WO2020166279A1 - 細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法 - Google Patents

細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法 Download PDF

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WO2020166279A1
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cell
flat
cell sheet
forming
forming member
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寿子 得能
啓 篠塚
紘太郎 大
凌峰 沈
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王子ホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells

Definitions

  • the present disclosure relates to a cell sheet forming member for forming a cell sheet in which cell aggregates are formed, a base material, and a method for manufacturing the cell sheet forming member.
  • cultured cells are used for drug screening, drug screening, drug safety evaluation, toxicity test, regenerative medicine, etc., and in these fields, three-dimensional tissues similar to in vivo tissues are used. May be used. (See Patent Document 1).
  • An object of the present disclosure is to provide a cell sheet forming member, a base material, and a method for manufacturing the cell sheet forming member, which enables easy formation of a cell sheet containing cell clusters.
  • a cell sheet forming member includes a surface for forming a cell sheet, and the surface has a flat portion in which cell adhesion is predominant, and cell adhesion is inferior to the flat portion.
  • the flat portion has a circular shape or a polygonal shape when viewed from a direction facing the surface, and is configured such that a cell mass is formed in at least the flat portion.
  • the cell mass is formed in the flat portion, and at least a part of the cell mass formed by aggregating the cells in the uneven portion is adhered to the flat portion, which makes it difficult for the cell mass to be released. .. Therefore, it becomes easy to identify the cell mass and measure movements such as the size and pulsation of the cell mass. Further, it becomes easy to perform analysis such as image processing.
  • the pitch of the convex portions in the irregular portion is 10 nm or more and 10 ⁇ m or less. According to the above configuration, the cells of the uneven portion have reduced adhesiveness, can aggregate, and easily form a cell mass.
  • the area of the flat portion is preferably 100 ⁇ m 2 or more and 10000 ⁇ m 2 or less. According to the above configuration, the cell mass is surely adhered to the flat portion.
  • cell aggregates are formed on the surface of the cell aggregate forming member as described above. According to the above configuration, it becomes easy to identify the cell mass adhered to the flat part while being fixed to the base material, and to measure the size and movement of the cell mass such as pulsation. Further, it becomes easy to perform analysis such as image processing.
  • a method for manufacturing a cell sheet forming member includes forming an intaglio plate, and forming the surface of a cell sheet forming member for forming a cell sheet by transferring the intaglio plate, The surface has a flat portion where cell adhesion is predominant, and an uneven portion where cell adhesion is inferior to the flat portion, and the intaglio plate is a flat forming portion that forms the flat portion, and the uneven portion.
  • a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method is used to form the intaglio plate. Forming by using.
  • a cell sheet forming member includes a surface for forming a cell sheet, the surface having an orientation control unit for controlling the orientation of cells, and the cells being aggregated cells
  • a cell mass forming part for forming a mass, wherein the orientation control part has a shape extending in a first direction, and a first flat part arranged in a second direction intersecting with the first direction.
  • a first concavo-convex portion filling between the first flat portions adjacent to each other, wherein the cell mass formation portion is adjacent to the orientation control portion and a second flat portion, and is adjacent to the orientation control portion.
  • a second uneven portion connected to the second flat portion, and at least a part of the cell mass is formed on the second flat portion.
  • the orientation control unit can align the cell extension direction with the first direction.
  • the orientation of the cells can be improved in the cell sheet spreading in the two-dimensional direction.
  • cells located in the second uneven portion are aggregated on the second flat portion, and at least a part of the cell mass is adhered to the second flat portion.
  • the cell mass is formed on the second flat portion, and the cell mass is adhered to the second flat portion, so that the cell mass is less likely to be released. Therefore, it becomes easy to identify the cell mass and measure movements such as the size and pulsation of the cell mass. Further, it becomes easy to perform analysis such as image processing.
  • the second flat portion is located between the first uneven portions. According to the above configuration, it is possible to form cell clusters near cells having orientation.
  • the second uneven portion is located so as to be sandwiched by the first uneven portion. According to the above configuration, it is possible to form a cell cluster with cells near cells having orientation.
  • the second flat portion has a length in the second direction of 50 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less and a length in the first direction of 100 ⁇ m or more. According to the above configuration, the cells located in the second uneven portion are aggregated in the second flat portion, and at least a part of the cell mass can be adhered to the second flat portion.
  • the length of the portion sandwiched by the orientation control portions adjacent to each other in the second uneven portion is 50 ⁇ m or more and 1 mm or less, and the convex portion in the second uneven portion is formed.
  • the pitch is preferably 10 nm or more and 10 ⁇ m or less. According to the above configuration, cells located in the second uneven portion are likely to aggregate.
  • the first uneven portion has a length in the second direction of 10 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and a length in the first direction of 100 ⁇ m or more. According to the above configuration, it is possible to improve the orientation of cells in the cell sheet that spreads in the two-dimensional direction.
  • cell aggregates are formed on the surface of the cell aggregate forming member as described above. According to the above configuration, it becomes easy to identify the cell mass adhered to the flat part while being fixed to the base material, and to measure the size and movement of the cell mass such as pulsation. Further, it becomes easy to perform analysis such as image processing. In the above base material, it is preferable that cells having orientation in the first direction are formed in the orientation control section.
  • a method for manufacturing a cell sheet forming member includes forming an intaglio plate, and forming a surface of a cell sheet forming member for forming a cell sheet by transferring the intaglio plate,
  • the surface comprises an orientation control unit for controlling the orientation of cells, and a cell cluster forming unit for forming the cell cluster by aggregating the cells, and the orientation control unit is in the first direction.
  • the cell mass comprising a first flat portion having an extending shape and arranged in a second direction intersecting the first direction, and a first uneven portion filling a space between the first flat portions adjacent to each other
  • the forming section includes a second flat section adjacent to the orientation control section, and a second uneven section adjacent to the orientation control section and connected to the second flat section, wherein the intaglio is the first section.
  • First flat forming part for forming 1 flat part, first uneven forming part for forming the first uneven part, second flat forming part for forming the second flat part, and second uneven part Forming the intaglio plate by using a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method. Forming using at least 1 sort(s) of these.
  • FIG. 2A is a plan view of the cell sheet forming member according to the first embodiment
  • FIG. 2B is a cross-sectional view of a range indicated by an arrow in FIG.
  • FIG. 4A is a plan view of the cell sheet forming member according to the second embodiment
  • FIG. 4B is a cross-sectional view of a range indicated by an arrow in FIG. 4A
  • FIG. 4C is the cell of FIG. 4A.
  • 4D is a perspective view of the orientation control unit of the sheet forming member, FIG.
  • FIG. 4D is an image of the surface of the orientation control unit of the cell sheet forming member of FIG.
  • (A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet.
  • (A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet.
  • A)-(c) is a schematic diagram for demonstrating the manufacturing process of a cell sheet.
  • a cell sheet forming member a method for manufacturing a cell sheet forming member, and a method for manufacturing a cell sheet will be described.
  • the structure of the cell sheet forming member will be described, and then the method for manufacturing the cell sheet forming member and the method for manufacturing the cell sheet will be described.
  • the cell sheet forming member 100 is, for example, a sheet material arranged on a culture dish 110 of a petri dish.
  • the cell sheet forming member 100 may be placed on the culture dish 110 or may be provided by directly processing a petri dish.
  • the cell sheet forming member 100 is insert-molded when the petri dish is injection-molded, for example.
  • the petri dish holds the cell suspension in the space surrounded by the culture dish 110 and the lid 120.
  • the cells contained in the cell suspension are not particularly limited as long as they are adhesive cells, but cells derived from various tissues in vivo, stem cells, various cells differentiated from ES cells or iPS cells, and the like can be used.
  • the surface 111 of the cell sheet forming member 100 includes a plurality of flat portions 130 and a plurality of uneven portions 140 provided around the flat portions 130.
  • Each flat part 130 has, for example, a circular shape when viewed from the side facing the surface 111 when viewed from the direction facing the surface 111. Alternatively, it may have a polygonal shape such as a triangle, a quadrangle, or a hexagon.
  • the concavo-convex portion 140 has a stepped structure of a concave portion and a convex portion 141, and the stepped structure fills a space between the flat portions 130 that are island regions.
  • Cell adhesion is dominant in the flat portion 130, and cell adhesion in the uneven portion 140 is inferior to the flat portion 130.
  • the cells seeded on the substrate are cultured in a state of being spread in a single layer on the substrate at the initial stage of culture, but after a certain period of time, the cells naturally located on the uneven portion 140. Aggregate to form a spherical or rod-shaped cell mass 11. Then, at least a part of the cell mass 11 adheres to the flat portion 130 and is not detached from the surface 111 and is not released. The cell mass 11 may be adhered to the flat portion 130 almost entirely.
  • Each of the convex portions 141 forming the concave-convex portion 140 is located, for example, at each vertex of a triangular lattice when viewed from the direction facing the surface 111.
  • Each concavo-convex part 140 repeats such arrangement
  • the master for forming the convex portion 141 is a mask suitable for forming a minute repetitive structure, for example, a single particle film. Can be formed by the etching method described above.
  • the pitch of the convex portions 141 in the concave-convex portion 140 preferably satisfies the following (A).
  • the area of the flat portion 130 preferably satisfies the following (B).
  • B Area of the flat portion 130: 100 ⁇ m 2 or more and 10000 ⁇ m 2 or less.
  • the pitch of the convex portions 141 is, for example, 300 nm or less, visible light transmitted through the cell sheet is less likely to be interfered by the convex portions 141.
  • the color displayed by the interference of the convex portions 141 complicates the observation of the cell sheet using a microscope.
  • the pitch of the convex portions 141 is preferably 10 nm or more and 300 nm or less.
  • the larger the pitch of the convex portions 141 the more accurately the fine structure of the convex portions can be formed on the resin surface by injection molding or the like.
  • the pitch of the convex portions 141 is 500 nm or more, it is easy to form a fine structure on the resin surface. From the viewpoint of workability, the pitch of the convex portions 141 is preferably 500 nm or more and 10 ⁇ m or less.
  • the method for manufacturing the cell sheet forming member includes a step of forming the intaglio plate 150 and a step of forming the surface 111 of the cell sheet forming member 100 by transferring the intaglio plate 150.
  • the lower surface of the intaglio plate 150 includes a flat forming portion 151 that forms a plurality of flat portions 130, and an uneven forming portion 152 that forms the uneven portion 140.
  • a silicon substrate for forming the intaglio 150 is formed by using at least one of a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method. Is formed.
  • the intaglio plate 150 itself may be obtained by transferring the master plate once or plural times.
  • a shape corresponding to the surface shape of the intaglio 150 is formed on the master by using at least one of a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method for a silicon substrate.
  • the lower surface of the intaglio plate 150 is opposed to the front surface 111 of the base material 160 for forming the cell sheet forming member 100.
  • the forming material of the base material 160 is, for example, a thermoplastic resin or a photocurable resin.
  • the lower surface of the intaglio plate 150 is pressed against the surface 111 of the base material 160 while the base material 160 has fluidity.
  • the intaglio plate 150 is released from the surface 111 of the base material 160 with the fluidity of the base material 160 suppressed.
  • the molding portions 151 and 152 of the intaglio plate 150 are transferred to the surface 111 of the base material 160, and the flat portion 130 and the uneven portion 140 are formed.
  • the base material 160 For the purpose of enhancing the adhesiveness of cells to the surface of the thermoplastic resin or the photocurable resin forming the base material 160, for example, laminin, collagen, gelatin, fibronectin, polylysine (PDL or PLL), hyaluronic acid, etc.
