WO2007125894A1 - 細胞培養容器の製造方法 - Google Patents

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WO2007125894A1
WO2007125894A1 PCT/JP2007/058803 JP2007058803W WO2007125894A1 WO 2007125894 A1 WO2007125894 A1 WO 2007125894A1 JP 2007058803 W JP2007058803 W JP 2007058803W WO 2007125894 A1 WO2007125894 A1 WO 2007125894A1
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WO
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cell culture
well
hydrophilic
pattern
culture container
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/058803
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takeshi Ikeya
Masaharu Watanabe
Kana Miyazaki
Toru Shibuya
Original Assignee
Toyo Gosei Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Gosei Co., Ltd. filed Critical Toyo Gosei Co., Ltd.
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Priority to JP2008513206A priority patent/JPWO2007125894A1/ja
Priority to US12/298,155 priority patent/US20090181158A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell culture vessel that can be suitably used in biochemical experiments, clinical experiments, drug development studies, and the like.
  • Various cell culture vessels are used in the fields of biochemical experiments, clinical experiments, and drug development research. For example, many attempts have been made to form a cell adhesion suppression layer or a cell adhesion suppression layer in a pattern on a slide glass, a cover glass, or a plastic flat plate.
  • a cell culture container has been proposed in which a pattern-shaped photocured product of a photosensitive composition mainly composed of a water-soluble polymer as a cell adhesion suppression layer is formed on a flat substrate (Patent Document). 1).
  • Patent Document Patent Document 1
  • a high-precision and highly accurate pattern can be easily obtained by using a flat substrate, such as applying a photosensitive composition to the substrate by spin coating.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-280076 (Claim 9, paragraph numbers [0093], [0094], etc.)
  • the present invention is preferred in biochemical experiments and clinical experiments' drug development research and the like. It is an object of the present invention to provide a method for producing a cell culture container that can be used appropriately. Means for solving the problem
  • a first aspect of the present invention for solving the above-described problem is a concave section serving as a region for culturing cells.
  • a hydrophilic photosensitive composition is applied to the bottom of the well of the cell culture vessel main body provided with a plurality of (wells) to form a coating film, and then the coating film is subjected to pattern exposure and development to an uncured region.
  • the present invention provides a method for producing a cell culture vessel, wherein a cell culture vessel is obtained by removing a region to obtain a hydrophilic film having a pattern-like photocured product on the bottom surface of the well.
  • a second aspect of the present invention is characterized in that the hydrophilic photosensitive composition contains a photosensitive resin having a main chain of a water-soluble polymer and a photocrosslinkable photosensitive group.
  • the method for producing a cell culture container described in the first aspect is characterized in that the hydrophilic photosensitive composition contains a photosensitive resin having a main chain of a water-soluble polymer and a photocrosslinkable photosensitive group.
  • a desired pattern is provided at a tip portion of the convex portion that faces the bottom surface of the well and has a convex portion that is inserted into the well.
  • the cell culture container is provided with a plurality of wells that serve as cell culture regions, and a patterned cell adhesion suppression layer is formed on the bottom of the well.
  • This cell culture container is advantageous in that it can be suitably used in biochemical experiments and clinical experiments, drug development studies, and the like. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 is a diagram showing a specific example of a method for producing a cell culture container according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a specific example of the method for producing a cell culture container according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a specific example of a mask.
  • FIG. 4 is a diagram showing a specific example of the method for producing a cell culture container according to the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing a specific example of the method for producing a cell culture container according to the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing an outline of a mask used in Example 11.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of test examples.
  • a hydrophilic photosensitive composition is applied to the bottom surface of a well of a cell culture container body provided with a plurality of concave sections (cells) serving as a cell culture region. After the coating film is formed, the cell culture is provided with a hydrophilic coating film that also has a pattern-like photocured product force on the bottom of the well by pattern exposure and development to remove the uncured region. A container is obtained.
  • the cell culture vessel main body may have any number of wells.
  • the number of wells that have been widely used in the past is 1 ⁇ 2, 12, 48, 96, 384, etc.
