WO2022210713A1 - 細胞塊形成部材、培養容器、培養細胞の生産方法、細胞塊形成部材付き培養細胞 - Google Patents

細胞塊形成部材、培養容器、培養細胞の生産方法、細胞塊形成部材付き培養細胞 Download PDF

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香織 繁富
寿子 得能
紘太郎 大
啓 篠塚
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国立大学法人北海道大学
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Definitions

  • the present invention relates to a cell cluster forming member, a culture vessel, a method for producing cultured cells, and a cultured cell with a cell cluster forming member.
  • Patent Document 1 proposes a cell culture vessel that can be suitably used in biochemical experiments, clinical experiments, drug development research, and the like.
  • Patent Literature 2 proposes a cell culture substrate for forming cell clusters having morphological polarity and tissue motility properties similar to those observed in cancer tissues in vivo.
  • the bottom surface of the well of the cell culture vessel of Patent Document 1 is provided with a hydrophilic film in which dot-shaped holes are patterned. Non-specific adhesion of cells is suppressed by this hydrophilic coating, and cells adhere to the dot-shaped hole portions. However, since the dot-shaped holes are dispersed within the well as a result of pattern formation, cells cannot be cultured to form cell clusters.
  • the present invention provides a cell cluster-forming member capable of easily forming cell clusters and excellent in industrial mass productivity; a culture vessel comprising the cell cluster-forming member; a method for producing cultured cells using the cell cluster-forming member; A cultured cell with a cell cluster forming member is provided.
  • a cell cluster-forming member having a base material; at least one adhesion-inhibiting region and at least one cell-adhering region are formed on the surface of the base material; at least one of the cell-adhering regions A cell mass-forming member, wherein a fine uneven structure region including a plurality of convex portions or a plurality of concave portions is formed in a portion; and a hydrophilic coating layer is formed on both the adhesion suppression region and the cell adhesion region.
  • a cell mass-forming member having a base material; at least one adhesion suppression region and at least one cell adhesion region are formed on the surface of the base material; at least one of the cell adhesion regions A fine uneven structure region including a plurality of protrusions or a plurality of recesses is formed in the portion; and a hydrophilic coating layer is formed on one of the adhesion suppression region and the cell adhesion region, wherein the cell Lump forming member.
  • the aspect ratio of the average height of the plurality of protrusions to the average diameter of the plurality of protrusions or the aspect ratio of the average depth of the plurality of recesses to the average diameter of the plurality of recesses is 0. 5 to 5.0, the cell cluster forming member according to any one of [1] to [3].
  • a hydrophilic layer is formed in the recesses between the plurality of protrusions of the fine uneven structure region, or on the bottom of the recesses between the plurality of protrusions, [1] to [7] ] any one of cell mass formation members.
  • the substrate contains at least one resin selected from the group consisting of polyethylene terephthalate, triacetylcellulose, polycarbonate, cycloolefin polymer, cycloolefin copolymer, acrylic resin, polystyrene and dimethylpolysiloxane, [ 1] to [8], the cell cluster forming member.
  • the cell cluster forming member according to any one of [1] to [9], wherein the ratio of the major axis of the ellipse with the smallest area circumscribing the cell attachment region to the minor axis of the ellipse is 1-3.
  • the cell attachment region is formed in an annular region surrounded by an outer diameter circle and an inner diameter circle, the diameter of the outer diameter circle is 10 to 100 ⁇ m, and the outer The difference between the diameter of the diameter circle and the diameter of the inner diameter circle is 200 nm to 30 ⁇ m, and at least a part of the annular region is formed with a fine uneven structure including a plurality of protrusions or a plurality of recesses;
  • the cell cluster forming member according to any one of [1] to [10], wherein a hydrophilic coating layer is formed on both the adhesion suppression region and the cell adhesion region.
  • a culture vessel comprising the cell cluster forming member according to any one of [1] to [11].
  • a method for producing cultured cells comprising culturing cells using the cell cluster forming member of any one of [1] to [11], and then peeling the cultured cells from the cell cluster forming member.
  • a cultured cell with a cell cluster forming member comprising: the cell cluster forming member according to any one of [1] to [11]; and cultured cells attached to the cell cluster forming member.
  • the cultured cells with the cell cluster forming member of [14], wherein the cell clusters containing the cells form a three-dimensional structure.
  • the cell clump formation member which can form a cell clump easily and is excellent in industrial mass productivity; the culture container provided with the said cell clump formation member; the production method of the cultured cell using the said cell clump formation member; and a cultured cell with a cell cluster forming member, which includes the cell cluster forming member.
  • FIG. 1 is a plan view schematically showing a cell cluster forming member according to one embodiment
  • FIG. 1 is a plan view schematically showing a cell cluster forming member according to one embodiment
  • FIG. FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 4 is a sectional view along IV-IV in FIG. 3
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 6 is a sectional view taken along line VI-VI of FIG. 5
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 8 is a cross-sectional view taken along line VIII-VIII of FIG. 7;
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 10 is a cross-sectional view taken along the line XX of FIG. 9
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 12 is a cross-sectional view taken along line XII-XII in FIG. 11
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • 14 is a cross-sectional view taken along line XIV-XIV of FIG. 13
  • FIG. FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • 16 is a cross-sectional view taken along line XVI-XVI of FIG. 15;
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 18 is a cross-sectional view taken along line XVIII-XVIII of FIG. 17
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 20 is a cross-sectional view taken along line XX-XX of FIG. 19
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 22 is a cross-sectional view taken along line XXII-XXII of FIG. 21;
  • FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • 24 is a cross-sectional view taken along line XXIV-XXIV of FIG. 23
  • FIG. FIG. 4 is an enlarged plan view schematically showing an example of a cell cluster forming member
  • FIG. 26 is a cross-sectional view taken along line XXVI-XXVI of FIG. 25
  • 4 is a DIC observation image showing the results of culturing human pancreatic ductal adenocarcinoma cell line PCI-55 after applying MPC polymer to the cell mass forming member of Example 1.
  • FIG. 4 is a DIC observation image showing the results of culturing a human pancreatic ductal adenocarcinoma cell line PCI-55 after applying an MPC polymer to the cell mass forming member of Example 2.
  • FIG. 4 is a DIC observation image showing the results of culturing mouse myoblast C2C12 strain using the cell cluster forming member of Example 1.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view schematically showing a cell cluster forming member according to a modification of FIG. 3;
  • FIG. 4 is a cross-sectional view schematically showing a cell cluster forming member according to a modification of FIG. 3;
  • FIG. 4 is a cross-sectional view schematically showing a cell cluster forming member according to a modification of FIG. 3;
  • a cell cluster forming member has a base material.
  • the material of the substrate is not particularly limited.
  • a base material made of inorganic glass and a base material made of organic polymer resin can be used.
  • a hydrophobic base material is preferable from the viewpoint of industrial mass production, and a resin base material is more preferable from the viewpoint of moldability and manufacturing cost.
  • substances constituting the organic polymer resin base material include cured products of thermoplastic resins, thermosetting resins, and cured products of photocurable resins.
  • thermoplastic resins thermoplastic resins
  • thermosetting resins thermosetting resins
  • photocurable resins examples include polyethylene terephthalate (PET), triacetyl cellulose (TAC), polycarbonate (PC), cycloolefin polymer (COP), cycloolefin copolymer (COC), acrylic resin (polymethyl methacrylate (PMMA), etc.), polystyrene (PS) and dimethylpolysiloxane (PDMS).
  • PET polyethylene terephthalate
  • TAC triacetyl cellulose
  • PC polycarbonate
  • COP cycloolefin polymer
  • COC cycloolefin copolymer
  • acrylic resin polymethyl methacrylate
  • PMMA polystyrene
  • PS polystyrene
  • PDMS dimethylpolys
  • Substances constituting the inorganic glass substrate include, for example, quartz glass, various alkali glasses, various non-alkali glasses, and the like. However, the substances constituting the inorganic glass substrate are not limited to these examples.
  • lead borosilicate glass which is a low-melting glass, or lead-free low-melting glass is preferably used.
  • a UV curable resin on an alkali glass, and form a fine structure by UV imprinting in which a fine structure plate is pressed against the resin coating layer and exposed to light. be.
  • a combination of an inorganic glass base material and an organic polymer material is also effective.
  • the overall shape of the substrate is not particularly limited. Examples thereof include film-like, sheet-like, plate-like and block-like shapes.
  • the overall shape of the base material may be changed according to the use of the cultured cells and the cell mass containing the cultured cells. For example, when producing a cell sheet with cell aggregates formed on the surface, the overall shape of the substrate is preferably sheet-like.
  • At least one adhesion suppression region and at least one cell adhesion region are formed on the surface of the substrate.
  • the adhesion-suppressing region is a hydrophilic region on the surface of the cell cluster-forming member.
  • the cell adhesion region is a hydrophobic region on the surface of the cell cluster forming member. Due to the difference in hydrophilic and hydrophobic surface properties, there is a difference in cell adhesiveness between the adhesion-inhibiting region and the cell-adhering region. Therefore, according to the cell cluster forming member according to one embodiment, cells can be selectively aggregated in the cell attachment region, and cell clusters having a three-dimensional structure can be formed in the cell attachment region.
  • the adhesion suppression region is formed with a hydrophilic coating layer.
  • the hydrophilic coating layer is a layer of hydrophilic material and imparts hydrophilicity to the surface of the cell culture member.
  • the hydrophilic material is not particularly limited as long as it has a hydrophilic functional group such as a hydroxyl group, a carbonyl group, or a carboxyl group.
  • examples include biocompatible polymers such as MPC polymers with phospholipid-like structures. Biocompatible polymers are preferred because they have low cytotoxicity and can suppress non-specific adhesion of cells and adsorption of cell adhesion factors such as proteins.
  • the type of biocompatible polymer is not particularly limited.
  • PDMS dimethylpolysiloxane
  • PEG polyethylene glycol
  • OED oligoethylene glycol
  • PMC poly(MPC-co-butyl methacrylate)
  • PMD poly(MPC-co -dodecyl methacrylate)
  • a hydrophilic coating layer is provided on part of the surface of the base material to form an adhesion suppression region.
  • the surface of the adhesion suppression region is the surface of the hydrophilic coating layer.
  • the thickness of the hydrophilic coating layer provided in the adhesion-preventing region is preferably 0.005 to 0.500 ⁇ m, more preferably 0.005 to 0.300 ⁇ m, even more preferably 0.010 to 0.100 ⁇ m.
  • the adhesion-suppressing region tends to exhibit sufficient hydrophilicity.
  • the thickness of the hydrophilic coating layer is measured as the shortest distance between the surface of the substrate and the top surface of the hydrophilic coating layer.
  • a hydrophilic coating layer is formed on both the adhesion suppression region and the cell adhesion region.
  • the fine uneven structure region in the cell adhesion region exhibits adhesiveness to cells.
  • the average height of the plurality of protrusions or the average depth of the plurality of recesses in the fine relief structure region is larger than the thickness of the hydrophilic coating layer. At the top of the plurality of projections or the base of the plurality of recesses, the thickness of the coating layer of the hydrophilicity-imparting liquid is reduced, making it easier for cells to adhere.
  • the adhesive force between the cells and the cell cluster-forming member is strengthened, and when the thickness of the hydrophilic coating layer is increased, the adhesive force between the cells and the cell cluster-forming member is weakened. .
  • the adhesive force between the cells and the cell cluster-forming member can be adjusted. Therefore, it is possible to reproduce a state close to an in vivo cell mass corresponding to a microenvironment under set conditions.
  • the adhesion suppression region may be formed by introducing a hydrophilic functional group to the surface of the resin base material.
  • a hydrophilic functional group can be introduced onto the surface of the resin substrate by irradiation treatment such as plasma irradiation, ion irradiation, radical irradiation, and ultraviolet irradiation.
  • the portion of the surface of the resin substrate into which the hydrophilic functional group has been introduced exhibits hydrophilicity.
  • the ratio of the major axis a of the ellipse with the minimum area circumscribing the cell adhesion region to the minor axis b of the ellipse is preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, 1 to 1.5 is more preferred.
  • the ratio of the major axis a of the ellipse to the minor axis b is within the above numerical range, it becomes easier to collect cells in the cell attachment region during cell culture, and cell clusters having a three-dimensional structure in which a plurality of cells are aggregated are formed. encourages formation.
  • the numerical value of the ratio of the long axis a to the short axis b can be 1 for the lower limit of the numerical range.
  • the ratio of major axis a to minor axis b is 1, the ellipse with the smallest area circumscribing the cell attachment area is determined as the circumscribed circle of the cell attachment area.
  • the ratio of the major axis a of the ellipse with the minimum area circumscribing the cell adhesion region to the minor axis b of the ellipse may exceed 3. In other embodiments, when the ratio exceeds 3, it becomes easier to obtain a cell mass in which individual cells forming the cell mass are aligned in the direction of the long axis a.
  • the major axis a of the ellipse with the minimum area circumscribing the cell adhesion region is preferably 5 to 200 ⁇ m, more preferably 10 to 100 ⁇ m, even more preferably 20 to 50 ⁇ m.
  • the major axis a of the ellipse with the smallest area circumscribing the cell-attached region is equal to or greater than the lower limit of the numerical range, the formation of cell clusters in the cell-attached region is likely to be promoted. If the major axis a of the ellipse with the minimum area circumscribing the cell adhesion region is equal to or less than the upper limit value of the numerical range, cells tend to gather in the cell adhesion region during cell culture.
  • the minor axis b of the ellipse with the minimum area circumscribing the cell adhesion region is preferably 0.5 to 200 ⁇ m, more preferably 2 to 100 ⁇ m, even more preferably 2 to 50 ⁇ m. If the minor axis b of the ellipse with the smallest area circumscribing the cell-adhesion region is equal to or greater than the lower limit of the numerical range, the formation of cell clusters in the cell-adhesion region is likely to be promoted.
  • minor axis b of the ellipse with the minimum area circumscribing the cell-adhesion region is equal to or less than the upper limit value of the above numerical range, cells tend to gather in the cell-adhesion region during cell culture.
  • the major axis a and minor axis b of the ellipse with the minimum area circumscribing the cell adhesion region are obtained as follows.
  • a circumscribed ellipse that includes the cell adhesion region is determined in plan view of the cell cluster-forming member, and the major axis and minor axis of the circumscribed ellipse are measured.
  • the shape of the cell attachment area is irregular, a plurality of circumscribed ellipses may exist for one cell attachment area.
  • the major axis and minor axis are measured for the circumscribed ellipse having the smallest area among the plurality of circumscribed ellipses.
  • the shapes of the adhesion suppression region and the cell adhesion region are not particularly limited.
  • the shapes of the adhesion suppression region and the cell adhesion region may be, for example, circular, elliptical, polygonal, or irregular, and are not limited to these examples.
  • FIG. 1 is a plan view schematically showing a cell cluster forming member according to one embodiment.
  • Four cell cluster forming regions 9, 9, 9, 9 are formed on the surface of the cell cluster forming member 1 shown in FIG.
  • the four cell mass forming regions 9, 9, 9, 9 are arranged in a square grid pattern of 2 rows ⁇ 2 columns, and adhesion suppression regions 3 are formed between the cell mass forming regions 9.
  • Each cell cluster formation region 9 includes 25 circular cell adhesion regions 4 arranged in a square lattice of 5 rows ⁇ 5 columns, and adhesion suppression regions 3 are also provided between each of the 25 cell adhesion regions 4 . is formed.
  • the arrangement form of the cell adhesion regions 4 in each cell cluster forming region is not limited to a square lattice arrangement.
  • the cell adhesion regions 4 may be arranged in a triangular grid like the cell cluster formation regions 10, 10, 10, 10 shown in FIG.
  • the mode of forming the adhesion-suppressing region, the cell-attaching region, and the cell-cluster-forming region is not limited to the modes shown in FIGS.
  • the cell cluster forming regions are regularly arranged on the surface of the cell cluster forming member, but the cell cluster forming regions may be arranged irregularly.