  • An organic substance containing an adhesion factor such as extracellular matrix, polymer or gel may be applied.
  • a biomaterial such as polysaccharide or protein may be used as a material for forming the base material 160.
  • the cell suspension located on the surface 111 of the cell sheet forming member 100 contains, for example, cells forming the cell cluster 11.
  • the cells seeded on the surface 111 are cultured in a state in which they are spread in a single layer on the surface 111 at the initial stage of culture.
  • the cells located in the uneven portion 140 naturally aggregate to form the spherical or rod-shaped cell mass 11 on at least the flat portion 130.
  • At least a part of the cell mass 11 may be adhered to the flat portion 130 so as not to be released.
  • the cell mass 11 may be wholly adhered to the flat portion 130 or may be partly adhered to the flat portion 130. In any case, the cell mass 11 is not detached from the surface 111 and is hardly released.
  • Example 1 in the cell sheet forming member, the method for producing the cell sheet forming member, and the cell sheet producing method described in the above embodiment will be described below.
  • a nickel intaglio plate for producing the cell sheet forming member 100 having a plurality of flat portions 130 inside the uneven portion 140 by transfer was produced. Then, using the nickel intaglio plate as a stamper, the concavo-convex portion 140 and the flat portion 130 were processed by a nanoimprinting method into a polystyrene sheet having a temperature-responsive polymer (PIPAAm) fixed to the surface of the substrate, and thereby, in Example 1.
  • PIPAAm temperature-responsive polymer
  • the uneven portion 140 in the cell sheet forming member 100 of Example 1 had a plurality of step structures, and the pitch of the convex portions 141 in the uneven portion 140 was 300 nm.
  • the height of each convex portion 141 in the concave-convex portion 140 was measured using an AFM, and the average height from the bottom surface of the concave portion 142 to the tip of the convex portion 141 was 446 nm.
  • the average height from the bottom surface of the concave portion 142 to the flat portion 130 was 455 nm.
  • the flat portion 130 had a circular shape with a diameter of 12 ⁇ m, and the shortest distance from the adjacent flat portion 130 was 50 ⁇ m. Then, the cell sheet forming member 100 of Example 1 was cut into a circle having a diameter of 8.8 mm, subjected to UV irradiation as a sterilization treatment, and then used in a cell culture test.
  • mice-derived cardiomyocytes manufactured by Cosmo Bio
  • the culture conditions were a 37° C., 5% CO 2 atmosphere using a dedicated medium.
  • the cells were collected using trypsin according to a standard method. The number of cells in the collected cells was measured using a hemocytometer.
  • Example 1 the cell sheet forming member 100 of Example 1 cut into a circle having a diameter of 8.8 mm was placed on the bottom surface of the cell culture multi-well plate (48 holes). 0.2 ml of each cardiomyocyte adjusted to a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells/ml was seeded. After culturing in a CO 2 incubator for 24 hours, the medium was exchanged, and the medium was exchanged every other day to observe the cell shape.
  • the cells proliferated in a monolayer to a confluent state after 2 days of culture, and after 4 days, a cell mass in which the cells were aggregated into a spherical shape was formed.
  • the cell mass was adhered to the flat portion 130 and was not released from the substrate by changing the medium.
  • the cell culture multi-well plate on which the cell sheet forming member 100 was installed was allowed to stand in an incubator at 20° C. for 30 minutes. After standing, the medium in the well was pipetted, and the released cell mass was collected together with the medium in a 15 ml centrifuge tube.
  • the effects listed below can be obtained.
  • (1-1) In the flat portion 130, cells located in the uneven portion 140 are aggregated and at least a part of the cells adhere to the flat portion 130. As a result, the cell clump 11 is formed in the flat portion 130, and the cell clump 11 is adhered to the flat portion 130, so that the cell clump 11 is less likely to be released. Therefore, in the state where the cell mass 11 is adhered to the flat portion 130, it is easy to identify the cell mass 11 and measure the movement of the size or the pulsation of the cell mass 11. Further, it becomes easy to perform analysis such as image processing.
  • the pitch of the convex portions 141 in the concave-convex portion 140 is 10 nm or more and 10 ⁇ m or less.
  • the cells of the uneven portion 140 have reduced adhesiveness and are capable of aggregating, which facilitates formation of the cell mass 11.
  • the first embodiment may be modified and implemented as follows.
  • each flat portion 130 is not limited to 100 ⁇ m 2 or more and 10000 ⁇ m 2 or less. That is, each flat portion 130 may have an area such that at least a part of the cell mass 11 adheres to the extent that the cell mass 11 is not released.
  • the pitch of the convex portions 141 in the concave-convex portion 140 is not limited to 10 nm or more and 10 ⁇ m or less as long as cells can be held on the surface 111.
  • the shape of the convex portion 141 is any one of a cone shape such as a cone and a pyramid, a columnar shape such as a cylinder and a prism, a truncated cone shape such as a truncated cone and a truncated pyramid, and a hemispherical shape. It is possible to
  • the position of the convex portion 141 may be irregular at each lattice point on the square lattice, at each lattice point on the hexagonal lattice, and further on the irregular portion 140.
  • the height of the uneven portion 140 may be the same as the height of the flat portion 130, may be higher, or may be lower.
  • the surface 211 of the cell sheet forming member 200 in the second embodiment has an orientation control unit 201 that controls the orientation of cells to be cultured, and a cell mass for forming a cell mass.
  • the forming part 202 is provided.
  • a plurality of orientation control units 201 are formed on the surface 211, and a cell mass formation unit 202 is formed adjacent to each orientation control unit 201.
  • the orientation control unit 201 includes a plurality of first flat portions 230 and a plurality of first uneven portions 240.
  • the first uneven portion 240 extends in the first direction and is formed side by side in the second direction.
  • Each of the first uneven portions 240 has a step structure (first step structure), and the step structure fills a space between the first flat portions 230 adjacent to each other.
  • the step structure is a convex portion or a concave portion.
  • the step structure in the present embodiment is the convex portion 241, and the first concave-convex portion 240 has the concave portion sandwiched between the first flat portions 230 adjacent to each other and the plurality of convex portions 241 located on the bottom surface of the concave portion.
  • Each first flat portion 230 is a flat surface extending in one direction, which is one direction.
  • the first flat portions 230 are arranged on the entire surface 211 in a second direction orthogonal to the first direction.
  • the first uneven portions 240 also extend in the first direction and are arranged in the second direction.
  • each convex portion 241 forming the first concave-convex portion 240 is located, for example, at each vertex of a triangular lattice when viewed from the direction facing the surface 211.
  • Each first concave-convex portion 240 repeats such an arrangement of the convex portions 241 in the first direction and the second direction.
  • a master suitable for forming the convex portion 241 is a mask suitable for forming a minute repeating structure, for example, a single particle film. It becomes possible to form by the etching method which used as a mask.
  • Each of the protrusions 241 has, for example, a circular shape when viewed from the direction facing the surface 211.
  • the mode of the distance between the centers of the convex portions 241 that are adjacent to each other is the pitch of the convex portions 241.
  • the maximum width of the convex portion 241 in the plan view shape is the diameter of the convex portion 241.
  • the configuration in which the first pitch, which is the pitch of the convex portions 241, satisfies the following (C) and (D) is such that the extending direction of the animal cells, particularly the above-described myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes is in the first direction. It is suitable in terms of alignment. That is, in the configuration in which the pitch of the convex portions 241 satisfies the following (C) and (D), the superiority or inferiority with respect to adhesion of animal cells, myoblasts such as human and mouse, fibroblasts, and cardiomyocytes This is preferable from the viewpoint of being clearly divided between the flat portion 230 and the first uneven portion 240.
  • each first flat portion 230 in the second direction is the width of the first flat portion 230. Further, the length in the second direction (short side direction) between the first flat portions 230 adjacent to each other is the width of the first uneven portion 240.
  • the width of the first flat portion 230 and the width of the first uneven portion 240 are, for example, 1/10 to 10 times the size of cells to be cultured (5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less).
  • the configuration in which the width of the first flat portion 230 and the width of the first concave-convex portion 240 satisfy the following (E) and (F) is that of animal cells, particularly the above-described myoblasts, fibroblasts, and cardiomyocytes. It is suitable from the viewpoint of facilitating the alignment of the extension direction with the first direction.
  • the first concavo-convex portion 240 may include a convex portion 241 adjacent to each other, and a concave portion 242 between the first flat portion 230 and the convex portion 241 adjacent thereto. Since the plurality of convex portions 241 are scattered on the first concave-convex portion 240, the concave portions 242 that are spaces between the convex portions 241 are continuous in the first concave-convex portion 240 in the first direction and the second direction.
  • the length between the bottom surface of the recess 242 and the first flat portion 230 is the height of the first flat portion 230.
  • the height difference between the tip end surface of each convex portion 241 and the first flat portion 230 is a boundary step.
  • the height difference between the bottom surface of the concave portion 242 and the tip surface of each convex portion 241 is the height of the convex portion 241.
  • the height of the first flat portion 230 and the height of the convex portion 241 are equal to each other.
  • the ratio of the pitch of the protrusions 241 to the height of the protrusions 241 is the aspect ratio of the protrusions 241.
  • the configuration in which the boundary step satisfies the following (G) is suitable from the viewpoint of improving the flatness of the cell sheet.
  • a configuration in which the height of the convex portion 241 satisfies the following (H), and a configuration in which the aspect ratio of the convex portion 241 satisfies the following (I), can improve the structural stability of the first uneven portion 240, Further, it is suitable from the viewpoint of facilitating the formation of the first uneven portion 240.
  • orientation control part 201 50 ⁇ m or more and 1 mm or less.
  • K Length of orientation control unit 201: 100 ⁇ m or more.
  • the cell sheet that spreads in the two-dimensional direction along the surface 111, it is possible to align the cell extension directions in the one-dimensional direction, that is, improve the orientation of the cells.
  • the cell sheet can also be stacked in the thickness direction in a state where the cultured cells are aligned in the one-dimensional direction, that is, in the state of having orientation, to form a three-dimensional tissue.
  • the configuration satisfying the above (G) particularly in the configuration in which the tip end surface of each convex portion 241 and the first flat portion 230 are flush with each other, the first uneven portion 240 and the first flat portion 230 are covered. It makes it possible to increase the flatness of the formed cell sheet. Furthermore, the configuration satisfying the above (H)(I) can further enhance the flatness of the cell sheet.
  • FIG. 4D is an image obtained by photographing the surface of the orientation control unit 201 with a scanning electron microscope.
  • the cell mass formation unit 202 includes a second flat portion 221 and a second uneven portion 222 that are adjacent to the orientation control unit 201.
  • the second flat portion 221 is sandwiched between the two orientation control units 201 forming a pair and extends in the first direction.
  • the second flat portion 221 is adjacent to the first uneven portion 240 of each orientation control unit 201, and the first uneven portion 240 of one orientation control unit 201 and the other orientation control unit. It is sandwiched by the first uneven portion 240 of 201.
  • the width of the second flat portion 221 preferably satisfies the following conditions (L)(M).
  • the cell mass 11 is attached to the second flat portion 221 and is unlikely to be released.
  • the width of the second flat portion 221 may not be the same at all positions.
  • the second uneven portion 222 is located between the first uneven portions 240 of the two adjacent orientation control units 201. Further, the second uneven portion 222 is connected to both end portions of the second flat portion 221 in the first direction. Each convex portion 223 forming the second concave-convex portion 222 is located at, for example, each vertex of the triangular lattice when viewed from the direction facing the surface 211. Each second uneven portion 222 repeats such an arrangement of the convex portions 223 in the first direction and the second direction.