  • a commercially available well (diameter: 7 mm, depth: about 12 mm) 96 well multi-well plate (length: 75 mm, width: 115 mm) can be used. .
  • the material of the cell culture vessel main body is not particularly limited! However, in order to observe the behavior of cells during culture, at least the bottom surface of the cell must be colorless and transparent or nearly colorless and transparent. Is preferred. From this point of view, plastics such as vinyl chloride, polystyrene, polypropylene, and acrylic are preferred, with plastic and glass being preferred. Well Since the exposure process is used to form a hydrophilic film on the bottom surface of the surface of the cell, the side surface of the well is colored and the cell culture volume is reduced from the viewpoint of suppressing light scattering of the side surface force of the well. A vessel body is preferred.
  • the cell culture vessel main body used in the present invention may have a modified surface.
  • the method for modifying the surface is a known method. Examples thereof include hydrophilized polystyrene by plasma treatment of the surface and plates coated with physiologically active substances such as poly-L-lysine, laminin, fibronectin and collagen.
  • the hydrophilic photosensitive composition applied to the well of the cell culture container main body preferably contains a hydrophilic photosensitive resin.
  • the hydrophilic photosensitive resin is not particularly limited as long as the photocured product can suppress cell adhesion.
  • the main chain skeleton is a water-soluble polymer.
  • a photosensitive resin obtained by introducing a photocrosslinkable photosensitive group as a side chain or as a main chain end group into the water-soluble polymer is preferable.
  • a hydrophilic photosensitive composition containing a low molecular weight photosensitive compound such as a low molecular weight photocrosslinking agent
  • unreacted low molecular weight photosensitive compound remains and is eluted during subsequent cell culture. It may be a factor that inhibits natural cell behavior.
  • low molecular weight photosensitive compounds can be used if there is no influence of the residue and if the cell culture system can be managed to eliminate the residue. .
  • Examples of the water-soluble polymer serving as the main chain skeleton of the hydrophilic photosensitive resin include polyethylene glycol and polybulal alcohol.
  • the photocrosslinkable photosensitive group introduced into the water-soluble polymer preferably has an azide group.
  • Examples of the photosensitive group having an azide group include azidobenzoic acid, and those obtained by introducing them into both ends of polyethylene glycol can be used as the hydrophilic photosensitive resin.
  • the photocrosslinkable photosensitive group introduced into the water-soluble polymer is preferably a photosensitive group represented by the following formula (1) from the viewpoint of ease of introduction into the water-soluble polymer.
  • R is a group selected from the following formula (2)
  • R is a group selected from the following formula (3)
  • At least one of 1 2 1 and R has at least one azide group.
  • R is a hydrogen atom, an alkyl
  • an alkyl group having an acetal group, an aryl group, an aralkyl group, or a substituent containing a basic nitrogen preferably a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an acetal group.
  • R and R both have an azide group.
  • R is preferably the following formula (4) and R is preferably the following formula (5).
  • the method for producing such hydrophilic photosensitive resin is not particularly limited, and may be produced by a known method.
  • a method for producing a hydrophilic photosensitive resin in which a photosensitive group represented by the above formula (1) is introduced into a water-soluble polymer a water-soluble polymer having an amino group at a side chain or terminal, and Bonded with this amino group to form the structure of the above formula (1) together with the amino group Let it react with the compound.
  • the remaining acetal group and hydroxy group having Molecules may be reacted.
  • a water-soluble polymer having an amino group! /! Is a compound that binds to an acetal compound and forms the structure of the above formula (1) together with the amino group.
  • the hydrophilic photosensitive composition is usually a solution obtained by dissolving the hydrophilic photosensitive resin in a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the hydrophilic photosensitive resin and does not damage the cell culture vessel body, but water, an organic solvent compatible with water, or a mixture thereof is preferable.
  • the organic solvent compatible with water include alcohols such as ethanol and dimethyl sulfoxide. Of these, water is particularly preferred. This is because when an organic solvent is used, the cell culture vessel body may be adversely affected, or the residual solvent after photocuring may adversely affect the cells.
