JP2008054566A - 軟骨細胞の培養方法、軟骨細胞培養基材、軟骨細胞含有生体組織再生用材料および軟骨細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】軟骨細胞の培養方法等であって、培養する軟骨細胞1の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部21が形成された培養面を有する培養基材2の前記複数の凸部21に軟骨細胞1を播種し、前記軟骨細胞1を配置した培養基材2を培養容器中に配置して培養を行うことで軟骨細胞塊を形成させることを特徴とする軟骨細胞の培養方法等である。
【選択図】図1
Description
軟骨組織は、自己修復能が極めて小さいため、小さな損傷では自然修復が期待できても、変形性関節症(OA)や関節リウマチ(RA)等で生じるある程度以上の損傷では、自然治癒は期待できない。軟骨組織の代表的な治療技術の一つである人工関節置換術は、人工関節の磨耗等のために10年以上の長期使用は困難であり、適用限界がある。
また、RWVバイオリアクターを用いて大型軟骨を構築する方法は、培養液が多量に必要であり、熟練者による培養が必要であり、コンタミネーションを起こしやすい。従って、厳密な無菌状態で、細心の注意のもとで培養する必要がある。
なお、他の発明については、本明細書の中で明らかにする。
そして、このように軟骨細胞1が培養されると、増殖などによる細胞や播種細胞など複数の軟骨細胞1が3次元的に凝集してスフェロイド(軟骨細胞塊に相当する)を形成する。ここで、「軟骨細胞塊」とは軟骨細胞1が互いに接している状態であって、例えば、軟骨細胞1が密着している状態、重なり合っている状態、接着している状態等を含む。
培養に用いられる軟骨細胞1は、軟骨細胞培養基材2で培養できるものであれば、特に限定されるものではなく、従来公知の軟骨細胞1から適宜選択できる。例えば、ヒトを対象とした再生治療に適用する場合には、軟骨細胞1はヒト由来の軟骨細胞1であることが好ましいが、患者の患部に適応する軟骨細胞1であれば非ヒト動物由来であってもよい。また、軟骨細胞1は、例えば、生体軟骨から調整したものであっても、幹細胞から軟骨細胞1に分化誘導したものであっても、さらには、これらを継代培養後に使用するものであってもよい。
換言すると、入手可能な軟骨細胞1から目的に応じて好適なものを適宜選択して、本実施形態に適用可能である。
図2は、本実施形態の軟骨細胞培養基材2の構成を示す斜視図であって、(a)は全体図、(b)は(a)で示したA領域の部分拡大図である。
図2(a)に示すように、軟骨細胞培養基材2は、基材ベース22と、この基材ベース22の培養表面(例えば、上面側)に形成される複数の凸部21とを含んで構成される。そして、この複数の凸部21は、軟骨細胞培養基材2で軟骨細胞1が培養される際に、軟骨細胞1を3次元的に凝集させる制御を行うことにより、スフェロイドを形成させるものである。
図2(b)に示すように、凸部21は、その最上面21Aにおいて所定の相当直径rを有し、所定の間隔gで配列している。
凸部21の最上面21Aの形状は、必ずしも円形である必要はない。従って、本実施形態においては、最上面21Aの大きさを規定する場合に、円形のみを想定した「直径」等の表現は用いず、「相当直径」として記載する。
ここで、「相当直径」とは、凸部21の最上面21Aの直径または直径に相当する長さであって、最上面21Aの形状が円形の場合にはその直径、矩形である場合にはその一辺の長さ、また、そのいずれにも該当しない場合には、例えば、円相当径を用いることができる。円相当径は、必ずしも円形ではない最上面21Aの形状を、円形とみなしてその直径を規定するものである。例えば、円相当径として、最上面21Aの面積と同じ面積を持つ円の直径とみなす面積円相当径、最上面21Aの周長と同じ長さの円の直径とみなす周長円相当径、最上面21Aの形状に外接する円の直径とみなす外接円相当径、最上面21Aの形状に内接する円の直径とみなす内接円相当径等が挙げられ、最上面21Aの形状に応じて適宜選択することができる。
また、相当直径rの下限は、複数の凸部21を均一な加工精度で形成することができれば特に限定されない。
具体的には、凸部21の相当直径rは、好ましくは10nm以上、10μm以下であって、より好ましくは0.2μm以上、5.0μm以下である。
凸部21間の間隔gは、凸部21の最上面21A外周から当該凸部21に隣接する凸部21の最上面21A外周までの最短距離として規定する。例えば、図2に示すように、凸部21の配列の様式が2次元正方格子状の場合には、凸部21間の間隔はgの長さである。