  • the master for forming the convex portions 223 is a mask suitable for forming a minute repeating structure, for example, a single particle film. It becomes possible to form by the etching method which used as a mask. Then, it becomes possible to form the convex portion 241 at the same time.
  • the width of the second uneven portion 222 preferably satisfies the following condition (N).
  • N Width of the second concave-convex portion 222 (length between two adjacent orientation control units 201, that is, length in a second direction of a portion sandwiched between two adjacent orientation control units 201) : 50 ⁇ m or more and 1 mm or less.
  • the width of the second uneven portion 222 does not have to be the same at all positions.
  • the pitch of the convex portions 223 that form the second concave-convex portion 222 preferably satisfies the following condition (O).
  • (O) Pitch of the convex portion 223 in the second concave-convex portion 222 10 nm or more and 10 ⁇ m or less.
  • it is 100 nm or more and 5 ⁇ m or less. More preferably, it is 300 nm or more and 5 ⁇ m or less. Even more preferably, it is 500 nm or more and 2 ⁇ m or less.
  • the pitch of the convex portions 223 may not be the same at all positions.
  • the pitch of the convex portions 223 in the second concave-convex portion 222 may be the same as the first pitch of the convex portions 241 in the first concave-convex portion 240, or may be large or small. That is, the pitch of the convex portions 223 in the second concave-convex portion 222 may be a dimension that allows cells to easily aggregate.
  • the width of the second uneven portion 222 may be the same as the width of the first uneven portion 240, or may be wide or narrow, as long as it has a width capable of holding cells for forming a cell mass. Good.
  • the second uneven portion 222 makes it easier for cells to aggregate and form a cell mass. Then, the cells released in the second uneven portion 222 are aggregated and at least a part of the cell mass 11 is adhered to the second flat portion 221.
  • the orientation control unit 201 can orient the cells in the first direction for culture, and the cell mass forming unit 202 can form the cell mass 11.
  • the method of manufacturing the cell sheet forming member includes a step of forming the intaglio plate 250 and a step of forming the surface 211 of the cell sheet forming member 200 by transferring the intaglio plate 250.
  • the lower surface of the intaglio plate 250 has a first flat forming portion 251 for forming the first flat portion 230, a first uneven forming portion 252 for forming the first uneven portion 240, and a second flat forming portion for forming the second flat portion 221.
  • the portion 253 and the second concavo-convex molding portion 254 that molds the second concavo-convex portion 222 are provided.
  • at least one of a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method is used on the silicon substrate for forming the intaglio 250 to form the uneven portion. Is formed.
  • the intaglio 250 itself may be obtained by transferring from the master once or plural times.
  • a shape corresponding to the surface shape of the intaglio 250 is formed on the master using, for example, at least one of a photolithography method, a colloidal lithography method, an anodic oxidation method, and an interference exposure method for a silicon substrate.
  • the lower surface of the intaglio 250 is opposed to the surface 211 of the base material 260 for forming the cell sheet forming member 200.
  • the forming material of the base material 260 is, for example, a thermoplastic resin or a photocurable resin.
  • the lower surface of the intaglio plate 250 is pressed against the surface 211 of the base material 260 while the base material 260 has fluidity.
  • the intaglio 250 is released from the surface 211 of the base material 260 while suppressing the fluidity of the base material 260.
  • the molding portions 251 to 254 of the intaglio 250 are transferred to the surface 211 of the base material 260, and the first flat portion 230, the first uneven portion 240, the second flat portion 221 and the second uneven molding portion 254 are formed. ..
  • the base material 260 For the purpose of enhancing the adhesiveness of cells to the surface of the thermoplastic resin or the photocurable resin forming the base material 260, for example, laminin, collagen, gelatin, fibronectin, polylysine (PDL or PLL), hyaluronic acid, etc.
  • An organic substance containing an adhesion factor such as extracellular matrix, polymer or gel may be applied.
  • a material for forming the base material 260 a biomaterial such as a polysaccharide or a protein may be used as a biomaterial such as a polysaccharide or a protein may be used.
  • the cell suspension located on the surface 211 of the cell sheet forming member 200 includes, for example, cells S1 that adhere to the first flat portion 230.
  • each first flat portion 230 extends in the long side direction (first direction) of the first concavo-convex portion 240, and the width of each first flat portion 230 corresponds to that of a general cell. It is about 1 to several times the size. Therefore, as shown in FIG.
  • the positions of the cells S1 are preferentially distributed within the range of the first flat portion 230, and the cells S1 are arranged with the long axis direction of the cells arranged in the first direction. It is a straight line. That is, the extension direction of the cell S1 is controlled so as to be aligned with the long side direction of the first flat portion 230.
  • FIG. 6 shows an example of myoblasts cultured using the cell sheet forming member 200, and in the example shown in FIG. 6, the myoblasts are controlled so that their extending directions are aligned in one direction.
  • FIG. 9 shows an example of myoblasts cultured in the orientation control unit 201 of the cell sheet forming member 200. In the example shown in FIG. 9, the myoblasts are controlled so that their extending directions are aligned in one direction. Has been done.
  • FIG. 10 shows an example of myoblasts cultivated using a commercially available cell culture dish that serves as a reference example. In the example shown in FIG. 10, the myoblast extension directions are randomly arranged.
  • the cell suspension located on the surface 211 of the cell sheet forming member 200 includes, for example, the cells S2 that adhere to the first uneven portion 240.
  • each first concavo-convex portion 240 extends in the long side direction (first direction) of the first concavo-convex portion 240, and the width of each first concavo-convex portion 240 is that of a general cell. It is about 1 to several times the size. Therefore, as shown in FIG. 7B, the positions of the cells S2 are preferentially distributed within the range of the first concavo-convex portion 240, and the cells S2 are arranged with the long axis direction of the cells arranged in the first direction. It is a straight line. That is, the extension direction of the cell S2 is controlled so as to be aligned with the long side direction of the first uneven portion 240.
  • the orientation of the cells S2 is not controlled, and thus the long axis direction of the cells exists in a random direction.
  • the cell suspension located on the surface 111 of the cell sheet forming member 100 contains, for example, cells forming a cell sheet.
  • the cell is the cell S1 that preferentially adheres to the first flat portion 230, and is inferior to the first flat portion 230, but adheres to the first uneven portion 240. Is also a cell S2 that has been allowed to.
  • the cells seeded on the surface 111 are cultured in a state in which they are spread in a monolayer on the surface 111 at the initial stage of culture.
  • the first flat portions 230 and the first uneven portions 240 extend in the first direction and are alternately arranged in the second direction. Therefore, on the surface 211 of the cell sheet forming member, for example, the orientation of the cells S1 preferentially adhered to the first flat portion 230 has the structure of the first flat portion 230 and the first irregularities that partition the structure. It is controlled by the structure of section 240.
  • the flat portion in the cell S2 adhered to the first uneven portion 240 is flat.
  • the control of the orientation by 130 is reflected.
  • the cells S1 and S2 whose orientation is controlled in the first direction form a cell sheet SA that spreads over the entire surface 111.
  • the cells are cultured in the orientation control unit 201 so that the cells have orientation in the first direction.
  • the cell clump forming unit 202 after a certain period of time, the cells located in the second uneven portion 222 naturally aggregate, and at least the second flat portion 221 has a spherical or rod-shaped cell clump. 11 is formed. At least a part of the cell mass 11 may be adhered to the second flat portion 221 so as not to be released.
  • the cell aggregate 11 may be wholly adhered to the second flat portion 221 or may be partly adhered to the second flat portion 221.
  • the cell mass 11 is a portion protruding from the orientation control unit 201 to the cell mass formation unit 202. In any case, the cell mass 11 is not detached from the surface 211 and is hardly released.
  • Example 2 in the cell sheet forming member, the method for producing the cell sheet forming member, and the method for producing the cell sheet described in the above embodiment will be described below.
  • a second uneven portion 222 is provided on the outer peripheral portion, an orientation control unit 201 (first flat portion 230 and first uneven portion 240) is provided inside the second uneven portion 222, A nickel intaglio plate for forming the cell sheet forming member 200 having the second flat portion 221 sandwiched between the two orientation control portions 201 by transfer was produced.
  • the second uneven portion 222, the orientation control portion 201 (the first flat portion 230 and the first uneven portion 240), and the second flat portion 221 are processed on the polystyrene sheet by the nanoimprint method. Then, thereby, the cell sheet forming member 200 of Example 2 was produced.
  • the second uneven portion 222 of the cell sheet forming member 200 of Example 2 had a plurality of step structures, and the pitch of the convex portions 223 in the second uneven portion 222 was 300 nm.
  • the height of each convex portion 223 in the second concave-convex portion 222 was measured using an AFM, and the average height from the bottom surface of the concave portion to the tip of the convex portion 223 was 446 nm.
  • the orientation control unit 201 includes a first flat portion 230 and a first uneven portion 240, each first flat portion 230 has a shape extending in the first direction, and the first flat portion 230 is a cell sheet.
  • the width (length in the second direction) of each of the first flat portions 230 was 10 ⁇ m in a region excluding the outer peripheral portion on the surface of the forming member 200, which were arranged in the second direction intersecting the first direction.
  • Each of the first concavo-convex portions 240 includes a plurality of step structures that fill the spaces between the first flat portions 230 adjacent to each other, and the length in the second direction between the first flat portions 230 adjacent to each other (the first concavo-convex portion 240).
  • Width was 10 ⁇ m
  • the pitch of the convex portions 241 in the first concave-convex portion 240 was 300 nm.
  • the height of each convex portion 241 in the first concave-convex portion 240 was measured using an AFM, and the average height from the bottom surface of the concave portion to the tip of the convex portion 241 was 446 nm.
  • the average height from the bottom surface of the recess to the first flat portion 230 was 455 nm.
  • the long side of the second flat portion 221 was adjacent to the long side of the first uneven portion 240, and the width of each second flat portion 221 was 100 ⁇ m. Then, the cell sheet forming member 200 of Example 2 was cut into a circle having a diameter of 8.8 mm, subjected to UV irradiation as a sterilization treatment, and then used in a cell culture test.
  • mice-derived cardiomyocytes manufactured by Cosmo Bio
  • the culture conditions were a 37° C., 5% CO 2 atmosphere using a dedicated medium.
  • the cells were collected using trypsin according to a standard method. The number of cells in the collected cells was measured using a hemocytometer.
  • Example 2 the cell sheet forming member 200 of Example 2 cut into a circle having a diameter of 8.8 mm was placed on the bottom surface of the multi-well plate for cell culture (48 holes). 0.2 ml of each cardiomyocyte adjusted to a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells/ml was seeded. After culturing in a CO 2 incubator for 24 hours, the medium was exchanged, and the medium was exchanged every other day to observe the cell shape.
  • the day of the start of culture was 0 days, and after 4 days, rod-shaped aggregates of cells were formed.
  • the cell mass was adhered to the second flat portion 221 and was not released from the base material by changing the medium.
  • the effects listed below can be obtained.
  • the cell extension direction can be aligned with the first direction.
  • the orientation of the cells can be improved in the cell sheet spreading in the two-dimensional direction.
  • the cells located in the second uneven portion 222 are aggregated on the second flat portion 221, and at least a part of the cells are adhered to the second flat portion 221.
  • the cell clump 11 is formed on the second flat portion 221, and the cell clump 11 adheres to the second flat portion 221 and becomes difficult to be released. Therefore, in a state in which the cell mass 11 is adhered to the second flat portion 221, it is easy to identify the cell mass 11 and measure the size, pulsation, or other movement of the cell mass 11. Further, it becomes easy to perform analysis such as image processing.
