JP2015057079A - 培養器材 - Google Patents

Abstract

【課題】培養器材表面に化学物質を塗布することなく、直径の揃った三次元組織を形成させる技術を可能にする培養シートを提供する。
【解決手段】培養器材の培養シート１５０上に、複数のホール１５２が形成され、各々のホール１５２の底面である培養面には、細胞の接着性や遊走性を制御できるナノピラー１５３が形成される。各ホール１５１の培養面は、仕切り壁１５２を設けた構造となり、且つ内部のナノピラー１５３は、各ホール１５１の中心付近に形成されているため、播種された細胞の相互作用を制限することができ、形成される細胞の三次元構造の大きさを均一にすることが可能となる。
【選択図】図１５Ａ

Description

本発明は、培養器材を用いて動植物細胞を培養し、細胞の球状組織（三次元組織）、および単層組織（二次元平面組織）を図形成する技術に関する。

医薬品開発プロセスにおいて、動物実験に代わり、細胞を利用したイン・ビトロ（in vitro）アッセイが求められている。特に、薬剤候補物質のスクリーニング、毒性・代謝試験に応用する動きが活発になっている。

このような背景のもと、従来の動物実験に代わる、細胞を利用した代替法のアプローチは盛んに試みられてきたが、臨床反応を予測するには限界があるものが多い。これは、これらの培養法では、細胞が実際の生体内の構造を模擬した構造を取っていないためであると考えられている（非特許文献１）。したがって、より生体に近い機能を発揮する三次元組織の構築がこれまでに試みられており、さまざまな細胞種で三次元組織を形成することに成功している。

細胞の三次元組織を形成させるための器材として、極微細な均一突起が規則的に配列されたシート表面に形成された培養のためのシート（ナノピラーシート）が開発されているが、形成された三次元組織は、器材からの剥離性が高く（特許文献１）、培地交換の過程で失われるという問題がある。また形成された三次元組織の直径を制御することができないため、大きさが均一ではなく、それぞれの三次元組織の性能がばらつく、といった問題点をはらんでおり、実用的な形成法としては依然未熟である。

そこで、培養器材に微小なキャビティ構造を設けて、そのキャビティあたりにひとつの三次元組織を形成させる技術（細胞組織体マイクロチップ）がこれまでに開発されている（特許文献２、非特許文献２）。本技術ではキャビティ底面の中央付近に対し、接着性を有する物質を所定領域に塗布することにより、細胞接着領域と細胞非接着領域を規定し、キャビティそのものを回転駆動装置等により回転させ、回転培養を実行することで細胞接着領域たるキャビティ底面の中央付近に培養細胞が保持されることを特徴としている。

特開2005-312343号公報 特開2006-121991号公報

"The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening: The Multicellular Spheroid Model"Leoni A. Kunz-Schughart, James P. Freyer, Fer Dinand Hofstaedter, and Reinhard Ebner J Biomol Screen, 9: 273-285 (2004) "Orderly arrangement of hepatocyte spheroids on a microfabr Icated chip." J Fukuda and K Nakazawa Tissue Eng, 11:1254-62 (2005) "Formation of Hepatocyte Spheroids with Structural Polarity And Functional Bile Canaliculi Using Nanopillar Sheets." R Takahashi, H So noda, Y Tabata and A Hisada, Tissue Eng Part A, 1-45 (Mar 4, 2010)

このような特長を持つ細胞組織体マイクロチップであるが、細胞を器材表面の特定部分に強制的に接着させるために、器材表面に化学的に合成された物質を塗布して細胞接着領域と細胞非接着領域を規定しなければならず、これによりいくつかの課題が挙げられる。

まず、塗布されたこれらの化学物質は細胞の成育に悪影響を及ぼす可能性があるばかりでなく、この操作は極微小な領域に化学物質を塗布ないし接着する必要があることから非常に煩雑な作業となり、製造コストもかかる。

また、播種された細胞が非接着領域に落ち込んだ場合、培養時の培地交換の際に培地と共に破棄され失われることが必至であり、効率的な培養方法とは言い難い。さらに接着領域に落ち込んだ細胞が回転培養により強制的に組織を形成させられるため、細胞に対するストレスがかかり活性の低下を招くことが懸念されている。

一方、従来のナノピラーシートにおいても、器材面上で細胞運動を制御することが困難であり、形成される三次元組織の大きさ・直径を制御することができないという問題がある。また形成された三次元組織を目的の場所に保持させることができないという問題も同時に抱えている。

本発明の目的は、培養器材の表面に化学物質を塗布することなく、直径の揃った三次元組織を形成し、さらに三次元組織を目的の位置に保持させることを可能にする、培養シート、培養器材、及びそれを用いた細胞培養方法を提供することにある。

上記の目的を達成するため、本発明においては、培養領域を有し、培養領域内に複数の突起が形成され、培養領域の周囲に培養領域を仕切る、突起よりも高い仕切りが形成され、且つ当該培養領域に占める突起の構成比率が２０％〜７５％の範囲である培養器材、及び培養シートを提供する。

また、上記の目的を達成するため、本発明においては、培養領域を有し、培養領域内に複数の突起が形成され、培養領域の周囲に培養領域を仕切る、突起よりも高い仕切りが形成され、且つ当該培養領域に占める突起の構成比率が４０％〜５０％の範囲である培養器材、及び培養シートを提供する。

本発明を適用することによって、単一素材のみを用い、細胞本来の機能である細胞運動を促して活性を維持したままストレスの少ない環境下での三次元組織形成を実現することができる。

また、仕切りという限定領域を同一素材で一体的に設けることにより、その限定領域内に播種された細胞が全て一つの三次元組織形成に関わることになり、非常に効率的な培養方法であるばかりではなく、それぞれの限定領域毎に形成された複数の三次元組織の大きさが均一で、均質であり、細胞アッセイに有効であることが期待される。

更に、三次元組織が仕切りという限定領域内の目的の位置に保持されることが期待される。更に、目的に応じて二次元平面組織を形成させることも可能である。二次元平面組織に対しても同様の効果が期待される。

