JPWO2020166279A1 - 細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[細胞シート形成部材]
図1に示すように、細胞シート形成部材100は、例えば、シャーレの培養皿110に配置されるシート材である。細胞シート形成部材100は、培養皿110に載置されるものであってもよいし、シャーレを直接加工して設けるものであってもよい。シャーレに直接加工して設ける場合、細胞シート形成部材100は、例えばシャーレを射出成型するときにインサート成形される。シャーレは、培養皿110と蓋120とに囲まれた空間に細胞懸濁液を保持する。細胞懸濁液に含まれる細胞は接着性の細胞であれば特に限定されないが、生体内の各組織由来の細胞や幹細胞、ES細胞やiPS細胞から分化誘導した種々の細胞等を使用できる。
(A)凹凸部140における凸部141のピッチ:10nm以上、10μ以下。好ましくは、100nm以上、5μm以下。より好ましくは、300nm以上、5μm以下。更により好ましくは、500nm以上、2μm以下。
(B)平坦部130の面積:100μm2以上、10000μm2以下。
凸部141は、(A)の条件を満たすことで、培養初期には基材に単層で広がった細胞が凝集し易くなり、細胞塊11を形成することができる。また、平坦部130は、(B)の条件を満たすことで、細胞塊11が接着され、遊離しにくくなる。そして、細胞塊11は遊離しないため、細胞塊11の識別、細胞塊11の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
次に、細胞シート形成部材の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ナノインプリント法を用いて、細胞シート形成部材の表面111を、凹版150の転写によって形成する例を説明する。
次に、細胞シート形成部材100を用いて製造される細胞シートについて説明する。
細胞シート形成部材100の表面111上に位置する細胞懸濁液は、例えば、細胞塊11を形成する細胞を含んでいる。この際、表面111に播種された細胞は、培養初期は表面111に単層で広がった状態で培養される。そして、一定時間経過すると、自然に、凹凸部140に位置する細胞が凝集し、少なくとも平坦部130上に球形状や棒形状をした細胞塊11を形成する。細胞塊11は、少なくとも一部が平坦部130に接着され遊離しないようになっていればよい。細胞塊11は、全体が平坦部130に接着されている場合もあれば、一部が平坦部130に接着されている場合もある。何れの場合であっても、細胞塊11は、表面111からの脱離は無く遊離しにくいものとなる。
上記実施形態に記載の細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法における実施例1を以下に説明する。
図2(a)および図2(b)に示すように、凹凸部140の内側に複数個の平坦部130を持つ細胞シート形成部材100を、転写によって形成するためのニッケル製凹版を作製した。次いで、ニッケル製凹版をスタンパとして用い、ナノインプリント法によって、温度応答性ポリマー(PIPAAm)を基材表面に固定したポリスチレンシートに凹凸部140、および平坦部130を加工し、それによって、実施例1の細胞シート形成部材100を作製した。実施例1の細胞シート形成部材100における凹凸部140は、複数の段差構造を備え、凹凸部140における凸部141のピッチは300nmであった。凹凸部140における各凸部141の高さはAFMを用いて測定し、凹部142の底面から凸部141の先端までの高さの平均は、446nmであった。また、凹部142の底面から平坦部130までの高さの平均は455nmであった。平坦部130は直径が12μmの円形を有し、隣接する平坦部130との最短距離は、50μmであった。そして、実施例1の細胞シート形成部材100は、直径8.8mmの円形に裁断し、滅菌処理としてUV照射を行った後に、細胞培養試験に使用した。
先ず、マウス由来の心筋細胞(コスモバイオ社製)を細胞培養用フラスコ(25cm2)で培養した。培養条件は、専用培地を用い、37℃、5%CO2雰囲気下で行った。細胞の回収にはトリプシンを用い、定法に従い実施した。回収した細胞について血球計算版を用いて細胞数を計測した。
(1−1)平坦部130には、凹凸部140に位置する細胞が凝集し、少なくとも一部が平坦部130に接着する。これにより、細胞塊11が平坦部130に形成され、細胞塊11は、平坦部130に接着することで、遊離しにくいものとなる。したがって、平坦部130に細胞塊11が接着されている状態において、細胞塊11の識別、細胞塊11の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