  • the second flat portion 221 is located so as to be sandwiched between the two first uneven portions 240. Therefore, the cell cluster 11 can be formed in the vicinity of the oriented cells.
  • the second uneven portion 222 is located between the two first uneven portions 240. Therefore, the cell cluster 11 can be formed by the cells near the oriented cells.
  • the second flat portion 221 has a length in the second direction of 50 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, and a length in the first direction of 100 ⁇ m or more.
  • the cells located in the second uneven portion 222 are aggregated in the second flat portion 221, and at least a part of the cell mass 11 can be adhered to the second flat portion 221.
  • the length between the two adjacent orientation control units 201 in the second direction is 50 ⁇ m or more and 1 mm or less.
  • the pitch of the convex portions in the second concave and convex portion 222 is 10 nm or more and 10 ⁇ m or less. Therefore, the cells of the second uneven portion 222 are likely to aggregate.
  • the first uneven portion 240 has a length in the second direction of 10 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, and a length in the first direction of 100 ⁇ m or more. This can improve the orientation of cells in the cell sheet that spreads in the two-dimensional direction.
  • the first uneven portion 240 has a length in the second direction of 10 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and a length in the first direction of 100 ⁇ m. It need not be the above.
  • the second uneven portion 222 has a length in the second direction of 50 ⁇ m or more and 1 mm or less, and the convex portion 223 of the second uneven portion 222.
  • the pitch does not have to be 10 nm or more and 10 ⁇ m or less.
  • the second flat portion 221 has a length in the second direction of 50 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, and a length in the first direction. It may not be 100 ⁇ m or more.
  • the second concavo-convex portion 222 does not have to be located between the first concavo-convex portions 240.
  • the second flat portion 221 does not have to be located between the first concavo-convex portions 240 as long as a cell mass can be formed near cells having orientation.
  • the shape of the convex portion 241 may be any one of a cone shape such as a cone and a pyramid, a columnar shape such as a cylinder and a prism, a truncated cone shape such as a truncated cone and a truncated pyramid, and a hemispherical shape. is there.
  • the position of the convex portion 241 may be irregular at each lattice point on the square lattice, at each lattice point on the hexagonal lattice, and further at the first irregular portion 240.
  • the shape of the first concavo-convex portion 240 is not limited to the linear shape extending in the first direction, but may be changed to a polygonal line extending in the first direction or a curved shape extending in the first direction.
  • the bottom surface of the first uneven portion 240 and the first flat portion 230 is changed, that is, to change the base end portion of the convex portion 241 and the first flat portion 230 to be flush. .. Note that, as described above, the configuration in which the tip end surface of the first uneven portion 240 and the first flat portion 230 are flush with each other is suitable from the viewpoint of improving the flatness of the cell sheet.
  • the stepped structure that constitutes the first concavo-convex portion 240 can be changed to a concave portion or both a concave portion and a convex portion.
  • the first concavo-convex portion 240 can be changed to a structure in which one side surface continuous with the first flat portion 230 is provided and a plurality of concave portions are formed on the side surface.
  • the width of one first concavo-convex portion 240 and the width of the other first concavo-convex portion 240 may be different from each other or may be equal to each other. If the width of one first concavo-convex portion 240 and the width of the other first concavo-convex portion 240 are equal to each other, it is possible to improve the uniformity of the characteristics of the cell sheet in the second direction. Become.
  • the width of one first flat portion 230 and the width of the other first flat portion 230 may be different from each other or may be equal to each other. If the width of one first flat portion 230 and the width of another first flat portion 230 are equal to each other, it is possible to improve the uniformity of the characteristics of the cell sheet in the second direction. Become.
  • the width of the first flat portion 230 and the width of the first uneven portion 240 may be different from each other or may be equal to each other.
  • the width of the first flat portion 230 may be within a range in which the orientation can be controlled and larger than the width of the first uneven portion 240. It is suitable.
  • the width of the first uneven portion 240 is within a range in which the orientation can be controlled and is larger than the width of the first flat portion 230. It is suitable.
  • the second direction in which the first flat portions 230 and the first concavo-convex portions 240 are alternately arranged is not limited to the direction orthogonal to the first direction, and may be, for example, the first direction as long as the direction intersects the first direction. It is also possible to set the direction in which the angle formed is 45°.
  • the shape of the convex portion is any one of a cone shape such as a cone and a pyramid, a column shape such as a cylinder and a prism, a truncated cone shape such as a truncated cone and a truncated pyramid, and a hemisphere shape. It is possible to
  • the position of the convex portion may be irregular at each lattice point on the square lattice, at each lattice point on the hexagonal lattice, and at the first irregular portion 240.
  • the height of the second uneven portion 222 may be the same as the height of the first flat portion 230 and/or the first uneven portion 240, may be higher, or may be lower.
  • the second flat portion 221 is provided adjacent to the orientation control unit 201 and the second uneven portion 222 is connected to the second flat portion 221, for example, the second uneven portion is formed.
  • the part 222 may not be adjacent to the orientation control part 201. This is because the cell cluster 11 may be formed near the oriented cells.
  • the surfaces 111, 211 of the cell sheet forming members 100, 200 are extracellular matrices such as laminin, collagen, gelatin, fibronectin, polylysine (PDL or PLL), and hyaluronic acid for the purpose of enhancing the adhesiveness of cells.
  • Extracellular matrices such as laminin, collagen, gelatin, fibronectin, polylysine (PDL or PLL), and hyaluronic acid for the purpose of enhancing the adhesiveness of cells.
  • Organic substances including adhesion factors such as polymers, gels, etc. may be applied. Alternatively, it may be a surface made of metal.