第１の実施例に係わる、培養シートと培養シート内のホール構造を示す図で ある。 第１の実施例に係わる、ナノピラー構造を示す拡大図である。 第１の実施例に係わる、培養シートを貼付したチャンバースライドを示す図 である。 第２の実施例に係わる、プレート枠体の構成を示す図である。 第２の実施例に係わる、プレートと培養シートの超音波溶着フローを説明す るための図である。 第３の実施例に係わる、肝細胞培養のフローチャートを示す図である。 第３の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細胞三 次元組織写真を示す図である。 第４の実施例に係わる、二段階、多段階ナノピラー培養シートを示す図であ る。 各実施例のナノピラーの配列パターンの種類を示す図である。 図９に示したピラー径が異なる培養シートを使用した場合の細胞培養結 果(細胞の様子)を示す図である。 図９に示したピラー径が異なる培養シートを使用した場合の細胞培養結 果(形成細胞数)を示す図である。 培養シートの実施例４の変形例である、傾斜ナノピラー培養シートを示す 図である。 培養シートの実施例の変形例４である、表面張力回避パターン培養シート の１ウェルを示す図である。 実施例１における培養器材の外観斜視図、上面図、上下側面図を示す図 である。 実施例１における培養器材の部分拡大図であり、Ａ−Ａ，Ｂ−Ｂ部分拡 大図と、Ｃ−Ｃ，Ｄ−Ｄ部分拡大図を示す図である。 実施例１における培養器材の部分拡大図、及び端面図であり、Ｅ−Ｅ， Ｆ−Ｆ部分拡大図、Ｇ−Ｇ線端面図を示す図である。 実施例２における培養器材の外観斜視図、底面図を示す図である。 実施例２における培養器材の上面図、上下側面図を示す図である。 実施例２における培養器材の部分拡大図、部分断面図であり、Ａ−Ａ， Ｂ−Ｂ部分拡大図と、Ｃ−Ｃ，Ｄ−Ｄ部分拡大図と、Ｈ−Ｈ断面図を示す図である。 実施例２における培養器材の部分拡大図、及び端面図であり、Ｅ−Ｅ， Ｆ−Ｆ部分拡大図、Ｇ−Ｇ線端面図を示す図である。 第５、６の実施例に係わる、培養シートと培養シート内のホール構造を 示す図である。 第５、６の実施例に係わる、異なる直径の突起部集合体を示す模式図で ある。 第５、６の実施例に係わる、突起部集合体の直径が８０μｍの培養シー トのSEM画像を示す図である。 第５、６の実施例に係わる、突起部集合体の直径が２０μｍの培養シー トのSEM画像を示す図である。 第７の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細 胞三次元組織の中心とホール構造との中心の間の距離の一例を示す図である。 第７の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細 胞三次元組織の中心とホール構造との中心の間の距離の他の例を示す図である。 第７の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細 胞三次元組織の中心とホール構造との中心の間の距離の他の例を示す図である。 第７の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細 胞三次元組織の中心とホール構造との中心の間の距離の他の例を示す図である。 第７の実施例に係わる、肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細胞 三次元組織写真の一例を示す図である。 肝細胞培養フローによる培養シートによる肝細胞三次元組織写真の一例を 示す図である。

培養シートを用いて細胞を培養し、細胞塊である三次元組織、あるいは二次元平面組織の形成方法を実現するための最良の形態について、以下詳細に説明する。

実施例１では、培養シートを培養シート保持部材であるチャンバースライドに適用した例を示す。以降、従来のナノピラーシートに対し、本発明における培養領域を形成する仕切り構造を有し、当該仕切構造の内部に突起物が複数形成されたシートを培養シートと記す。
当該培養シートは細胞に悪影響の無い材質で形成され、本例では、ポリスチレンとしている。ただし、材質はポリスチレンに限らないことは云うまでもない。

図１は本実施例で作成した培養シート１００の走査型電子顕微鏡写真の模式図である。また同時に、培養シート１枚あたりに複数個存在する仕切り構造１０２により構成された孔１０１（以下、ホール）の一つの構造を示す。当該ホール１０１の内部が細胞組織形成単位での培養領域を構成する。

ホール１０１の底面に保持されている複数の突起物１０２は、複数の微小突起物１０３（以下、突起、ピラー、ナノピラーともいう）からなる。また、このホール１０１の直径をホール径１０５とする。当該培養シート１００において、上記の仕切壁１０２を具備するホール１０１と、当該ホール１０１の内部に形成されている複数の突起１０３とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール１０１は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良い。

このように細胞に悪影響の無い単一材料で、仕切壁１０２を具備したホール１０１と当該ホール１０１の内部に形成されている複数の突起１０３とが一体的に培養シート１００として形成されることにより、培養工程において細胞に異物が接着することなく細胞を成長させることができる。さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。

また、囲み配置された仕切壁１０２の内部に複数の突起を設けているので、細胞が本来保持している能力である細胞運動を促し、当該運動により成長することで、回転培養等による外乱(ストレス)の影響なく、細胞活性を維持した細胞培養が可能となる。

これらホール１０１と突起集合体１０３とを別体として培養領域を形成しようとすると、それらの接着、溶着による接合が必要となる。

例えばこれらを接着接合した場合には、培養領域の内部に接着剤成分が混入し、生成細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。
また溶着接合では、ホール１０１の内径が細胞形成レベルの極微小領域径のため、目的とする細胞領域を形成しつつ、仕切、突起に損傷を与えずに溶着することはかなり困難である。当該仕切や突起に損傷、変形があると、細胞形成過程において細胞に不要なストレスを与えたり、細胞自身の運動に障害となる可能性がある。

従って、培養領域を形成するホール１０１を構成するホール底面１０４、仕切り壁１０２および突起１０３とは一体的に形成されていることが望ましい。このように一体的に形成されることにより、細胞培養に必要な成分以外の不要成分の影響を排除した培養を実行
することが可能となり好適である。

次に、突起１０３の拡大図を図２に示す。ピラー径とは突起物先端部の直径１０６を示す。ピラーピッチとは、突起物先端部の中心から、隣り合う突起物先端部の中心までの距離１０７を示す。ピラー高さとは、ナノピラーの先端部から底部までの高さ１０８を示す。図２の（a）、図２の（ｂ）は、それぞれ本実施例のナノピラーの正方配置、三角配置を示す。