なお、上記第1実施形態は、以下のように変更して実施してもよい。
・凹凸部140において、凸部141の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか1種とすることが可能である。
・凹凸部140の高さは、平坦部130の高さと同じであってもよいし、高くてもよいし、低くてもよい。
[細胞シート形成部材]
図4(a)に示すように、第2実施形態における細胞シート形成部材200の表面211は、培養する細胞の配向性を制御する配向性制御部201と、細胞塊を形成するための細胞塊形成部202とを備えている。表面211には、複数の配向性制御部201が形成され、各配向性制御部201に隣接して細胞塊形成部202が形成されている。
図4(b)に示すように、配向性制御部201は、複数の第1平坦部230と、複数の第1凹凸部240とを備える。第1凹凸部240は、第1方向に延び、かつ、第2方向に並んで形成されている。各第1凹凸部240は、段差構造(第1段差構造)を有し、段差構造は、相互に隣り合う第1平坦部230の間を埋める。段差構造は、凸部、または、凹部である。なお、本実施形態における段差構造は、凸部241であり、第1凹凸部240は、相互に隣り合う第1平坦部230に挟まれた凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部241とを備える。
各第1平坦部230の第2方向(短辺方向)での長さは、第1平坦部230の幅である。また、相互に隣り合う第1平坦部230間の第2方向(短辺方向)での長さは、第1凹凸部240の幅である。
(F)第1凹凸部240の幅:10μm以上、50μm以下。
第1凹凸部240は、相互に隣り合う凸部241、および、第1平坦部230とそれに隣接する凸部241との間に、凹部242を備えてもよい。複数の凸部241が第1凹凸部240に点在するため、凸部241間の空間である凹部242は、第1凹凸部240において、第1方向、および、第2方向に連なる。
(H)凸部241の高さ:5nm以上5μm以下。好ましくは、50nm以上5μm以下。
また、第1平坦部230と第1凹凸部240とで構成された1つの配向性制御部201は、下記(J)(K)の条件を満たすことが好ましい。
(K)配向性制御部201の長さ:100μm以上。
各配向性制御部201が(H)および(I)を満たす構成では、細胞が第1方向に配向性を有する領域を細胞シートに形成することができる。
[細胞塊形成部]
細胞塊形成部202は、配向性制御部201に対して隣接する第2平坦部221と第2凹凸部222とを備えている。第2平坦部221は、対をなす2つの配向性制御部201に挟まれ第1方向に延びている。具体的には、第2平坦部221は、各配向性制御部201の第1凹凸部240に隣接し、かつ、一方の配向性制御部201の第1凹凸部240と他方の配向性制御部201の第1凹凸部240とによって挟まれている。
(L)第2平坦部221の幅:50μm以上、200μm以下。
(M)第2平坦部221の長さ:100μm以上。
(N)第2凹凸部222の幅(隣り合う2つの配向性制御部201の間の長さ、すなわち、隣り合う2つの配向性制御部201に挟まれた部分の第2方向の長さ):50μm以上、1mm以下。
また、第2凹凸部222を構成する凸部223のピッチは、下記(O)の条件を満たすことが好ましい。
第2凹凸部222における凸部223のピッチは、第1凹凸部240における凸部241の第1ピッチと同じであってもよいし、大きくても、小さくてもよい。すなわち、第2凹凸部222における凸部223のピッチは、細胞が凝集し易い寸法であればよい。また、第2凹凸部222の幅は、細胞塊を形成するための細胞を保持できる幅を有していればよく、第1凹凸部240の幅と同じでもよいし、広くても狭くてもよい。
次に、細胞シート形成部材の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ナノインプリント法を用いて、細胞シート形成部材の表面211を、凹版250の転写によって形成する例を説明する。
次に、細胞シート形成部材200を用いて製造される細胞シートについて説明する。
図6(a)に示すように、細胞シート形成部材200の表面211上に位置する細胞懸濁液は、例えば、第1平坦部230に接着する細胞S1を含む。この際、配向性制御部201において、各第1平坦部230は、第1凹凸部240の長辺方向(第1方向)に延び、各第1平坦部230の幅は、一般的な細胞の大きさの1〜数倍程度である。そのため、図6(b)に示すように、細胞S1の位置は、第1平坦部230の範囲内に優先的に分布し、細胞S1は、第1方向に細胞の長軸方向が配置されて直線状に連なる。すなわち、細胞S1の伸長方向は、第1平坦部230の長辺方向と揃うように制御される。図6は、細胞シート形成部材200を用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、図6に示す例では、筋芽細胞の伸長方向が一方向に揃うように制御されている。図9は、細胞シート形成部材200の配向性制御部201で培養された筋芽細胞の一例を示しており、図9に示す例では、筋芽細胞の伸長方向が一方向に揃うように制御されている。