  • the surfaces 111 and 211 of the cell sheet forming members 100 and 200 may have hydrophilicity or hydrophobicity for the purpose of enhancing the adhesiveness of cells and the flatness of cell sheets.
  • An extracellular matrix production promoting factor may be added to the cell suspension.
  • the extracellular matrix production-promoting factor include TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 3, ascorbic acid, ascorbic acid diphosphate or a derivative thereof or a salt thereof.
  • ascorbic acid, ascorbic acid diphosphate or derivatives thereof and salts thereof are preferable.
  • Ascorbic acid is preferably L-form.
  • the surface 111, 211 may be coated with a stimuli-responsive material in order to facilitate the peeling/collection of the cell sheet formed on the surface 111, 211 of the cell sheet forming member 100, 200.
  • a stimuli-responsive material a temperature-responsive polymer whose water affinity changes with temperature changes is preferable. Specifically, poly-N-isopropylacrylamide (PIPAAm) is preferable.
  • PIPAAm poly-N-isopropylacrylamide
  • the stimuli-responsive material may be applied to the substrate using conventional coating methods, or the structure treated on the substrate treated with the stimuli-responsive material may be processed using the methods described below. Further, in order to facilitate the detachment/collection of cell aggregates, ultrasonic treatment may be performed on the culture substrate on which the cell aggregates are formed.
  • the cell sheet forming members 100 and 200 are not limited to the transfer body using an intaglio plate, but may be a transfer body using a relief plate, and can also be formed by injection molding. That is, it is also possible to manufacture a cell sheet molding member using injection molding.
  • the cell sheet forming member can be applied to a multi-well plate, a petri dish, a flask, a chamber slide or the like as long as it can hold a cell suspension.

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Abstract

細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、表面は、細胞の接着が優勢な平坦部と、細胞の接着が平坦部に対して劣勢な凹凸部とを備え、平坦部は、表面と対向する方向から見て、円形形状または多角形形状を有し、少なくとも平坦部に細胞塊が形成されるように構成されている。

Description

細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法
　本開示は、細胞塊が形成された細胞シートを形成するための細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法に関する。
　創薬開発の分野において、培養細胞は薬剤スクリーニング、薬剤スクリーニング、薬剤の安全性評価、毒性試験、再生医療などに利用されており、これらの分野では、生体内組織と同様な、三次元組織が用いられることがある。（特許文献１参照）。
国際公開第２００７／０９７１２０号
　ところで、薬剤スクリーニングや毒性試験の分野においても、ｉＰＳ細胞などの幹細胞を使用する試験が導入されつつある。しかしながら、細胞塊などの三次元組織を用いる試験法は、三次元組織化する手法が煩雑である。
　本開示の目的は、細胞塊を含む細胞シートを容易に形成することを可能とした細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法を提供することにある。
　本開示の一態様に係る細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、細胞の接着が優勢な平坦部と、前記細胞の接着が前記平坦部に対して劣勢な凹凸部とを備え、前記平坦部は、前記表面と対向する方向から見て、円形形状または多角形形状を有し、少なくとも前記平坦部に細胞塊が形成されるように構成されている。
　上記構成によれば、細胞塊が平坦部に形成され、凹凸部の細胞が凝集して形成された細胞塊の少なくとも一部が平坦部に接着することで、細胞塊が遊離しにくいものとなる。したがって、細胞塊の識別、細胞塊の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
　上記細胞シート形成部材において、前記凹凸部における凸部のピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であることが好ましい。上記構成によれば、凹凸部の細胞は、接着性が低下し、凝集可能となり、細胞塊を形成し易くなる。
　上記細胞シート形成部材において、前記平坦部の面積は、１００μｍ２以上、１００００μｍ２以下であることが好ましい。上記構成によれば、細胞塊が確実に平坦部に接着される。
　本開示の一態様に係る基材は、以上のような細胞塊形成部材の表面に細胞塊が形成されている。上記構成によれば、基材に固定された状態で平坦部に接着された細胞塊の識別、細胞塊の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
　本開示の一態様に係る細胞シート形成部材の製造方法は、凹版を形成することと、細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することとを含み、前記表面は、細胞の接着が優勢な平坦部と、前記細胞の接着が前記平坦部に対して劣勢な凹凸部とを備え、前記凹版は、前記平坦部を成形する平坦成形部と、前記凹凸部を成形する凹凸成形部とを備え、前記凹版を形成することは、前記平坦成形部および前記凹凸成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む。
　本開示の別の態様に係る細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、細胞の配向性を制御するための配向性制御部と、前記細胞が凝集され細胞塊を形成するための細胞塊形成部とを備え、前記配向性制御部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１方向と交差する第２方向に並ぶ第１平坦部と、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１凹凸部とを備え、前記細胞塊形成部は、前記配向性制御部に隣接する第２平坦部と、前記配向性制御部に隣接し、かつ、前記第２平坦部と繋がる第２凹凸部とを備え、前記第２平坦部に少なくとも細胞塊の一部が形成されるように構成されている。
　上記構成によれば、配向性制御部では、第１方向に、細胞の伸長方向を揃えることができる。結果として、二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の配向性を向上させることができる。また、細胞塊形成部では、第２平坦部に、第２凹凸部に位置する細胞が凝集され、少なくとも細胞塊の一部が第２平坦部に接着する。これにより、細胞塊が第２平坦部に形成され、細胞塊が第２平坦部に接着されることで、遊離しにくいものとなる。したがって、細胞塊の識別、細胞塊の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
　上記細胞シート形成部材において、前記第２平坦部は、前記第１凹凸部に挟まれて位置していることが好ましい。上記構成によれば、配向性を有する細胞の近くに細胞塊を形成することができる。
　上記細胞シート形成部材において、前記第２凹凸部は、前記第１凹凸部に挟まれて位置していることが好ましい。上記構成によれば、配向性を有する細胞の近くの細胞で細胞塊を形成することができる。
　上記細胞シート形成部材において、前記第２平坦部は、５０μｍ以上、２００μｍ以下の前記第２方向の長さと、１００μｍ以上の前記第１方向の長さとを有することが好ましい。上記構成によれば、第２平坦部には、第２凹凸部に位置する細胞が凝集し、少なくとも細胞塊の一部を第２平坦部に接着することができる。
　上記細胞シート形成部材において、前記第２凹凸部において隣り合う前記配向性制御部に挟まれた部分の前記第２方向の長さが５０μｍ以上、１ｍｍ以下であり、前記第２凹凸部における凸部のピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であることが好ましい。上記構成によれば、第２凹凸部に位置する細胞が凝集し易くなる。
　上記細胞シート形成部材において、前記第１凹凸部は、１０μｍ以上、５０μｍ以下の前記第２方向の長さと、１００μｍ以上の前記第１方向の長さとを有することが好ましい。上記構成によれば、二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の配向性を向上させることができる。
　本開示の別の態様に係る基材は、以上のような細胞塊形成部材の表面に細胞塊が形成されている。上記構成によれば、基材に固定された状態で平坦部に接着された細胞塊の識別、細胞塊の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。上記基材において、前記配向性制御部には、前記第１方向に配向性を有した細胞が形成されていることが好ましい。
　本開示の別の態様に係る細胞シート形成部材の製造方法は、凹版を形成することと、細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することとを含み、前記表面は、細胞の配向性を制御するための配向性制御部と、前記細胞が凝集され細胞塊を形成するための細胞塊形成部とを備え、前記配向性制御部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１方向と交差する第２方向に並ぶ第１平坦部と、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１凹凸部とを備え、前記細胞塊形成部は、前記配向性制御部に隣接する第２平坦部と、前記配向性制御部に隣接し、かつ、前記第２平坦部と繋がる第２凹凸部とを備え、前記凹版は、前記第１平坦部を成形する第１平坦成形部と、前記第１凹凸部を成形する第１凹凸成形部と、前記第２平坦部を成形する第２平坦成形部と、前記第２凹凸部を成形する第２凹凸成形部とを備え、前記凹版を形成することは、前記第１凹凸成形部および前記第２凹凸成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む。
細胞シート形成部材をシャーレとともに示す斜視図。 （ａ）は、第１実施形態における細胞シート形成部材の平面図、（ｂ）は、図２（ａ）において矢印で示した範囲の断面図。 図２（ａ）に示す第１実施形態における細胞シート形成部材の製造方法の一例を説明するための図。 （ａ）は、第２実施形態における細胞シート形成部材の平面図、（ｂ）は、図４（ａ）において矢印で示した範囲の断面図、（ｃ）は、図４（ａ）の細胞シート形成部材の配向性制御部の斜視図、（ｄ）は、図４（ａ）の細胞シート形成部材の配向性制御部の表面を走査電子顕微鏡によって撮影した画像。 図４（ａ）に示す第２実施形態における細胞シート形成部材の製造方法の一例を説明するための図。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 本開示に係る細胞シート形成部材を用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。 参考例としての細胞培養シャーレを用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。
　以下、細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法の一実施形態について説明する。まず、細胞シート形成部材の構成を説明し、次いで、細胞シート形成部材の製造方法、細胞シートの製造方法を説明する。
　［第１実施形態］
　［細胞シート形成部材］
　図１に示すように、細胞シート形成部材１００は、例えば、シャーレの培養皿１１０に配置されるシート材である。細胞シート形成部材１００は、培養皿１１０に載置されるものであってもよいし、シャーレを直接加工して設けるものであってもよい。シャーレに直接加工して設ける場合、細胞シート形成部材１００は、例えばシャーレを射出成型するときにインサート成形される。シャーレは、培養皿１１０と蓋１２０とに囲まれた空間に細胞懸濁液を保持する。細胞懸濁液に含まれる細胞は接着性の細胞であれば特に限定されないが、生体内の各組織由来の細胞や幹細胞、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導した種々の細胞等を使用できる。
　図２（ａ）に示すように、第１実施形態における細胞シート形成部材１００の表面１１１は、複数の平坦部１３０と、平坦部１３０の周囲に設けられる複数の凹凸部１４０とを備える。表面１１１と対向する方向から見て、各平坦部１３０は、表面１１１と対向する側から見て、例えば円形状を有する。または、三角形、四角形、六角形などの多角形形状を有していてもよい。凹凸部１４０は、凹部と凸部１４１の段差構造とを備え、段差構造は、島状領域となる平坦部１３０の間を埋める。平坦部１３０は、細胞の接着が優勢であり、凹凸部１４０は、細胞の接着が平坦部１３０に対して劣勢である。図２（ｂ）に示すように、基材に播種した細胞は、培養初期は基材に単層で広がった状態で培養されるが、一定時間経過すると、自然に凹凸部１４０に位置する細胞が凝集し、球形状や棒形状をした細胞塊１１を形成する。そして、細胞塊１１は、少なくとも一部が平坦部１３０に接着し、表面１１１からの脱離は無く遊離しなくなる。細胞塊１１は、ほぼ全体が平坦部１３０に接着されていることもある。