本実施例では、ピラー径、ピラーピッチ、ピラー高さはそれぞれ２．０μｍ、４．０μｍ、１．０μｍのものを使用したが、後述するように、これら以外の培養シートであっても構わない。本実施例では仕切り構造の高さは７０μｍであるが、この値に限らず、好適には形成される細胞が仕切りを乗り越えない程度の高さであれば良い。

本実施例における培養シート１００は以下に述べる方法で作製する。
直径２００μｍ、深さ７０μｍの円形の孔が正方配置され、その底面に直径２．０μｍ、深さ１．０μｍの微細孔が４．０μｍピッチで形成された金型を、４００μｍの厚さのポリスチレンフィルムに１３５℃、圧力２ＭＰａでプレスした。室温に冷却後にプレス装置より取り出し、金型をポリスチレンフィルムから剥離することにより、ホール径が２００μｍのホールを複数保持し、その底面に複数の突起を有した培養シートが作製できる。

ここで型材はシリコンウェハであり、培養シート作製時におけるポリスチレンフィルムとの接着を防止するため、フッ素系の離型剤により離型処理を予め施している。本実施例では型材をシリコンウェハとしたが、その他金属材料等の金型であっても構わない。

図３に示すように、このように単一素材で一体成型により作製された培養シート１００を、本例では２ｃｍ角にカットして、チャンバースライド１０９のガラス底面に手術用接着剤１１０を塗布して接着させることにより、培養シート１００が貼付されたチャンバースライド１０９を作製している。なお、図３において、１０９ａは各培養シート１００を区分ける枠を示す。この枠１０９ａは例えばプラスチック材などで形成される。なお、この枠１０９ａ等の枠体の形状は、四角形状に限らず、丸型形状等他の形状であっても良い。

図１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃにおいて、本実施例の培養シートが貼付されたチャンバースライドの全体構成図及び要部断面図として示す。
図１３Ａは本実施例における培養器材の外観斜視図、上面図、上下側面図である。左右側面図は斜視図よりその形態が明らかであるため図示を省略する。
図１３Ｂは部分拡大図であり、Ａ−Ａ，Ｂ−Ｂ部分拡大図と、Ｃ−Ｃ，Ｄ−Ｄ部分拡大図を示すものである。
図１３Ｃは部分拡大図、及び端面図であり、Ｅ−Ｅ，Ｆ−Ｆ部分拡大図、Ｇ−Ｇ線端面図を示すものである。

図１３Ａ−１３Ｃにおいて示される当該物品は、人や動物や植物などの細胞を培養する培養其材（培養容器）で、培養シート１００と培養シート１００を保持する保持部(チャンバースライド)１０９とから構成されており、培養シート１００の表面には複数の仕切り部１０２が形成されており、保持部１０９に形成された筒状の穴部１０９ａの内部底面に設けられている。

更にその仕切り部の内部には複数の微細な突起部１０３を有する培養領域が夫々形成されている。仕切り部１０２内の培養領域を形成するシート面に添加されるように、培養する目的細胞を穴部１０９ａ内に対して添加すると、複数の微細な突起部１０３に保持されて当該目的細胞が培養されることになる。

次に、第２の実施例を図４、図５に従い説明する。実施例２では培養シート付マルチウェルプレートの構成、及びその作製例を示す。図４の(a)はマルチウェルプレートを構成する枠体１１１の底面図である。培養シート保持部材である枠体１１１は、横幅約１２５ｍｍ、縦約８０ｍｍ、高さ約２０ｍｍの中に縦列に４穴、横列に６穴の計２４穴の筒状の穴部１１１ａが成型されたものである。素材はポリスチレンを用いている。

枠体に形成される穴の数は、通常６穴から１５３６穴まで、用途によって使い分けるため、この枠体も穴の数は２４穴に限定されない。また枠体の素材もポリスチレンに限定されるものではない。

当該培養器材の作製では、枠体１１１と培養シート１００を超音波溶着により接合させる。

枠体１１１には予め、以下の処理を施しておく。まず一つ目は、枠体１１１と培養シート１００を溶着させる際に与える超音波の振動で細胞培養シートとプレートがずれてしまうのを防ぐ目的で、枠体１１１の底面にフィルム固定用突起１１２を加工する。二つ目は、培養シートを超音波で溶着させるためにリブ構造１１３を設けておく。

図４の(b)、(c)は図４の(a)のＢ−Ｂ’、Ａ−Ａ’それぞれの断面図を示す。また、両者を重ねた際の同じ位置に、フィルム用固定突起が嵌るように培養シートに同じ径の穴１１４を設けておく。続いてこの枠体と培養シート１００を超音波溶着により接着する。

その工程を図５に示す。まず枠体のフィルム固定用突起と培養シートの穴を合わせて、両者を重ねる（図５の（a））。続いて、超音波発振器から、コンバータ、ブースタ、さらにはホーンを介して培養シート側から超音波を発生させ、両者を溶着する（図５の（b））。ホーンとは、適切な位置に適切なエネルギーの超音波を当てて溶着させる装置であり、リブ構造の位置に沿って適切に超音波が発生されるように設計した専用装置を作製して使用した。１１５は、このようにして作製されたプレートの上面図を示している。

本実施例では超音波溶着を用いて枠体と培養シートを接合したがこの方法に限定されないことは言うまでもない。超音波溶着では細胞に影響を与える接着剤のような有機物の介在ないしにプレート化が実現できるため、細胞に対する悪影響がなく、新薬開発プロセスにおける毒性・代謝試験のみならず、再生医療向けの組織体形成においても適用可能な有用な培養シートであることは言うまでもない。

尚、実施例１において例示したチャンバースライド形状の培養器材においても、枠１０９ａの底部にリブ構造を複数個設け、当該リブ構造により培養シート１００との溶着を行うことで、本実施例と同様の接合方法による培養器材を作成できることは言うまでもない。