  • the number of cell cluster formation regions is not particularly limited.
  • the number of cell adhesion regions 4 included in each cell cluster forming member is not particularly limited.
  • the geometric shape of the cell adhesion region 4 is also not limited to the circular shape shown in FIGS. 1 and 2, and can be changed according to the desired cell mass morphology. As described above, in the cell cluster-forming member according to one embodiment, there may be countless modes of the adhesion-suppressing region, the cell-adhering region, and the cell-forming region.
  • the cell cluster-forming member In the cell cluster-forming member according to one embodiment, at least part of the cell-adhesion region is formed with a fine uneven structure region including a plurality of projections or depressions. In the fine unevenness structure region, a plurality of recesses are formed between the plurality of protrusions. Alternatively, in the fine concavo-convex structure region, continuous convex portions are formed between a plurality of concave portions.
  • the fine relief structure including these multiple protrusions and multiple recesses can serve as a structure that supports cells during culture. Therefore, the fine uneven structure can function as a scaffold for cells like an extracellular matrix. Therefore, the fine uneven structure region exhibits relatively high cell adhesiveness among the cell adhesion regions, and can form a three-dimensional structure.
  • the fine uneven structure region may be formed in at least a part of the cell adhesion region, and may be formed in the entire cell adhesion region.
  • the ratio of the fine relief structure region to the cell adhesion region is not particularly limited, and can be changed according to the desired morphology and properties of the cell mass.
  • the shape of the fine uneven structure region is also not particularly limited, and can be changed according to the desired morphology and properties of the cell mass. For example, if it is desired to form a cell mass with a tubular structure, the fine uneven structure region may be formed in a ring shape.
  • the shape of the fine relief structure region may be changed according to the shape of the desired cell mass.
  • a difference in adhesiveness to cells may occur even in the cell adhesion region depending on the presence or absence of the fine uneven structure region. In this case, it becomes easier for cells to selectively aggregate in the fine uneven structure region among the cell adhesion regions, and it becomes easier to form a cell cluster having a three-dimensional structure.
  • the shape of the protrusions and recesses of the fine uneven structure region is not particularly limited.
  • the shape of the protrusions and recesses may be conical, cylindrical, truncated conical, pyramidal, or bell-shaped, and is not limited to these exemplified shapes.
  • the average height of the plurality of protrusions or the average depth of the plurality of recesses is preferably 250 nm or more, more preferably 300 nm to 2 ⁇ m, and even more preferably 400 nm to 1.2 ⁇ m.
  • the average height of the plurality of protrusions or the average depth of the plurality of recesses is equal to or higher than the lower limit of the numerical range, the protrusions and recesses of the fine uneven structure region are easily formed, and industrial mass productivity is improved.
  • the hydrophilicity-imparting liquid of the coating layer flows into the adhesion-suppressing region.
  • the thickness of the coating layer of the hydrophilicity-imparting liquid on the tops of the plurality of protrusions is reduced. Therefore, the productivity of the cell cluster forming member is improved, and the industrial mass productivity is improved.
  • the average height of the plurality of protrusions or the average depth of the plurality of recesses is equal to or less than the upper limit of the numerical range, the adhesion of cells to the fine uneven structure region is further improved.
  • the average height of the plurality of protrusions and the average depth of the plurality of recesses are obtained as follows.
  • a cell cluster-forming member is cut perpendicularly to the surface at an arbitrary position by a microtome, CP processing (ion milling), or the like, and the cross section is observed with a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope Randomly select 20 convex portions or concave portions in a plurality of images in a magnification range in which 20 to 50 convex portions or concave portions are imaged, measure the height of the convex portion or the depth of the concave portion, and calculate the arithmetic mean Let the value be the average height of a plurality of protrusions or the average depth of recesses.
  • each convex portion is measured as the shortest distance in the thickness direction of the substrate between the apex of the convex portion and the base surface of the fine uneven structure region
  • the height of each concave portion is the apex of the concave portion and the base surface. Measured as the shortest distance in the thickness direction of the base material between the material surfaces.
  • the average depth of the plurality of recesses may be measured.
  • the average depth of the plurality of recesses is the shortest distance between the recess at the same height as the apex of the adjacent protrusion and the base surface of the fine uneven structure region. It is obtained in the same way as the average height of
  • the details and preferred aspects of the average depth of the plurality of recesses are the same as those described for the average height of the plurality of protrusions.
  • the average diameter of the plurality of protrusions or recesses is preferably 50 nm to 1.2 ⁇ m, more preferably 100 nm to 1 ⁇ m, and even more preferably 200 nm to 900 nm.
  • the average diameter of the plurality of projections is equal to or greater than the lower limit of the numerical range, the fine uneven structure region can be easily formed, and industrial mass productivity is improved.
  • the average diameter of the plurality of projections or depressions is equal to or less than the upper limit value of the numerical range, the adhesion of cells to the fine uneven structure region is further improved.
  • the average diameter of multiple protrusions is obtained as follows.
  • a scanning electron microscope (SEM) is used to observe the cell mass-forming member in plan view, and 20 convex portions are randomly selected in an image of a magnification range in which 50 to 100 convex portions are imaged, The major axis and minor axis of the circumscribed ellipse with the minimum area in plan view of the 20 convex portions are measured, and the geometric mean value of the major and minor axes is taken as the average diameter of the plurality of convex portions.
  • the average diameter of a plurality of concave portions is obtained in the same manner as the average diameter of convex portions, except that the major axis and minor axis of the circumscribed ellipse with the smallest area in plan view of the concave portions are measured. Details and preferred aspects of the average diameter of the plurality of recesses are the same as those described for the average diameter of the plurality of projections.
  • the aspect ratio of the average height of the plurality of protrusions to the average diameter of the plurality of protrusions, or the aspect ratio of the average depth of the plurality of recesses to the average diameter of the plurality of recesses is preferably 0.5 to 5.0. , is more preferably 0.6 to 4.0, more preferably 0.8 to 3.0.
  • the aspect ratio is equal to or higher than the lower limit of the numerical range, the adhesion of cells to the fine uneven structure region is further improved.
  • the aspect ratio is equal to or less than the upper limit of the numerical range, it is easy to form a fine uneven structure region, and industrial mass productivity is improved.
  • the average pitch between a plurality of protrusions or between a plurality of recesses is preferably 50 nm to 1 ⁇ m, more preferably 100 nm to 900 nm, even more preferably 200 nm to 800 nm.
  • the average pitch between the plurality of protrusions is equal to or higher than the lower limit of the numerical range, the fine uneven structure region can be easily formed, and industrial mass productivity is improved.
  • the average pitch between the plurality of protrusions is equal to or less than the upper limit of the numerical range, the adhesion of cells to the fine uneven structure region is further improved.
  • the average pitch of a plurality of convex portions is obtained as follows. Observe the cell mass forming member in plan view using a scanning electron microscope (SEM), and randomly select 20 convex portions in a plurality of images in a magnification range in which 50 to 100 convex portions are imaged. , the arithmetic average value of the shortest distances between the centers of the circumscribed ellipses with the minimum areas in plan view of two adjacent protrusions is taken as the average pitch of the plurality of protrusions.
  • SEM scanning electron microscope
  • the average pitch of a plurality of concave portions is obtained in the same manner as the average pitch of convex portions except that the shortest distance between the centers of the circumscribed ellipses with the minimum areas in two adjacent concave portions in plan view is measured.
  • the details and preferred aspects of the average pitch of the plurality of concave portions are the same as those described for the average pitch of the plurality of convex portions.
  • the cell adhesion region may be located at a position relatively different in height from the adhesion suppression region in the thickness direction of the substrate.
  • the “height difference between the adhesion-inhibiting region and the cell-adhering region” is the height difference between the basal surfaces of the substrates in the adhesion-inhibiting region and the cell-adhering region.
  • the “basal surface of the substrate” is the flat surface of the substrate itself.
  • the “basal surface of the substrate” refers to the surface excluding all protrusions from the surface, or the surface of the surface. This is a surface formed by filling all the concave portions.
  • the positional relationship between the cell adhesion region and the adhesion suppression region in the height direction is not particularly limited. That is, the cell adhesion region may be positioned higher than the adhesion suppression region in the thickness direction of the base material, or may be positioned lower than the adhesion suppression region, and the adhesion suppression region and the cell adhesion region may be at the same height position. There may be.
  • the height position of the cell attachment region is the height position of the apex of the projections of the fine uneven structure region.
  • the height position of the apex of the convex portion of the fine uneven structure region coincides with the height position of the surface of the adhesion-inhibiting region in the thickness direction of the substrate. do.
  • the cell adhesion region should be positioned higher than the adhesion suppression region in the thickness direction of the base material.
  • the hydrophilicity-imparting liquid tends to flow down from the cell-adhering region to the adhesion-inhibiting region, resulting in production because it is easy to
  • the height difference between the cell adhesion region and the surface of the substrate is preferably 0 to 3 ⁇ m, more preferably 100 nm to 2 ⁇ m, even more preferably 300 nm to 1 ⁇ m. If the height difference is more than 0 ⁇ m and the cell adhesion region is positioned higher than the adhesion suppression region, hydrophilicity is imparted to the entire surface of the base material when producing a cell cluster formation member by the method ( ⁇ 1) described below. After applying the liquid, the hydrophilicity-imparting liquid tends to flow down from the cell-adhering area to the adhesion-inhibiting area. Therefore, the cell cluster-forming member can be easily manufactured, and the industrial mass productivity is further improved. When the difference in height is equal to or less than the upper limit of the numerical range, migration of cells to the cell attachment region is less likely to be hindered.
  • a hydrophilic layer is formed in the recesses between the plurality of protrusions of the fine relief structure region of the cell adhesion region, or on the bottom of the recesses between the plurality of protrusions.
  • a hydrophilic layer is a layer of hydrophilic material. Details and preferred aspects of the hydrophilic material are the same as those described for the hydrophilic coating layer.
  • the hydrophilic material in the hydrophilic layer may be the same as or different from the hydrophilic material in the hydrophilic coating layer. Considering industrial mass productivity, the hydrophilic material in the hydrophilic layer is preferably the same as the hydrophilic material in the hydrophilic coating layer.
  • the fine uneven structure region in the cell adhesion region exhibits adhesiveness to cells.
  • a layer of an adhesion factor may be provided on the surface of the cell-adhering region in order to enhance cell adhesiveness.
  • Adhesion factors include laminin, collagen, gelatin, fibronectin, polylysine (PDL, PLL), extracellular matrices such as hyaluronic acid, polymers, gels and the like.
  • the cell mass-forming member In the cell mass-forming member according to one embodiment described above, at least one or more adhesion suppression regions and at least one or more cell adhesion regions are formed on the surface of the substrate, and at least a part of the cell adhesion region has fine unevenness. A structural region is formed. Therefore, cells are relatively more likely to adhere to the cell adhesion region than to the adhesion suppression region, and cells are more likely to adhere to the fine uneven structure region among the cell adhesion regions. In this way, since a sufficient difference in adhesiveness to cells occurs among the adhesion suppression region, the cell adhesion region, and the fine uneven structure region, cells can be transferred from the adhesion suppression region to the fine uneven structure region in the cell adhesion region during cell culture. more likely to move to Therefore, the cell cluster forming member according to one embodiment facilitates the formation of cell clusters.
  • a method for manufacturing a cell cluster-forming member according to one embodiment is not particularly limited. For example, it can be produced by the following method ( ⁇ ).
  • the division between the adhesion-inhibiting region and the cell-adhering region can be changed according to the type of cells, the desired morphology and properties of the cell mass, and is not particularly limited.
  • a single particle film etching mask made of colloidal silica described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-034630 may be used for forming the fine uneven structure region.
  • a fine relief structure region can be formed on the substrate by vapor phase etching using the monoparticle film etching mask.
  • various methods for forming fine relief structure regions such as colloidal lithography, anodization, and interference exposure can be used.
  • the hydrophilic treatment is not particularly limited as long as it is a treatment that increases hydrophilicity.
  • a hydrophilicity imparting liquid containing at least a hydrophilic material may be applied to the surface of the substrate. After that, the applied layer of the hydrophilicity-imparting liquid is solidified, and a hydrophilic coating layer is provided on a part of the surface of the substrate to form at least one adhesion-inhibiting region and at least one cell-adhering region. good.
  • a part of the surface of the base material may be subjected to a hydrophilic treatment to form at least one adhesion-inhibiting region and at least one cell-adhering region on the surface of the base material.
  • a hydrophilic treatment such as plasma irradiation, ion irradiation, radical irradiation, ultraviolet irradiation, or the like.
  • plasma irradiation is preferred because it causes less physical damage to the substrate surface.
  • a stimulus-responsive material may be applied to the surface of the cell cluster forming member in order to facilitate detachment and collection of cultured cells.
  • a temperature-responsive polymer whose water affinity changes with temperature change is preferred, and poly-N-isopropylacrylamide (PIPAAm) is preferred.
  • the fine uneven structure region may be formed after the stimuli-responsive material is applied to the substrate, or the stimulus-responsive material may be applied to the substrate after the fine uneven structure region is formed. You can apply it. However, when the stimulus-responsive material is applied to the base material after forming the fine relief structure region, it is preferable to apply the stimulus-responsive material to the base material before the hydrophilization treatment.
  • Method ( ⁇ 1) The surface of the substrate is divided into an adhesion-suppressing region and a cell-adhering region, a fine uneven structure region is formed in the cell-adhering region, and then a hydrophilicity-imparting liquid is applied to the entire surface of the substrate. how to.
  • method ( ⁇ 1) when separating the adhesion-inhibiting region and the cell-adhering region, it is preferable to form the cell-adhering region at a position higher than the adhesion-inhibiting region in the thickness direction of the substrate. This is because after the hydrophilicity-imparting liquid is applied to the entire surface of the base material, the hydrophilicity-imparting liquid tends to flow down from the cell-attaching region to the adhesion-suppressing region, which facilitates production.
  • a height difference in the thickness direction may be provided on the surface of the base material. This height difference may be provided on the substrate by a general photolithographic method.
  • FIG. 3 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • FIG. 4 is a sectional view taken along line IV-IV of FIG.
  • a cell cluster forming member 1A shown in FIGS. 3 and 4 has a substrate 2. As shown in FIG. On the surface 2a of the substrate 2, a circular and spot-like cell adhesion area 4A and an adhesion suppression area 3A are formed. Therefore, there is a difference in the adhesiveness of cells in each region. Therefore, in the cell cluster-forming member 1A, cells can be selectively aggregated in the cell-attached regions 4A to form cell clusters in the circular and spot-like cell-attached regions 4A.
  • the adhesion suppression region 3A is formed outside the circular spot-shaped cell adhesion region 4A. Also, the adhesion suppression region 3A is covered with a hydrophilic coating layer 5 provided on the surface 2a of the substrate 2. As shown in FIG. The adhesion suppression region 3A exhibits hydrophilicity due to the hydrophilic coating layer 5. As shown in FIG. The thickness of the hydrophilic coating layer 5 in the adhesion suppression region 3A is preferably 0.005-0.500 ⁇ m, more preferably 0.005-0.300 ⁇ m, and even more preferably 0.010-0.100 ⁇ m.
  • the spot-shaped cell-adhering region 4A is circular in plan view.
  • the ellipse with the smallest area circumscribing the cell adhesion region 4A coincides with the outer circle that separates the cell adhesion region 4A and the adhesion suppression region 3A. Therefore, in the cell mass-forming member 1A, the major axis a of the ellipse with the smallest area circumscribing the cell adhesion region 4A coincides with the minor axis b of the ellipse, and the outer circumference circle partitions the cell adhesion region 4A and the adhesion suppression region 3A. equal to the diameter of
  • the entire cell adhesion region 4A is the fine uneven structure region 6.
  • the cell adhesion region 4A exhibits hydrophobicity due to the fine relief structure region 6 formed on the surface 2a of the substrate 2.
  • the fine concavo-convex structure region 6 includes a plurality of conical protrusions 7 .