　凹凸部１４０を構成する各凸部１４１は、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。各凹凸部１４０は、凸部１４１のこうした配列を、第１方向、および、第２方向に繰り返す。三角格子の各頂点に凸部１４１が位置する凹凸部１４０であれば、凸部１４１を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。
　凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは、下記の（Ａ）を満たすことが好ましい。
　（Ａ）凹凸部１４０における凸部１４１のピッチ：１０ｎｍ以上、１０μ以下。好ましくは、１００ｎｍ以上、５μｍ以下。より好ましくは、３００ｎｍ以上、５μｍ以下。更により好ましくは、５００ｎｍ以上、２μｍ以下。
　また、平坦部１３０の面積は、下記の（Ｂ）を満たすことが好ましい。
　（Ｂ）平坦部１３０の面積：１００μｍ２以上、１００００μｍ２以下。
　凸部１４１は、（Ａ）の条件を満たすことで、培養初期には基材に単層で広がった細胞が凝集し易くなり、細胞塊１１を形成することができる。また、平坦部１３０は、（Ｂ）の条件を満たすことで、細胞塊１１が接着され、遊離しにくくなる。そして、細胞塊１１は遊離しないため、細胞塊１１の識別、細胞塊１１の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
　なお、（Ａ）の条件において、凸部１４１のピッチが、たとえば３００ｎｍ以下であれば、細胞シートを透過した可視光が、凸部１４１によって干渉されにくい。凸部１４１の干渉によって表示される色は、顕微鏡を使用した細胞シートの観察を複雑にする。こうした視認性の観点において、凸部１４１のピッチは１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下が好ましい。一方、凸部１４１のピッチが大きいほど、射出成形等によって樹脂表面に凸部の微細構造を正確に形成することができる。たとえば、凸部１４１のピッチが５００ｎｍ以上であれば、樹脂表面への微細構造の形成は容易である。こうした加工性の観点において、凸部１４１のピッチは５００ｎｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
　［細胞シート形成部材の製造方法］
　次に、細胞シート形成部材の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ナノインプリント法を用いて、細胞シート形成部材の表面１１１を、凹版１５０の転写によって形成する例を説明する。
　図３に示すように、細胞シート形成部材の製造方法は、凹版１５０を形成する工程と、細胞シート形成部材１００の表面１１１を凹版１５０の転写によって形成する工程とを含む。
　凹版１５０の下面は、複数の平坦部１３０を成形する平坦成形部１５１と、凹凸部１４０を成形する凹凸成形部１５２とを備える。凹版１５０を形成する工程では、例えば、凹版１５０を形成するためのシリコン基板に対して、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて、凹凸部が形成される。また、凹版１５０自体を原盤からの１回、あるいは複数回の転写によって得てもよい。原盤には、例えば、シリコン基板に対するフォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて凹版１５０の表面形状に対応する形状が作り込まれている。
　次に、細胞シート形成部材１００を形成するための基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を対向させる。基材１６０の形成材料は、例えば、熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂である。そして、基材１６０が流動性を有する状態で、基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を押し付ける。次いで、基材１６０の流動性を抑えた状態で、凹版１５０を基材１６０の表面１１１から離型する。これによって、基材１６０の表面１１１に凹版１５０の成形部１５１，１５２が転写され、平坦部１３０と凹凸部１４０とが形成される。
　基材１６０の形成材料の熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂の表面に、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリーリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲルなどの接着因子を含む有機物が塗布されていてもよい。また、基材１６０の形成材料として、多糖類やタンパク質などの生体材料を用いてもよい。
　［細胞シートの製造方法］
　次に、細胞シート形成部材１００を用いて製造される細胞シートについて説明する。
　細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、細胞塊１１を形成する細胞を含んでいる。この際、表面１１１に播種された細胞は、培養初期は表面１１１に単層で広がった状態で培養される。そして、一定時間経過すると、自然に、凹凸部１４０に位置する細胞が凝集し、少なくとも平坦部１３０上に球形状や棒形状をした細胞塊１１を形成する。細胞塊１１は、少なくとも一部が平坦部１３０に接着され遊離しないようになっていればよい。細胞塊１１は、全体が平坦部１３０に接着されている場合もあれば、一部が平坦部１３０に接着されている場合もある。何れの場合であっても、細胞塊１１は、表面１１１からの脱離は無く遊離しにくいものとなる。
　＜実施例１＞
　上記実施形態に記載の細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法における実施例１を以下に説明する。
　＜細胞シート形成部材の作製＞
　図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、凹凸部１４０の内側に複数個の平坦部１３０を持つ細胞シート形成部材１００を、転写によって形成するためのニッケル製凹版を作製した。次いで、ニッケル製凹版をスタンパとして用い、ナノインプリント法によって、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を基材表面に固定したポリスチレンシートに凹凸部１４０、および平坦部１３０を加工し、それによって、実施例１の細胞シート形成部材１００を作製した。実施例１の細胞シート形成部材１００における凹凸部１４０は、複数の段差構造を備え、凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは３００ｎｍであった。凹凸部１４０における各凸部１４１の高さはＡＦＭを用いて測定し、凹部１４２の底面から凸部１４１の先端までの高さの平均は、４４６ｎｍであった。また、凹部１４２の底面から平坦部１３０までの高さの平均は４５５ｎｍであった。平坦部１３０は直径が１２μｍの円形を有し、隣接する平坦部１３０との最短距離は、５０μｍであった。そして、実施例１の細胞シート形成部材１００は、直径８．８ｍｍの円形に裁断し、滅菌処理としてＵＶ照射を行った後に、細胞培養試験に使用した。
　＜細胞培養試験＞
　先ず、マウス由来の心筋細胞（コスモバイオ社製）を細胞培養用フラスコ（２５ｃｍ２）で培養した。培養条件は、専用培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で行った。細胞の回収にはトリプシンを用い、定法に従い実施した。回収した細胞について血球計算版を用いて細胞数を計測した。
　次いで、細胞培養用マルチウェルプレート（４８孔）の底面に、直径８．８ｍｍの円形に裁断した実施例１の細胞シート形成部材１００を設置した。４×１０５細胞／ｍｌの濃度に調整した心筋細胞を０．２ｍｌずつ播種した。ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後に培地交換を行い、１日おきに培地交換を行い、細胞の形状を観察した。
　培養開始日を０日として、培養２日後には細胞が単層でコンフルエント状態に増殖し、４日後には、細胞が球状に凝集した細胞塊が形成された。細胞塊は、平坦部１３０に接着しており、培地交換によって基材から遊離することは無かった。次に、細胞シート形成部材１００を設置した細胞培養用マルチウェルプレートを２０℃のインキュベーターに３０分静置した。静置後に、ウェル内の培地をピペッティングし、遊離した細胞塊を培地とともに１５ｍｌの遠沈管に回収した。
　上記第１実施形態によれば、以下に列挙する効果が得られる。
　（１－１）平坦部１３０には、凹凸部１４０に位置する細胞が凝集し、少なくとも一部が平坦部１３０に接着する。これにより、細胞塊１１が平坦部１３０に形成され、細胞塊１１は、平坦部１３０に接着することで、遊離しにくいものとなる。したがって、平坦部１３０に細胞塊１１が接着されている状態において、細胞塊１１の識別、細胞塊１１の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
　（１－２）凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である。これにより、凹凸部１４０の細胞は、接着性が低下し、凝集可能となり、細胞塊１１を形成し易くなる。
　（１－３）平坦部１３０の面積が１００μｍ２以上、１００００μｍ２以下であることで、細胞塊１１は、確実に平坦部１３０に接着される。
　なお、上記第１実施形態は、以下のように変更して実施してもよい。
　・各平坦部１３０の面積は、１００μｍ２以上、１００００μｍ２以下に限定されるものではない。すなわち、各平坦部１３０は、細胞塊１１が遊離しない程度に細胞塊１１の少なくとも一部が接着するだけの面積を有していていればよい。
　・凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは、細胞を表面１１１上に保持できる程度であれば、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下に限定されるものではない。
　・凹凸部１４０において、凸部１４１の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか１種とすることが可能である。
　・凹凸部１４０において、凸部１４１の位置は、四角格子上の各格子点、六角格子上の各格子点、さらには、凹凸部１４０において不規則とすることも可能である。
　・凹凸部１４０の高さは、平坦部１３０の高さと同じであってもよいし、高くてもよいし、低くてもよい。
　［第２実施形態］
　［細胞シート形成部材］
　図４（ａ）に示すように、第２実施形態における細胞シート形成部材２００の表面２１１は、培養する細胞の配向性を制御する配向性制御部２０１と、細胞塊を形成するための細胞塊形成部２０２とを備えている。表面２１１には、複数の配向性制御部２０１が形成され、各配向性制御部２０１に隣接して細胞塊形成部２０２が形成されている。
　［配向性制御部］
　図４（ｂ）に示すように、配向性制御部２０１は、複数の第１平坦部２３０と、複数の第１凹凸部２４０とを備える。第１凹凸部２４０は、第１方向に延び、かつ、第２方向に並んで形成されている。各第１凹凸部２４０は、段差構造（第１段差構造）を有し、段差構造は、相互に隣り合う第１平坦部２３０の間を埋める。段差構造は、凸部、または、凹部である。なお、本実施形態における段差構造は、凸部２４１であり、第１凹凸部２４０は、相互に隣り合う第１平坦部２３０に挟まれた凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部２４１とを備える。
　各第１平坦部２３０は、１つの方向である第１方向に延びる平坦面である。第１平坦部２３０は、表面２１１の全体において、第１方向と直交する第２方向に並ぶ。第１凹凸部２４０もまた、第１方向に延び、かつ、第２方向に並ぶ。
　図４（ｃ）に示すように、第１凹凸部２４０を構成する各凸部２４１は、表面２１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。各第１凹凸部２４０は、凸部２４１のこのような配列を、第１方向、および、第２方向に繰り返す。三角格子の各頂点に凸部２４１が位置する第１凹凸部２４０であれば、凸部２４１を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。
　表面２１１と対向する方向から見て、各凸部２４１は、例えば円形状を有する。相互に隣り合う凸部２４１の中心間の距離の最頻値は、凸部２４１のピッチである。また、凸部２４１の平面視形状における凸部の最大幅は、凸部２４１の直径である。
　凸部２４１のピッチである第１ピッチが下記（Ｃ）および（Ｄ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃える観点において好適である。すなわち、凸部２４１のピッチが下記（Ｃ）および（Ｄ）を満たす構成は、動物細胞、ヒト・マウスなどの筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞などの接着に対する優劣が、第１平坦部２３０と第１凹凸部２４０との間で明確に区画される観点において好適である。
　（Ｃ）凸部２４１の第１ピッチ：１０ｎｍ以上、１０μｍ以下。好ましくは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下。より好ましくは、１００ｎｍ以上、５μｍ以下。更により好ましくは、５００ｎｍ以上、２μｍ以下。
　（Ｄ）凸部２４１の直径：凸部２４１のピッチの５０％以上、１００％以下。
　各第１平坦部２３０の第２方向（短辺方向）での長さは、第１平坦部２３０の幅である。また、相互に隣り合う第１平坦部２３０間の第２方向（短辺方向）での長さは、第１凹凸部２４０の幅である。
　第１平坦部２３０の幅、および、第１凹凸部２４０の幅は、例えば、培養の対象となる細胞の大きさ（５μｍ以上、１００μｍ以下）の１／１０倍以上１０倍以下である。第１平坦部２３０の幅、および、第１凹凸部２４０の幅が下記（Ｅ）および（Ｆ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃えることを容易なものとする観点において好適である。
　（Ｅ）第１平坦部２３０の幅：１０μｍ以上、５０μｍ以下。
　（Ｆ）第１凹凸部２４０の幅：１０μｍ以上、５０μｍ以下。
　第１凹凸部２４０は、相互に隣り合う凸部２４１、および、第１平坦部２３０とそれに隣接する凸部２４１との間に、凹部２４２を備えてもよい。複数の凸部２４１が第１凹凸部２４０に点在するため、凸部２４１間の空間である凹部２４２は、第１凹凸部２４０において、第１方向、および、第２方向に連なる。
　細胞シート形成部材２００の厚み方向において、凹部２４２の底面と第１平坦部２３０との間の長さは、第１平坦部２３０の高さである。また、細胞シート形成部材２００の厚み方向において、各凸部２４１の先端面と第１平坦部２３０との間の高低差は、境界段差である。凹部２４２の底面と各凸部２４１の先端面の高低差は、凸部２４１の高さである。各凸部２４１の先端面と第１平坦部２３０とが面一である構成では、第１平坦部２３０の高さと、凸部２４１の高さとが、相互に等しい。凸部２４１の高さに対する凸部２４１のピッチの比は、凸部２４１のアスペクト比である。