細胞シート形成部材100の表面111上に位置する細胞懸濁液は、例えば、細胞シートを形成する細胞を含んでいる。図8(a)に示すように、細胞は、第1平坦部230に対して優先的に接着する細胞S1であり、第1平坦部230よりも劣勢ではあるが、第1凹凸部240に対する接着を許容された細胞S2でもある。表面111に播種された細胞は、培養初期は表面111に単層で広がった状態で培養される。配向性制御部201では、図8(b)に示すように、第1平坦部230、および、第1凹凸部240は、第1方向に延び、第2方向に交互に配置される。そのため、細胞シート形成部材の表面211には、例えば、第1平坦部230に優先的に接着された細胞S1の配向性が、第1平坦部230の構造、および、それを区画する第1凹凸部240の構造によって制御される。
上記実施形態に記載の細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法における実施例2を以下に説明する。
図4(a)および(b)に示すように、外周部に第2凹凸部222、第2凹凸部222の内側に配向性制御部201(第1平坦部230および第1凹凸部240)、および、2つの配向性制御部201に挟まれた第2平坦部221を備えた細胞シート形成部材200を、転写によって形成するためのニッケル製凹版を作製した。次いで、ニッケル製凹版をスタンパとして用い、ナノインプリント法によって、ポリスチレンシートに第2凹凸部222、配向性制御部201(第1平坦部230および第1凹凸部240)、および第2平坦部221を加工し、それによって、実施例2の細胞シート形成部材200を作製した。
先ず、マウス由来の心筋細胞(コスモバイオ社製)を細胞培養用フラスコ(25cm2)で培養した。培養条件は、専用培地を用い、37℃、5%CO2雰囲気下で行った。細胞の回収にはトリプシンを用い、定法に従い実施した。回収した細胞について血球計算版を用いて細胞数を計測した。
(2−1)配向性制御部201では、第1方向に、細胞の伸長方向を揃えることができる。結果として、二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の配向性を向上させることができる。また、細胞塊形成部202では、第2平坦部221には、第2凹凸部222に位置する細胞が凝集し、少なくとも一部が第2平坦部221に接着する。これにより、細胞塊11が第2平坦部221に形成され、細胞塊11は、第2平坦部221に接着することで、遊離しにくいものとなる。したがって、細胞塊11が第2平坦部221に接着された状態において、細胞塊11の識別、細胞塊11の大きさや拍動などの動きの計測が容易となる。また、画像処理などの解析を行い易くなる。
(2−3)第2凹凸部222は、2つの第1凹凸部240に挟まれて位置している。したがって、配向性を有する細胞の近くの細胞で細胞塊11を形成することができる。
・二次元方向に広がる細胞シートにおいて細胞の配向性向上が可能であれば、第1凹凸部240は、第2方向の長さが10μm以上、50μm以下、かつ、第1方向の長さが100μm以上でなくてもよい。
・配向性を有する細胞の近くに細胞塊が形成可能であれば、第2平坦部221は、第1凹凸部240に挟まれて位置していなくてもよい。
・凸部241の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか1種とすることが可能である。
・第1凹凸部240の有する形状は、第1方向に延びる直線状に限らず、第1方向に延びる折れ線状や、第1方向に延びる曲線状に変更することも可能である。
・第2凹凸部222において、凸部の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか1種とすることが可能である。
・第2凹凸部222の高さは、第1平坦部230および/または第1凹凸部240の高さと同じであってもよいし、高くてもよいし、低くてもよい。
・細胞シート形成部材100,200の表面111,211は、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリーリシン(PDLまたはPLL)、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲルなどの接着因子を含む有機物が塗布されてもよい。あるいは、金属から構成される面であってもよい。また、細胞シート形成部材100,200の表面111,211は、細胞の接着性や細胞シートの平坦性を高めることを目的として、親水性、あるいは、疎水性を有してもよい。