このようにして作成された培養器材において、枠体１１１の底面に形成された培養シート１００には、複数のホール１０１が形成され、当該ホール底面１０４に構成されている複数の突起物は、複数の微小突起物１０３（以下、突起、ピラー、ナノピラーともいう）からなる。また、このホール１０１の直径をホール径１０５とする。当該培養シート１００において、上記の仕切壁１０２を具備したホール１０１と、当該ホール１０１の内部に形成されている複数の突起１０３とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール１０１は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良い。

このように細胞に悪影響の無い単一材料で、仕切壁１０２を具備したホール１０１と当該ホール１０１の内部に形成されている複数の突起１０３とが一体的に培養シートとして形成されることにより、培養工程において細胞に異物が接着することなく細胞を成長させることができる。さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。

また、囲み配置された仕切の内部に複数の突起を設けているので、細胞が本来保持している能力である細胞運動を促し、当該運動により成長することで、回転培養等による外乱(ストレス)の影響なく、細胞活性を維持した細胞培養が可能となる。

これらホール１０１と突起集合体１０３とを別体として培養領域を形成しようとすると、それらの接着、溶着による接合が必要となる。例えば接着で接合した場合には、培養領域の内部に接着剤成分が混入し、生成細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。

また、溶着しようとすると、ホール１０１内部の径が細胞形成レベルの極微小領域のため、目的とする細胞領域を形成しつつ、仕切、突起に損傷を与えずに溶着することはかなり困難である。当該仕切や突起に損傷、変形があると、細胞形成過程において細胞に不要なストレスを与えたり、細胞自身の運動に障害となる可能性がある。

従って、培養領域を形成するホール１０１と突起１０３とは一体的に形成されていることが望ましい。このように一体的に形成されることにより、細胞培養に必要な成分以外の不要成分の影響を排除した培養を実行することが可能となり好適である。

ここで図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄにおいて、本実施例の培養シート付マルチウェルプレートの全体構成図及び要部断面図を示す。

図１４Ａは本実施例における培養器材の外観斜視図、底面図を示すものである。
図１４Ｂは培養器材の上面図、上下側面図を示すものである。ここで、左右側面図は外観斜視図よりその形態が明らかであるため、図示省略する。
図１４Ｃは部分拡大図、部分断面図であり、Ａ−Ａ，Ｂ−Ｂ部分拡大図と、Ｃ−Ｃ，Ｄ−Ｄ部分拡大図と、Ｈ−Ｈ断面図を示すものである。
図１４Ｄは部分拡大図、及び端面図であり、Ｅ−Ｅ，Ｆ−Ｆ部分拡大図、Ｇ−Ｇ線端面図を示すものである。

図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄにおいて示される当該物品は、人や動物や植物などの細胞を培養する培養其材（培養容器）で、培養シート１００と培養シート１００を保持する保持部（枠体）１１１とから構成されている。

培養シート１００の表面には複数のホール１０１が形成されており、保持部に形成された筒状の穴部１１１ａの内部底面に設けられている。
更にその仕切り部の内部には複数の微細な突起部１０３を有する培養領域が夫々形成されている。ホール１０１内の培養領域を形成するシート面に添加されるように、培養する目的細胞を穴部１１１ａ内に対して添加すると、複数の微細な突起部１０３に保持されて当該目的細胞が培養されることになる。

また、本例の培養器材は、枠体１１１の裏面から培養シートが溶着される例を示しており、保持部である枠体１１１と培養シート１００とは接合部１１１２を介して溶着されている。
当該接合部１１１２は穴部１１１ａの外部に設けられており、培養領域にはその溶着の影響がない。
したがって、本例では溶着を例示したが、当該接合方法に限らず、他の接合方法によっても培養領域自体に接合による影響を及ぼすことはないため、他の接合方法を採用することも可能である。

さらに、本例の器材は、当該枠体１１１が四角状の形態を成しており、その４つの頂点の内、少なくとも１点がカットされている。このカット面１１１３が形成されていることにより、培養を行う作業者が器材穴部の位置を特定しやすくなるという効果がある。
このカット面は必須ではなく、無くても良いことは云うまでもない。当該培養器材にはまた、滑止め１１１１が形成されており、作業中、作業者が不意に当該器材を揺動、落下等を防ぐことが出来る。

実施例３では実施例１および２で作製した培養器材を利用した細胞の組織培養への適用例を示す。新薬開発において、生体機能を反映する三次元組織の構築は、動物実験に代わる細胞を利用した様々な評価に対して需要がある。さらに、こうして形成された三次元組織が薬剤のスクリーニング，あるいは新薬開発における各種試験に供される際には、三次元組織が試験に耐えうるだけの活性を保持しているかどうかを事前に検証する必要がある。この場合、形成されたスフェロイドが再現性よく所定の位置に保持されていると、ハイスループットなスクリーニング、各種試験に向くことが期待される。

また、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：iPS細胞）や胚性幹細胞（Embryonic stem cells：ＥＳ細胞）を培養して目的の細胞に分化させる前には、三次元組織を形成しなければならないことから、再生医療分野においても三次元組織を簡便に構築する技術が望まれている。このような背景から、ここでは特にチャンバースライドを用いた三次元組織を形成させる例を示すが、マルチウェルプレートであっても細胞培養の本質的な部分は特に変わるところはない。本実施例ではラット肝細胞を用いた例を示すが、上述のように様々な動植物の細胞種に適用可能であり、特に細胞種は限定されない。

肝細胞の調製は、インサイチュ(in situ)コラゲナーゼかん流法にしたがう。詳しくは以下の通りである。Ｆｉｓｈｅｒ３４４系雄ラット（７〜１０週齢）を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液（Ｃａ^２＋とＭｇ^２＋不含，ＥＧＴＡを含むハンクス液）を注入する。

同時に肝臓下部の下大静脈を切開して血液を放出させる。次に胸腔を開き、右心房に入る下大静脈を切開し、肝臓下部の下大静脈をかん止で止めてかん流を行なう。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止める。かん流液をコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行う。

本実施例では０．０５％コラゲナーゼを含むハンクス液を用いてかん流を行うが、この限りではない。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止める。肝臓を切り離し、冷したハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより細胞まで分散する。次いでガーゼろ過により未消化の組織を除去する。細胞懸濁液は、５０Ｇ、１分の遠心分離を数回繰り返して非実質細胞を除去する。次いで等張パーコール液を使用して５００Ｇ、５分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限られるものではないことはいうまでもない。また、肝細胞の調製は必ずしもin situコラゲナーゼかん流法に限られるものではない。