  • the cell adhesion region 4A is located higher than the adhesion suppression region 3A in the thickness direction of the substrate 2. Therefore, in the case of manufacturing a cell mass-forming member by the method ( ⁇ 1), when the hydrophilicity-imparting liquid is applied to the entire surface 2a of the substrate 2, the hydrophilicity-imparting liquid spreads from the cell-adhering region 4A to the adhesion-suppressing region 3A. Easy to flow down and easy to manufacture.
  • the height difference h between the cell adhesion region 4A and the surface 2a of the substrate 2 is preferably 0-3 ⁇ m, more preferably 100 nm-2 ⁇ m, and even more preferably 300 nm-1 ⁇ m.
  • the height difference h is equal to or greater than the lower limit of the numerical range, the cell cluster-forming member can be easily manufactured, and industrial mass productivity is improved.
  • the height difference h is equal to or less than the upper limit value of the numerical range, migration of cells to the cell attachment region is less likely to be hindered.
  • the cell mass-forming member 1A In the cell mass-forming member 1A, a sufficient difference in adhesiveness to cells can be obtained between the adhesion suppression region 3A and the fine uneven structure region 6. FIG. Therefore, during cell culture, cells tend to migrate from the adhesion suppression region 3A to the fine uneven structure region within the cell adhesion region 4A.
  • the ratio of the long axis a to the short axis b of the ellipse with the minimum area circumscribing the spot-shaped cell-adhesion region 4A is sufficiently small, cells are easily collected in the spot-shaped cell-adhesion region 4A during cell culture. , promotes the formation of cell clusters with a three-dimensional structure in which multiple cells aggregate. Therefore, according to the cell cluster forming member 1A, it is easy to form cell clusters.
  • FIG. 5 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • FIG. 6 is a sectional view taken along line VI-VI in FIG.
  • the cell cluster forming member 1B shown in FIGS. 5 and 6 differs from the cell cluster forming member 1A in the following three points, and has the same structure as the cell cluster forming member 1A in other respects.
  • the hydrophilic coating layer 5 is also formed on the surfaces of the plurality of protrusions 7 of the fine uneven structure region 6 of the cell attachment region 4B.
  • the hydrophilic layer 8 is formed on the bottom of the concave portions between the plurality of convex portions 7 of the fine concave-convex structure region 6B.
  • the surface of the hydrophilic coating layer 5 formed on the fine concavo-convex structure region 6 of the cell adhesion region 4B follows the fine concavo-convex structure region 6 .
  • the average height of the plurality of protrusions 7 or the average depth of the plurality of recesses is greater than the thickness of the hydrophilic coating layer in the fine uneven structure region 6.
  • the cell cluster forming member 1B can be suitably manufactured by the method ( ⁇ 1).
  • the hydrophilic coating layer 5 in the fine uneven structure region 6 of the cell attachment region 4B is formed by the hydrophilicity imparting liquid applied to the entire surface 2a of the base material 2, the liquid remaining on the surfaces of the plurality of protrusions or the plurality of recesses. can be said to be solidified.
  • the thickness of the hydrophilic coating layer 5 in the fine relief structure region 6 of the cell attachment region 4B is preferably 0.005 to 0.500 ⁇ m, more preferably 0.005 to 0.300 ⁇ m, and even more preferably 0.010 to 0.100 ⁇ m. .
  • the hydrophilic layer 8 is a layer of hydrophilic material. Details and preferred aspects of the hydrophilic material are the same as those described for the hydrophilic coating layer.
  • the hydrophilic material in the hydrophilic layer 8 may be the same material as the hydrophilic material in the hydrophilic coating layer 5, or may be a different material. However, considering industrial mass productivity, the same hydrophilic material is preferable for all layers.
  • the same effect as the cell mass forming member 1A can be obtained.
  • the cell mass-forming member 1B can form the adhesion suppression region 3A and the cell adhesion region 4B by coating the entire surface 2a of the base material 2 with a hydrophilicity-imparting liquid in the manufacturing process, so that it can be industrially mass-produced. Also excellent.
  • FIG. 7 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view taken along line VIII-VIII of FIG.
  • a cell mass-forming member 1C shown in FIGS. 7 and 8 is different from the cell mass-forming member 1A in that a fine uneven structure region 6 is also formed in an adhesion suppression region 3B. It has a configuration common to
  • the "height difference between the cell adhesion region and the surface of the base material” means the base surface of the plurality of projections of the fine uneven structure region 6 in the cell adhesion region 4A and the adhesion suppression region.
  • 3B is the difference in height from the base surface of the plurality of projections of the fine uneven structure region 6 .
  • the details and preferred aspects of the fine concavo-convex structure region 6 in the adhesion-suppressing region 3B are similar to those described for the cell cluster-forming member 1A, except that the average height of the plurality of convex portions 7 is equal to or less than the thickness of the hydrophilic coating layer 5.
  • the content is the same as that of the concave-convex structure region 6 .
  • the average height of the plurality of protrusions 7 in the adhesion suppression region 3B is preferably 80% or less, more preferably 50% or less, of the thickness of the hydrophilic coating layer 5 .
  • the properties such as the average height, average diameter, and average pitch of the protrusions 7 of the fine uneven structure region 6 in the adhesion suppression region 3B may be the same as or different from the properties of the fine uneven structure region 6 in the cell adhesion region 4A. good.
  • the cell cluster forming member 1C as well, effects similar to those of the cell cluster forming member 1A can be obtained.
  • FIG. 9 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • 10 is a cross-sectional view taken along the line XX of FIG. 9.
  • FIG. The cell cluster forming member 1D shown in FIGS. 9 and 10 differs from the cell cluster forming member 1A in the following three points, and has the same configuration as the cell cluster forming member 1A in other respects.
  • the hydrophilic coating layer 5 is also formed on the surfaces of the plurality of protrusions 7 of the fine uneven structure region 6 of the cell attachment region 4B.
  • the surface of the hydrophilic coating layer 5 formed on the fine concavo-convex structure region 6 of the cell adhesion region 4B follows the fine concavo-convex structure region 6 .
  • the average height of the plurality of protrusions 7 or the average depth of the plurality of recesses is greater than the thickness of the hydrophilic coating layer in the fine relief structure region 6 .
  • the relationship between the average height of the plurality of protrusions 7 or the average depth of the plurality of recesses and the thickness of the hydrophilic coating layer in the fine unevenness structure region 6 is determined by surface observation of the fine unevenness structure region 6 with an electron microscope. It can be confirmed by the appearance of the structure on the surface.
  • a cross-sectional sample of the cell mass-forming member in which the fine uneven structure region 6 is embedded in the embedding resin for cross-sectional observation is prepared, and the cross-sectional observation is performed with an electron microscope to determine the average height of the plurality of protrusions 7 or the number of the plurality of The size relationship between the average depth of the recesses and the thickness of the hydrophilic coating layer can be confirmed.
  • the cell cluster forming member 1D as well, effects similar to those of the cell cluster forming member 1A can be obtained. Further, the cell cluster forming member 1D is also excellent in industrial mass productivity like the cell cluster forming member 1B.
  • FIG. 11 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • 12 is a cross-sectional view taken along line XII-XII of FIG. 11.
  • FIG. The cell cluster forming member 1E shown in FIGS. 11 and 12 is different from the cell cluster forming member 1A in that the cell adhesion region 4A is positioned lower than the surface 2a of the substrate 2 in the thickness direction of the substrate 2. In some respects, it has the same configuration as the cell cluster forming member 1A.
  • FIG. 13 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • 14 is a cross-sectional view taken along line XIV-XIV of FIG. 13.
  • FIG. The cell cluster forming member 1F shown in FIGS. 13 and 14 is different from the cell cluster forming member 1B in that the cell adhesion region 4B is positioned lower than the surface 2a of the substrate 2 in the thickness direction of the substrate 2. In some respects, it has the same configuration as the cell cluster forming member 1B. Also in the cell mass forming member 1F, the same effects as those of the cell mass forming member 1B can be obtained.
  • FIG. 15 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • 16 is a cross-sectional view taken along line XVI-XVI of FIG. 15.
  • FIG. 15 In a cell cluster forming member 1G shown in FIGS. 15 and 16, an adhesion suppression region 3A and a cell adhesion region 4C are formed on the surface 2a of the substrate 2.
  • a fine concavo-convex structure region 6 is annularly formed in the cell adhesion region 4C.
  • the outer periphery of the annular fine uneven structure region 6 coincides with the outer edge of the cell adhesion region 4C.
  • the surface 2a of the substrate 2 is exposed and forms part of the cell attachment region 4C.
  • the surface of the cell adhesion region 4C includes the surface of the annular fine uneven structure region 6 and the surface 2a of the substrate 2. As shown in FIG.
  • the diameter R of the outer diameter circle of the annular fine relief structure region 6 is preferably 10 to 100 ⁇ m, more preferably 10 to 60 ⁇ m, even more preferably 20 to 45 ⁇ m.
  • the diameter R of the outer diameter circle is equal to or greater than the lower limit of the numerical range, the annular fine uneven structure region 6 is easily formed, and industrial mass productivity is improved.
  • the diameter R of the outer diameter circle is equal to or less than the upper limit value of the above numerical range, cells are likely to be selectively aggregated in the cell adhesion region 4C to form cell clusters.
  • the diameter r of the inner diameter circle of the annular fine uneven structure region 6 is preferably 500 nm or more, more preferably 1 ⁇ m or more, and even more preferably 10 ⁇ m or more.
  • the diameter r of the inner diameter circle is equal to or greater than the lower limit of the numerical range, the annular fine uneven structure region 6 is easily formed, industrial mass productivity is improved, and the three-dimensional structure in the annular fine uneven structure region 6 is improved. It is easy to promote the formation of cell clusters.
  • the width W of the annular fine relief structure region 6, that is, the difference between the outer diameter R and the diameter r of the inner diameter circle is preferably 200 nm to 30 ⁇ m, more preferably 1 to 20 ⁇ m, and even more preferably 3 to 15 ⁇ m.
  • the width W is equal to or greater than the lower limit of the numerical range, the annular fine uneven structure region 6 is easily formed, and industrial mass productivity is improved.
  • the width W is equal to or less than the upper limit of the numerical range, the formation of cell clusters having a three-dimensional structure in the annular fine uneven structure region 6 is likely to be promoted.
  • the surface of the projections 7 of the annular fine uneven structure region 6 tends to exhibit relatively high adhesiveness to cells.
  • the adhesion-suppressing region 3A in the cell cluster-forming member 1G does not need to be as hydrophilic as the adhesion-suppressing region 3A in the cell cluster-forming member 1A.
  • the thickness of the hydrophilic coating layer 5 of the adhesion-suppressing region 3A of the cell cluster-forming member 1G may be smaller than the hydrophilic coating layer of the adhesion-suppressing region 3A of the cell cluster-forming member 1A.
  • the thickness of the hydrophilic coating layer 5 in the adhesion suppression region 3A in the cell cluster forming member 1G is preferably 0.005 to 0.500 ⁇ m, more preferably 0.005 to 0.300 ⁇ m, and more preferably 0.010 to 0.010 ⁇ m. .100 ⁇ m is more preferred.
  • the thickness of the hydrophilic coating layer 5 of the adhesion-suppressing region 3A of the cell mass-forming member 1G is equal to or greater than the lower limit value of the numerical range, sufficient hydrophilicity can be easily imparted to the adhesion-suppressing region 3A of the cell mass-forming member 1G.
  • the thickness of the hydrophilic coating layer 5 in the adhesion suppression region 3A in the cell cluster forming member 1G is equal to or less than the upper limit of the numerical range, the production cost can be easily reduced.
  • the cell mass forming member 1G effects similar to those of the cell mass forming member 1A can be obtained.
  • cells tend to gather on the surfaces of the convex portions 7 of the fine uneven structure region 6 among the cell adhesion regions 4C during cell culture.
  • the annular fine relief structure region 6 may be recessed and positioned lower than the adhesion suppression region 3A. Also in this case, the same effects as those of the cell cluster forming member 1G can be obtained.
  • FIG. 17 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • 18 is a cross-sectional view taken along line XVIII-XVIII of FIG. 17.
  • FIG. The cell cluster forming member 1H shown in FIGS. 17 and 18 differs from the cell cluster forming member 1G in the following two points, and has the same configuration as the cell cluster forming member 1G in other respects.
  • the hydrophilic coating layer 5 is also formed in the concave portions between the plurality of convex portions 7 of the ring-shaped fine concavo-convex structure region 6 .
  • the adhesion suppression region 3A is also formed in the inner region of the ring-shaped fine concavo-convex structure region 6 .
  • the cell cluster-forming member 1H as well, effects similar to those of the cell cluster forming member 1G can be obtained.
  • the cell cluster-forming member 1H can be suitably manufactured by the method ( ⁇ 1) so as to have the hydrophilic coating layer 5 in the same manner as the cell cluster-forming member 1B, it is also excellent in industrial mass productivity.
  • the ring-shaped fine relief structure region 6 may be recessed and positioned lower than the adhesion suppression region 3A. Also in this case, the same effects as those of the cell cluster forming member 1H can be obtained.
  • FIG. 19 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member. 20 is a cross-sectional view taken along line XX-XX of FIG. 19.
  • FIG. The cell mass-forming member 1I shown in FIGS. 19 and 20 is different from the cell mass-forming member 1A in that a concave fine uneven structure region 6I including a plurality of recesses 11 is formed. It has a configuration common to that of the member 1A. In the cell cluster forming member 1I as well, effects similar to those of the cell cluster forming member 1A can be obtained.
  • FIG. 21 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member. 22 is a cross-sectional view taken along line XXII-XXII of FIG. 21.
  • FIG. The cell cluster forming member 1J shown in FIGS. 21 and 22 differs from the cell cluster forming member 1B in the following four points, and has the same configuration as the cell cluster forming member 1B in other respects. - The point that the concave-shaped fine uneven structure region 6J is formed. •
  • the hydrophilic layer 8 is formed on the bottoms of the plurality of concave portions 11 of the fine concave-convex structure region 6 .
  • the surface of the hydrophilic coating layer 5 formed on the fine concavo-convex structure region 6 of the cell adhesion region 4B follows the fine concavo-convex structure region 6 .
  • the average height of the plurality of protrusions 7J or the average depth of the plurality of recesses is greater than the thickness of the hydrophilic coating layer in the fine uneven structure region 6.
  • the cell cluster forming member 1J also has the same effect as the cell cluster forming member 1B.
  • FIG. 23 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • 24 is a cross-sectional view taken along line XXIV-XXIV of FIG. 23.
  • FIG. The cell cluster forming member 1K shown in FIGS. 23 and 24 is different from the cell cluster forming member 1C in that a concave fine concave-convex structure region 6K including a plurality of concave portions 11 is formed. It has a configuration common to that of the member 1C. In the cell mass forming member 1K as well, effects similar to those of the cell mass forming member 1C can be obtained.
  • FIG. 25 is an enlarged plan view schematically showing an example of the cell cluster forming member.
  • 26 is a cross-sectional view taken along line XXVI-XXVI of FIG. 25.
  • FIG. The cell cluster forming member 1L shown in FIGS. 25 and 26 differs from the cell cluster forming member 1D in the following two points, and has the same configuration as the cell cluster forming member 1D in other respects.
  • regions are formed.
  • the hydrophilic layer 8 is formed on the bottoms of the plurality of concave portions 11 of the fine concave-convex structure region 6 .
  • effects similar to those of the cell cluster forming member 1D can be obtained.
  • FIG. 30 is a sectional view corresponding to the IV-IV line section in the modified example (1A') of the cell cluster forming member 1A shown in FIG.
  • the tips of a plurality of protrusions 7 are exposed from the hydrophilic layer 8 in the fine relief structure region 6 of the cell attachment region 4A'.
  • the adhesion of cells in the cell adhesion region 4A' becomes higher.
  • FIG. 31 is a cross-sectional view corresponding to the cross section taken along the line XX in the modified example (1D') of the cell cluster forming member 1D shown in FIG.