・細胞シート形成部材は、マルチウェルプレート、シャーレ、フラスコ、チェンバースライドなど、細胞懸濁液を保持可能なものであれば、それに適用することができる。
Claims (14)
- 細胞シートを形成するための表面を備え、
前記表面は、細胞の接着が優勢な平坦部と、前記細胞の接着が前記平坦部に対して劣勢な凹凸部とを備え、
前記平坦部は、前記表面と対向する方向から見て、円形形状または多角形形状を有し、
少なくとも前記平坦部に細胞塊が形成されるように構成されている
細胞シート形成部材。 - 前記凹凸部における凸部のピッチは、10nm以上、10μm以下である
請求項1に記載の細胞シート形成部材。 - 前記平坦部の面積は、100μm2以上、10000μm2以下である
請求項1または2に記載の細胞シート形成部材。 - 請求項1から3のうち何れか1項に記載の細胞シート形成部材の表面に細胞塊が形成された基材。
- 凹版を形成することと、
細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することとを含み、
前記表面は、細胞の接着が優勢な平坦部と、前記細胞の接着が前記平坦部に対して劣勢な凹凸部とを備え、
前記凹版は、前記平坦部を成形する平坦成形部と、前記凹凸部を成形する凹凸成形部とを備え、
前記凹版を形成することは、前記平坦成形部および前記凹凸成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも1種を用いて形成することを含む、
細胞シート形成部材の製造方法。 - 細胞シートを形成するための表面を備え、
前記表面は、細胞の配向性を制御するための配向性制御部と、前記細胞が凝集され細胞塊を形成するための細胞塊形成部とを備え、
前記配向性制御部は、第1方向に延びる形状を有し、かつ、前記第1方向と交差する第2方向に並ぶ第1平坦部と、相互に隣り合う前記第1平坦部の間を埋める第1凹凸部とを備え、
前記細胞塊形成部は、前記配向性制御部に隣接する第2平坦部と、前記配向性制御部に隣接し、かつ、前記第2平坦部と繋がる第2凹凸部とを備え、
前記第2平坦部に少なくとも細胞塊の一部が形成されるように構成されている
細胞シート形成部材。 - 前記第2平坦部は、前記第1凹凸部に挟まれて位置している
請求項6に記載の細胞シート形成部材。 - 前記第2凹凸部は、前記第1凹凸部に挟まれて位置している
請求項7に記載の細胞シート形成部材。 - 前記第2平坦部は、50μm以上、200μm以下の前記第2方向の長さと、100μm以上の前記第1方向の長さとを有する
請求項6ないし8のうち何れか1項に記載の細胞シート形成部材。 - 前記第2凹凸部において、隣り合う前記配向性制御部に挟まれた部分の前記第2方向の長さが50μm以上、1mm以下であり、
前記第2凹凸部における凸部のピッチは、10nm以上、10μm以下である
請求項6ないし9のうち何れか1項に記載の細胞シート形成部材。 - 前記第1凹凸部は、10μm以上、50μm以下の前記第2方向の長さと、100μm以上の前記第1方向の長さとを有する
請求項6ないし10のうち何れか1項に記載の細胞シート形成部材。 - 請求項6から11のうち何れか1項に記載の細胞シート形成部材の表面に細胞塊が形成された基材。
- 前記配向性制御部には、前記第1方向に配向性を有した細胞が形成された
請求項12に記載の基材。 - 凹版を形成することと、
細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することとを含み、
前記表面は、細胞の配向性を制御するための配向性制御部と、前記細胞が凝集され細胞塊を形成するための細胞塊形成部とを備え、
前記配向性制御部は、第1方向に延びる形状を有し、かつ、前記第1方向と交差する第2方向に並ぶ第1平坦部と、相互に隣り合う前記第1平坦部の間を埋める第1凹凸部とを備え、
前記細胞塊形成部は、前記配向性制御部に隣接する第2平坦部と、前記配向性制御部に隣接し、かつ、前記第2平坦部と繋がる第2凹凸部とを備え、
前記凹版は、前記第1平坦部を成形する第1平坦成形部と、
前記第1凹凸部を成形する第1凹凸成形部と、
前記第2平坦部を成形する第2平坦成形部と、
前記第2凹凸部を成形する第2凹凸成形部とを備え、
前記凹版を形成することは、前記第1凹凸成形部および前記第2凹凸成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも1種を用いて形成することを含む、
細胞シート形成部材の製造方法。
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