そして、本実施形態においては、凸部21間の間隔gを、培養する軟骨細胞1の相当直径よりも小さく設定する。このように設定することによって、軟骨細胞1は、凸部21間の隙間に入り込むことがなくなり、凸部21の最上面21A上で培養されることとなる。
具体的には、凸部21の高さは、好ましくは10nm以上、1mm以下であって、より好ましくは0.1μm以上、100μm以下である。
なお、凸部21の高さ方向の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、柱状、錐状、逆錐状等であってもよく、また、その外周部の形状や修飾等は、特に限定されるものではない。凸部21の高さ方向の形状は、例えば、根本から先端にかけて細くなっていく形状であってもよく、根本から先端にかけて細くなり先端部に太い部分を有するきのこのような形状でもよい。
なお、凸部21と基材ベース22とは、例えば、同じ材料で構成して一体的に形成してもよく、また、異なる材質で構成して基材ベース上面22Aに凸部21を接着する構成としてもよい。ただし、凸部21と基材ベース22とを同じ材料で構成して一体的に形成する方が、高い強度を得られるためにより好ましい。
例えば、過酸化水素やオゾン等の酸化剤を含む溶媒を用いた溶媒への浸漬や紫外線照射、プラズマ処理等の気相処理等による親水化処理、疎水化処理、溶液への浸漬等によるポリリジン、アルブミン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、ラミニン等のタンパク質によるコート、若しくは無電解めっき、気相蒸着法による金属コート、温度感応性被覆材によるコート、光や電子線、粒子線等による表面改質が行われ、軟骨細胞1の培養に必要な表面処理が施される。
また、これらの表面処理は、軟骨細胞培養基材2の表面全体に渡って施してもよいし、限定した領域であってもよい。例えば、一部の凸部21と、その他の凸部21とに対し、異なる表面処理を施してもよいし、凸部21と、それ以外の部位とに対し、異なる表面処理を施してもよい。また、凸部21の最上面21Aと、当該凸部21の外周面とに対し、異なる表面処理を施してもよい。
このような軟骨細胞含有生体組織再生用材料3を構成する軟骨細胞培養基材2は、生分解性物質(水解性物質を含む)によって構成されることがより好ましい。
図3は、軟骨細胞培養基材2の製造方法の一例であるナノインプリント法による製造工程を説明するための図である。
まず、図3(a)に示すように、軟骨細胞培養基材2の原料である基材原料4と金型5を用意する。基材原料4は、前記した軟骨細胞培養基材2に好適な材料である。金型5の材質は、ニッケル等の金属、カーボンやシリコン等の無機物、PDMS等の有機物、および樹脂組成物等から、基材原料4の材質や凸部21の加工精度に応じて適切に選択される。金型5表面への金型凹部6の形成法は、切削加工、光リソグラフィ法、電子線直接描画法、粒子線ビーム加工法、走査プローブ加工法等の微細加工法や微粒子の自己組織化、又はこれらの手法によって形成されたマスタからのナノインプリント法、キャスト法、射出成型法に代表される成型加工法、めっき法等から適切に選択される。
そして、図3(c)に示すように、金型5を引き剥がすことによって、基材ベース上面22Aに凸部21が一体的に形成された軟骨細胞培養基材2を得ることができる。
なお、加熱した基材原料4から金型5を離型する際に、基材ベース上面22Aおよび凸部21の損傷を防ぐために、金型5の表面をフッ素系、または、シリコーン系等の離型剤でコートしておくことが好ましい。
次に、本実施形態の軟骨細胞1の培養方法を図面を参照して説明する。
本実施形態の軟骨細胞1の培養条件については、選択された軟骨細胞1に対応する従来公知の培養条件の中から、適宜適切な条件を適用することができる。この選択された軟骨細胞1に対応する培養条件は、当業者であれば、容易に選択し、選択した培養条件に基づいて培養を実施することができる。
ただし、本実施形態においては、軟骨細胞培養基材2による軟骨細胞1の表現型の制御効果を明確に説明する必要性に鑑み、定着を除く培養中の培養液には軟骨細胞1の表現型を誘導・抑制する物質を特に含有していない培養液で培養を行うことを前提として説明する。
まず、軟骨細胞培養基材2をシャーレ状の培養器7底部の上面側に設置して、軟骨細胞培養キット8を構成する。そして、軟骨細胞1を培養液(図示せず)とともに培養器7内部の軟骨細胞培養基材2上に播種する。このとき、軟骨細胞培養基材2の培養表面は培養液により浸漬され、培養液中の軟骨細胞1は、軟骨細胞培養基材2上へと沈降する。
そして、培養液および軟骨細胞1が播種された軟骨細胞培養基材2をCO2インキュベータ内で所定期間静置する。