  • the tips of a plurality of protrusions are exposed from the hydrophilic layer 8 in the fine relief structure region 6 of the cell adhesion region 4B'.
  • the adhesion of cells in the cell adhesion region 4B' becomes higher.
  • FIG. 32 is a cross-sectional view corresponding to the XXII-XXII line cross section in the modified example (1J') of the cell cluster forming member 1J shown in FIG.
  • the tips of a plurality of protrusions 7J are exposed from the hydrophilic layer 8 in the cell attachment region 4J'.
  • the adhesion of cells in the cell adhesion region 4J' becomes higher.
  • the culture vessel according to one embodiment includes the cell mass-forming member according to one embodiment, it can easily form cell masses and is excellent in industrial mass productivity.
  • the culture vessel for example, there is a vessel having a cell cluster forming member on the inner wall surface of a vessel body for containing a culture solution containing cells.
  • the inner wall surface of the container body is not particularly limited as long as it can come into contact with the culture medium, and may be the bottom surface of the container body or the inner side surface of the container body.
  • the cell cluster forming member may be provided on the inner wall surface of the container body via an adhesive.
  • the shape and size of the culture vessel are not particularly limited.
  • Culture vessels include petri dishes; culture plates with one or more wells (holes); culture flasks; glass slide chambers;
  • the number of wells in the culture plate is not particularly limited, and is set according to the application of the cultured cells, the analyzer to be used, and the like.
  • the shape of the well in plan view is not particularly limited. Examples include perfect circles, ellipses, triangles, squares, rectangles, and pentagons.
  • the shape of the bottom of the well is also not particularly limited. Flat bottoms, round bottoms, irregularities and the like can be mentioned.
  • the material of the culture vessel is not particularly limited. Examples include polymer materials, metal materials, and inorganic materials.
  • polymer resins include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyester, polyisoprene, cycloolefin polymer, polyimide, polyamide, polyamideimide, (meth)acrylic resin, epoxy resin, and silicone.
  • Metal materials include, for example, stainless steel, copper, iron, nickel, aluminum, titanium, gold, silver, and platinum.
  • inorganic materials include silicon oxide (glass), aluminum oxide, titanium oxide, zirconium oxide, iron oxide, and silicon nitride.
  • ⁇ Method for producing cultured cells In a method for producing cultured cells according to one embodiment, cells are cultured using the cell cluster forming member according to one embodiment, and then the cultured cells are separated from the cell cluster forming member. In the method for producing cultured cells, cells are cultured using the cell cluster-forming member according to the above-described embodiment, so cells tend to gather in the cell-adhesion region, and the formation of cell clusters having a three-dimensional structure is likely to be promoted.
  • Cells are not particularly limited. Those capable of forming cell clusters can be preferably selected. Examples thereof include hepatocytes, osteoblasts, chondrocytes, myoblasts, fibroblasts, myocardial cells, blood immune cells, vascular endothelial cells and the like. Stem cells with differentiation potential such as iPS cells and ES cells, and differentiated cells derived from stem cells may be used as the cells. Tumor cells may also be used as cells.
  • Tumor cells are preferably epithelial tumor cells, and include cervical cancer cells such as HeLa cells, pancreatic cancer cells, lung cancer cells, colon cancer cells, head and neck cancer cells, and the like.
  • Animal species of cells, stem cells, differentiated cells, and tumor cells are not particularly limited. Examples include mammals such as humans, pigs, mice, rats, rabbits, guinea pigs, hamsters, cows, horses, cats, dogs, sheep and goats.
  • the culture conditions are not particularly limited, and can be changed according to the cell type, use of the cell mass, and the like.
  • a cell detachment agent may be used to detach confluent cultured cells.
  • the cell detachment agent is not particularly limited as long as it is a detachment agent commonly used in cell culture.
  • a cultured cell with a cell cluster forming member includes the cell cluster forming member according to one embodiment; and cultured cells attached to a cell attachment region of the cell cluster forming member.
  • the cultured cells with the cell cluster forming member according to one embodiment are produced by culturing the cells in a state of adhering to the surface of the cell cluster forming member using the above-described cell cluster forming member. Therefore, any three-dimensional cell cluster containing cultured cells can adhere to the surface of the cell cluster forming member.
  • Cell types are not particularly limited. Cells similar to those exemplified in the section on the production method of cultured cells can be used.
  • the cultured cells with the cell cluster forming member can be suitably applied to regenerative medicine, viral and bacterial infectious disease research, and therapeutic agent screening methods for diseases. When applied to the development of therapeutic drugs for diseases, the drug exerts either or both of a preventive effect and a therapeutic effect on the disease.
  • the screening method cell clusters containing disease target cells and tumor cells are allowed to coexist with a test substance, and the presence or absence of attenuation or loss of morphology specific to the target cells is observed in the presence of the test substance. Then, whether or not the test substance has preventive and curative effects on diseases is determined.
  • Example 1 A single particle film etching mask made of colloidal silica was produced by the method described in JP-A-2009-034630 on a Si wafer with a spot pattern (photoresist) using a general photolithography method. A fine uneven structure is formed on a Si substrate by vapor phase etching using this monoparticle film etching mask, and the remaining photoresist is removed, so that a circular spot-like fine uneven structure region with a diameter of 30 ⁇ m and a shortest length of 40 ⁇ m is formed. A convex Si surface fine structure original plate (1) was prepared with 100 pieces per 1 mm 2 spaced apart.
  • the fine relief structure region includes a plurality of approximately conical protrusions, the average pitch between the protrusions is 200 nm, and the average pitch of the protrusions is 200 nm.
  • the height was 530 nm.
  • the height difference h between the tips of the projections of the circular and spot-shaped fine uneven structure region and the flat region outside the fine uneven structure region was 270 nm.
  • a convex structure to be a mounting portion is transferred to the surface of a cycloolefin polymer film having a thickness of 188 ⁇ m by a thermal nanoimprint method, and a convex resin transfer member (1) is formed.
  • a convex resin transfer member (1) is formed.
  • the surface of a cycloolefin polymer film having a thickness of 188 ⁇ m and the fine structure surface of a concave Ni electroforming stamper (1) were set in the pressure unit of a nanoimprinting apparatus. In this state, the temperature was started to rise, and the pressure was applied at 175° C. for 5 minutes at 5 MPa.
  • the pressurizing part was cooled to room temperature, and the concave Ni electroforming stamper (1) was released from the surface of the cycloolefin polymer film to obtain a convex resin transfer member (1).
  • This convex resin transfer member (1) was used as the convex cell cluster forming member of Example 1.
  • Example 2 A concave resin original plate (1) was obtained by transferring a convex structure to be a mounting portion onto the surface of a cycloolefin polymer film having a thickness of 188 ⁇ m by thermal nanoimprinting from the convex Si surface microstructure master plate (1) prepared in Example 1. ) was made. A convex Ni electroformed stamper (1) was produced from the concave resin master plate (1), and concave cells were produced in the same manner as in Example 1 except that the convex Ni electroformed stamper (1) was used. A mass-forming member was obtained.
  • Example 3 A single particle film etching mask made of colloidal silica was produced on a Si wafer with a ring pattern (photoresist) using a general photolithography method by the method described in JP-A-2009-034630. An annular fine relief structure region was formed on the Si substrate by vapor phase etching using this monoparticle film etching mask (remaining photoresist was removed).
  • the diameter R of the outer diameter circle of the annular fine uneven structure was 40 ⁇ m
  • the diameter r of the inner diameter circle was 30 ⁇ m
  • the width W was 5 ⁇ m.
  • a convex Si surface microstructure master plate (2) was prepared in which 100 annular fine uneven structure regions were arranged per 1 mm 2 at intervals of 30 ⁇ m at the shortest.
  • the annular fine relief structure region includes a plurality of substantially conical protrusions, the average pitch between the protrusions is 400 nm, and the plurality of protrusions
  • the average height of the part was 1100 nm.
  • the height difference h between the tip of the convex portion of the annular fine uneven structure region and the flat region outside the fine uneven structure region was 500 nm.
  • a convex cell mass-forming member was obtained in the same manner as in Example 1, except that a concave Ni electroforming stamper (2) produced from a convex Si surface microstructure master (2) was used. rice field.
  • Example 4 From the convex Si surface microstructure master plate (2) prepared in Example 3, a concave structure made of cycloolefin polymer was transferred to the surface of a cycloolefin polymer film having a thickness of 188 ⁇ m by thermal nanoimprinting. A resin original plate (2) was produced. A concave cell cluster-forming member was obtained in the same manner as in Example 1, except that a convex Ni electroforming stamper (2) produced from a concave resin master plate (2) was used.
  • the cell mass-forming member was washed with distilled water, and the air-dried cell mass-forming member was cut into a size of 20 mm ⁇ 20 mm, and petroleum jelly was applied to the inner bottom of a culture petri dish (Aznol petri dish, AS ONE Co., Ltd.) having a diameter of 40 mm and a depth of 13.5 mm. fixed through.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • 2 ⁇ 10 6 PCI-55 cells suspended in 3 mL of DMEM were seeded on each cell cluster-forming member. and cultured at 37° C. overnight to 48 hours.
  • FIG. 27 is a DIC observation image showing the result of culturing human pancreatic ductal adenocarcinoma cell line PCI-55 after applying MPC polymer to the cell mass-forming member of Example 1.
  • FIG. A plurality of polyp-like cell clusters straddling two or more cell-attaching regions and firmly adhering to the cell-attaching regions were formed.
  • FIG. 28 is a DIC observation image showing the results of culturing human pancreatic ductal adenocarcinoma cell line PCI-55 after applying MPC polymer to the cell mass-forming member of Example 2.
  • FIG. A plurality of polyp-like cell masses elongated in the height direction of one cell-attached region were formed. From the above culture results, it was confirmed that self-organized anchorage-dependent non-spheroid-like cancer cell clusters having morphological polarity and tissue movement polarity were formed in the cell cluster-forming members of Examples 1 to 4. confirmed.
  • each cell cluster-forming member obtained in Examples 1 to 4 was entirely coated with the MPC polymer liquid by spin coating to form a coating layer of the MPC polymer with an average thickness of 40 nm on the surface of the substrate.
  • the coating layer was dried to obtain a cell cluster-forming member having an adhesion-inhibiting region and a cell-adhering region formed on the surface.
  • the cell mass-forming member was washed with distilled water, air-dried, and cut into a size of 20 mm x 20 mm.
  • Vaseline was applied to the inner bottom of a culture petri dish (Aznol petri dish, As One Co., Ltd.) having a diameter of 40 mm and a depth of 13.5 mm. fixed through After adding DMEM and washing the cell cluster-forming member three times, 5 ⁇ 10 5 C2C12 cells suspended in DMEM containing 3 mL of 10% FBS were seeded on each cell cluster-forming member and allowed to stand at 37°C. Cultured overnight to 48 hours. After culturing, the cell clusters were fixed with paraformaldehyde, actin was stained with phalloidin, and cell nuclei were stained with DAPI, and two-dimensional images were obtained with an all-in-one fluorescence microscope (BZ-X800, Keyence).
  • FIG. 29 is a DIC observation image showing the results of culturing mouse myoblast C2C12 strain using the cell cluster forming member of Example 1.
  • FIG. Formation of non-spheroidal cell clusters straddling two or more spots was observed.
  • the mouse myoblast cell line C2C12 was cultured using the cell cluster-forming members of Examples 2 to 4
  • formation of non-spheroidal cell clusters spanning two or more spots was observed. From the above culture results, it was confirmed that self-organized anchorage-dependent non-spheroid-like cell clusters having morphological polarity and tissue movement polarity were formed in the cell cluster-forming members of Examples 1 to 4. did.
  • a cell cluster-forming member capable of easily forming cell clusters and excellent in industrial mass productivity; a culture vessel provided with the cell cluster-forming member; and a method for producing cultured cells using the cell cluster-forming member. and a cultured cell with a cell cluster forming member provided with the cell cluster forming member.

