに添加し、１５分後に測定を行った。続いて、測定後直ちに、薬剤をｄｏｓｅ２の濃度になるように、同じウェルに薬剤を各ウェルに添加し、１５分後に測定を行った。ｄｏｓｅ３についても同様に行った。
　薬剤の種類、作用機序および濃度を以下の表に示す。

　薬剤投与後の細胞の応答性は、共焦点イメージング装置（ＣＱ１、横河電機株式会社製）を使用したＣａ－イメージングによる不整脈測定法、ライブセルイメージング装置（ＳＩ８０００、ソニー株式会社製）を使用した動き試験法を実施し、拍動数および拍動ピークの線幅への影響を調べた。
（９－１）ライブセルイメージング装置を使用した動き試験法による測定
　以下の手順で行った。
　維持培養５日目のＣＭ２を使用し、初めに、Ｄｏｓｅ０として、薬剤を添加しない状態で、ＳＩ８０００（ソニー株式会社製）にて動画データを取得した。測定後直ちに、同じウェルプレートにｄｏｓｅ１の濃度の各種薬剤を添加し、１５分後に動画データを取得した。Ｄｏｓｅ２と　Ｄｏｓｅ３についても、同様に薬剤を累積投与し、動画データを取得した。各薬剤の添加試験はｎ＝６で行った。
　ＳＩ８０００の動画データから拍動数（ＢＲ）、収縮速度（ＣＶ）、弛緩速度（ＲＶ）、収縮弛緩間隔（ＣＲＤ）を解析し、薬剤による細胞の動きへの影響を比較した。収縮弛緩間隔（ＣＲＤ）は拍動数（ＢＲ）による変動を補正するため、Ｆｒｅｄｅｒｉｃａの式を参考にして、次の式で補正した。
　　　ＣＲＤ／（６０／ＢＲ）^１／３
　有意差検定は、平面プレートと配向プレートにおいてＤＭＳＯを添加した対象群と薬剤添加群間でＴ検定を行った。
　ＳＩ８０００のパラメータの変化から見た副作用について、早期後脱分極（ｅａｒｌｙ　ａｆｔｅｒｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＥＡＤ）と遅延後脱分極（ｄｅｌａｙｅｄ　ａｆｔｅｒｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＤＡＤ）、小さな規則的な波形（ＶＴ－ｌｉｋｅ）、反応（波形）消失を記録した。ＥＡＤ、ＤＡＤに分類されない波形の変化は、不整脈と記載した。また、表中の「－」は、不整脈等が発生していない状態を示す。
　不整脈の程度はＥＡＤが軽度、ＤＡＤが中度、ｖｔ－ｌｉｋｅが重度である。「不整脈」と記載されたものは軽度である。

Ｅ－４０３１（Ｉｋｒの遮断薬）
　平面プレートで培養したＣＭ２、配向プレートで培養したＣＭ２ともにＥ－４０３１の添加により、拍動数（ＢＲ）、収縮速度（ＣＶ）、弛緩速度（ＲＶ）が減少した。ＣＲＤ（心拍数で補正）は、配向プレート、平面プレートで中濃度（Ｄｏｓｅ２、０．３μＭ）、高濃度（Ｄｏｓｅ３、１μＭ）で有意に短縮を示した（図１４（Ａ））。平面プレートでは、より顕著に短縮した。
　平面プレートで培養したＣＭ２では、６ウェル中６ウェルで不整脈が発生しているが、配向プレートで培養したＣＭ２では６ウェル中１ウェルの不整脈発生であった（表３－１、表３－２）。
　不整脈の発生率は、配向プレートで培養したＣＭ２では、低濃度（Ｄｏｓｅ１、０．１μＭ）で１／６、中濃度（Ｄｏｓｅ２、０．３μＭ）で１／６、高濃度（Ｄｏｓｅ３、１μＭ）で１／６であった。一方、平面プレートで培養したＣＭ２では、低濃度（Ｄｏｓｅ１、０．１μＭ）で３／６、中濃度（Ｄｏｓｅ２、０．３μＭ）で５／６、高濃度（Ｄｏｓｅ３、１μＭ）で６／６であり、配向プレートで培養したＣＭ２で低く、平面プレートで培養したＣＭ２で高い傾向であった。

Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（β受容体作動薬）
　Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ　１、３、１０μＭを適用した。ＢＲとＲＶは配向プレートで培養したＣＭ２、平面プレートで培養したＣＭ２で増加傾向であり、ＣＶは平面プレートで培養したＣＭ２、配向プレートで培養したＣＭ２とも横ばいであった。ＣＲＤ（心拍数で補正）は、配向プレート、平面プレートで低濃度（Ｄｏｓｅ１、１μＭ）、中濃度（Ｄｏｓｅ２、３μＭ）、高濃度（Ｄｏｓｅ３、１０μＭ）で延長した。配向プレートでは、溶媒（ＤＭＳＯ）と似た変動を示したが、平面プレートは溶媒（ＤＭＳＯ）との差が大きく、薬剤の影響が現れたと考えられる（図１４（Ｂ））。
　また、いずれの濃度においても、不整脈等は観察されなかった。

（９－２）Ｃａ－イメージングによる不整脈測定
　以下の手順で行った。
　維持培養６日目のＣＭ２に、蛍光Ｃａ指示薬（ＥａｒｌｙＴｏｘ　ｃａｒｄｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を添加し、生細胞を染色した。初めに、Ｄｏｓｅ０として、薬剤を添加しない状態で、心筋細胞の収縮に伴うＣａ蛍光強度の変化をＣＱ１にて測定した。測定後直ちに、同じウェルプレートにＤｏｓｅ１の濃度の各種薬剤を添加し、１５分後にＣａ蛍光強度の変化を測定した。Ｄｏｓｅ２とＤｏｓｅ３についても、同様に薬剤を累積投与し、Ｃａ蛍光強度の変化を測定した。各薬剤の添加試験はｎ＝６で行った。
　ＣＱ１を用いてのＣａ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔの波形のピークを１００％とした場合の２０％の波形幅（Ｄｕｒａｔｉｏｎ）、ピーク間の間隔（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）、ピーク高さ（Ｐｅａｋ　ｏｆ　Ｃａ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）のデータを使用し、平面プレートと配向プレートへ播種、６日間培養したＣＭ２において、薬剤の作用を比較した。有意差検定は、平面プレートで培養したＣＭ２と配向プレートで培養したＣＭ２においてＤＭＳＯを添加した対象群と薬剤添加群間で行った。
　Ｃａ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔの波形変化から見た副作用について、早期後脱分極（ｅａｒｌｙ　ａｆｔｅｒｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＥＡＤ）と遅延後脱分極（ｄｅｌａｙｅｄ　ａｆｔｅｒｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＤＡＤ）、小さな規則的な波形（ＶＴ－ｌｉｋｅ）、反応（波形）消失を記録した。また、表中の「－」は、不整脈等が発生していない状態を示す。不整脈の程度はＥＡＤが軽度、ＤＡＤが中度、ｖｔ－ｌｉｋｅが重度である。

Ｅ－４０３１（Ｉｋｒの遮断薬）
　Ｃａ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔのＤｕｒａｔｉｏｎは０μＭでは、配向プレートで培養したＣＭ２は平面プレートで培養したＣＭ２よりやや長く（有意に）、０．１μＭでは、平面プレートで培養したＣＭ２でやや長く、０．３μＭでは、平面プレートで培養したＣＭ２で配向プレートで培養したＣＭ２より有意に長く、１μＭでは有意ではないものの平面プレートで培養したＣＭ２で顕著に延長していた。
　これらの結果から、Ｅ－４０３１添加によるＩＫｒ遮断の影響は平面プレートで培養したＣＭ２でより発現しやすく、配向プレートで培養したＣＭ２で少ないということができる（図１５－１）。
　中程度～重度の不整脈（ＤＡＤ、ＶＴ－ｌｉｋｅ）の発生率は、配向プレートで培養したＣＭ２では、低濃度（Ｄｏｓｅ１、０．１μＭ）で０／６、中濃度（Ｄｏｓｅ２、０．３μＭ）で１／６、高濃度（Ｄｏｓｅ３、１μＭ）で４／６であった。平面プレートで培養したＣＭ２では、低濃度（Ｄｏｓｅ１、０．１μＭ）で３／６、中濃度（Ｄｏｓｅ２、０．３μＭ）で６／６、高濃度（Ｄｏｓｅ３、１μＭ）で６／６であり、配向プレートで培養したＣＭ２で低く、平面プレートで培養したＣＭ２で高い傾向であった（表４－１、表４－２）。