このようにして得られた肝細胞を用いた培養のフローチャートを図６に示す。

図６のフローにおいて、まず、実施例１で作製したチャンバースライドタイプの培養シートに、Ｉ型コラーゲン１１６を塗布する。弱酸性溶液に溶解しているＩ型コラーゲンを所定の濃度まで滅菌水で希釈した希釈液の１−１．５ｍＬを上述のチャンバースライドに添加する（同図の(a)）。次に、添加したＩ型コラーゲンをナノピラーシート１００に完全に吸着させるため、減圧操作を施す（同図の(b)）。減圧操作は、減圧用容器１１７と減圧ポンプ１１８を用い、０．０４気圧以下で行う。減圧時間は特に限定されるものではないが、本実施例では１０分間行う。減圧に用いる装置構成は特に限定するものではない。ここで希釈液の所定濃度の範囲は１００（ｎｇ／ｍｌ）以上１０（μｇ／ｍｌ）以下である。必ずしも当該範囲に限定されるものではないが、当該は球状の三次元組織が形成されるのに好適な範囲である。最後に、余剰のＩ型コラーゲンを除き、ＰＢＳ（−）１１９を加える（同図の(c)）。この操作を３回行い、余剰のＩ型コラーゲンを洗浄する。

上述の通りin situコラゲナーゼかん流法により調製した肝細胞１２０を培地１２１に懸濁し、同じく上述の通り準備したＩ型コラーゲンを塗布したＮＰシートに播種する（同図の(d)）。培地は特に限定されるものではないが、血清（ＦＣＳ）、インシュリン、デキザメタゾンを含んだ培地（以下、培地（１０％ＦＣＳ含む））を含むウィリアムズＥ培地を用いる。本実施例では、特に１０％ＦＣＳ、８．６ｎＭインシュリン、２５５ｎＭデキザメタゾンを含んだウィリアムズＥ培地を用いる。播種後、ＣＯ_２インキュベータを用いて５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で培養を開始し、１８時間以上経過した後に、最初の培地交換を行い、以降２４時間毎に培地交換を行う。播種後１８時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地（１０％ＦＣＳ含む）からＦＣＳを除いた培地（以下、培地（ＦＣＳ含まず））を用いる。

また、肝細胞の播種密度は、本実施例では１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌとしたが、この濃度に限定されない。ここで、培養に用いる培養シート１００は、ピラー高さ、ピラー径、ピラーピッチがそれぞれ１．０μｍ、２．０μｍ、４．０μｍのものを用いたが、この値に限らない。

また、培養シートに添加するＩ型コラーゲンの濃度は、本実施例では１００（ｎｇ／ｍｌ）としたがこれ以外の濃度であっても構わない。細胞の条件によってはこの濃度以外の濃度であってもスフェロイドが形成されるものもある。計９６時間培養し、三次元組織１２２が形成される（同図の(e)）。

図７に、ホール径が２００μｍの上述の培養シートを用いて実際に肝細胞を培養した結果の写真を示す。図７から明らかなように、培養シート表面に特別な化学物質の塗布無しで、かつ細胞にとってストレスの少ない静置培養より、このように大きさの揃った球状の三次元組織７１がホール７０内に形成された。これは、本来保持している細胞の活性を失わせることがないと考えられるため、細胞アッセイ等に有効な培養方法である。

図８に実施例４として、上述した培養シート１００の実施例の変形例を示す。まず、培養シート１２３は細胞の遊走性、接着性の違いをもたらす突起物の配列パターンを同図の(a)のように、第一の配列パターン１２５aの周囲を第二の配列パターン１２５bで囲うように二段階に配置することにより、第一の配列パターン１２５a上（例えばホールの中心近傍）に三次元組織あるいは二次元平面組織を形成させる例を示す。

また逆に、同図の(b)のように、第二の配列パターン１２５bの周囲を第一の配列パターン１２５aで囲うように二段階に配置することにより、第二の配列パターン１２５b上（例えばホール辺縁部）に三次元組織あるいは二次元平面組織を形成させる例を示す。なお、１２４は先の実施例同様、ホールを示す。点線は、パターンの境界を示している。

またホール１２４内の中央部に限らず、同図の(c)の培養シート１２６のように配置することにより、例えば４箇所の第一の配列パターン１２７ｂを第二の配列パターン１２７aで囲むことで、第一の配列パターン１２７ｂ上に大きさの揃った組織を形成させることもできる。このように、ピラー径、ピラーピッチ、配置パターンの組み合わせは、目的に応じて最適なパターンを配置し、培養することが可能となる。同様に、同図の(d)は、配列パターンを多段階パターン１２９ｃ、１２９b、１２９aのとした培養シート１２８を示す。

続いて、図９を用いて、上述した実施例における突起物の配列パターン(以下、ピラーパターン)の種類を説明する。図９に示すように、１１種の配列パターンを例示した。同図より明らかなように、ピラー径とピラーピッチがそれぞれ０．１８〜２０．０μｍ、０．３６〜４０．０μｍの１１種であるが、これに限定されるものではない。

これらのピラーパターンの下で培養した肝細胞の一例を図１０Ａ、１０Ｂに示した。

尚、ピラーパターンの無いフラット平面下での培養では、培養途中における培地交換の際に多数の細胞が培地と共に排出されてしまうため、所望とする培養細胞を効果的に取得することはできない。このため、図１０Ａでは図示をしていない。

図１０Ａはピラー径に対して２倍のピッチの培養シート１００を用いて培養を行ったときの細胞の様子を示す図である。この結果、ピラー径が０．１８μｍ、０．５μｍ、１．０μｍにおいては、球状ではない平坦な組織が器材底面に接着している一方、２．０μｍ、５．０μｍでは器材に対して球状をした三次元組織が形成されていた。

また２．０μｍ、５．０μｍの器材において形成された球状細胞について比較してみると、２．０μｍ器材の方が細胞が器材に接着しており、安定な状態であることが分かった。即ち、細胞接着性に関しては、ピラー径が大きいほど、低接着性を示し、細胞による移動が促進されていることがわかる。