  • the hydrophilic photosensitive composition does not inhibit the formation of a photocured product!
  • additives may be included.
  • the additives include mineral acids and organic acids as acids for adjusting the pH of the photosensitive composition, and sodium hydroxide, potassium hydroxide and aqueous ammonia as bases. it can.
  • salt such as sodium chloride for adjusting salt strength, buffer solution such as phosphate buffer for stabilizing pH, antifoaming agent and the like can be added.
  • this hydrophilic photosensitive composition is exposed to light, a photocrosslinking reaction occurs and a hydrophilic photocured product is obtained.
  • the hydrophilic photosensitive composition is applied to the bottom surface of the well to form a coating film, and then the coating film is subjected to pattern exposure and development to remove the unexposed area which is an uncured area. To do.
  • a cell culture vessel can be obtained in which a hydrophilic coating having a patterned photocured product force is provided on the bottom surface of the well.
  • the method of applying the hydrophilic photosensitive composition to the bottom surface of the well of the cell culture container body is not particularly limited as long as it can be applied substantially uniformly to the bottom surface of the well.
  • the amount of the photosensitive composition to be applied may be determined appropriately depending on the volume of the well, but a commercially available 96-well multi-well plate having 96 wells having a diameter of about 7 mm and a depth of about 12 mm as the cell culture container body.
  • the coating amount is preferably 5 to 200 ⁇ L, particularly preferably 5 to 50 ⁇ L.
  • the coating thickness of the hydrophilic photosensitive composition is preferably uniform, and the coating thickness is 5 ⁇ ! About 10 / z m is preferable.
  • the film thickness is less than 5 nm, it is not easy to confirm whether the film is uniformly formed.
  • create a film with a film thickness exceeding 10 m increase the viscosity of the solution of the photosensitive composition. This is because a problem in the coating process is likely to occur.
  • heat treatment may be performed as necessary before exposure.
  • the heat treatment conditions are not particularly limited as long as they do not adversely affect the cell culture container and the hydrophilic photosensitive composition, but are usually 4 to 70 ° C for about 1 minute to 24 hours, preferably 20 to 40 °. C for 5 minutes to 1 hour.
  • Pattern exposure of the coating film of the hydrophilic photosensitive composition may be performed by a conventionally known pattern exposure method.
  • a mask having a desired pattern is used.
  • the area corresponding to the pattern of the desired photocured product transmits the light to be exposed, and other areas do not transmit the light to be exposed.
  • a chromium mask in which an emulsion mask is vapor-deposited in a pattern shape on a mask body made of a material that transmits light to be exposed, for example, glass, quartz, polymethyl methacrylate, etc. it can.
  • the size of the mask having a pattern may be smaller than the area of the bottom surface of the well. In this case, they are arranged independently on the coating film. It is also possible to use a mask having a convex portion inserted into the tool larger than the area of the bottom surface of the well and having a desired pattern at the tip portion facing the bottom surface of the convex wall. In this case, the tip of the mask is attached to each well, and the tip is arranged so as to be in close contact with or close to the coating film. It is larger than the area of the bottom of the well, and it is preferable to use a mask because of its productivity.
  • the mask When pattern-exposing a coating film using such a mask, the mask is placed in close contact with the coating film, and a liquid layer inert to the coating film is formed on the coating film. It is preferable that the mask is disposed in close proximity, or the mask is disposed close to the coating film via a gas layer.
  • the mask When the mask is brought into close contact with or close to the coating film, interference of light to be exposed is suppressed, so that the pattern exposure can be limited to a desired specific region, and the pattern-like hydrophilic cured film that is particularly excellent after development. This is because the can be formed.
  • a mask When a mask is placed in this way, exposure is performed from the side opposite to the mask coating.
  • a mask having a pattern is brought into close contact with or close to the surface of the cell culture container body opposite to the side on which the coating film is provided.
  • the mask side force exposure may be performed.
  • the arrangement method of the mask when bringing the mask into close contact with or close to the coating film is not particularly limited as long as the mask and the coating film are not damaged.