Ｑｉｎｉｄｉｎｅ（ＩＮａ遮断薬、Ｉｋｒ遮断薬）
　Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ　３、１０、３０μＭで同様な作用に関して検討した結果を下記の図１５－２に示した。中濃度（Ｄｏｓｅ２、１０μＭ）において、平面プレートで培養したＣＭ２で配向プレートで培養したＣＭ２より強いＤｕｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｖａｌの延長、有意に弱いＰｅａｋ高の低下が観察された。高濃度（Ｄｏｓｅ３、３０μＭ）では収縮力が極度に低下し、頻度の高い波形に変化したため図中には示さなかった。
　中程度～重度の不整脈（ＤＡＤ、ＶＴ－ｌｉｋｅ）の発生率は、配向プレートで培養したＣＭ２では、低濃度（Ｄｏｓｅ１、３μＭ）で０／６、中濃度（Ｄｏｓｅ２、１０μＭ）で０／６、高濃度（Ｄｏｓｅ３、３０μＭ）で６／６であった。平面プレートで培養したＣＭ２では、低濃度（Ｄｏｓｅ１、３μＭ）で０／６、中濃度（Ｄｏｓｅ２、１０μＭ）で０／６、高濃度（Ｄｏｓｅ３、３０μＭ）で４／６であり、配向でやや高い傾向であった（表５－１、表５－２）。不整脈の発生率は、配向プレートでやや高い傾向であったが、Ｄｕｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｖａｌの変化は、配向プレートで培養したＣＭ２でより小さいことから、薬剤による影響が現れにくいと考えられる。

Ｃｉｓａｐｒｉｄｅ（Ｉｋｒの遮断薬、５－ＨＴ４受容体作動薬）
　Ｃｉｓａｐｒｉｄｅ　０．０１、０．０３、０．１μＭの作用を検討した。Ｄｕｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｖａｌともに用量依存性に延長した（図１５－３）。配向プレートで培養したＣＭ２では、Ｄｏｓｅ０で示した値とＤｏｓｅ３で示した値との差が平面プレートで培養したＣＭ２より小さかった。配向プレートで培養したＣＭ２は、平面プレートで培養したＣＭ２よりＣｉｓａｐｒｉｄｅに対して耐性があると考えられた。
　不整脈の発生は、配向プレートの低濃度（Ｄｏｓｅ１、０．０１μＭ）から高濃度（Ｄｏｓｅ３、０．１μＭ）で１／６であった。平面プレートでは不整脈は発生しなかった（表６－１、表６－２）。
　不整脈の発生率は、配向プレートでやや高い傾向であったが、Ｄｕｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｖａｌの変化は、配向プレートで培養したＣＭ２でより小さいことから、薬剤による影響が現れにくいと考えられる。

Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（β受容体作動薬）
　Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ　１、３、１０μＭの作用を検討した。Ｄｕｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｖａｌとも減少が観察された（図１５－４）。ただし平面でのＤｕｒａｔｉｏｎの減少は少なかった。このＤｕｒａｔｉｏｎの減少作用はβ受容体刺激でみられる典型的な反応である。
　Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌは高濃度（Ｄｏｓｅ３、１０μＭ）においても不整脈は発生しなかった。配向プレートで培養したＣＭ２と平面プレートで培養したＣＭ２で同じ傾向であった。