　境界段差が下記（Ｇ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。凸部２４１の高さが下記（Ｈ）を満たす構成、また、凸部２４１のアスペクト比が下記（Ｉ）を満たす構成は、第１凹凸部２４０の構造上での安定性を高められる観点、また、第１凹凸部２４０の形成を容易なものとする観点において好適である。
　（Ｇ）境界段差：０．５μｍ以下、好ましくは０．３μｍ以下。
　（Ｈ）凸部２４１の高さ：５ｎｍ以上５μｍ以下。好ましくは、５０ｎｍ以上５μｍ以下。
　（Ｉ）凸部２４１のアスペクト比：０．１以上１０以下。
　また、第１平坦部２３０と第１凹凸部２４０とで構成された１つの配向性制御部２０１は、下記（Ｊ）（Ｋ）の条件を満たすことが好ましい。
　（Ｊ）配向性制御部２０１の幅：５０μｍ以上、１ｍｍ以下。
　（Ｋ）配向性制御部２０１の長さ：１００μｍ以上。
　各配向性制御部２０１が（Ｈ）および（Ｉ）を満たす構成では、細胞が第１方向に配向性を有する領域を細胞シートに形成することができる。
　そして、上記（Ｊ）および（Ｋ）を満たす構成であれば、第１平坦部２３０に対する接着が優勢である細胞であれ、第１凹凸部２４０に対する接着が優勢である細胞であれ、一方の構造体に対して細胞が優先的に接着し、他方の構造体に対する接着の劣勢と相まって、双方の構造体の延在方向である第１方向に、細胞の伸長方向が揃えられる。結果として、表面１１１に沿った二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の伸長方向を一次元方向に揃えること、すなわち、細胞の配向性を向上させることが可能となる。なお、細胞シートは、培養細胞が一次元方向に揃った状態、すなわち配向性を有する状態で厚さ方向に積み上がって三次元組織を形成することも可能である。
　また、上記（Ｇ）を満たす構成、特に、各凸部２４１の先端面と第１平坦部２３０とが面一である構成は、第１凹凸部２４０と第１平坦部２３０とを覆うように形成された細胞シートにおいて、それの平坦性を高めることを可能とする。さらに、上記（Ｈ）（Ｉ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性をより一層に高めることが可能である。
　なお、図４（ｄ）は、配向性制御部２０１の表面を走査電子顕微鏡によって撮影した画像である。
　［細胞塊形成部］
　細胞塊形成部２０２は、配向性制御部２０１に対して隣接する第２平坦部２２１と第２凹凸部２２２とを備えている。第２平坦部２２１は、対をなす２つの配向性制御部２０１に挟まれ第１方向に延びている。具体的には、第２平坦部２２１は、各配向性制御部２０１の第１凹凸部２４０に隣接し、かつ、一方の配向性制御部２０１の第１凹凸部２４０と他方の配向性制御部２０１の第１凹凸部２４０とによって挟まれている。
　第２平坦部２２１の幅は、下記（Ｌ）（Ｍ）の条件を満たすことが好ましい。
　（Ｌ）第２平坦部２２１の幅：５０μｍ以上、２００μｍ以下。
　（Ｍ）第２平坦部２２１の長さ：１００μｍ以上。
　第２平坦部２２１が（Ｌ）および（Ｍ）を満たす構成では、第２平坦部２２１に細胞塊１１が接着され、遊離しにくくなる。第２平坦部２２１の幅は、全ての位置で同じでなくてもよい。
　第２凹凸部２２２は、隣り合う２つの配向性制御部２０１の第１凹凸部２４０の間に位置している。また、第２凹凸部２２２は、第２平坦部２２１の第１方向の両端部と繋がっている。第２凹凸部２２２を構成する各凸部２２３は、表面２１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。各第２凹凸部２２２は、凸部２２３のこうした配列を、第１方向、および、第２方向に繰り返す。三角格子の各頂点に凸部２２３が位置する第２凹凸部２２２であれば、凸部２２３を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、凸部２４１と同時に形成することが可能となる。
　また、第２凹凸部２２２の幅は、下記（Ｎ）の条件を満たすことが好ましい。
　（Ｎ）第２凹凸部２２２の幅（隣り合う２つの配向性制御部２０１の間の長さ、すなわち、隣り合う２つの配向性制御部２０１に挟まれた部分の第２方向の長さ）：５０μｍ以上、１ｍｍ以下。
　第２凹凸部２２２の幅は、全ての位置で同じでなくてもよい。
　また、第２凹凸部２２２を構成する凸部２２３のピッチは、下記（Ｏ）の条件を満たすことが好ましい。
　（Ｏ）第２凹凸部２２２における凸部２２３のピッチ：１０ｎｍ以上、１０μｍ以下。好ましくは、１００ｎｍ以上、５μｍ以下。より好ましくは、３００ｎｍ以上、５μｍ以下。更により好ましくは、５００ｎｍ以上、２μｍ以下。
　凸部２２３のピッチは、全ての位置で同じでなくてもよい。
　第２凹凸部２２２における凸部２２３のピッチは、第１凹凸部２４０における凸部２４１の第１ピッチと同じであってもよいし、大きくても、小さくてもよい。すなわち、第２凹凸部２２２における凸部２２３のピッチは、細胞が凝集し易い寸法であればよい。また、第２凹凸部２２２の幅は、細胞塊を形成するための細胞を保持できる幅を有していればよく、第１凹凸部２４０の幅と同じでもよいし、広くても狭くてもよい。
　第２凹凸部２２２は、（Ｎ）および（Ｏ）の条件を満たすことで、細胞が凝集し易くなり、細胞塊を形成することができる。そして、第２平坦部２２１には、第２凹凸部２２２で遊離する細胞が凝集して細胞塊１１の少なくとも一部が接着される。
　すなわち、表面２１１は、１つの第２平坦部２２１を２つの第２凹凸部２２２で挟んで構成された島状領域が離間して第２方向に並び、各島状領域の周囲に、第２凹凸部２２２が形成される。このような細胞シート形成部材２００では、配向性制御部２０１において、細胞を第１方向に配向させて培養することができるとともに、細胞塊形成部２０２において、細胞塊１１を形成することができる。
　［細胞シート形成部材の製造方法］
　次に、細胞シート形成部材の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ナノインプリント法を用いて、細胞シート形成部材の表面２１１を、凹版２５０の転写によって形成する例を説明する。
　図５に示すように、細胞シート形成部材の製造方法は、凹版２５０を形成する工程と、細胞シート形成部材２００の表面２１１を凹版２５０の転写によって形成する工程とを含む。
　凹版２５０の下面は、第１平坦部２３０を成形する第１平坦成形部２５１と、第１凹凸部２４０を成形する第１凹凸成形部２５２と、第２平坦部２２１を成形する第２平坦成形部２５３と、第２凹凸部２２２を成形する第２凹凸成形部２５４とを備える。凹版２５０を形成する工程では、例えば、凹版２５０を形成するためのシリコン基板に対して、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて、凹凸部が形成される。また、凹版２５０自体を原盤からの１回、あるいは複数回の転写によって得てもよい。原盤には、例えば、シリコン基板に対するフォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて凹版２５０の表面形状に対応する形状が作り込まれている。
　次に、細胞シート形成部材２００を形成するための基材２６０の表面２１１に、凹版２５０の下面を対向させる。基材２６０の形成材料は、例えば、熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂である。そして、基材２６０が流動性を有する状態で、基材２６０の表面２１１に、凹版２５０の下面を押し付ける。次いで、基材２６０の流動性を抑えた状態で、凹版２５０を基材２６０の表面２１１から離型する。これによって、基材２６０の表面２１１に凹版２５０の成形部２５１～２５４が転写され、第１平坦部２３０、第１凹凸部２４０、第２平坦部２２１および第２凹凸成形部２５４が形成される。
　基材２６０の形成材料の熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂の表面に、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリーリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲルなどの接着因子を含む有機物が塗布されていてもよい。また、基材２６０の形成材料として、多糖類やタンパク質などの生体材料を用いてもよい。
　［細胞シートの製造方法］
　次に、細胞シート形成部材２００を用いて製造される細胞シートについて説明する。
　図６（ａ）に示すように、細胞シート形成部材２００の表面２１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、第１平坦部２３０に接着する細胞Ｓ１を含む。この際、配向性制御部２０１において、各第１平坦部２３０は、第１凹凸部２４０の長辺方向（第１方向）に延び、各第１平坦部２３０の幅は、一般的な細胞の大きさの１～数倍程度である。そのため、図６（ｂ）に示すように、細胞Ｓ１の位置は、第１平坦部２３０の範囲内に優先的に分布し、細胞Ｓ１は、第１方向に細胞の長軸方向が配置されて直線状に連なる。すなわち、細胞Ｓ１の伸長方向は、第１平坦部２３０の長辺方向と揃うように制御される。図６は、細胞シート形成部材２００を用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、図６に示す例では、筋芽細胞の伸長方向が一方向に揃うように制御されている。図９は、細胞シート形成部材２００の配向性制御部２０１で培養された筋芽細胞の一例を示しており、図９に示す例では、筋芽細胞の伸長方向が一方向に揃うように制御されている。
　なお、図６（ｃ）に示すように、上記（Ｃ）を満たさない細胞塊形成基材では、細胞Ｓ１の配向性が制御されないため、細胞の長軸方向はランダムな方向で配置される。図１０は、参考例となる市販の細胞培養シャーレを用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、図１０に示す例では、筋芽細胞の伸長方向がランダムに配置されている。
　図７（ａ）に示すように、細胞シート形成部材２００の表面２１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、第１凹凸部２４０に接着する細胞Ｓ２を含む。この際、配向性制御部２０１において、各第１凹凸部２４０は、第１凹凸部２４０の長辺方向（第１方向）に延び、各第１凹凸部２４０の幅は、一般的な細胞の大きさの１～数倍程度である。そのため、図７（ｂ）に示すように、細胞Ｓ２の位置は、第１凹凸部２４０の範囲内に優先的に分布し、細胞Ｓ２は、第１方向に細胞の長軸方向が配置されて直線状に連なる。すなわち、細胞Ｓ２の伸長方向は、第１凹凸部２４０の長辺方向と揃うように制御される。
　なお、図７（ｃ）が示すように、上記（Ａ）を満たさない細胞シート形成部材では、細胞Ｓ２の配向性が制御されないため、細胞の長軸方向はランダムな方向で存在する。
　細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、細胞シートを形成する細胞を含んでいる。図８（ａ）に示すように、細胞は、第１平坦部２３０に対して優先的に接着する細胞Ｓ１であり、第１平坦部２３０よりも劣勢ではあるが、第１凹凸部２４０に対する接着を許容された細胞Ｓ２でもある。表面１１１に播種された細胞は、培養初期は表面１１１に単層で広がった状態で培養される。配向性制御部２０１では、図８（ｂ）に示すように、第１平坦部２３０、および、第１凹凸部２４０は、第１方向に延び、第２方向に交互に配置される。そのため、細胞シート形成部材の表面２１１には、例えば、第１平坦部２３０に優先的に接着された細胞Ｓ１の配向性が、第１平坦部２３０の構造、および、それを区画する第１凹凸部２４０の構造によって制御される。
　そして、相互に隣り合う第１平坦部２３０に挟まれた第１凹凸部２４０においては、第１平坦部２３０よりも劣勢ではあるが、第１凹凸部２４０に接着した細胞Ｓ２にて、平坦部１３０による配向性の制御が反映される。結果として、図８（ｃ）に示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる細胞シートＳＡを形成する。
　図６（ａ）～図８（ｃ）に示す細胞シート形成部材２００では、配向性制御部２０１において、細胞が第１方向に配向性を有するように培養される。これに対して、細胞塊形成部２０２では、一定時間経過すると、自然に、第２凹凸部２２２に位置する細胞が凝集し、少なくとも第２平坦部２２１上に球形状や棒形状をした細胞塊１１を形成する。細胞塊１１は、少なくとも一部が第２平坦部２２１に接着され遊離しないようになっていればよい。細胞塊１１は、全体が第２平坦部２２１に接着されている場合もあれば、一部が第２平坦部２２１に接着されている場合もある。さらに、細胞塊１１は、配向性制御部２０１から細胞塊形成部２０２にはみ出した部分である。何れの場合であっても、細胞塊１１は、表面２１１からの脱離は無く遊離しにくいものとなる。
　＜実施例２＞
　上記実施形態に記載の細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法における実施例２を以下に説明する。
　＜細胞シート形成部材の作製＞
　図４（ａ）および（ｂ）に示すように、外周部に第２凹凸部２２２、第２凹凸部２２２の内側に配向性制御部２０１（第１平坦部２３０および第１凹凸部２４０）、および、２つの配向性制御部２０１に挟まれた第２平坦部２２１を備えた細胞シート形成部材２００を、転写によって形成するためのニッケル製凹版を作製した。次いで、ニッケル製凹版をスタンパとして用い、ナノインプリント法によって、ポリスチレンシートに第２凹凸部２２２、配向性制御部２０１（第１平坦部２３０および第１凹凸部２４０）、および第２平坦部２２１を加工し、それによって、実施例２の細胞シート形成部材２００を作製した。
　実施例２の細胞シート形成部材２００における第２凹凸部２２２は、複数の段差構造を備え、第２凹凸部２２２における凸部２２３のピッチは３００ｎｍであった。第２凹凸部２２２における各凸部２２３の高さはＡＦＭを用いて測定し、凹部の底面から凸部２２３の先端までの高さの平均は、４４６ｎｍであった。
　配向性制御部２０１は、第１平坦部２３０および第１凹凸部２４０を備え、各第１平坦部２３０は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、第１平坦部２３０は、細胞シート形成部材２００の表面における外周部を除いた領域で、第１方向と交差する第２方向に並び、各第１平坦部２３０の幅（第２方向での長さ）は、１０μｍであった。各第１凹凸部２４０は、相互に隣り合う第１平坦部２３０の間を埋める複数の段差構造を備え、隣り合う第１平坦部２３０間の第２方向での長さ（第１凹凸部２４０の幅）は１０μｍであり、第１凹凸部２４０における凸部２４１のピッチは３００ｎｍであった。第１凹凸部２４０における各凸部２４１の高さは、ＡＦＭを用いて測定し、凹部の底面から凸部２４１の先端までの高さの平均は、４４６ｎｍであった。また、凹部の底面から第１平坦部２３０までの高さの平均は４５５ｎｍであった。第２平坦部２２１の長辺は、第１凹凸部２４０の長辺に隣接し、各第２平坦部２２１の幅は、１００μｍであった。そして、実施例２の細胞シート形成部材２００は、直径８．８ｍｍの円形に裁断し、滅菌処理としてＵＶ照射を行った後に、細胞培養試験に使用した。
　＜細胞培養試験＞
　先ず、マウス由来の心筋細胞（コスモバイオ社製）を細胞培養用フラスコ（２５ｃｍ２）で培養した。培養条件は、専用培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で行った。細胞の回収にはトリプシンを用い、定法に従い実施した。回収した細胞について血球計算版を用いて細胞数を計測した。
　次いで、細胞培養用マルチウェルプレート（４８孔）の底面に、直径８．８ｍｍの円形に裁断した実施例２の細胞シート形成部材２００を設置した。４×１０５細胞／ｍｌの濃度に調整した心筋細胞を０．２ｍｌずつ播種した。ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後に培地交換を行い、１日おきに培地交換を行い、細胞の形状を観察した。