  • the light source for pattern exposure of the coating film is not particularly limited as long as it is a light source capable of exposing the hydrophilic photosensitive composition.
  • X-ray, electron beam, excimer laser (F, ArF, KrF laser, etc.) and solid-state ultraviolet laser are generated as light sources.
  • Light source metalno, ride lamp, xenon lamp, or high-pressure mercury lamp can be used.
  • the exposure energy should be set appropriately according to the structure of the photosensitive functional group and the energy of the light source used. Usually 0. ln3jZcm 2 to 5000 mjZcm 2 , especially lmjZcm 2
  • post-exposure heat treatment may be performed!
  • the conditions for this heat treatment may be the same as the conditions for the heat treatment appropriately performed after the photosensitive composition is applied and before exposure.
  • the method of forming a patterned photocured product by removing a non-cured region by development using a developer is not particularly limited as long as it is a method capable of dissolving the coating film in the uncured region. Yes.
  • a method of immersing each cell culture container body after exposure in a developer In addition, a method of applying or spraying a developer to the cell culture vessel main body can be exemplified.
  • a photocured material having a good pattern can be obtained by immersing in a developer tank for 1 minute. After forming a pattern-like photocured product by development, rinsing may be performed as necessary.
  • the developer used for the development is not particularly limited as long as it has a sufficient difference in solubility between the uncured region and the cured region and does not adversely affect the cell culture vessel such as denaturation.
  • a solvent that can dissolve the uncured region of the photosensitive composition coating film water, an organic solvent compatible with water, a mixed solution thereof, or the like can be used.
  • organic solvents compatible with water include alcohols such as ethanol, dimethyl sulfoxide, and the like. Of these, water is particularly preferred. This is because there is no influence on the cells due to the remaining organic solvent as in the solvent of the hydrophilic photosensitive composition. When these solvents are used, a pattern having no development residue can be produced.
  • the concentration of the developer is not particularly limited as long as it can dissolve the uncured region.
  • the developer is a mixed solution of water and ethanol. If present, the content ratio of ethanol can take any value greater than ⁇ wt% and less than 100wt%.
  • the step of drying after development is not particularly limited as long as the developer can be removed, but a constant temperature dryer, a hot plate, an air dryer, or the like can be used. It is preferable to dry at a constant temperature using a constant temperature dryer.
  • the drying conditions are usually 30 to 70 ° C for about 1 minute to 24 hours, preferably 30 to 40 ° C for about 3 minutes to 1 hour.
  • the cell culture container produced by the production method of the present invention can be used as it is as a cell culture container for biochemical experiments, clinical experiments, drug development research, and generally a substrate with a pattern built on a flat plate is made fine.
  • Necessary for cell culture the process of putting the cell-containing aqueous solution into the dish after bonding the substrate to the surface of the dish, which is a kind of culture vessel, and the culture dish containing the cell-containing aqueous solution No need to submerge in the process. Therefore, there is a problem that the compound dissolved from the adhesive adversely affects the cells, and the patterning of the submerged substrate There is no problem that the cells wrap around the back side.
  • This hydrophilic film formed on the bottom surface of the well can stably maintain its structure in any of a dry state and a solution. In addition to being able to maintain its structure sufficiently in dry and humidified conditions, it can be maintained for a long period of time, for example, 1 day or more, and further 10 days, even in water at 37 ° C or in an aqueous solvent.
  • the structure is maintained stably. It is important to be able to exist stably in solution, particularly in water or an organic solvent compatible with water, and in particular, the bottom of each well of the cell culture vessel is exposed to a dry state, an aqueous solution, or an organic solvent solution. This is because they are required to be resistant to all of them.
  • the aqueous solvent is not particularly limited as long as it is a solution containing water.
  • the aqueous solvent include alcohols such as ethanol, a mixture of water and an organic solvent compatible with water such as dimethyl sulfoxide, potassium phosphate-hydrogen hydrogen 'hydrogen phosphate-sodium water solution, sodium hydrogen carbonate' Buffers such as aqueous sodium carbonate, inorganic sodium organic salts such as sodium chloride, potassium salt, and ammonium salt, glucose, galactose, wheat sugar, starch, heparin, heparan sulfate, etc.