そして、前記所定期間経過後、軟骨細胞1を使用する。この所定期間は、特に限定されるものではなく、所望する軟骨細胞1の表現型(例えば、スフェロイドの大きさ、スフェロイドに含まれる軟骨細胞1の数、細胞外マトリクスの産生量等)に対応して延長または短縮して調節することができる。
また、軟骨細胞1を使用する際には、軟骨細胞1を軟骨細胞培養基材2の凸部21から剥離させて軟骨細胞1のみを使用してもよいし、軟骨細胞1および軟骨細胞培養基材2からなる軟骨細胞含有生体組織再生用材料3として使用してもよい。
本発明の軟骨細胞1や軟骨細胞培養基材2は、軟骨組織の再生に好適に用いることが考えられる。例えば、本実施形態の軟骨細胞1によれば、変形性関節症や関節リウマチの治療に好適に利用することが期待される。
従って、本発明の範囲は、軟骨由来疾患を患う患者の疾患部位に、軟骨細胞を前記患者の疾患部位に移植する軟骨由来疾患の治療方法まで拡張されうる。
例えば、軟骨細胞培養基材2の形状は、多面体、筒状、単層シートを積層した積層体等であってもよく、軟骨細胞培養基材2の側面、下面、内面等を培養表面としてもよい。
第一実施例は、複数の凸部21を有する軟骨細胞培養基材2と培養器7とが一体形成された軟骨細胞培養キット8(図4(b)参照)を作製した実施例である。
複数の凸部21は2次元正方配列で配列している。それぞれの凸部21は略円柱形状であり、最上面21Aの相当直径rが400nmで、下方に向かって末広がり状となっており、最下面では相当直径が500nmになっている。また、高さは1μmであり、高さと一辺の比は2となり、1より大きいことが分かる。複数の凸部21の間隔gは1μmであり、培養する軟骨細胞1の相当直径rよりも小さい値となっている。
このように作製された軟骨細胞培養キット8の凸部21は、軟骨細胞1の表現型を制御するための所定の形状や間隔を満たしつつも、凸部21が軟骨細胞培養キット8から取れにくいという効果を有していた。
第二実施例は、第一実施例と同様の製造方法で作製した軟骨細胞培養キット8でウシ関節軟骨細胞を培養し、培養された軟骨細胞(軟骨細胞塊)1について検証を行った実施例である。
まず、軟骨細胞1を調整するために、ウシ関節軟骨部をメスで1mm角程度にスライスし、PBSで洗った。その後、コラゲナーゼ溶液(0.2%コラゲナーゼDMEM溶液、アンホテリシンB(5ml/500ml medium)を含む)にいれ、37℃で12−20時間攪拌・振とうし、コラーゲンを分解した。遠心分離(4℃、1200rpm、5分)により軟骨細胞を得た。その後、3×107cells/mlになるようにセルバンカーで希釈し、凍結保存した。
実施例1 凸部の相当直径r:2.0μm、間隔g:2.0μm、高さ:1.0μm
実施例2 凸部の相当直径r:0.5μm、間隔g:0.5μm、高さ:1.0μm
比較例 凸部なし(培養器7のみ)
実施例1、実施例2の凸部形成領域は10mm×10mmの正方形状である。なお、これらの軟骨細胞培養キット8の製造方法については、第一実施例と同様であるので説明を省略する。
これら実施例1、実施例2および比較例を用いて、下記の評価を行った。
1.グリコサミノグリカン(GAG)の定量
実施例1、実施例2および比較例で培養したウシ軟骨のGAG量を、培養開始後36日で測定した。測定は、Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit (Biocolor Ltd.)を用いた色素定量による。
走査型電子顕微鏡観察するために、実施例1、実施例2および比較例で培養した軟骨細胞1を、2.5%グルタルアルデヒドを含むPBSで4℃にて3時間固定し、0.1%四酸化オスミウム(OsO4)中4℃で2時間インキュベートし、50、60、70、80、90、95、100%エタノールで30分ずつ順次脱水処理を行った。その後、t−ブチルアルコール中で凍結乾燥させ、プラチナコートし、HITACHI S−4500走査型電子顕微鏡(SEM)で観察を行った。
また、光学顕微鏡観察は、Olympus CKX−41型顕微鏡を用いて観察した。
36日間の培養の後、TBS−Ca(1mM CaCl2を含むTris-buffred saline、pH7.6)で3回洗い、4%パラフォルムアルデヒドで室温15分固定した。TBS−Caで3回洗った後、−20℃で30分間メタノール処理を行い、5%スキムミルクを含むTBS−Caで2時間ブロッキングを行った。TBS−Caで1回洗った後、一次抗体(抗マウスII型コラーゲン抗体;第1ファインケミカル)を5%スキムミルクを含むTBS−Caで1/500に稀釈し、4℃オーバーナイトで静置した。TBS−Caで2回洗った後、2次抗体(Jackson Immuno Research、FITC-conjugated Affinity Pure F(ab')2 fragment goat anti-mouse IgG(H+L))をTBS−Caで1/100に稀釈して加え、室温で30分処理、TBS−Caで3回洗った後、蛍光退色防止剤(Vector Laboraories、VECTASHIELD)で封入し、Carl Zeiss AkioPlan2蛍光顕微鏡を用いて観察した。