　培養開始日を０日として、４日後には、細胞が棒状に凝集した細胞塊が形成された。細胞塊は、第２平坦部２２１に接着しており、培地交換によって基材から遊離することは無かった。
　上記第２実施形態によれば、以下に列挙する効果が得られる。
　（２－１）配向性制御部２０１では、第１方向に、細胞の伸長方向を揃えることができる。結果として、二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の配向性を向上させることができる。また、細胞塊形成部２０２では、第２平坦部２２１には、第２凹凸部２２２に位置する細胞が凝集し、少なくとも一部が第２平坦部２２１に接着する。これにより、細胞塊１１が第２平坦部２２１に形成され、細胞塊１１は、第２平坦部２２１に接着することで、遊離しにくいものとなる。したがって、細胞塊１１が第２平坦部２２１に接着された状態において、細胞塊１１の識別、細胞塊１１の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
　（２－２）第２平坦部２２１は、２つの第１凹凸部２４０に挟まれて位置している。したがって、配向性を有する細胞の近くに細胞塊１１を形成することができる。
　（２－３）第２凹凸部２２２は、２つの第１凹凸部２４０に挟まれて位置している。したがって、配向性を有する細胞の近くの細胞で細胞塊１１を形成することができる。
　（２－４）第２平坦部２２１は、第２方向の長さが５０μｍ以上、２００μｍ以下であり、第１方向の長さが１００μｍ以上である。これにより、第２平坦部２２１には、第２凹凸部２２２に位置する細胞が凝集し、少なくとも細胞塊１１の一部を第２平坦部２２１に接着することができる。
　（２－５）第２凹凸部２２２において、隣り合う２つの配向性制御部２０１に挟まれている部分の第２方向の長さが５０μｍ以上、１ｍｍ以下である。また、第２凹凸部２２２における凸部のピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である。したがって、第２凹凸部２２２の細胞が凝集し易くなる。
　（２－６）第１凹凸部２４０は、第２方向の長さが１０μｍ以上、５０μｍ以下であり、第１方向の長さが１００μｍ以上である。これにより、二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の配向性を向上させることができる。
　上記第２実施形態によれば、以下のように変更して実施してもよい。
　・二次元方向に広がる細胞シートにおいて細胞の配向性向上が可能であれば、第１凹凸部２４０は、第２方向の長さが１０μｍ以上、５０μｍ以下、かつ、第１方向の長さが１００μｍ以上でなくてもよい。
　・第２凹凸部２２２に位置する細胞の凝集が可能であれば、第２凹凸部２２２は、第２方向の長さが５０μｍ以上、１ｍｍ以下、かつ、第２凹凸部２２２における凸部２２３のピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下でなくてもよい。
　・少なくとも細胞塊１１の一部を第２平坦部２２１に接着可能であれば、第２平坦部２２１は、第２方向の長さが５０μｍ以上、２００μｍ以下、かつ、第１方向の長さが１００μｍ以上でなくてもよい。
　・配向性を有する細胞の近くの細胞で細胞塊１１が形成可能であれば、第２凹凸部２２２は、第１凹凸部２４０に挟まれて位置していなくてもよい。
　・配向性を有する細胞の近くに細胞塊が形成可能であれば、第２平坦部２２１は、第１凹凸部２４０に挟まれて位置していなくてもよい。
　［第２実施形態における細胞シート形成部材の配向性制御部］
　・凸部２４１の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか１種とすることが可能である。
　・凸部２４１の位置は、四角格子上の各格子点、六角格子上の各格子点、さらには、第１凹凸部２４０において不規則とすることも可能である。
　・第１凹凸部２４０の有する形状は、第１方向に延びる直線状に限らず、第１方向に延びる折れ線状や、第１方向に延びる曲線状に変更することも可能である。
　・第１凹凸部２４０の底面と第１平坦部２３０とを面一に変更すること、すなわち、凸部２４１の基端部と第１平坦部２３０とを面一に変更することも可能である。なお、上述したように、第１凹凸部２４０の先端面と第１平坦部２３０とを面一とする構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。
　・第１凹凸部２４０を構成する段差構造を、凹部に変更することも可能であり、凹部と凸部との両方に変更することも可能である。例えば、第１凹凸部２４０は、第１平坦部２３０に連続する１つの側面を備え、該側面に複数の凹部が形成された構造に変更することも可能である。
　・１つの第１凹凸部２４０の幅と、他の第１凹凸部２４０の幅とは、相互に異なっていてもよいし、相互に等しくてもよい。なお、１つの第１凹凸部２４０の幅と、他の第１凹凸部２４０の幅とが、相互に等しければ、細胞シートが有する特性について、第２方向での均一性を高めることが可能となる。
　・１つの第１平坦部２３０の幅と、他の第１平坦部２３０の幅とは、相互に異なってもよいし、相互に等しくてもよい。なお、１つの第１平坦部２３０の幅と、他の第１平坦部２３０の幅とが、相互に等しければ、細胞シートが有する特性について、第２方向での均一性を高めることが可能となる。
　・第１平坦部２３０の幅と、第１凹凸部２４０の幅とは、相互に異なっていてもよいし、相互に等しいものであってもよい。例えば、細胞の接着が第１平坦部２３０において優勢である場合、第１平坦部２３０の幅は、配向性を制御できる範囲であって、かつ、第１凹凸部２４０の幅よりも大きいことが好適である。また、細胞の接着が第１凹凸部２４０において優勢である場合、第１凹凸部２４０の幅は、配向性を制御できる範囲であって、かつ、第１平坦部２３０の幅よりも大きいことが好適である。
　・第１平坦部２３０と第１凹凸部２４０とが交互に並ぶ第２方向は、第１方向と直交する方向に限らず、第１方向と交差する方向であれば、例えば、第１方向と形成する角度が４５°である方向とすることも可能である。
　［第２実施形態における細胞シート形成部材の細胞塊形成部］
　・第２凹凸部２２２において、凸部の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか１種とすることが可能である。
　・第２凹凸部２２２において、凸部の位置は、四角格子上の各格子点、六角格子上の各格子点、さらには、第１凹凸部２４０において不規則とすることも可能である。
　・第２凹凸部２２２の高さは、第１平坦部２３０および／または第１凹凸部２４０の高さと同じであってもよいし、高くてもよいし、低くてもよい。
　・細胞塊形成部２０２は、配向性制御部２０１に隣接して第２平坦部２２１が設けられ、第２平坦部２２１に第２凹凸部２２２が繋がって設けられていれば、例えば第２凹凸部２２２が配向性制御部２０１に隣接していなくてもよい。配向性を有した細胞の近くに細胞塊１１が形成されればよいからである。
　さらに、上記第１実施形態および第２実施形態は、以下のように変更して実施してもよい。
　・細胞シート形成部材１００，２００の表面１１１，２１１は、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリーリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲルなどの接着因子を含む有機物が塗布されてもよい。あるいは、金属から構成される面であってもよい。また、細胞シート形成部材１００，２００の表面１１１，２１１は、細胞の接着性や細胞シートの平坦性を高めることを目的として、親水性、あるいは、疎水性を有してもよい。
　・細胞懸濁液中には、細胞外基質産生促進因子を添加するようにしてもよい。細胞外基質産生促進因子としては、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはそれらの塩を挙げることができる。コラーゲン産生の観点から、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはそれらの誘導体およびその塩（例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩など）とすることが好ましい。アスコルビン酸としては、Ｌ体であることが好ましい。
　・細胞シート形成部材１００，２００の表面１１１，２１１に形成した細胞シートの剥離・回収を容易にするために、表面１１１，２１１には、刺激応答性材料を塗布してもよい。刺激応答性材料としては、温度変化によって水親和性が変化する温度応答性ポリマーが好ましい。具体的にはポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）が好ましい。刺激応答性材料は慣用の塗布方法を用いて基材に塗布してもよいし、刺激応答性材料を処理した基材に下記に記載した方法を用いて構造を加工してもよい。また、細胞塊の剥離・回収を容易にするために、細胞塊が形成された培養基材に対して超音波処理を行ってもよい。
　・細胞シート形成部材１００，２００は、凹版を用いた転写体に限らず、凸版を用いた転写体であってもよく、さらに、射出成形による成形体とすることも可能である。すなわち、射出成形を用いて細胞シート成形部材を製造することも可能である。
　［その他］
　・細胞シート形成部材は、マルチウェルプレート、シャーレ、フラスコ、チェンバースライドなど、細胞懸濁液を保持可能なものであれば、それに適用することができる。
　１１…細胞塊、１００…細胞シート形成部材、１１０…培養皿、１１１…表面、１２０…蓋、１３０…平坦部、１４０…凹凸部、１４１…凸部、１５０…凹版、１５１…平坦成形部、１５２…凹凸成形部、１６０…基材、２００…細胞シート形成部材、２０１…配向性制御部、２０２…細胞塊形成部、２１１…表面、２２１…第２平坦部、２２２…第２凹凸部、２２３…凸部、２３０…第１平坦部、２４０…第１凹凸部、２４１…凸部、２４２…凹部、２５０…凹版、２５１…第１平坦成形部、２５２…第１凹凸成形部、２５３…第２平坦成形部、２５４…第２凹凸成形部、２６０…基材。

Claims (14)

  1. 　細胞シートを形成するための表面を備え、
    　前記表面は、細胞の接着が優勢な平坦部と、前記細胞の接着が前記平坦部に対して劣勢な凹凸部とを備え、
    　前記平坦部は、前記表面と対向する方向から見て、円形形状または多角形形状を有し、
    　少なくとも前記平坦部に細胞塊が形成されるように構成されている
    　細胞シート形成部材。
  2. 　前記凹凸部における凸部のピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である
    　請求項１に記載の細胞シート形成部材。
  3. 　前記平坦部の面積は、１００μｍ２以上、１００００μｍ２以下である
    　請求項１または２に記載の細胞シート形成部材。
  4. 　請求項１から３のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材の表面に細胞塊が形成された基材。
  5. 　凹版を形成することと、
    　細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することとを含み、
    　前記表面は、細胞の接着が優勢な平坦部と、前記細胞の接着が前記平坦部に対して劣勢な凹凸部とを備え、
    　前記凹版は、前記平坦部を成形する平坦成形部と、前記凹凸部を成形する凹凸成形部とを備え、
    　前記凹版を形成することは、前記平坦成形部および前記凹凸成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む、
    　細胞シート形成部材の製造方法。
  6. 　細胞シートを形成するための表面を備え、
    　前記表面は、細胞の配向性を制御するための配向性制御部と、前記細胞が凝集され細胞塊を形成するための細胞塊形成部とを備え、
    　前記配向性制御部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１方向と交差する第２方向に並ぶ第１平坦部と、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１凹凸部とを備え、
    　前記細胞塊形成部は、前記配向性制御部に隣接する第２平坦部と、前記配向性制御部に隣接し、かつ、前記第２平坦部と繋がる第２凹凸部とを備え、
    　前記第２平坦部に少なくとも細胞塊の一部が形成されるように構成されている
    　細胞シート形成部材。
  7. 　前記第２平坦部は、前記第１凹凸部に挟まれて位置している
    　請求項６に記載の細胞シート形成部材。
  8. 　前記第２凹凸部は、前記第１凹凸部に挟まれて位置している
    　請求項７に記載の細胞シート形成部材。
  9. 　前記第２平坦部は、５０μｍ以上、２００μｍ以下の前記第２方向の長さと、１００μｍ以上の前記第１方向の長さとを有する
    　請求項６ないし８のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
  10. 　前記第２凹凸部において、隣り合う前記配向性制御部に挟まれた部分の前記第２方向の長さが５０μｍ以上、１ｍｍ以下であり、
    　前記第２凹凸部における凸部のピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である
    　請求項６ないし９のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
  11. 　前記第１凹凸部は、１０μｍ以上、５０μｍ以下の前記第２方向の長さと、１００μｍ以上の前記第１方向の長さとを有する
    　請求項６ないし１０のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
  12. 　請求項６から１１のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材の表面に細胞塊が形成された基材。
  13. 　前記配向性制御部には、前記第１方向に配向性を有した細胞が形成された
    　請求項１２に記載の基材。
  14. 　凹版を形成することと、
    　細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することとを含み、
    　前記表面は、細胞の配向性を制御するための配向性制御部と、前記細胞が凝集され細胞塊を形成するための細胞塊形成部とを備え、
    　前記配向性制御部は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１方向と交差する第２方向に並ぶ第１平坦部と、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１凹凸部とを備え、
    　前記細胞塊形成部は、前記配向性制御部に隣接する第２平坦部と、前記配向性制御部に隣接し、かつ、前記第２平坦部と繋がる第２凹凸部とを備え、
    　前記凹版は、前記第１平坦部を成形する第１平坦成形部と、
    　前記第１凹凸部を成形する第１凹凸成形部と、
    　前記第２平坦部を成形する第２平坦成形部と、
    　前記第２凹凸部を成形する第２凹凸成形部とを備え、
    　前記凹版を形成することは、前記第１凹凸成形部および前記第２凹凸成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む、
    　細胞シート形成部材の製造方法。
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