  • Examples thereof include saccharide aqueous solutions containing monosaccharides and polysaccharides, protein aqueous solutions, DNA, RNA aqueous solutions, liquid media, and mixtures thereof.
  • minerals such as clay, metal fine particles such as gold nanoparticles, polymer fine particles such as polystyrene beads and latex particles, animals, and the like may be included.
  • examples thereof include cells, plant cells, microorganisms, viruses, and mixtures thereof.
  • the temperature at which the cell culture vessel produced in the present invention can be used is not particularly limited as long as the cell culture vessel is not adversely affected by alteration or deformation, but it is usually from -80 ° C to 70 ° C. Particularly preferred is 20 to 40 ° C. If the temperature exceeds 70 ° C, the photosensitive group of the photosensitive resin may be decomposed and the photocured product may not exist stably.
  • the region where the hydrophilic coating is provided on the bottom surface of the well that is, the cell non-adhesive region, and the bottom surface of the cell culture container are exposed. Since the exposed region, that is, the cell adhesive region, is provided, it is suitable for use in a new culture system such as a use for culturing cells in a pattern. Specifically, when a liquid medium in which cells are suspended is placed in the well of the cell culture container obtained by the present invention, Cells can be attached to regions other than the patterned hydrophilic coating on the bottom surface of the elbow. Therefore, cells can be cultured in a pattern on the bottom of the well.
  • the shape of the hydrophilic coating pattern can be easily set to a desired shape such as a hole, a dot, or a stripe depending on the design of the mask.
  • the cell culture container of the present invention includes a plurality of wells, cells different from one another can be cultured as necessary, and various evaluations related to cell culture can be performed. It is a good place for research and development.
  • a pattern can be formed on a multi-well plate that is frequently used for cell culture on a daily basis, a multi-well plate instrument, for example, a fluorescence measuring instrument such as an immuno reader, has been introduced. And automatic medium exchange that can process a large number of multi-well plates at once can be used as it is.
  • FIG. 1 (a) is a top view of the cell culture vessel main body
  • Fig. 1 (b) is a cross-sectional view taken along arrow A in Fig. 1 (a)
  • Fig. 2 (a) is a diagram showing the hydrophilic photosensitive composition on the bottom of the well.
  • Fig. 2 (b) is a cross-sectional view taken along line A- in Fig. 2 (a)
  • Fig. 3 is a cross-sectional view of the mask
  • Fig. 4 is a hydrophilic photosensitive composition.
  • FIG. 5 (a) is a top view of the manufactured cell culture container
  • FIG. 5 (b) is A in FIG. 5 (a). — Cross sectional view.
  • the cell culture vessel main body 1 has six wells 2. As shown in FIG. 2, a water-soluble photosensitive composition is applied to the bottom surface of each well 2 of the cell culture container body 1 to form a coating film 3. Next, the coating film 3 is subjected to pattern exposure using the mask 10 shown in FIG.
  • the mask body 11 is made of a transparent material, and has a cylindrical convex portion 12 inserted into the well 2 as shown in FIG. 3, and the cylindrical convex portion 12 has a bottom surface of the well 2.
  • the opposite tip portion 13, that is, the tip portion 13 facing the surface on which the coating film 3 is formed, has a pattern 14 in which 16 dots formed by chromium vapor deposition that do not transmit light are formed. As shown in FIG.
  • the top portion 13 of the mask 10 is attached to the well 2, and the top force of the mask 10 is also exposed while the tip portion 13 is in close contact with or close to the coating layer 3.
  • the exposed areas are cross-linked and cured, so unexposed areas should be developed and removed.
  • a pattern 5 having dot-like holes 4 on the coating made of a photocured hydrophilic photosensitive composition on the bottom surface of the well 2 (the “patterned photocured product” in the claims) Is formed).