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Abstract

本発明の一態様は、細胞塊を容易に形成でき、工業的な量産性に優れる細胞塊形成部材；前記細胞塊形成部材を備えた培養容器；前記細胞塊形成部材を用いる培養細胞の生産方法；及び前記細胞塊形成部材を備えた細胞塊形成部材付き培養細胞を提供する。　本発明の一例に係る細胞塊形成部材１Ｂは基材２を有し、基材２の表面２ａに付着抑制領域３Ａと細胞付着領域４Ｂとが形成され、細胞付着領域４Ｂに複数の凸部７を含む微細凹凸構造領域６が形成され、付着抑制領域３Ａ及び細胞付着領域４Ｂの両方に親水性コーティング層５が形成されている；一例に係る培養容器及び細胞塊形成部材付き培養細胞は、細胞塊形成部材１Ｂを備える；一例に係る培養細胞の生産方法では、細胞塊形成部材１Ｂを用いる。

Description

細胞塊形成部材、培養容器、培養細胞の生産方法、細胞塊形成部材付き培養細胞
　本発明は、細胞塊形成部材、培養容器、培養細胞の生産方法、細胞塊形成部材付き培養細胞に関する。
　本願は、２０２１年３月３０日に日本国特許庁に出願された特願２０２１－０５８０１３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、細胞の培養技術が種々の産業分野で利用されている（例えば、特許文献１、２）。特許文献１では、生化学実験、臨床実験、薬剤の開発研究等で好適に使用できる細胞培養容器が提案されている。
　特許文献２では、生体内のがん組織で観察されるような形態学的極性及び組織運動特性を具備する細胞塊を形成するための細胞培養基材が提案されている。
国際公開第２００７／１２５８９４号 国際公開第２０１８／１８２０４４号
　特許文献１の細胞培養容器のウェルの底面には、ドット状のホールがパターン形成された親水性被膜が設けられている。この親水性被膜によって細胞の非特異的接着が抑制され、細胞はドット状のホール部分に接着する。しかし、ドット状のホールはパターン形成の結果ウェル内で分散して配置されているため、細胞塊が形成されるように細胞を培養できない。
　特許文献２の細胞培養基材では、生体適合性ポリマー層で覆われていない粗面部分で細胞を培養して細胞塊を形成する。しかし、生体適合性ポリマーを選択的に塗布する工程はフォトリソグラフィーの手法を使用し、大量生産には適さないため、製造時の工業的な量産性に改善の余地がある。
　本発明は、細胞塊を容易に形成でき、工業的な量産性に優れる細胞塊形成部材；前記細胞塊形成部材を備えた培養容器；前記細胞塊形成部材を用いる培養細胞の生産方法；及び前記細胞塊形成部材を備えた細胞塊形成部材付き培養細胞を提供する。
　本発明は下記の態様を有する。
［１］基材を有する細胞塊形成部材であって；前記基材の表面に、少なくとも１以上の付着抑制領域と、少なくとも１以上の細胞付着領域とが形成され；前記細胞付着領域の少なくとも一部に、複数の凸部又は複数の凹部を含む微細凹凸構造領域が形成され；前記付着抑制領域及び前記細胞付着領域の両方に、親水性コーティング層が形成されている、細胞塊形成部材。
［２］基材を有する細胞塊形成部材であって；前記基材の表面に、少なくとも１以上の付着抑制領域と、少なくとも１以上の細胞付着領域とが形成され；前記細胞付着領域の少なくとも一部に、複数の凸部又は複数の凹部を含む微細凹凸構造領域が形成され；前記付着抑制領域及び前記細胞付着領域のうち前記付着抑制領域の一方に親水性コーティング層が形成されている、細胞塊形成部材。
［３］前記複数の凸部の平均高さ又は前記複数の凹部の平均深さが、２５０ｎｍ以上である、［１］又は［２］の細胞塊形成部材。
［４］前記複数の凸部の平均直径に対する前記複数の凸部の平均高さのアスペクト比、又は、前記複数の凹部の平均直径に対する前記複数の凹部の平均深さのアスペクト比が、０．５～５．０である、［１］～［３］のいずれかの細胞塊形成部材。
［５］前記複数の凸部間又は前記複数の凹部間の平均ピッチが、５０ｎｍ～１μｍである、［１］～［４］のいずれかの細胞塊形成部材。
［６］前記細胞付着領域が、前記基材の厚み方向で前記付着抑制領域と相対的に高低差を設けた位置にある、［１］～［５］のいずれかの細胞塊形成部材。
［７］前記細胞付着領域と前記基材の前記表面との間の高低差が、０～３μｍである、［１］～［５］のいずれかの細胞塊形成部材。
［８］前記微細凹凸構造領域の前記複数の凸部の間の凹部に、又は、前記複数の凸部の間の凹部の底部に、親水性層が形成されている、［１］～［７］のいずれかの細胞塊形成部材。
［９］前記基材が、ポリエチレンテレフタラート、トリアセチルセルロース、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、アクリル樹脂、ポリスチレン及びジメチルポリシロキサンからなる群から選ばれる少なくとも１種以上の樹脂を含む、［１］～［８］のいずれかの細胞塊形成部材。
［１０］前記細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の短軸に対する前記楕円の長軸の比が、１～３である、［１］～［９］のいずれかの細胞塊形成部材。
［１１］前記細胞塊形成部材の平面視において、前記細胞付着領域が、外径円と内径円で囲まれた環状領域に形成され、前記外径円の直径は１０～１００μｍであり、前記外径円の直径と前記内径円の直径との差が２００ｎｍ～３０μｍであり、かつ、前記環状領域の少なくとも一部には、複数の凸部又は複数の凹部を含む微細凹凸構造が形成され；前記付着抑制領域及び前記細胞付着領域の両方に、親水性コーティング層が形成されている、［１］～［１０］のいずれかの細胞塊形成部材。
［１２］［１］～［１１］のいずれかの細胞塊形成部材を備えた、培養容器。
［１３］［１］～［１１］のいずれかの細胞塊形成部材を用いて細胞を培養し、次いで、前記細胞塊形成部材から培養細胞を剥離する、培養細胞の生産方法。
［１４］［１］～［１１］のいずれかの細胞塊形成部材と；前記細胞塊形成部材に付着した培養細胞と；を備えた、細胞塊形成部材付き培養細胞。
［１５］前記細胞を含む細胞塊が、三次元構造を形成している、［１４］の細胞塊形成部材付き培養細胞。
　本発明によれば、細胞塊を容易に形成でき、工業的な量産性に優れる細胞塊形成部材；前記細胞塊形成部材を備えた培養容器；前記細胞塊形成部材を用いる培養細胞の生産方法；及び前記細胞塊形成部材を備えた細胞塊形成部材付き培養細胞が提供される。
一実施形態に係る細胞塊形成部材を模式的に示す平面図である。 一実施形態に係る細胞塊形成部材を模式的に示す平面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図３のＩＶ－ＩＶ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図５のＶＩ－ＶＩ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図７のＶＩＩＩ－ＶＩＩＩ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図９のＸ－Ｘ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図１１のＸＩＩ－ＸＩＩ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図１３のＸＩＶ－ＸＩＶ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図１５のＸＶＩ－ＸＶＩ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図１７のＸＶＩＩＩ－ＸＶＩＩＩ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図１９のＸＸ－ＸＸ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図２１のＸＸＩＩ－ＸＸＩＩ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図２３のＸＸＩＶ－ＸＸＩＶ断面図である。 細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。 図２５のＸＸＶＩ－ＸＸＶＩ断面図である。 実施例１の細胞塊形成部材にＭＰＣポリマーを塗布した後に、ヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ－５５を培養した結果を示すＤＩＣ観察画像である。 実施例２の細胞塊形成部材にＭＰＣポリマーを塗布した後に、ヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ－５５を培養した結果を示すＤＩＣ観察画像である。 実施例１の細胞塊形成部材を用いてマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２株を培養した結果を示すＤＩＣ観察画像である。 図３の変形例に係る細胞塊形成部材を模式的に示す断面図である。 図３の変形例に係る細胞塊形成部材を模式的に示す断面図である。 図３の変形例に係る細胞塊形成部材を模式的に示す断面図である。
　本明細書において、数値範囲を示す「～」は、その前後に記載された数値を下限値および上限値として含むことを意味する。
　本明細書に開示の数値範囲の下限値および上限値は、任意に組み合わせて新たな数値範囲とすることができる。
＜細胞塊形成部材＞
　以下、一実施形態に係る細胞塊形成部材について適宜図面を参照しながら説明する。各図面における寸法比は、説明の便宜上のものであり、実際のものとは異なったものである。また、以下の図面において、同一の構成については同じ符号を用いて示し、重複する構成について説明を省略することがある。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材は、基材を有する。基材の材質は特に限定されない。例えば、無機ガラスによる基材、有機高分子樹脂による基材が挙げられる。中でも、基材としては、工業的な量産性の点から疎水性の基材が好ましく、成形性、製造コストの点から樹脂基材がより好ましい。
　有機高分子樹脂基材を構成する物質としては、例えば、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂の硬化物、光硬化性樹脂の硬化物が挙げられる。中でもポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、アクリル樹脂（ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等）、ポリスチレン（ＰＳ）及びジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の樹脂を含む基材が好ましい。ただし、有機高分子樹脂基材を構成する物質は、これらの例示に限定されない。
　無機ガラス基材を構成する物質としては、例えば、石英ガラス、各種アルカリガラス、各種無アルカリガラス等が挙げられる。ただし、無機ガラス基材を構成する物質は、これらの例示に限定されない。微細凹凸構造をガラスインプリント工程によって賦形する場合は、低融点ガラスであるホウケイ酸鉛系ガラスや、鉛フリーの低融点ガラスが好適に用いられる。
　また、例えばアルカリガラス上にＵＶ硬化性樹脂を塗工しておき、樹脂塗工層に微細構造の版を押し当てた状態で露光するＵＶインプリントによって微細構造を賦形する作製法も可能である。この一例のように無機ガラス基材と有機高分子材料の組み合わせも有効である。
　基材の全体的な形状は特に限定されない。例えばフィルム状、シート状、プレート状、ブロック状等が挙げられる。
　基材の全体的な形状は培養細胞、培養細胞を含む細胞塊の用途に応じて変更してもよい。例えば、細胞塊が表面に形成された細胞シートを製造する場合、基材の全体的な形状はシート状が好ましい。
　基材の表面には、少なくとも１以上の付着抑制領域と少なくとも１以上の細胞付着領域とが形成されている。付着抑制領域は細胞塊形成部材の表面において親水性を示す領域である。一方、細胞付着領域は細胞塊形成部材の表面において疎水性を示す領域である。
　この親水性、疎水性の表面性状の違いにより、付着抑制領域と細胞付着領域とで細胞の接着性に差異が生じる。したがって、一実施形態に係る細胞塊形成部材によれば、細胞付着領域に細胞を選択的に集合させることができ、細胞付着領域に三次元構造をもつ細胞塊を形成できる。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材において、付着抑制領域には親水性コーティング層が形成されている。親水性コーティング層は親水性材料の層であり、細胞培養部材の表面に親水性を付与する。親水性材料は、水酸基、カルボニル基、カルボキシ基等の親水性官能基を有するものであれば特に限定されない。例えば、リン脂質類似構造を持つＭＰＣポリマー等の生体適合性ポリマーが挙げられる。
　細胞毒性が低く、細胞の非特異的接着及びタンパク質等の細胞接着因子の吸着を抑制できることから、生体適合性ポリマーが好ましい。生体適合性ポリマーの種類は特に限定されない。例えば、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴエチレングリコール（ＯＥＤ）、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ポリ（ＭＰＣ－ｃｏ－ブチルメタクリレート）（ＰＭＢ）、ポリ（ＭＰＣ－ｃｏ－ドデシルメタクリレート）（ＰＭＤ）等が挙げられる。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材において、親水性コーティング層が基材の表面の一部に設けられ、付着抑制領域を形成している。親水性コーティング層が設けられている場合、付着抑制領域の表面は親水性コーティング層の表面である。
　付着抑制領域に設けられる親水性コーティング層の厚みは、０．００５～０．５００μｍが好ましく、０．００５～０．３００μｍがより好ましく、０．０１０～０．１００μｍがさらに好ましい。親水性コーティング層の厚みが前記数値範囲の下限値以上であると、付着抑制領域が充分な親水性を示しやすい。親水性コーティング層の厚みが前記数値範囲の上限値以下であると、生産コストを低減しやすい。
　親水性コーティング層の厚みは、基材の表面と親水性コーティング層の上面との間の最短距離として測定する。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材において、付着抑制領域及び細胞付着領域の両方に、親水性コーティング層が形成されている。この場合、細胞付着領域における微細凹凸構造領域が細胞に対する接着性を示す。
　この場合、微細凹凸構造領域において複数の凸部の平均高さ又は複数の凹部の平均深さが、親水性コーティング層の厚みより大きいことが好ましい。複数の凸部の頂部又は複数の凹部の基底面において、親水性付与液の塗布層の厚さが薄くなり細胞が接着しやすくなる。
　さらに、微細凹凸構造領域において親水性コーティング層の厚みを小さくすると細胞と細胞塊形成部材の接着力が強くなり、親水性コーティング層の厚みを大きくすると細胞と細胞塊形成部材の接着力が弱くなる。このように微細凹凸構造領域において親水性コーティング層の厚みを制御することにより、細胞と細胞塊形成部材の接着力を調整できる。そのため、設定条件下における微小環境下に対応した生体内の細胞塊に近い状態を再現できる。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材において、基材が樹脂基材である場合、付着抑制領域は樹脂基材の表面に親水性官能基が導入されて形成されていてもよい。例えば、プラズマ照射、イオン照射、ラジカル照射、紫外線照射等の照射処理により、樹脂基材の表面に親水性官能基を導入できる。樹脂基材の表面において親水性官能基が導入された部分は、親水性を示す。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材においては、細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の短軸ｂに対する当該楕円の長軸ａの比は、１～３が好ましく、１～２がより好ましく、１～１．５がさらに好ましい。短軸ｂに対する当該楕円の長軸ａの比が前記数値範囲内であると、細胞培養の際に細胞を細胞付着領域に集めやすくなり、複数の細胞が集合した三次元構造をもつ細胞塊の形成が促される。ここで、前記数値範囲の下限値について、短軸ｂに対する長軸ａの比の数値は１をとり得る。短軸ｂに対する長軸ａの比が１である場合、細胞付着領域に外接する最小面積の楕円は細胞付着領域の外接円として決定される。
　ただし、他の実施形態に係る細胞塊形成部材においては、細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の短軸ｂに対する当該楕円の長軸ａの比が３を超えてもよい。他の実施形態において当該比が３を超える場合、細胞塊を構成する個々の細胞が長軸ａの方向に並んだ細胞塊が得られやすくなる。
　細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の長軸ａは５～２００μｍが好ましく、１０～１００μｍがより好ましく、２０～５０μｍがさらに好ましい。細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の長軸ａが前記数値範囲の下限値以上であると、細胞付着領域における細胞塊の形成が促されやすい。細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の長軸ａが前記数値範囲の上限値以下であると、細胞培養の際に細胞が細胞付着領域に集まりやすくなる。
　細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の短軸ｂは０．５～２００μｍが好ましく、２～１００μｍがより好ましく、２～５０μｍがさらに好ましい。細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の短軸ｂが前記数値範囲の下限値以上であると、細胞付着領域における細胞塊の形成が促されやすい。細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の短軸ｂが前記数値範囲の上限値以下であると、細胞培養の際に細胞が細胞付着領域に集まりやすくなる。