ＤＭＳＯ（溶媒）
　溶媒では、Ｄｕｒａｔｉｏｎは軽度に延長した。薬物効果に著しい影響をもたらす作用ではなかった（図１５－５）。

　活動電位のＤｕｒａｔｉｏｎの延長が最も典型的なＩＫｒ遮断薬のＥ－４０３１や類似の作用に注目すると、高用量のＥ－４０３１でのＤｕｒａｔｉｏｎ延長作用が、配向プレートで培養したＣＭ２では平面プレートで培養したＣＭ２より認められにくいことから、副作用は平面プレートで培養したＣＭ２でより現れやすく、配向プレートで培養したＣＭ２では現れにくいと傾向があると考えられる。
　ほとんどの試験系で薬物適応前のＣａ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔのＤｕｒａｔｉｏｎは配向プレートで培養したＣＭ２で長く平面プレートで培養したＣＭ２で短く、活動電位持続時間も同様であることが示唆される。この持続時間の延長は一般に心筋細胞の成熟化とも相関しており６日目でも配向プレートで培養したＣＭ２と平面プレートで培養したＣＭ２とで、機能変化（配向プレートの分化促進）が起きていることは明白である。

（１０）薬剤安全性試験－２
　ｉＣｅｌｌ心筋細胞ＣＭ２を１５日間培養し、より成熟した状態において、心筋の副作用惹起として多く使われている２薬剤の容量依存作用を検討した。
　上記の手順で、ＣＭ２を配向プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ、ＮＤ　Ｃｅｌｌ　Ａｌｉｇｎｅｒ）、平面プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで維持培養を行い、播種当日を０日目として、１５日目に薬剤を投与した。
　薬剤は、Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（イソプロテレノール）、Ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ（ミルリノン）を使用した。薬剤はＤＭＳＯに溶解し、投与を行った。初めに、ｄｏｓｅ０として、薬剤を添加しない状態で測定を行った。測定後直ちに、各ｄｏｓｅの濃度になるように、ＤＭＳＯに溶解した薬剤を各ウェルに添加し、一定時間経過後に測定を行った。薬剤の種類、作用機序および濃度を以下の表に示す。

　薬剤投与後の細胞の応答性は、ライブセルイメージング装置（ＳＩ８０００、ソニー株式会社製）を使用した動き試験法を実施し、拍動数および収縮速度、弛緩速度への影響を調べた。
（１０－１）ライブセルイメージング装置を使用した動き試験法による測定
　以下の手順で行った。
　維持培養１５日目のＣＭ２を使用し、初めに、ｄｏｓｅ０として、薬剤を添加しない状態で、ＳＩ８０００（ソニー株式会社製）にて動画データを取得した。測定後直ちに、同じウェルプレートに各ｄｏｓｅの濃度の各種薬剤を添加し、イソプロテレノールは１２０分後、ミルリノンは１５分後に動画データを取得した。各薬剤の添加試験はｎ＝５で行った。
　ＳＩ８０００の動画データから拍動数（ＢＲ）、収縮速度（ＣＶ）、弛緩速度（ＲＶ）を解析し、薬剤による細胞の動きへの影響を比較した。
　測定データは、薬剤を添加しないｄｏｓｅ０の平均値で補正し（各測定値／ｄｏｓｅ０の測定値）、ｄｏｓｅ０の測定値を１とした相対値を求めた。
　有意差検定は、各薬剤添加濃度における平面プレートと配向プレートの結果をｄｏｓｅ０の結果と比較してＴ検定を行った。また、薬剤添加群における平面プレートと配向プレート間でＴ検定を行った。Ｐ値が０．０１以下であった比較群に関して、グラフにマークを記した。