図１０Ｂでは、各ピラー径におけるシートで形成された肝細胞の３次元組織（スフェロイド：spheroid）の数について、その形成される直径毎に纏めた結果を示す図である。シート面積は４平方ｃｍ(２ｃｍ×２ｃｍ)である。

肝細胞の三次元組織においては、創薬分野における動物実験に替わる薬剤スクリーニング，毒性・代謝試験を目的とした細胞アッセイにおいて、５０−１００ミクロン径である細胞が好ましく、本例においてはピラー径が２．０μｍ器材の場合において当該サイズの細胞形成数が最も多く好適であることがわかる。

しかし、上記の検討の下では、５０−１００ミクロン径である細胞を形成するためにピラー径が２．０μｍの場合が好ましいとしたが、これに限るものではなく、本検討において使用した全てのピラー径において、ピラーの形成されていないフラットな状態に比して、形状の安定した細胞が数多く形成されることがわかった。このように、ピラーパターンの違いにより、自在に細胞、あるいは細胞から形成される組織の形態、あるいは器材への接着性を変化させることができる。

上述の結果を応用し、図８の実施例で説明したように、ピラー径(ピラーピッチ)の小さい第一の配列パターンの周囲を、ピラー径(ピラーピッチ)の大きい第二の配列パターンで囲うように二段階で配置したり、あるいは多段階に配置することにより、細胞接着性及び細胞自身の運動特性を利用して、ホール内の目的の位置に、目的の形状の組織を形成させることが可能になる。

また、同一サイズのピラー径をもつナノピラーの高さを、ホールの辺縁部から中心部に向かって下げていくことにより、傾斜するように段階的に高さに差異を設けて、重力により中心部に集めるように細胞の運動を促し、組織を形成させることも可能である。

図１１の(a)に段階的にナノピラーの高さに差異を設けた変形例である培養シート１３０を示した。この際、通常のＵ字型の培養容器と異なり、ピラーが存在することにより、細胞が中央に保持される効果がある。さらに、同図（ｂ）の培養シート１３１のように、傾斜の中でもピラー直径に違いを設けて、上述の効果を促進させることも可能となる。

図１１の変形例では、傾斜が滑らかになるように段階的に高さを変化させているが、階段状に順次高さに変化を持たせる構成としてもよい。

また、複数のホールが集合して培養面を形成するが（チャンバースライドの場合は四角形状、プレートの場合は丸型形状）、培養する際には表面張力の影響により、培養面中央部と辺縁部では三次元組織のでき方に違いが生じる。すなわち、培養面中央部では三次元組織が形成されているにもかかわらず、辺縁部では表面張力により当該部分の培地量が増え、酸素供給量が低下し、あるいは高い水圧がかかるといった理由により、三次元組織が形成されない事態が生じる可能性がある。この現象を回避するために、図１２の(a)、(b)に示すような培養面の中央部にのみホール構造を保持した培養シート１３２、１３３を作製するようにしてもよい。

このように培養シートを形成することにより、培養効率が高く、かつ製造負荷の少ない培養器材を達成することが出来る。

図１５Ａ，図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄに第５の実施例の培養シートを示した。実施例５では、図８の実施例４で示された種々の変形例のうち、第一の配列パターン１２５ａがフラット構造で、ホールの中心部に突起が配列されているパターンの培養シートを培養シート保持部材であるチャンバースライドに適用した例を示す。すなわち、本実施例においては、培養領域各々が、第一の領域と、それを囲む第二の領域からなり、第一の領域にのみ突起を配列し、第二の領域には突起を形成しない構造の培養シートとすることにより、直径の揃った三次元組織であるスフェロイドが第一の領域に対応する、培養領域の中心部に保持されることにより、目的の位置に保持させることができる。

ここでは培養領域内の中心近傍に突起を配列した例を示すが、必ずしも中心を含む必要は無く、培養領域内の所望とする領域に突起を配列させれば良いことは云うまでもない。また、略ひし形状や円形形状の突起領域を形成する例を示すが、その他四角形、多角形状であっても良いことは云うまでもない。

図１５Ａは本実施例で作成した培養シート一例を示す。図１５Ａは、培養シート１枚あたりに複数個存在する仕切り構造１５２により構成されたホール１５１の一つの構造を示す。ホール１０１の内部が、仕切り壁で仕切られた細胞組織形成単位での培養領域を構成することは、上述した実施例と同様である。ホール１５１の底面１５４に保持されている複数の突起物１５３は、複数の微小突起物からなる。また、このホール１５１の直径をホール径１５５とする。好ましくは、培養シート１５０において、上記の仕切壁１５２を具備するホール１５１と、ホール１５１の内部に形成されている複数の突起１５３とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール１５１は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良いことは上述した実施例と同様である。

本実施例の好適な態様では，図１５Ｂの培養シート１５０aに示すように、ピラー高さ、ピラー径、ピラーピッチがそれぞれ１．０μｍ、１．０μｍ、２．０μｍおよび、１．０μｍ、２．０μｍ、４．０μｍで突起部集合体の直径が２００μｍ（全面ナノピラー）、１５０μｍ、１２０μｍ、１００μｍ、８０μｍ、６０μｍ、４０μｍ、２０μｍの培養シートを用いることができる。

図１５Ｂの拡大部１５０bに示すように、ホール内、すなわち、仕切り壁で仕切られた細胞組織形成単位での突起の形成領域(構成比率)を多段階に構成した培養器材を提供することは、後述する実施例７において最適な突起領域の形成割合を把握するためのテスト器材として有効である。培養目的とする細胞種や所望とする大きさにより最適な構成比率が異なる可能性もあることから、このような培養器材を用いて事前に培養試験をすることは、その後の培養効率にも影響するため有用である。なお、ホール１５１ａは、突起が形成されていないホールを示す。