　細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の長軸ａ、短軸ｂは、次のように求められる。細胞塊形成部材の平面視において細胞付着領域を包含する外接楕円を決定し、当該外接楕円の長軸、短軸を測定する。細胞付着領域の形状が不定形である場合、一の細胞付着領域について複数の外接楕円が存在し得る。一の細胞付着領域について複数の外接楕円が存在する場合、これら複数の外接楕円のうち面積が最小の外接楕円について長軸、短軸を測定する。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材の平面視において、付着抑制領域及び細胞付着領域の形状は特に限定されない。付着抑制領域及び細胞付着領域の形状は、例えば、円形状でもよく、楕円形状でもよく、多角形状でもよく、不定形でもよく、これらの例示にも限定されない。
　図１は、一実施形態に係る細胞塊形成部材を模式的に示す平面図である。図１に示す細胞塊形成部材１の表面には４つの細胞塊形成領域９，９，９，９が形成されている。４つの細胞塊形成領域９，９，９，９は２行×２列の正方格子状に配列され、各細胞塊形成領域９の間に付着抑制領域３が形成されている。
　各細胞塊形成領域９は、５行×５列の正方格子状に配列された２５個の円形の細胞付着領域４を含み、２５個の細胞付着領域４のそれぞれの間にも付着抑制領域３が形成されている。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材において、各細胞塊形成領域における細胞付着領域４の配列態様は正方格子状の配列に限定されない。例えば、図２に示す細胞塊形成領域１０，１０，１０，１０のように細胞付着領域４は三角格子状に配列していてもよい。
　ただし、一実施形態に係る細胞塊形成部材において、付着抑制領域、細胞付着領域、細胞塊形成領域の形成態様は、図１、図２に示す態様に限定されない。例えば、図１、図２においては、細胞塊形成領域が細胞塊形成部材の表面で規則的に配列しているが、細胞塊形成領域は不規則的に配置されていてもよい。
　また、図１、図２において細胞塊形成領域は４つ形成されているが、細胞塊形成領域の数も特に限定されない。同様に、各細胞塊形成部材に含まれる細胞付着領域４の数も特に限定されない。細胞付着領域４の幾何学的形状も、図１、図２に示す円形に限定されず、所望する細胞塊の形態に応じて変更できる。
　このように一実施形態に係る細胞塊形成部材において、付着抑制領域、細胞付着領域、細胞形成領域のそれぞれの態様は無数に存在し得る。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材において細胞付着領域の少なくとも一部には、複数の凸部又は凹部を含む微細凹凸構造領域が形成されている。微細凹凸構造領域においては、複数の凸部同士の間に複数の凹部が形成される。あるいは微細凹凸構造領域においては、複数の凹部同士の間に連続した凸部が形成される。これらの複数の凸部及び複数の凹部を含む微細凹凸構造は、培養時に細胞を支える構造となり得る。そのため微細凹凸構造は、細胞外マトリクスのように細胞の足場として機能し得る。したがって、微細凹凸構造領域は細胞付着領域の中でも相対的に高い細胞接着性を示し、三次元的構造を形成し得る。
　微細凹凸構造領域は細胞付着領域内の少なくとも一部に形成されていればよく、細胞付着領域の全体に形成されていてもよい。細胞付着領域において微細凹凸構造領域の占める割合は特に限定されず、所望する細胞塊の形態、性状に応じて変更できる。
　微細凹凸構造領域の形状も特に限定されず、所望する細胞塊の形態、性状に応じて変更できる。例えば、管腔構造の細胞塊の形成を所望するのであれば、微細凹凸構造領域がリング状に形成されているとよい。所望する細胞塊の形状に応じて微細凹凸構造領域の形状を変更してもよい。
　細胞付着領域の一部に微細凹凸構造領域が形成されている場合には、微細凹凸構造領域の有無によって細胞に対する接着性の差異が細胞付着領域の中でも生じ得る。この場合、細胞付着領域の中でも微細凹凸構造領域に細胞をさらに選択的に集合させやすくなり、三次元構造をもつ細胞塊の形成がさらに容易となる。
　微細凹凸構造領域の凸部、凹部の形状は特に限定されない。凸部、凹部の形状は、円錐形状でもよく、円柱形状でもよく、円錐台形状でもよく、角錐形状でもよく、釣鐘形状でもよく、これら例示した形状にも限定されない。
　微細凹凸構造領域において、複数の凸部の平均高さ又は複数の凹部の平均深さは、２５０ｎｍ以上が好ましく、３００ｎｍ～２μｍがより好ましく、４００ｎｍ～１.２μｍがさらに好ましい。複数の凸部の平均高さ又は複数の凹部の平均深さが前記数値範囲の下限値以上であると、微細凹凸構造領域の凸部及び凹部を形成しやすく、工業的な量産性がよくなる。加えて、後述の方法（α１）によって細胞塊形成部材を製造する場合には、基材の表面の全体に親水性付与液を塗布した後に、塗布層の親水性付与液が付着抑制領域に流出することで、複数の凸部の頂部の親水性付与液の塗布層の厚さが薄くなる。したがって、細胞塊形成部材の生産性が向上し、工業的な量産性がよくなる。
　一方、複数の凸部の平均高さ又は複数の凹部の平均深さが前記数値範囲の上限値以下であると、微細凹凸構造領域に対する細胞の接着性がさらによくなる。
　複数の凸部の平均高さと複数の凹部の平均深さは、次のように求められる。細胞塊形成部材をミクロトーム又はＣＰ加工（イオンミリング）等によって任意の位置で表面に対して垂直に切り出し、その断面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察する。凸部又は凹部が２０～５０個撮像される倍率範囲の複数の画像において２０個の凸部又は凹部を無作為に選び、凸部の高さ又は凹部の深さを測定し、その相加平均値を複数の凸部の平均高さ又は凹部の平均深さとする。
　ここで各凸部の高さは、凸部の頂点と微細凹凸構造領域の基底面との間の基材の厚み方向の最短距離として測定し、各凹部の高さは、凹部の頂点と基材表面間の基材の厚み方向の最短距離として測定する。
　複数の凸部の平均高さの代わりに、複数の凹部の平均深さを測定してもよい。複数の凹部の平均深さは、隣接する凸部の頂点と同じ高さ位置の凹部と微細凹凸構造領域の基底面との間の最短距離として各凹部の深さを測定する以外は、凸部の平均高さと同様にして求められる。複数の凹部の平均深さの詳細及び好ましい態様は、複数の凸部の平均高さについて説明した内容と同じである。
　複数の凸部又は凹部の平均直径は、５０ｎｍ～１．２μｍが好ましく、１００ｎｍ～１μｍがより好ましく、２００ｎｍ～９００ｎｍがさらに好ましい。複数の凸部の平均直径が前記数値範囲の下限値以上であると、微細凹凸構造領域を形成しやすく、工業的な量産性がよくなる。複数の凸部又は凹部の平均直径が前記数値範囲の上限値以下であると、微細凹凸構造領域に対する細胞の接着性がさらによくなる。
　複数の凸部の平均直径は、次のように求められる。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて細胞塊形成部材を平面視して観察し、複数の凸部が５０～１００個撮像される倍率範囲の画像において２０個の凸部を無作為に選び、２０個の凸部の平面視における最小面積の外接楕円の長軸及び短軸を測定し、その長軸及び短軸の相乗平均値を複数の凸部の平均直径とする。
　複数の凹部の平均直径は、凹部の平面視における最小面積の外接楕円の長軸及び短軸を測定する以外は凸部の平均直径と同様にして求められる。複数の凹部の平均直径の詳細及び好ましい態様は、複数の凸部の平均直径について説明した内容と同じである。
　複数の凸部の平均直径に対する複数の凸部の平均高さのアスペクト比、又は、複数の凹部の平均直径に対する複数の凹部の平均深さのアスペクト比は、０．５～５．０が好ましく、０．６～４．０がより好ましく、０．８～３．０がさらに好ましい。
　前記アスペクト比が前記数値範囲の下限値以上であると、微細凹凸構造領域に対する細胞の接着性がさらによくなる。前記アスペクト比が前記数値範囲の上限値以下であると、微細凹凸構造領域を形成しやすく、工業的な量産性がよくなる。
　複数の凸部間又は複数の凹部間の平均ピッチは、５０ｎｍ～１μｍが好ましく、１００ｎｍ～９００ｎｍがより好ましく、２００ｎｍ～８００ｎｍがさらに好ましい。
　複数の凸部同士の間の平均ピッチが前記数値範囲の下限値以上であると、微細凹凸構造領域を形成しやすく、工業的な量産性がよくなる。複数の凸部同士の間の平均ピッチが前記数値範囲の上限値以下であると、微細凹凸構造領域に対する細胞の接着性がさらによくなる。
　複数の凸部の平均ピッチは、次のように求められる。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて細胞塊形成部材を平面視で観察し、複数の凸部が５０～１００個撮像される倍率範囲の複数の画像において２０個の凸部を無作為に選び、隣り合う２つの凸部の平面視における最小面積の外接楕円の中心同士の間の最短距離の相加平均値を複数の凸部の平均ピッチとする。
　複数の凹部の平均ピッチは、隣り合う２つの凹部の平面視における最小面積の外接楕円の中心同士の間の最短距離を測定する以外は凸部の平均ピッチと同様にして求められる。複数の凹部の平均ピッチの詳細及び好ましい態様は、複数の凸部の平均ピッチについて説明した内容と同じである。
　一実施形態において、細胞付着領域は、基材の厚み方向で前記付着抑制領域と相対的に高低差を設けた位置にあってもよい。「付着抑制領域と細胞付着領域との間の高低差」とは、付着抑制領域及び細胞付着領域における各基材の基底面同士の高さの差である。「基材の基底面」とは、付着抑制領域又は細胞付着領域の基材の表面が平坦面である場合は、当該基材の平坦面そのものである。付着抑制領域又は細胞付着領域の基材の表面に微細凹凸構造が形成されている場合は、「基材の基底面」とは、当該表面から凸部を全て除いた面、又は、当該表面の凹部をすべて埋めて形成される面である。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材において、細胞付着領域と付着抑制領域との高さ方向（すなわち、基材の厚み方向）の位置関係は特に限定されない。すなわち、細胞付着領域は付着抑制領域より基材の厚み方向で高い位置にあってもよく、付着抑制領域より低い位置にあってもよく、付着抑制領域と細胞付着領域とが同じ高さ位置にあってもよい。
　ここで、細胞付着領域の高さ位置は、微細凹凸構造領域の凸部の頂点の高さ位置とする。したがって、付着抑制領域と細胞付着領域とが同じ高さ位置にある場合、微細凹凸構造領域の凸部の頂点の高さ位置は付着抑制領域の表面の高さ位置と基材の厚み方向で一致する。
　細胞塊形成部材に工業的な量産性を求めるなら、細胞付着領域が基材の厚み方向で付着抑制領域より高い位置にあるとよい。後述の方法（α１）によって細胞塊形成部材を製造する場合に、基材の表面の全体に親水性付与液を塗布した後に、親水性付与液が細胞付着領域から付着抑制領域に流れ落ちやすく、製造しやすいからである。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材において、細胞付着領域と基材の表面との間の高低差は０～３μｍが好ましく、１００ｎｍ～２μｍがより好ましく、３００ｎｍ～１μｍがさらに好ましい。高低差が０μｍ超であり、かつ細胞付着領域が付着抑制領域より高い位置にあれば、後述の方法（α１）によって細胞塊形成部材を製造する場合に、基材の表面の全体に親水性付与液を塗布した後に、親水性付与液が細胞付着領域から付着抑制領域に流れ落ちやすい。そのため細胞塊形成部材を製造しやすく、工業的な量産性がさらに優れる。高低差が前記数値範囲の上限値以下であると、細胞付着領域への細胞の移動が妨げられにくい。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材においては、細胞付着領域の微細凹凸構造領域の複数の凸部の間の凹部に、又は、複数の凸部の間の凹部の底部に、親水性層が形成されていてもよい。親水性層は親水性材料の層である。親水性材料の詳細及び好ましい態様は、親水性コーティング層について説明した内容と同じである。親水性層における親水性材料は親水性コーティング層の親水性材料と同一の材料でもよく、異なる材料でもよい。工業的な量産性を考慮すると、親水性層における親水性材料は親水性コーティング層の親水性材料と同一の材料が好ましい。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材においては、微細凹凸構造領域の複数の凸部の間の凹部に、又は、複数の凸部の間の凹部の底部に、親水性層が形成されていてもよい。この場合、細胞付着領域における微細凹凸構造領域が細胞に対する接着性を示す。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材においては、細胞付着領域の表面には細胞の接着性を高めるために接着因子の層が設けられてもよい。接着因子としては、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリリシン（ＰＤＬ、ＰＬＬ）、ヒアルロン酸等の細胞外マトリクス、ポリマー、ゲル等が挙げられる。
（作用効果）
　以上説明した一実施形態に係る細胞塊形成部材においては、基材の表面に少なくとも１以上の付着抑制領域と少なくとも１以上の細胞付着領域が形成され、当該細胞付着領域の少なくとも一部に微細凹凸構造領域が形成されている。そのため、付着抑制領域と比較して細胞付着領域に細胞が相対的に接着しやすく、細胞付着領域の中でも微細凹凸構造領域に細胞がさらに接着しやすい。このように付着抑制領域、細胞付着領域、微細凹凸構造領域の間で細胞に対する接着性の差異が充分に生じるから、細胞培養の際に細胞が付着抑制領域から細胞付着領域中の微細凹凸構造領域に移動する傾向が強くなる。
　したがって、一実施形態に係る細胞塊形成部材によれば細胞塊を形成しやすくなる。
（製造方法）
　一実施形態に係る細胞塊形成部材の製造方法は特に限定されない。例えば下記の方法（α）で製造できる。
　方法（α）：基材の表面を少なくとも１以上の付着抑制領域と少なくとも１以上の細胞付着領域とに区分して、細胞付着領域の少なくとも一部に微細凹凸構造領域を形成し、かつ、付着抑制領域に親水化処理を施す方法。
　方法（α）において付着抑制領域と細胞付着領域との区分は、細胞の種類、所望する細胞塊の形態、性状に応じて変更でき、特に限定されない。
　微細凹凸構造領域の形成には、例えば、特開２００９－０３４６３０号公報に記載のコロイダルシリカからなる単粒子膜エッチングマスクを用いてもよい。当該単粒子膜エッチングマスクを用いた気相エッチングによって基材に微細凹凸構造領域を形成できる。他にも、コロイダルリソグラフィー、陽極酸化、干渉露光等の種々の微細凹凸構造領域の形成方法を使用できる。
　親水化処理は、親水性を高める処理であれば特に限定されない。例えば、親水性材料を少なくとも含む親水性付与液を基材の表面に塗布してもよい。その後、親水性付与液の塗布層を固化して、基材の表面の一部に親水性コーティング層を設けて少なくとも１以上の付着抑制領域と少なくとも１以上の細胞付着領域とが形成してもよい。
　疎水性の基材を用いる場合、基材の表面の一部に親水化処理を施して基材の表面に少なくとも１以上の付着抑制領域と少なくとも１以上の細胞付着領域とを形成してもよい。
　樹脂基材を用いる場合、親水化処理としてプラズマ照射、イオン照射、ラジカル照射、紫外線照射等の照射処理を樹脂基材の表面に施してもよい。照射処理の結果、基材の表面の分子の化学結合が切断され、樹脂の種類に応じた親水性官能基が生成し、処理前に比べて親水性が向上する。照射処理のなかでも、基材表面の物理的ダメージが少ない点でプラズマ照射が好ましい。
　培養細胞の剥離、回収を容易にするために、刺激応答性材料を細胞塊形成部材の表面に塗布してもよい。刺激応答性材料としては、温度変化によって水親和性が変化する温度応答性ポリマーが好ましく、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）が好ましい。
　刺激応答性材料を基材に塗布する場合、刺激応答性材料を基材に塗布した後に微細凹凸構造領域を形成してもよく、微細凹凸構造領域を形成した後に刺激応答性材料を基材に塗布してもよい。ただし、微細凹凸構造領域を形成した後に刺激応答性材料を基材に塗布する場合、親水化処理の前に刺激応答性材料を基材に塗布することが好ましい。
　工業的な量産性の点から、方法（α）の好ましい一例として下記の方法（α１）が挙げられる。
　方法（α１）：基材の表面を付着抑制領域と細胞付着領域とに区分して、細胞付着領域に微細凹凸構造領域を形成し、次いで、基材の表面の全体に親水性付与液を塗布する方法。
　方法（α１）においては、付着抑制領域と細胞付着領域を区分する際に、基材の厚み方向で付着抑制領域より高い位置に細胞付着領域を形成するとよい。基材の表面の全体に親水性付与液を塗布した後において、親水性付与液が細胞付着領域から付着抑制領域に流れ落ちやすく、製造しやすいからである。
　基材の厚み方向で付着抑制領域より高い位置に細胞付着領域する場合、基材の表面において、厚み方向の高低差を設けてもよい。この高低差は、一般的なフォトリソグラフィー法によって基材に設ければよい。
（実施形態例）
　以下、実施形態例を例示して一実施形態に係る細胞塊形成部材を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態例に限定されない。
［実施形態例１］
　図３は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図４は、図３のＩＶ－ＩＶ断面図である。
　図３、図４に示す細胞塊形成部材１Ａは基材２を有する。基材２の表面２ａには、円形かつスポット状の細胞付着領域４Ａと付着抑制領域３Ａとが形成されている。そのため、各領域における細胞の接着性に差異が生じる。したがって細胞塊形成部材１Ａにおいては、細胞付着領域４Ａに細胞を選択的に集合させ、円形かつスポット状の細胞付着領域４Ａに細胞塊を形成できる。