イソプロテレノール（β受容体作動薬）
　平面プレートで培養したＣＭ２、配向プレートで培養したＣＭ２ともにイソプロテレノールの添加により、拍動数（ＢＲ）、弛緩速度（ＲＶ）が増加した。弛緩速度は、配向プレートのｄｏｓｅ２、ｄｏｓｅ３は平面プレートと比較して増加した。
収縮速度（ＣＶ）は、配向プレートで培養したＣＭ２は増加したが、平面プレートでは減少する傾向であった。配向プレートのｄｏｓｅ２は薬剤添加前と比較して優位に増加し、また、平面プレートとの比較では、配向プレートのｄｏｓｅ２、ｄｏｓｅ３は有意に増加した（図１６－１）。

ミルリノン（ホスホジエステラーゼ３阻害剤）
　配向プレートで培養したＣＭ２はミルリノンの添加により、拍動数（ＢＲ）、収縮速度（ＣＶ）、弛緩速度（ＲＶ）が増加した。平面プレートで培養したＣＭ２は、拍動数は薬剤投与によって変化はなかったが、収縮速度、弛緩速度は減少する傾向であった。
　配向プレートで培養したＣＭ２の拍動数（ＢＲ）は、全てのｄｏｓｅにおいて薬剤添加前と比較して優位に増加した。弛緩速度（ＲＶ）はｄｏｓｅ３において、薬剤添加前と比較して優位に増加した。また、平面プレートと比較して有意に増加した。収縮速度（ＣＶ）はｄｏｓｅ３において、平面プレートと比較して有意に増加した（図１６－２）。

ＤＭＳＯ（溶媒）
　溶媒では、薬物効果に著しい影響をもたらす作用は確認されなかった。

　上記（１０）に示すように、ｉＣｅｌｌ心筋細胞ＣＭ２を１５日間培養し、より成熟した状態において、心筋の副作用惹起として多く使われている２薬剤の容量依存作用を検討した結果から、配向プレートを使用することで、収縮速度の有意な増加が見られ、ｉＣｅｌｌ心筋細胞では効果の検証が難しいとされてきた、陽性変力作用を配向プレートの使用により検出することが可能であることが示された。

（１１）薬剤安全性試験－３（抗がん剤）
　ｉＣｅｌｌ心筋細胞ＣＭ２を１５日間培養し、心筋への副作用（中毒性心筋炎、過敏性心筋炎）が惹起される抗がん剤の容量依存作用を検討した。
　上記の（１０）と同様の手順で、ＣＭ２を配向プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ、ＮＤ　Ｃｅｌｌ　Ａｌｉｇｎｅｒ）、平面プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで維持培養を行い、播種当日を０日目として、１５日目に薬剤を投与した。
　薬剤は、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ドキソルビシン、アントラサイクリン系抗がん剤）を使用した。薬剤はＤＭＳＯに溶解し、投与を行った。初めに、事前測定として、薬剤を添加しない状態で測定を行った。測定後直ちに、３μＭの濃度になるように、ＤＭＳＯに溶解した薬剤を各ウェルに添加し、２４時間、４８時間経過後に測定を行った。測定は、上記（１０－１）ライブセルイメージング装置を使用した動き試験法による測定と同様に行った。
　測定データは、３μＭの濃度での測定値を、薬剤を添加しない事前測定の平均値で補正し（３μＭでの測定値／事前測定の測定値）、事前測定の測定値を１とした変化率を求めた。
　有意差検定は、各時間における薬剤添加群の平面プレートと配向プレートの結果を各時間におけるＤＭＳＯ添加群と比較しＴ検定を行った。また、薬剤添加群における平面プレートと配向プレート間でＴ検定を行った。Ｐ値が０．０１以下であった比較群に関して、グラフにマークを記した。
　溶媒として使用したＤＭＳＯは、最終濃度０．０１％で添加した。ＤＭＳＯによる影響は、ＤＭＳＯ０．０１％添加群を２４時間後、４８時間後の測定を行うことにより確認した。測定データは薬剤投与群と同様に処理を行った。