当該培養シート１５０aは細胞に悪影響の無い材質で形成され、本例では、ポリスチレンとしている。ただし、材質はポリスチレンに限らないことは云うまでもない。

主な代表例として、図１５Ｃに突起部集合体の直径が８０μｍ，及び図１５Ｄに２０μｍの培養シートのSEM画像を例示した。図１５Ｃ、及び図１５Ｄのそれぞれの図において、１５６と１５８はホールを、１５７，１５９は突起物集合体を示している。

このように細胞に悪影響の無い単一材料で、仕切壁１５２を具備したホール１５１と当該ホール１５１の内部に形成されている複数の突起１５３とが一体的に培養シート１５０、１５０aとして形成されることにより、培養工程において細胞に異物が接着することなく細胞を成長させることができる。
さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。

また、囲み配置された仕切壁１５２の内部に複数の突起を設けているので、細胞が本来保持している能力である細胞運動を促し、当該運動により成長することで、回転培養等による外乱(ストレス)の影響なく、細胞活性を維持した細胞培養が可能となる。

これらホール１５１と突起集合体１５３とを別体として培養領域を形成しようとすると、それらの接着、溶着による接合が必要となる。例えばこれらを接着接合した場合には、培養領域の内部に接着剤成分が混入し、生成細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。また溶着接合では、ホール１５１の内径が細胞形成レベルの極微小領域径のため、目的とする細胞領域を形成しつつ、仕切、突起に損傷を与えずに溶着することはかなり困難である。当該仕切や突起に損傷、変形があると、細胞形成過程において細胞に不要なストレスを与えたり、細胞自身の運動に障害となる可能性がある。

従って、本実施例においても上述のとおり、培養領域を形成するホール１５１を構成するホール底面１５４、仕切り壁１５２および突起１５３とは一体的に形成されていることが望ましい。このように一体的に形成されることにより、細胞培養に必要な成分以外の不要成分の影響を排除した培養を実行することが可能となり好適である。

本実施例では、ピラー径、ピラーピッチ、ピラー高さはそれぞれ１．０μｍまたは２．０μｍ、２．０μｍまたは４．０μｍ、１．０μｍのものを使用したが、後述するように、これら以外の培養シートであっても構わない。本実施例では仕切り構造の高さは７０μｍであるが、この値に限らず、好適には形成される細胞が仕切りを乗り越えない程度の高さであれば良い。

本実施例における培養シート１５０、１５０aは、実施例１と同様の方法で作製されるので、ここでは作製法の詳細な説明は省略する。 さらに、本実施例おいても、図３に示すような、培養シート１５０が貼付されたチャンバースライド１０９を作製することができ、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃと同様の全体構成及び要部断面を有するチャンバースライド得ることができることは言うまでもなく、ここでは説明を省略する。

次に、第６の実施例を図４、図５に従い説明する。本実施例は、第５の実施例で説明した培養シート１５０、１５０ａを用いた、培養シート付マルチウェルプレートの構成、及びその作製例を示す実施例である。マルチウェルプレートの構成とその作製例は、図４、図５で詳細に説明したが、本実施例においては、実施例２で用いた培養シート１００に代え、培養シート１５０、１５０ａを使う以外は、基本的に実施例２と同様である。

図４の(a)はマルチウェルプレートを構成する枠体１１１の底面図である。培養シート保持部材である枠体１１１は、横幅約１２５ｍｍ、縦約８０ｍｍ、高さ約２０ｍｍの中に縦列に４穴、横列に６穴の計２４穴の筒状の穴部１１１ａが成型されたものである。素材はポリスチレンを用いている。

枠体に形成される穴の数は、通常６穴から１５３６穴まで、用途によって使い分けるため、この枠体も穴の数は２４穴に限定されない。また枠体の素材もポリスチレンに限定されるものではない。

当該培養器材の作製では、枠体１１１と図１５Ａ、図１５Ｂの培養シート１５０、１５０ａを超音波溶着により接合させる。以下の処理と構成は実施例２と同様であるので、ここでは説明を省略する。

このようにして作成された培養器材において、枠体１１１の底面に形成された培養シート１００に代わる、培養シート１５０、１５０ａには、複数のホール１５１が形成され、当該ホール底面１５４に構成されている複数の突起物は、複数の微小突起物１５３からなる。当該培養シート１５０、１５０ａにおいて、上記の仕切壁１５２を具備したホール１５１と、当該ホール１５１の内部に形成されている複数の突起１５３とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール１５１は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良い。

このように細胞に悪影響の無い単一材料で、仕切壁１５２を具備したホール１５１と当該ホール１５１の内部に形成されている複数の突起１５３とが一体的に培養シートとして形成されることにより、培養工程において細胞に異物が接着することなく細胞を成長させることができる。さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。 また、囲み配置された仕切の内部に複数の突起を設けているので、細胞が本来保持している能力である細胞運動を促し、当該運動により成長することで、回転培養等による外乱(ストレス)の影響なく、細胞活性を維持した細胞培養が可能となる。

上述のとおり、本実施例においても、培養領域を形成するホール１５１と突起１５３とは一体的に形成されていることが望ましい。このように一体的に形成されることにより、細胞培養に必要な成分以外の不要成分の影響を排除した培養を実行することが可能となり好適である。

本実施例の培養シート付マルチウェルプレートの全体構成図、及び要部断面図も、実施例２と同様、図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄに示す通りとなるので、ここでは説明を省略する。

続いて、第７の実施例として、実施例５および６で作製した培養器材を利用した細胞の組織培養への適用例を示す。先に、実施例３として、図６、図７を用いて、実施例１および２で作製した培養器材を利用した細胞の組織培養への適用例を示したが、本実施例と実施例３の相違点は、培養シート１００の代わりに、培養シート１５０、１５０ａを使った培養器材を用いる点である。それ以外の点は、説明が共通するのでここでは説明を省略する。

なお、本実施例においては、肝細胞の播種密度は、５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌとしたが、この濃度に限定されない。ここで、培養に用いる培養シート１５０、１５０ａは、先に説明したとおり、ピラー高さ、ピラー径、ピラーピッチがそれぞれ１．０μｍ、１．０μｍ、２．０μｍおよび、１．０μｍ、２．０μｍ、４．０μｍのものを用いたが、この値に限らない。