　細胞塊形成部材１Ａにおいては、付着抑制領域３Ａが円形かつスポット状の細胞付着領域４Ａの外側に形成されている。また、付着抑制領域３Ａは基材２の表面２ａに設けられた親水性コーティング層５で覆われている。付着抑制領域３Ａはこの親水性コーティング層５によって親水性を示す。付着抑制領域３Ａにおける親水性コーティング層５の厚みは、０．００５～０．５００μｍが好ましく、０．００５～０．３００μｍがより好ましく、０．０１０～０．１００μｍがさらに好ましい。
　スポット状の細胞付着領域４Ａは平面視において円形状である。この場合、細胞付着領域４Ａに外接する最小面積の楕円は細胞付着領域４Ａと付着抑制領域３Ａとを区画する外周円と一致する。そのため細胞塊形成部材１Ａにおいては、細胞付着領域４Ａに外接する最小面積の楕円の長軸ａが当該楕円の短軸ｂと一致し、細胞付着領域４Ａと付着抑制領域３Ａとを区画する外周円の直径と等しい。
　細胞塊形成部材１Ａにおいては、細胞付着領域４Ａの全体が微細凹凸構造領域６となっている。細胞付着領域４Ａは、基材２の表面２ａに形成された微細凹凸構造領域６により疎水性を示す。微細凹凸構造領域６は複数の円錐形状の凸部７を含む。
　細胞塊形成部材１Ａにおいては、細胞付着領域４Ａは基材２の厚み方向で付着抑制領域３Ａより高い位置にある。そのため、方法（α１）によって細胞塊形成部材を製造する場合において、親水性付与液を基材２の表面２ａの全体に塗布したときに、親水性付与液が細胞付着領域４Ａから付着抑制領域３Ａに流れ落ちやすく、製造しやすい。
　細胞付着領域４Ａと基材２の表面２ａとの間の高低差ｈは０～３μｍが好ましく１００ｎｍ～２μｍがより好ましく、３００ｎｍ～１μｍがさらに好ましい。高低差ｈが前記数値範囲の下限値以上であると、細胞塊形成部材を製造しやすく、工業的な量産性がよくなる。高低差ｈが前記数値範囲の上限値以下であると、細胞付着領域への細胞の移動が妨げられにくい。
　細胞塊形成部材１Ａにおいては、付着抑制領域３Ａ、微細凹凸構造領域６の間で細胞に対する接着性の差異が充分に得られる。そのため、細胞培養の際に細胞が付着抑制領域３Ａから細胞付着領域４Ａ内の微細凹凸構造領域に移動する傾向が強くなる。
　スポット状の細胞付着領域４Ａに外接する最小面積の楕円の短軸ｂに対する長軸ａの比が充分に小さい場合には、細胞培養の際に細胞をスポット状の細胞付着領域４Ａに集めやすくなり、複数の細胞が集合した三次元構造をもつ細胞塊の形成が促される。
　したがって、細胞塊形成部材１Ａによれば細胞塊を形成しやすい。
［実施形態例２］
　図５は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図６は、図５のＶＩ－ＶＩ断面図である。
　図５、図６に示す細胞塊形成部材１Ｂは、下記の３点で細胞塊形成部材１Ａと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ａと共通する構成を備える。
・細胞付着領域４Ｂの微細凹凸構造領域６の複数の凸部７の表面にも親水性コーティング層５が形成されている点。
・微細凹凸構造領域６Ｂの複数の凸部７の間の凹部の底部に親水性層８が形成されている点。
・細胞付着領域４Ｂの微細凹凸構造領域６に形成された親水性コーティング層５の表面が、微細凹凸構造領域６に追従している点。
　細胞塊形成部材１Ｂにおいては、複数の凸部７の平均高さ又は複数の凹部の平均深さは、微細凹凸構造領域６における親水性コーティング層の厚みより大きい。
　細胞塊形成部材１Ｂは方法（α１）によって好適に製造できる。細胞付着領域４Ｂの微細凹凸構造領域６における親水性コーティング層５は、基材２の表面２ａの全体に塗布した親水性付与液のうち、複数の凸部又は複数の凹部の表面に残存した液が固化したものであるとも言える。
　細胞付着領域４Ｂの微細凹凸構造領域６における親水性コーティング層５の厚みは０．００５～０．５００μｍが好ましく、０．００５～０．３００μｍがより好ましく、０．０１０～０．１００μｍがさらに好ましい。
　親水性層８は親水性材料の層である。親水性材料の詳細及び好ましい態様は、親水性コーティング層について説明した内容と同じである。親水性層８における親水性材料は親水性コーティング層５の親水性材料と同一の材料でもよく、異なる材料でもよい。ただし、工業的な量産性を考慮すると、いずれの層も同一の親水性材料が好ましい。
　細胞塊形成部材１Ｂにおいても、細胞塊形成部材１Ａと同様の作用効果が得られる。加えて、細胞塊形成部材１Ｂは、製造工程において基材２の表面２ａの全体に親水性付与液をベタ塗りして付着抑制領域３Ａ、細胞付着領域４Ｂを形成できることから、工業的な量産性にも優れる。
［実施形態例３］
　図７は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図８は、図７のＶＩＩＩ－ＶＩＩＩ断面図である。図７、図８に示す細胞塊形成部材１Ｃは、付着抑制領域３Ｂにも微細凹凸構造領域６が形成されている点で細胞塊形成部材１Ａと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ａと共通する構成を備える。
　細胞塊形成部材１Ｃにおいては、「細胞付着領域と基材の表面との間の高低差」とは、細胞付着領域４Ａにおける微細凹凸構造領域６の複数の凸部の基底面と、付着抑制領域３Ｂにおける微細凹凸構造領域６の複数の凸部の基底面との高さの差とする。
　付着抑制領域３Ｂにおける微細凹凸構造領域６の詳細及び好ましい態様は、複数の凸部７の平均高さが親水性コーティング層５の厚み以下である点以外は、細胞塊形成部材１Ａについて説明した微細凹凸構造領域６の内容と同様である。付着抑制領域３Ｂにおける複数の凸部７の平均高さは、親水性コーティング層５の厚みに対して８０％以下が好ましく、５０％以下が望ましい。
　付着抑制領域３Ｂにおける微細凹凸構造領域６の凸部７の平均高さ、平均直径、平均ピッチ等の性状は、細胞付着領域４Ａにおける微細凹凸構造領域６の性状と同一でもよく、異なっていてもよい。
　細胞塊形成部材１Ｃにおいても、細胞塊形成部材１Ａと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例４］
　図９は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図１０は、図９のＸ－Ｘ断面図である。図９、図１０に示す細胞塊形成部材１Ｄは、以下の３点で細胞塊形成部材１Ａと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ａと共通する構成を備える。
・付着抑制領域３Ｂに微細凹凸構造領域６が形成されている点。
・細胞付着領域４Ｂの微細凹凸構造領域６の複数の凸部７の表面にも親水性コーティング層５が形成されている点。
・細胞付着領域４Ｂの微細凹凸構造領域６に形成された親水性コーティング層５の表面が、微細凹凸構造領域６に追従している点。
　細胞塊形成部材１Ｄにおいて、複数の凸部７の平均高さ又は複数の凹部の平均深さは微細凹凸構造領域６における親水性コーティング層の厚みより大きい。
　複数の凸部７の平均高さ又は複数の凹部の平均深さと、微細凹凸構造領域６における親水性コーティング層の厚みの大小関係は、微細凹凸構造領域６を電子顕微鏡で表面観察し、微細凹凸構造が表面に現れていることにより確認できる。あるいは、微細凹凸構造領域６を断面観察用包埋樹脂で包埋した細胞塊形成部材の断面サンプルを作製し、電子顕微鏡で断面観察することで、複数の凸部７の平均高さ又は複数の凹部の平均深さ、及び、親水性コーティング層の厚みの大小関係を確認できる。
　細胞塊形成部材１Ｄにおいても、細胞塊形成部材１Ａと同様の作用効果が得られる。また、細胞塊形成部材１Ｄは細胞塊形成部材１Ｂと同様に工業的な量産性にも優れる。
［実施形態例５］
　図１１は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図１２は、図１１のＸＩＩ－ＸＩＩ断面図である。
　図１１、図１２に示す細胞塊形成部材１Ｅは、細胞付着領域４Ａが基材２の表面２ａより基材２の厚み方向で低い位置にある点で細胞塊形成部材１Ａと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ａと共通する構成を備える。
　細胞塊形成部材１Ｅのように、細胞付着領域４Ａが付着抑制領域３Ａより陥没して低い位置にあるような場合でも細胞培養の際に細胞が付着抑制領域３Ａから細胞付着領域４Ａに移動する傾向は強く、細胞塊形成部材１Ａと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例６］
　図１３は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図１４は、図１３のＸＩＶ－ＸＩＶ断面図である。
　図１３、図１４に示す細胞塊形成部材１Ｆは、細胞付着領域４Ｂが基材２の表面２ａより基材２の厚み方向で低い位置にある点で細胞塊形成部材１Ｂと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ｂと共通する構成を備える。
　細胞塊形成部材１Ｆにおいても、細胞塊形成部材１Ｂと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例７］
　図１５は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図１６は、図１５のＸＶＩ－ＸＶＩ断面図である。
　図１５、図１６に示す細胞塊形成部材１Ｇにおいては、基材２の表面２ａに付着抑制領域３Ａと細胞付着領域４Ｃとが形成されている。細胞塊形成部材１Ｇの平面視において、細胞付着領域４Ｃ内に微細凹凸構造領域６が環状に形成されている。
　環状の微細凹凸構造領域６の外周は細胞付着領域４Ｃの外縁と一致している。また、環状の微細凹凸構造領域６の内周の内側の領域では、基材２の表面２ａが露出して細胞付着領域４Ｃの一部となっている。細胞塊形成部材１Ｇにおいては、細胞付着領域４Ｃの表面が、環状の微細凹凸構造領域６の表面と基材２の表面２ａとを含んで構成されている。
　環状の微細凹凸構造領域６の外径円の直径Ｒは１０～１００μｍが好ましく、１０～６０μｍがより好ましく、２０～４５μｍがさらに好ましい。外径円の直径Ｒが前記数値範囲の下限値以上であると、環状の微細凹凸構造領域６を形成しやすく、工業的な量産性がよくなる。外径円の直径Ｒが前記数値範囲の上限値以下であると、細胞付着領域４Ｃに細胞を選択的に集合させて細胞塊を形成しやすい。
　環状の微細凹凸構造領域６の内径円の直径ｒは、５００ｎｍ以上が好ましく、１μｍ以上がより好ましく、１０μｍ以上がさらに好ましい。内径円の直径ｒが前記数値範囲の下限値以上であると、環状の微細凹凸構造領域６を形成しやすく、工業的な量産性がよくなり、環状の微細凹凸構造領域６における三次元構造をもつ細胞塊の形成が促されやすい。
　環状の微細凹凸構造領域６の幅Ｗ、すなわち外径Ｒと内径円の直径ｒとの差は、２００ｎｍ～３０μｍが好ましく、１～２０μｍがより好ましく、３～１５μｍがさらに好ましい。幅Ｗが前記数値範囲の下限値以上であると、環状の微細凹凸構造領域６を形成しやすく、工業的な量産性がよくなる。幅Ｗが前記数値範囲の上限値以下であると、環状の微細凹凸構造領域６における三次元構造をもつ細胞塊の形成が促されやすい。
　細胞付着領域４Ｃの中でも環状の微細凹凸構造領域６の凸部７の表面は細胞に対して相対的に高い接着性を示しやすい。このように細胞塊形成部材１Ｇにおいては、付着抑制領域３Ａと細胞付着領域４Ｃとの間のみならず、細胞付着領域４Ｃの中でも微細凹凸構造領域６の有無によって細胞に対する接着性の差異を得やすい。
　したがって、細胞塊形成部材１Ｇにおける付着抑制領域３Ａには、細胞塊形成部材１Ａにおける付着抑制領域３Ａほど親水性を付与しなくてもよい。結果として細胞塊形成部材１Ｇにおける付着抑制領域３Ａの親水性コーティング層５の厚みは、細胞塊形成部材１Ａにおける付着抑制領域３Ａの親水性コーティング層より小さくてもよい。
　この点から、細胞塊形成部材１Ｇにおける付着抑制領域３Ａの親水性コーティング層５の厚みは、０．００５～０．５００μｍが好ましく、０．００５～０．３００μｍがより好ましく、０．０１０～０．１００μｍがさらに好ましい。細胞塊形成部材１Ｇにおける付着抑制領域３Ａの親水性コーティング層５の厚みが、前記数値範囲の下限値以上であると、細胞塊形成部材１Ｇにおける付着抑制領域３Ａに充分な親水性を付与しやすい。細胞塊形成部材１Ｇにおける付着抑制領域３Ａの親水性コーティング層５の厚みが、前記数値範囲の上限値以下であると、生産コストを低減しやすい。
　細胞塊形成部材１Ｇにおいても、細胞塊形成部材１Ａと同様の作用効果が得られる。加えて細胞塊形成部材１Ｇにおいては、細胞培養の際に細胞が細胞付着領域４Ｃの中でも微細凹凸構造領域６の凸部７の表面に集まりやすい。その結果、環状の微細凹凸構造領域６の表面において細胞塊を環状に形成しやすく、管腔構造の細胞塊を形成しやすくなる。
　さらなる図示は省略するが、他の実施形態例においては、環状の微細凹凸構造領域６が付着抑制領域３Ａより陥没して低い位置にあってもよい。この場合も、細胞塊形成部材１Ｇと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例８］
　図１７は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図１８は、図１７のＸＶＩＩＩ－ＸＶＩＩＩ断面図である。図１７、図１８に示す細胞塊形成部材１Ｈは、下記の２点で細胞塊形成部材１Ｇと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ｇと共通する構成を備える。
・リング状の微細凹凸構造領域６の複数の凸部７の間の凹部にも親水性コーティング層５が形成されている点。
・リング状の微細凹凸構造領域６の内側の領域にも付着抑制領域３Ａが形成されている点。
　細胞塊形成部材１Ｈにおいても、細胞塊形成部材１Ｇと同様の作用効果が得られる。加えて、細胞塊形成部材１Ｈは親水性コーティング層５を有するように、細胞塊形成部材１Ｂと同様に方法（α１）によって好適に製造できるため、工業的な量産性にも優れる。
　さらなる図示は省略するが、他の実施形態例においては、リング状の微細凹凸構造領域６が付着抑制領域３Ａより陥没して低い位置にあってもよい。この場合も、細胞塊形成部材１Ｈと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例９］
　図１９は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図２０は、図１９のＸＸ－ＸＸ断面図である。図１９、図２０に示す細胞塊形成部材１Ｉは、複数の凹部１１を含む凹型の微細凹凸構造領域６Ｉが形成されている点で細胞塊形成部材１Ａと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ａと共通する構成を備える。
　細胞塊形成部材１Ｉにおいても、細胞塊形成部材１Ａと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例１０］
　図２１は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図２２は、図２１のＸＸＩＩ－ＸＸＩＩ断面図である。図２１、図２２に示す細胞塊形成部材１Ｊは、下記の４点で細胞塊形成部材１Ｂと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ｂと共通する構成を備える。
・凹型の微細凹凸構造領域６Ｊが形成されている点。
・微細凹凸構造領域６の複数の凹部１１の底部に親水性層８が形成されている点。
・細胞付着領域４Ｂの微細凹凸構造領域６に形成された親水性コーティング層５の表面が、微細凹凸構造領域６に追従している点。
・細胞塊形成部材１Ｊにおいては、複数の凸部７Ｊの平均高さ又は複数の凹部の平均深さは、微細凹凸構造領域６における親水性コーティング層の厚みより大きい。
　細胞塊形成部材１Ｊにおいても、細胞塊形成部材１Ｂと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例１１］
　図２３は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図２４は、図２３のＸＸＩＶ－ＸＸＩＶ断面図である。図２３、図２４に示す細胞塊形成部材１Ｋは、複数の凹部１１を含む凹型の微細凹凸構造領域６Ｋが形成されている点で細胞塊形成部材１Ｃと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ｃと共通する構成を備える。
　細胞塊形成部材１Ｋにおいても、細胞塊形成部材１Ｃと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例１２］
　図２５は、細胞塊形成部材の一例を模式的に示す拡大平面図である。図２６は、図２５のＸＸＶＩ－ＸＸＶＩ断面図である。図２５、図２６に示す細胞塊形成部材１Ｌは、下記の２点で細胞塊形成部材１Ｄと相違し、その他の点では細胞塊形成部材１Ｄと共通する構成を備える。
・凹型の微細凹凸構造領域６Ｌが形成されている点。
・微細凹凸構造領域６の複数の凹部１１の底部に親水性層８が形成されている点。
　細胞塊形成部材１Ｌにおいても、細胞塊形成部材１Ｄと同様の作用効果が得られる。
［実施形態例１３］
　図３０は、図３に示す細胞塊形成部材１Ａの変形例（１Ａ’）におけるＩＶ－ＩＶ線断面に対応する断面図である。この一例では細胞付着領域４Ａ’の微細凹凸構造領域６において、複数の凸部７の先端が親水性層８から露出している。この一例に係る細胞塊形成部材によれば、細胞付着領域４Ａ’における細胞の付着性がより高くなる。
［実施形態例１４］
　図３１は、図９に示す細胞塊形成部材１Ｄの変形例（１Ｄ’）におけるＸ－Ｘ線断面に対応する断面図である。この一例では細胞付着領域４Ｂ’の微細凹凸構造領域６において、複数の凸部の先端が親水性層８から露出している。この一例に係る細胞塊形成部材によれば、細胞付着領域４Ｂ’における細胞の付着性がより高くなる。
［実施形態例１５］
　図３２は、図２１に示す細胞塊形成部材１Ｊの変形例（１Ｊ’）におけるＸＸＩＩ－ＸＸＩＩ線断面に対応する断面図である。この一例では細胞付着領域４Ｊ’において、複数の凸部７Ｊの先端が親水性層８から露出している。この一例によれば、細胞付着領域４Ｊ’における細胞の付着性がより高くなる。