ドキソルビシン（抗がん剤）
　平面プレートで培養したＣＭ２、配向プレートで培養したＣＭ２ともにドキソルビシンの添加により、拍動数（ＢＲ）が増加した。４８時間後の測定結果は２４時間後の測定結果より増加しており、時間経過とともに拍動数が増加した。特に、配向プレートで培養したＣＭ２では、３μＭ添加により平面プレートと比較して拍動数が有意に増加した。ＤＭＳＯの添加により、平面プレートと配向プレートともに拍動数は減少する傾向があった（図１７）。
　ＣＶ（収縮速度）は、配向プレートで培養したＣＭ２で増加が認められた。ＤＭＳＯ投与群と比較して、２４時間後の測定では３μＭ添加により有意に増加し、２４時間後、４８時間後の測定では、平面プレートと比較して配向プレートで培養したＣＭ２で有意に増加した。ＤＭＳＯの添加により、平面は収縮速度が減少する傾向が見られたが、配向プレートは薬剤投与前と変化がなかった（図１７）。
　ＲＶ（弛緩速度）は、平面プレートで培養したＣＭ２、配向プレートで培養したＣＭ２ともにドキソルビシンの添加により、増加した。配向プレートで培養したＣＭ２では、
４８時間後の測定で、平面プレートと比較してＲＶが有意に増加した。
ＤＭＳＯの添加により、配向プレートでＲＶが増加傾向であったが、平面プレートは薬剤投与前と変化がなかった（図１７）。

　上記（１１）に示すように、抗がん剤のドキソルビシンを使用した容量依存作用を検討した結果から、配向プレートを使用することで、拍動数、収縮速度、弛緩速度で有意な増加が見られ、配向プレートの使用により、心筋に対する毒性の検出が可能であることが示された。

（１２）酸素消費速度の測定
　上記の手順で、ＣＭ２を配向プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ、ＮＤ　Ｃｅｌｌ　Ａｌｉｇｎｅｒ）、平面プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで維持培養を行い、播種当日を０日目として、２７日目に酸素消費速度を測定した。
　測定は、酸素消費速度プレートアッセイキット（同仁化学株式会社製、Ｅ２９７）を使用した。
　ＣＭ２を培養したウェルプレートに、培地で希釈したＯｘｙｇｅｎ　Ｐｒｏｂｅを添加し、あらかじめ３７℃に保温したプレートリーダー内で３０分間静置した。次に脂肪酸代謝酵素を阻害するβ酸化阻害剤であるＥｔｏｍｏｘｉｒを終濃度で５０μＭ含むＳａｍｐｌｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、直ちにＭｅｎｅｒａｌ　Ｏｉｌを滴下し、酸素の供給を遮断した。
　３７℃に保温したプレートリーダー内で５分間静置した後、経時的に蛍光強度を測定した。蛍光プレートリーダーの測定条件は、励起波長４９５ｎｍ／蛍光波長６５０ｎｍ、データ取得は１０分ごとに、少なくとも１６８分間行った。
　測定は、コントロールとしてＥｔｏｍｏｘｉｒ未添加を６ウェル、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ５０μＭ添加を３ウェルで行った。
　酸素濃度（ｐｍｏｌ）は、酸素消費速度プレートアッセイキットに付属の計算シートによって算出し、酸素消費速度（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ）は、測定開始１０～７０分後の６０分間における酸素濃度減少量から算出した。
　測定の結果、平面プレートでは、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ未添加のＯＣＲは７９．１ｐｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ添加のＯＣＲは７７．８ｐｍｏｌ／ｍｉｎであり、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ添加によって、添加前のＯＣＲに比べて、ＯＣＲは９８．３％であった。
　一方、配向プレートでは、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ未添加のＯＣＲは６３．６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ添加のＯＣＲは７．０ｐｍｏｌ／ｍｉｎであり、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ添加によって、添加前のＯＣＲに比べて、ＯＣＲは１１．０％に低下した。
　結果を図１６に示す。図１６中、縦軸は、Ｅｔｏｍｏｘｉｒ未添加のＯＣＲを１．０としている。

　上記結果から、本実施形態の培養細胞シートは、従来の培養細胞シートに比べて成熟化が進行しており、その結果、該培養細胞シートを使用することにより、評価対象である化合物または薬物の評価方法として、より生体内に近い評価が可能であると考えられる。