図6は、軟骨細胞1で発現しているグリコサミノグリカン量の比較結果を示す図である。図6に示すように、実施例1および実施例2は、比較例と比較して、単位DNAあたりのグリコサミノグリカン量が多かった。さらに、実施例1と実施例2の比較から、2.0μmの相当直径rの凸部21を有する軟骨細胞培養キット8の方が0.5μmの相当直径の凸部21に比べて、グリコサミノグリカン量が多かった。
グリコサミノグリカンは、他の種類の細胞(例えば、繊維芽細胞)に比べ、軟骨細胞1において特に発現量が多いとされている。すなわち、グリコサミノグリカンの定量により、実施例1および実施例2に比べて比較例は、軟骨細胞1が脱分化を起こしていることが示された。また、実施例1と実施例2との比較から、凸部21の形状によって軟骨細胞1の分化の度合いが異なることが示された。
図10に示すように、凸部21上での軟骨細胞1のスフェロイド径分布を示しているが、2.0μmより0.5μmの相当直径rの凸部21上での培養が、スフェロイド径をよく制御していることが分かった。
2 軟骨細胞培養基材
3 軟骨細胞含有生体組織再生用材料
4 基材原料
5 金型
6 金型凹部
7 培養器
8 軟骨細胞培養キット
21 凸部
21A 最上面(頂部)
22 基材ベース
22A 基材ベース上面
g 間隔
r 相当直径
Claims (15)
- 軟骨細胞の培養方法であって、
培養する軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部が形成された培養面を有する培養基材の前記複数の凸部に軟骨細胞を播種し、
前記軟骨細胞を配置した培養基材を培養容器中に配置して培養を行うことで軟骨細胞塊を形成させることを特徴とする軟骨細胞の培養方法。 - 前記軟骨細胞塊が相当直径10μm以上5.0mm以下の軟骨細胞塊であることを特徴とする請求項1に記載の軟骨細胞の培養方法。
- 前記軟骨細胞塊を形成する軟骨細胞が互いに接していることを特徴とする請求項1に記載の軟骨細胞の培養方法。
- 前記複数の凸部の相当直径が0.01μm以上10μm以下、高さが0.01μm以上100μm以下であることを特徴とする請求項1に記載の軟骨細胞の培養方法。
- 前記軟骨細胞が生体軟骨より調整した軟骨細胞、または骨髄、滑膜由来間葉系幹細胞由来軟骨細胞由来であることを特徴とする請求項1に記載の軟骨細胞の培養方法。
- 前記軟骨細胞が患者から採取された細胞由来であることを特徴とする請求項5に記載の軟骨細胞の培養方法。
- 前記軟骨細胞が、培養液中にTGF−βおよび/またはデキサメタゾンを添加して培養して得られたことを特徴とする請求項1に記載の軟骨細胞の培養方法。
- 前記軟骨細胞の播種密度が1×104〜1×107cells/cm2の密度であることを特徴とする請求項1に記載の軟骨細胞の培養方法。
- 軟骨細胞を培養するための軟骨細胞培養基材であって、
培養面と、
前記培養面に形成され、軟骨細胞を頂部に接して培養するための軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部と、
を含むことを特徴とする軟骨細胞培養基材。 - さらに、培養液を入れるための培養器を含んで構成されることを特徴とする請求項9に記載の軟骨細胞培養基材。
- 前記培養面と、前記培養器とが一体に形成されたことを特徴とする請求項10に記載の軟骨細胞培養基材。
- 軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部が形成された培養面を有する培養基材と、
前記複数の凸部頂部に接して培養された軟骨細胞と、を含んで構成され、
前記軟骨細胞が軟骨細胞塊を形成していることを特徴とする軟骨細胞含有生体組織再生用材料。 - 軟骨細胞の相当直径よりも小さい相当直径と間隔を有する複数の凸部が形成された培養面の前記複数の凸部の頂部に接して培養され、前記軟骨細胞が軟骨細胞塊を形成していることを特徴とする軟骨細胞。
- 前記軟骨細胞塊が相当直径10μm以上5.0mm以下の軟骨細胞塊であることを特徴とする請求項13に記載の軟骨細胞。
- 前記軟骨細胞塊を形成する軟骨細胞が互いに接していることを特徴とする請求項14に記載の軟骨細胞。
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