＜培養容器＞
　一実施形態に係る培養容器は、一実施形態に係る細胞塊形成部材を備えるため、細胞塊を容易に形成でき、工業的な量産性に優れる。
　培養容器として、例えば、細胞を含む培養液を収容する容器本体の内壁面に細胞塊形成部材を備えたものが挙げられる。容器本体の内壁面は、培養液と接触し得る面であれば特に限定されず、容器本体の底面でもよく、容器本体の内側の側面でもよい。細胞塊形成部材は接着剤を介して容器本体の内壁面に設けられていてもよい。
　培養容器の形状、大きさは特に限定されない。培養容器としては、シャーレ；１つ又は複数のウェル（穴）を備える培養プレート；培養フラスコ；スライドグラスチャンバー等が挙げられる。
　培養プレートのウェルの数は、特に限定されず、培養細胞の用途、使用する分析装置等に応じて設定される。ウェルの平面視の形状は特に限定されない。例えば、真円、楕円、三角形、正方形、長方形、五角形等が挙げられる。ウェルの底面の形状も特に限定されない。平底、丸底、凹凸等が挙げられる。
　培養容器の材質は特に限定されない。例えば、高分子材料、金属材料、無機材料が挙げられる。高分子樹脂としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリイソプレン、シクロオレフィンポリマー、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミドイミド、（メタ）アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン等が挙げられる。
　金属材料としては、例えば、ステンレス、銅、鉄、ニッケル、アルミ、チタン、金、銀、白金等が挙げられる。
　無機材料としては、例えば、酸化ケイ素（ガラス）、酸化アルミ、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、窒化ケイ素等が挙げられる。
＜培養細胞の生産方法＞
　一実施形態に係る培養細胞の生産方法では、一実施形態に係る細胞塊形成部材を用いて、細胞を培養し、次いで、細胞塊形成部材から培養細胞を剥離する。培養細胞の生産方法では上述の一実施形態に係る細胞塊形成部材を用いて培養するため、細胞付着領域に細胞が集まりやすく、三次元構造をもつ細胞塊の形成が促されやすい。
　培養細胞の生産方法においては、細胞塊形成部材の細胞付着領域及び付着抑制領域が形成された表面に細胞を播種して細胞塊形成部材の表面に付着させることが好ましい。
　細胞は特に限定されない。細胞塊を形成し得るものが好適に選択され得る。例えば、肝細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、心筋細胞、血中免疫細胞、血管内皮細胞等が挙げられる。
　細胞としてｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の分化能をもつ幹細胞、幹細胞から誘導された分化細胞を用いてもよい。また、細胞として腫瘍細胞を用いてもよい。腫瘍細胞としては、上皮系の腫瘍細胞が好ましく、例えばＨｅＬａ細胞等の子宮頸癌細胞、膵癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、頭頸部癌細胞等が挙げられる。
　細胞、幹細胞、分化細胞、腫瘍細胞の動物種は特に限定されない。例えば、ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳類等が挙げられる。
　培養条件は特に限定されず、細胞種、細胞塊の用途等に応じて変更できる。
　コンフルエントになった培養細胞を剥離する際には細胞剥離剤を使用してもよい。細胞剥離剤は、細胞培養において一般的に使用される剥離剤であれば、特に限定されない。
＜細胞塊形成部材付き培養細胞＞
　一実施形態に係る細胞塊形成部材付き培養細胞は、一実施形態に係る細胞塊形成部材と；細胞塊形成部材の細胞付着領域に付着した培養細胞と；を備える。
　一実施形態に係る細胞塊形成部材付き培養細胞は、上述の細胞塊形成部材を用いて、細胞が細胞塊形成部材の表面に付着した状態で培養することで生産したものである。そのため、培養細胞を含む任意の三次元構造の細胞塊が細胞塊形成部材の表面に付着し得る。
　細胞の種類は特に限定されない。培養細胞の生産方法の項で例示したものと同様の細胞が挙げられる。細胞塊形成部材付き培養細胞を再生医療、ウイルスや細菌感染症研究及び疾患の治療薬スクリーニング方法に好適に適用できる。疾患の治療薬開発に適用する場合は、薬剤は疾患の予防効果及び治療効果のいずれか一方又は両方の効果を発揮するものである。
　スクリーニング方法においては、疾患の対象となる細胞、腫瘍細胞を含む細胞塊を被試験物質と共存させ、被験物質の共存下で対象細胞に特有の形態の減弱又は喪失の有無を観察する。そして、被験物質について、疾患の予防効果、治療効果の有無を判定する。
　以上一実施形態について説明したが、本発明は本明細書に開示の実施形態に限定されず、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施できる。本明細書に開示の実施形態は、その他の様々な形態で実施可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更が可能である。
　以下、実施例を用いて一実施形態をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
＜実施例１＞
　特開２００９－０３４６３０号公報に記載の方法でコロイダルシリカからなる単粒子膜エッチングマスクを、一般的なフォトリソグラフィー法を利用したスポットパターン（フォトレジスト）付きＳｉウェハ上に作製した。この単粒子膜エッチングマスクを用いた気相エッチング法によって微細凹凸構造をＳｉ基板に形成し、残ったフォトレジストを除去することで、直径３０μｍの円形かつスポット状の微細凹凸構造領域が最短４０μｍの間隔で１ｍｍ２あたり１００個並んだ、凸型のＳｉ製表面微細構造原版（１）を作製した。凸型のＳｉ製表面微細構造原版（１）において微細凹凸構造領域内には、複数の略円錐形状の凸部が含まれ、複数の凸部間の平均ピッチは２００ｎｍ、複数の凸部の平均高さは５３０ｎｍであった。また、円形かつスポット状の微細凹凸構造領域の凸部の先端と、微細凹凸構造領域外の平坦領域との高低差ｈは２７０ｎｍであった。
　続いて、凸型のＳｉ製表面微細構造原版（１）から凹型のＮｉ製電鋳スタンパー（１）を作製した。その後、凹型のＮｉ製電鋳スタンパー（１）を用いて、熱ナノインプリント法によって、厚み１８８μｍのシクロオレフィンポリマーフィルムの表面に載置部となる凸構造を転写し、凸型の樹脂転写部材（１）を作製した。具体的には、厚み１８８μｍのシクロオレフィンポリマーフィルムの表面に、凹型のＮｉ製電鋳スタンパー（１）の微細構造面を対向させたものをナノインプリント装置の加圧部にセットした。この状態で昇温を開始し、１７５℃で５分間、５ＭＰａで加圧した。５分間経過した後、加圧部を室温まで冷却し、凹型のＮｉ製電鋳スタンパー（１）をシクロオレフィンポリマーフィルムの表面から離型し、凸型の樹脂転写部材（１）を得た。この凸型の樹脂転写部材（１）を実施例１の凸型の細胞塊形成部材とした。
＜実施例２＞
　実施例１で作製した凸型のＳｉ製表面微細構造原版（１）から熱ナノインプリント法によって、厚み１８８μｍのシクロオレフィンポリマーフィルム表面に載置部となる凸構造を転写して凹型の樹脂原版（１）を作製した。凹型の樹脂原版（１）から凸型のＮｉ製電鋳スタンパー（１）を作製し、凸型のＮｉ製電鋳スタンパー（１）を用いた以外は実施例１と同様にして、凹型の細胞塊形成部材を得た。
＜実施例３＞
　特開２００９－０３４６３０号公報に記載の方法でコロイダルシリカからなる単粒子膜エッチングマスクを、一般的なフォトリソグラフィー法を利用したリングパターン（フォトレジスト）付きＳｉウェハ上に作製した。この単粒子膜エッチングマスクを用いた気相エッチング法によって環状の微細凹凸構造領域をＳｉ基板に形成した（残ったフォトレジストは除去した。）。環状の微細凹凸構造の外径円の直径Ｒは４０μｍであり、内径円の直径ｒは３０μｍであり、幅Ｗは５μｍであった。環状の微細凹凸構造領域が最短３０μｍの間隔で１ｍｍ２あたり１００個並んだ、凸型のＳｉ製表面微細構造原版（２）を作製した。凸型のＳｉ製表面微細構造原版（２）において、環状の微細凹凸構造領域内には、複数の略円錐形状の凸部が含まれ、複数の凸部間の平均ピッチは４００ｎｍ、複数の凸部の平均高さは１１００ｎｍであった。環状の微細凹凸構造領域の凸部の先端と、微細凹凸構造領域外の平坦領域との高低差ｈは５００ｎｍであった。
　その後、凸型のＳｉ製表面微細構造原版（２）から作製した凹型のＮｉ製電鋳スタンパー（２）を用いた以外は、実施例１と同様にして、凸型の細胞塊形成部材を得た。
＜実施例４＞
　実施例３で作製した凸型のＳｉ製表面微細構造原版（２）から熱ナノインプリント法によって、厚み１８８μｍのシクロオレフィンポリマーフィルム表面に載置部となる凸構造を転写してシクロオレフィンポリマーからなる凹型の樹脂原版（２）を作製した。凹型の樹脂原版（２）から作製した凸型のＮｉ製電鋳スタンパー（２）を用いた以外は実施例１と同様にして、凹型の細胞塊形成部材を得た。
＜ヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ－５５の培養＞
　実施例１～４で得られた各細胞塊形成部材の表面にＵＶオゾン法により親水化処理を行った後に、ＭＰＣポリマー液をスピンコーティングによって塗布し、平均厚み４０ｎｍのＭＰＣポリマーの塗布層を基材の表面に設けた。塗布層を乾燥し、表面に付着抑制領域と細胞付着領域とが形成された細胞塊形成部材を得た。細胞塊形成部材を蒸留水で水洗し、風乾した細胞塊形成部材を２０ｍｍ×２０ｍｍのサイズに切り出し、直径４０ｍｍ×深さ１３．５ｍｍの培養シャーレ（アズノールシャーレ、アズワン社）の内底にワセリンを介して固定した。次いで、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を加えて細胞塊形成部材を３回洗浄した後、３ｍＬのＤＭＥＭに懸濁した２×１０６個のＰＣＩ－５５細胞を各例の細胞塊形成部材に播種し、３７℃で一晩～４８時間培養した。
　図２７は実施例１の細胞塊形成部材にＭＰＣポリマーを塗布した後に、ヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ－５５を培養した結果を示すＤＩＣ観察画像である。細胞付着領域の２つ以上を跨いで細胞付着領域に強固に接着したポリープ状細胞塊が複数形成されていた。
　図２８は実施例２の細胞塊形成部材にＭＰＣポリマーを塗布した後に、ヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ－５５を培養した結果を示すＤＩＣ観察画像である。１つの細胞付着領域の高さ方向において伸長したポリープ状細胞塊が複数形成されていた。
　以上の培養結果から、実施例１～４の細胞塊形成部材において形態学的極性及び組織運動極性を具備し、自己組織化した足場依存性の非スフェロイド様がん細胞塊が形成されたことを確認した。
＜マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２株の培養＞
　実施例１～４で得られた各細胞塊形成部材の表面にＭＰＣポリマー液をスピンコーティングによって全面に塗布し、平均厚み４０ｎｍのＭＰＣポリマーの塗布層を基材の表面に設けた。塗布層を乾燥し、表面に付着抑制領域と細胞付着領域とが形成された細胞塊形成部材を得た。細胞塊形成部材を蒸留水で水洗し、風乾した細胞塊形成部材を、２０ｍｍ×２０ｍｍのサイズに切り出し、直径４０ｍｍ×深さ１３．５ｍｍの培養シャーレ（アズノールシャーレ、アズワン社）の内底にワセリンを介して固定した。ＤＭＥＭを加えて細胞塊形成部材を３回洗浄した後、３ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁した５×１０５個のＣ２Ｃ１２細胞を各細胞塊形成部材上に播種し、３７℃で一晩～４８時間培養した。
　培養終了後、細胞塊をパラホルムアルデヒドで固定し、ファロイジンを用いてアクチンを、ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色し、オールインワン蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ８００、キーエンス社）により２次元画像を取得した。
　図２９は実施例１の細胞塊形成部材を用いてマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２株を培養した結果を示すＤＩＣ観察画像である。２つ以上のスポットを跨いだ非スフェロイド状細胞塊の形成が認められた。
　同様に、実施例２～４の細胞塊形成部材を用いてマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を培養した場合も、２つ以上のスポットを跨いだ非スフェロイド状細胞塊の形成が認められた。
　以上の培養結果から、実施例１～４の細胞塊形成部材において、形態学的極性及び組織運動極性を具備し、自己組織化した足場依存性の非スフェロイド様細胞塊が形成されたことを確認した。
　一実施形態によれば、細胞塊を容易に形成でき、工業的な量産性に優れる細胞塊形成部材；前記細胞塊形成部材を備えた培養容器；前記細胞塊形成部材を用いる培養細胞の生産方法；及び前記細胞塊形成部材を備えた細胞塊形成部材付き培養細胞が提供される。
　１…細胞塊形成部材、２…基材、３…付着抑制領域、４…細胞付着領域、５…親水性コーティング層、６…微細凹凸構造領域、７…凸部、８…親水性層、９、１０…細胞形成領域、１１…凹部。

Claims (15)

  1. 　基材を有する細胞塊形成部材であって、
    　前記基材の表面に、少なくとも１以上の付着抑制領域と、少なくとも１以上の細胞付着領域とが形成され、
    　前記細胞付着領域の少なくとも一部に、複数の凸部又は複数の凹部を含む微細凹凸構造領域が形成され、
    　前記付着抑制領域及び前記細胞付着領域の両方に、親水性コーティング層が形成されている、細胞塊形成部材。
  2. 　基材を有する細胞塊形成部材であって、
    　前記基材の表面に、少なくとも１以上の付着抑制領域と、少なくとも１以上の細胞付着領域とが形成され、
    　前記細胞付着領域の少なくとも一部に、複数の凸部又は複数の凹部を含む微細凹凸構造領域が形成され、
    　前記付着抑制領域及び前記細胞付着領域のうち前記付着抑制領域の一方に親水性コーティング層が形成されている、細胞塊形成部材。
  3. 　前記複数の凸部の平均高さ又は前記複数の凹部の平均深さが、２５０ｎｍ以上である、請求項１又は２に記載の細胞塊形成部材。
  4. 　前記複数の凸部の平均直径に対する前記複数の凸部の平均高さのアスペクト比、又は、前記複数の凹部の平均直径に対する前記複数の凹部の平均深さのアスペクト比が、０．５～５．０である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材。
  5. 　前記複数の凸部間又は前記複数の凹部間の平均ピッチが、５０ｎｍ～１μｍである、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材。
  6. 　前記細胞付着領域が、前記基材の厚み方向で前記付着抑制領域と相対的に高低差を設けた位置にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材。
  7. 　前記細胞付着領域と前記基材の前記表面との間の高低差が、０～３μｍである、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材。
  8. 　前記微細凹凸構造領域の前記複数の凸部の間の凹部に、又は、前記複数の凸部の間の凹部の底部に、親水性層が形成されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材。
  9. 　前記基材が、ポリエチレンテレフタラート、トリアセチルセルロース、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、アクリル樹脂、ポリスチレン及びジメチルポリシロキサンからなる群から選ばれる少なくとも１種以上の樹脂を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材。
  10. 　前記細胞付着領域に外接する最小面積の楕円の短軸に対する前記楕円の長軸の比が、１～３である、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材。
  11. 　前記細胞塊形成部材の平面視において、前記細胞付着領域が、外径円と内径円で囲まれた環状領域に形成され、前記外径円の直径は１０～１００μｍであり、前記外径円の直径と前記内径円の直径との差が２００ｎｍ～３０μｍであり、かつ、前記環状領域の少なくとも一部には、複数の凸部又は複数の凹部を含む微細凹凸構造が形成され、
    　前記付着抑制領域及び前記細胞付着領域の両方に、親水性コーティング層が形成されている、請求項１に記載の細胞塊形成部材。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材を備えた、培養容器。
  13. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材を用いて細胞を培養し、次いで、前記細胞塊形成部材から培養細胞を剥離する、培養細胞の生産方法。
  14. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞塊形成部材と、
    　前記細胞塊形成部材に付着した培養細胞と、
    　を備えた、細胞塊形成部材付き培養細胞。
  15. 　前記細胞を含む細胞塊が、三次元構造を形成している、請求項１４に記載の細胞塊形成部材付き培養細胞。
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