Claims

　心筋細胞から構成される培養細胞シートであって、
　心筋細胞が配向性を有して配置され、
　前記培養細胞シートに対して、抗α－アクチニン抗体を使用して免疫染色を行い顕微鏡観察で得られる画像において画面水平方向を０°とした際、測定範囲（７１．６μｍ×７１．６μｍ）内にあるα－アクチニン抗体で検出される棒状構造体の長手方向の角度を計測し、その最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の頻度を、下記式（１）により求める配向度が２３％以上である、培養細胞シート。
　配向度（％）＝（最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の数）／（棒状構造体の総数）×１００　（１）
　ライブセルイメージングにおいて、動きベクトルの最頻値の角度から±５°の角度を示すベクトルの数（配向度）が１２％以上である、請求項１に記載の培養細胞シート。
　前記心筋細胞が、幹細胞由来の心筋細胞である、請求項１に記載の培養細胞シート。
　以下の要件Ａ１および要件Ａ２の少なくともいずれかを満たす、請求項１に記載の培養細胞シート。
　要件Ａ１：ＭＹＬ３（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　３）遺伝子の発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＭＹＬ３／ＡＣＴＢ）が１２．０以上である。
　要件Ａ２：ＭＹＨ７（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　７）遺伝子の発現量と、ＭＹＨ６（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　６）遺伝子の発現量との比（ＭＹＨ７／ＭＹＨ６）が６．０以上である。
　以下の要件Ｂ１および要件Ｂ２の少なくともいずれかを満たす、請求項１に記載の培養細胞シート。
　要件Ｂ１：ＣＫＭ（Ｃｒｅａｔｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ，Ｍ－ｔｙｐｅ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＣＫＭ／ＡＣＴＢ）が、１．８０以上である。
　要件Ｂ２：ＬＤＨＡ（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢの遺伝子発現量との比（ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢ）が０．８０以上である。
　細胞１個あたりのミトコンドリアの面積が２００μｍ^２以上である、請求項１に記載の培養細胞シート。
　ライブセルイメージングにおいて検出された収縮速度をＣＶ（ｍ／ｓｅｃ）とし、弛緩速度をＲＶ（ｍ／ｓｅｃ）としたとき、下記式（２）を満たす、請求項１に記載の培養細胞シート。
　　１．０≦ＣＶ／ＲＶ≦２．８　　　　　（２）
　カルシウムイメージング解析において、カルシウムトランジェントの波形ピーク高さを１００％としたとき、２０％の高さの波形幅をＤｕｒａｔｉｏｎ（秒）とし、ピーク間の間隔をＩｎｔｅｒｖａｌ（秒）としたとき、下記式（３）を満たす、請求項１に記載の培養細胞シート。
　　Ｄｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２≧０．６８　　　（３）
　培養細胞シートを構成する細胞が、２５℃溶液中でのパッチクランプ試験における活動電位８０％再分極持続時間が６００ｍｓｅｃ以上であり、かつ、最大拡張期電位が－６０ｍＶ以下である、請求項１に記載の培養細胞シート。
　再生医療用である、請求項１に記載の培養細胞シート。
　請求項１～１０のいずれか１項に記載の培養細胞シートの製造方法であって、
　培養細胞シートを形成するための表面を備え、
　前記表面は、複数の平坦部と複数の凹凸部とを備え、
　各平坦部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記複数の平坦部は前記表面の全体で前記第１方向と交差する第２方向に並び、
　各凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部の間を埋める複数の段差構造を含み、前記段差構造のピッチが１００ｎｍ以上１０μｍ以下であり、
　前記段差構造は、凸部であり、