  • Polyethylene glycol diamine manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd., number average molecular weight 1000
  • photofunctional compound 4 (2— (2- (4 azidophenol) butyl) , 3-Oxazoline-5-one
  • Og 2.0 times molar equivalent to the amino group of polyethylene glycol diamine
  • 70 g of tetrahydrofuran (THF) are mixed and reacted at 25 ° C for 18 hours. I let you. After completion of the reaction, THF was removed by evaporation. Thereafter, 50 g of water and 50 g of ethyl acetate were added to carry out a liquid separation extraction operation.
  • the obtained photosensitive resin A was subjected to 1 H-NMR measurement, and the proton peak of the polyethylene oxide methylene chain observed at 3.5 ppm and the photofunctionality observed from 6.8 ppm to 8.7 ppm.
  • the compound was identified as the target compound by the proton peak of the aromatic ring derived from product 4. From the integration ratio of these peaks, the introduction ratio of photofunctional compound 4 was 95%.
  • the compound was identified as the target compound by the proton peak of the aromatic ring derived from product 4. From the integration ratio of these peaks, the introduction ratio of photofunctional compound 4 was 96%.
  • the obtained photosensitive resin C was subjected to 1 H-NMR measurement.
  • the proton peak of the polyethylene oxide methylene chain found at 3.5 ppm and the photofunctional compound 4 found at 6.8 ppm to 8.7 ppm were observed.
  • the compound was confirmed to be the target compound by the peak peak of the derived aromatic ring. From the integration ratio of these peaks, the introduction ratio of photofunctional compound 4 was 90%.
  • the mixture was reacted at 60 ° C for 24 hours. Acetal-i was 97%.
  • Phosphoric acid was removed by ion exchange treatment to prepare photosensitive resin F in which a photosensitive group was introduced in an amount of 0.8 mol% relative to the hydroxy group of PVA.
  • Polyuric alcohol (EG 30, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.) lOOg was dissolved in 700 g of water and 200 g of methanol, and the photofunctional compound synthesized according to Synthesis Example 1 of JP-A-2003-292477 ( 10 g of 3— (4-azidophenol) N— (4,4′-dimethoxybutyl) 2 -phenol-aminoamino 2-aminoamide) and 3 g of phosphoric acid were added and reacted at 60 ° C. for 24 hours. Acetal-i was 97%. Phosphoric acid was removed by ion exchange treatment to prepare photosensitive resin G in which 0.8 mol% of the photosensitive group was introduced with respect to the hydroxy group of PVA.
  • THF tetrahydrofuran
  • the obtained photosensitive resin I was subjected to 1 H-NMR measurement, and the proton peak of the polyethylene oxide methylene chain found at 3.5 ppm and the photofunctionality seen from 6.8 ppm to 8.7 ppm
  • the compound was identified as the target compound by the proton peak of the aromatic ring derived from product 4. From the integration ratio of these peaks, mZ (m + n) was 0.048.
  • the photosensitive resin A obtained in Synthesis Example 1 was mixed with water adjusted to pH 3 with hydrochloric acid so that the total weight of the solid content was as shown in Table 2.
  • the obtained aqueous solution was filtered through a 0.45 m cellulose acetate membrane filter (hereinafter referred to as “filter”) to obtain photosensitive composition I-1.
  • the photosensitive resin used and the total solid weight were in accordance with Table 2 or Table 3, except that pure water was used instead of water adjusted to pH 3 in the same manner as in the preparation of photosensitive composition I.
  • Compositions II to IX were obtained.
  • polystyrene 96-well multi-well plate flat bottom type (Sumitomo Bakelite Co., Ltd .: Trademark “Sumilon Multi-Plate 96F”, 0.32 cm 2 Z or less “Non-Coated Resin Plate” .)It was used.
  • the prepared photosensitive composition 1-1 was pipetted into each well so that the coating amount was 10 L, and was present in the well. Then, leave it in a constant temperature dryer set at 60 ° C for 30 minutes. The coating film of photosensitive composition I-1 was obtained in each well.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the photosensitive resin used, each coating amount and the exposure amount present in the well were in accordance with Table 2 or Table 3, and each well of the 96-well multiwell plate was used.