また、培養シート１５０、１５０ａに添加するＩ型コラーゲンの濃度は、本実施例では、実施例１００（ｎｇ／ｍｌ）としたがこれ以外の濃度であっても構わない。細胞の条件によってはこの濃度以外の濃度であってもスフェロイドが形成されるものもある。本実施例では，図１５Ｂに示すように、ピラー高さ、ピラー径、ピラーピッチがそれぞれ１．０μｍ、１．０μｍ、２．０μｍおよび、１．０μｍ、２．０μｍ、４．０μｍでホール径が２００μｍ、突起部集合体の直径が２００μｍ（全面ナノピラー）、１５０μｍ、１２０μｍ、１００μｍ、８０μｍ、６０μｍ、４０μｍ、２０μｍの培養シートを用いた。言うまでもなく、ホール径および突起部集合体の直径はこの値に限定されない。

図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄに、これらのパターンの培養シートを用いて計９６時間培養した結果を示す。すなわち、ホールの中心とスフェロイドの中心の間の距離を測定し、スフェロイドのホール中心保持率を検証した結果のグラフを示す。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄはそれぞれ図示のとおり、ピラー直径２．０μｍの正方配置、ピラー直径２．０μｍの三角配置、ピラー直径１．０μｍの正方配置、ピラー直径１．０μｍの三角配置に対応している。

各グラフの横軸にホール中心とスフェロイドの中心間距離を０−１９μｍ、２０―３９μｍ、４０μｍ以上の3段階に分けて表示し、縦軸には、各範囲を占めるスフェロイド数の全スフェロイド数に占める割合を示した。その結果、今回検討した全てのパターンにおいて，突起部集合体の直径が１００μｍ、あるいは８０μｍのシートで、スフェロイドがより中心に保持される割合が高いことが明らかとなった。

そして、ホール径に対し、突起部集合体の直径の最適な割合は、４０％から５０％であることが示されたが、細胞種や培養条件によってはこの値には限定されない。実験結果によれば、割合が２０％から７５％の場合にも、その半数以上がホール中心とスフェロイドの中心間距離２０―３９μｍ範囲内となることから、この２０％〜７５％範囲としても良い。

図１７、図１８は、本実施例の培養シートの培養結果の位相差顕微鏡画像の代表例として、それぞれ、ピラー高さ、ピラー径、ピラーピッチが１．０μｍ、２．０μｍ、４．０μｍで突起部集合体の直径がそれぞれ８０μｍ、２０μｍの結果を示す。図中の、ホール１５６、１５８中の数番１７０、１８０はスフェロイドを示している。図１７に示すように、突起部集合体の直径が８０μｍでは、ほぼ直径の揃ったスフェロイド１７０がホール１５６の中心部に保持されていた。一方、図１８に示すように、突起部集合体の直径が２０μｍのシートでは、スフェロイド１８０が中心部に保持されなかった。

以上の結果から明らかなように、本発明の培養器材、培養シートによれば、培養シート表面に特別な化学物質を塗布すること無く、かつ細胞にとってストレスの少ない静置培養により、このように大きさの揃った球状の三次元組織が形成され、かつホール直径と突起部集合体の直径を適切にすることにより寸法の揃ったスフェロイドがホールの中心部に保持されることが明らかとなった。

100,123,126,128,130,131,132,133,150,150a…培養シート
101,124,151,156,158…ホール
102,152…仕切り壁
103,153,157,159…突起物/突起物集合体
104,154…ホール底面
105,155…ホール径
106…ピラー径
107…ピラーピッチ
108…ピラー高さ
109…チャンバースライド
110…手術用接着剤
111…枠体
111a…枠体に形成された穴部
112…フィルム固定用突起
113…リブ構造
114…培養シート穴
115…細胞培養プレート
116…Ｉ型コラーゲン溶液
117…減圧用容器
118…減圧用ポンプ
119…洗浄用生理食塩水（ＰＢＳ（−））
120…培地
121…肝細胞
122…肝細胞スフェロイド
125a,125b,127a,127b,129a,129b,129c…突起物配列パターン
1111…滑止め部
1112…接合部
1113…カット面

Claims (10)

1. 細胞を培養する培養器材であって、
   複数の突起が形成された培養領域を備え、
   前記培養領域を仕切る仕切りによってホールが形成され、
   前記ホールは、当該ホールの直径に対する前記複数の突起の集合体の直径が２０％〜７５％の範囲となるように形成される、
   ことを特徴とする培養器材。
2. 請求項１に記載の培養器材であって、
   前記培養領域は、第一の領域と第二の領域を有し、前記第一の領域における前記突起の幅/直径と、前記第二の領域における前記突起の幅/直径とが異なる、
   ことを特徴とする培養器材。
3. 請求項１に記載の培養基材であって、
   前記突起の幅/直径が多段階に構成される、
   ことを特徴とする培養基材。
4. 請求項１に記載の培養基材であって、
   前記培養領域内に第一の領域と第二の領域とを有し、前記第一の領域における前記突起のピッチと、前記第二の領域における前記突起のピッチとが異なる、
   ことを特徴とする培養基材。
5. 請求項１に記載の培養基材であって、
   複数の前記突起のピッチが多段階に構成される、
   ことを特徴とする培養基材。
6. 請求項１に記載の培養基材であって、
   前記培養領域内に第一の領域と第二の領域とを有し、前記第一の領域における前記突起の高さと、前記第二の領域における前記突起の高さとが異なる、
   ことを特徴とする培養基材。
7. 請求項１に記載の培養基材であって、
   複数の前記突起の高さが多段階に構成される、
   ことを特徴とする培養基材。
8. 請求項１に記載の培養器材であって、
   前記仕切り及び複数の前記突起は、同一素材で一体的に形成されている、
   ことを特徴とする培養器材。
9. 請求項１に記載の培養器材であって、
   前記ホールの直径に占める、前記複数の突起の集合体の直径が４０％〜５０％の範囲である、
   ことを特徴とする培養器材。
10. 請求項１に記載の培養器材であって、
    前記仕切りに仕切られた複数の前記培養領域各々で、前記ホールの直径に占める、前記複数の突起の集合体の直径が２０％〜７５％の範囲で相異なるものが配置されている、
    ことを特徴とする培養器材。

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