　前記凹凸部は、相互に隣り合う前記平坦部に挟まれた凹部の底面に複数の前記凸部を備えており、
　細胞シート形成部材の厚み方向において、前記凹凸部における先端面の高さと、前記平坦部の高さとの差が０．５μｍ以下である細胞シート形成部材を用いて、心筋細胞を培養することを含む、培養細胞シートの製造方法。
　請求項１～１０のいずれか１項に記載の培養細胞シートに対して、評価対象である化合物または薬物を作用させる、化合物または薬物の評価方法。
　培養細胞シートの生理学的特性の変化および運動機能の変化から選択される少なくとも１つの変化を評価する、請求項１２に記載の化合物または薬物の評価方法。
　前記評価対象である化合物または薬物が、ＩＮａ遮断薬、Ｉｋｒ遮断薬、Ｉｋｓ遮断薬、ＩＣａ遮断薬、５－ＨＴ４受容体作動薬、α受容体遮断薬、β受容体遮断薬、α受容体作動薬、β受容体作動薬、毒劇物、抗がん剤、およびその他の生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１つの既存化合物またはその候補化合物である、請求項１２に記載の化合物または薬物の評価方法。
　心筋細胞から構成される培養細胞シートの品質評価方法であって、
　下記（ｉ）～（viii）のいずれかを評価する、
　品質評価方法。
　（ｉ）　前記培養細胞シートに対して、抗α－アクチニン抗体を使用して免疫染色を行い顕微鏡観察で得られる画像において画面水平方向を０°とした際、測定範囲（７１．６μｍ×７１．６μｍ）内にあるα－アクチニン抗体で検出される棒状構造体の長手方向の角度を計測し、その最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の頻度を、下記式（１）により求める配向度が２３％以上である。
　配向度（％）＝（最頻値の±１５°以内に含まれる棒状構造体の数）／（棒状構造体の総数）×１００　（１）
　（ii）　ライブセルイメージングにおいて、動きベクトルの最頻値の角度から±５°の角度を示すベクトルの数（配向度）が１２％以上である。
　（iii）　以下の要件Ａ１および要件Ａ２の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ａ１：ＭＹＬ３（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　３）遺伝子の発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）遺伝子の発現量との比（ＭＹＬ３／ＡＣＴＢ）が１２．０以上である。
　要件Ａ２：ＭＹＨ７（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　７）遺伝子の発現量と、ＭＹＨ６（Ｍｙｏｓｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　６）遺伝子の発現量との比（ＭＹＨ７／ＭＹＨ６）が６．０以上である。
　（iv）　以下の要件Ｂ１および要件Ｂ２の少なくともいずれかを満たす。
　要件Ｂ１：ＣＫＭ（Ｃｒｅａｔｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ，Ｍ－ｔｙｐｅ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢ（Ａｃｔｉｎ　Ｂｅｔａ）の遺伝子発現量との比（ＣＫＭ／ＡＣＴＢ）が、１．８０以上である。
　要件Ｂ２：ＬＤＨＡ（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ）の遺伝子発現量と、ＡＣＴＢの遺伝子発現量との比（ＬＤＨＡ／ＡＣＴＢ）が０．８０以上である。
　（ｖ）　細胞１個あたりのミトコンドリアの面積が２００μｍ^２以上である。
　（vi）　ライブセルイメージングにおいて検出された収縮速度をＣＶ（ｍ／ｓｅｃ）とし、弛緩速度をＲＶ（ｍ／ｓｅｃ）としたとき、下記式（２）を満たす。
　　１．０≦ＣＶ／ＲＶ≦２．８　　　　　（２）
　（vii）　カルシウムイメージング解析において、カルシウムトランジェントの波形ピーク高さを１００％としたとき、２０％の高さの波形幅をＤｕｒａｔｉｏｎ（秒）とし、ピーク間の間隔をＩｎｔｅｒｖａｌ（秒）としたとき、下記式（３）を満たす。
　　Ｄｕｒａｔｉｏｎ／（Ｉｎｔｅｒｖａｌ）^１／２≧０．６８　　　（３）
　（viii）　培養細胞シートを構成する細胞が、２５℃溶液中でのパッチクランプ試験における活動電位８０％再分極持続時間が６００ｍｓｅｃ以上であり、かつ、最大拡張期電位が－６０ｍＶ以下である。