  • a cell culture vessel was obtained in which a photocured product of a photosensitive composition having a group of dot-shaped holes corresponding to the dot pattern was provided on the bottom surface of the substrate.
  • the drying conditions were 60 ° C for 1 hour, 60 ° C for 15 hours, 37 ° C for 30 minutes and 37 ° C 1 I also went with the time.
  • photosensitive composition II-1 to IV-4 and 1 1 to ⁇ 1-4 is a collagen type I made of polystyrene coated with collagen type I as a base material for general-purpose well plates.
  • Coating 96well plate flat bottom type manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd .: Trademark “Sumilon Celtite C-1 Plate 96F” 0.32 cm 2 Zwell.
  • non-coated glass plate glass 96well plate Flat bottom type (manufactured by Nippon Sheet Glass Co., Ltd., hereinafter referred to as “non-coated glass plate”), and 96-well plate flat bottom type of aminosilane-coated polystyrene with amino groups on the surface (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd .: Trademark) “Sumilon Celtite PL Plate 96F” 0.32 cm 2 Zwell (hereinafter referred to as “APS-coated resin plate”) The test was performed under the condition of 3.
  • a polystyrene 12-well multiwell plate flat bottom type manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd .: trademark “Sumilon Multiplate 12F”, 3.6 cm 2Z Well
  • Photosensitive composition ⁇ -1 prepared in Example 2 was dispensed into each well, and a coating amount of 100 L was present in each well. Thereafter, it was left in a constant temperature dryer set at 60 ° C. and left for 30 minutes to obtain a coating film of photosensitive composition -1 in each barrel.
  • each well there is a 150 / zm ⁇ dot pattern (number of dots 900. Each dot is formed by chrome deposition) in a 10mm mouth (length lOmm x width 10mm).
  • the applied mask material: quartz
  • exposure lOOOOmjZcm 2
  • Example 1 except that the mask shown in FIG. 6 was used instead of the mask with 150 / ⁇ ⁇ ⁇ dot pattern in the 4 mm mouth, and the photosensitive compositions ⁇ -1 to ⁇ -4 were used.
  • the photosensitive composition having a group of dot-shaped holes corresponding to the dot pattern is provided on the bottom of each well of the 96-well multi-well plate.
  • the obtained cell culture container was obtained.
  • 6 (a) is a top view of the mask used in Example 11
  • FIG. 6 (b) is an enlarged view of a part of the tip of the convex portion of FIG. 6 (a)
  • FIG. c) is a cross-sectional view taken along arrow A- in Fig. 6 (a). As shown in Fig.
  • the mask 20 is a 115 mm x 75 mm flat substrate (material: quartz) 21 on a cylinder (material: quartz) with 6 mm ⁇ and a height of 11.6 mm. It is constructed according to the arrangement of each well, and the pattern (group of dots 24 is 135, and each dot 24 is chromium-deposited). Formed by.).
  • a 100 m ⁇ dot pattern (number of dots 16 9 on a 15 mm x 75 mm flat substrate (material: quartz).
  • a mask material: quartz
  • chrome vapor deposition was used, and the back surface force was exposed by contacting the back surface of the 96-well multiwell plate.
  • a cell culture container having a photosensitive composition ⁇ -1 to ⁇ -4 photocured product having a group of dot-shaped holes corresponding to the dot pattern on the bottom of each well of a 96-well multiwell plate is obtained. It was.
  • an aqueous solvent at 25 ° C. or 37 ° C. was injected into each well, and after 3 days and 21 days, The hydrophilic coating on the bottom surface was observed to investigate the shape of the hydrophilic coating and the presence or absence of peeling from the tool bottom force.
  • the aqueous solvent used was pure water or a phosphate-potassium hydrogen hydrogen 'hydrogen phosphate-sodium aqueous solution (phosphate buffer, pH 7.4).
  • FIGS. Figure 7 (a) shows a collagen coat. 5 ⁇ L of photosensitive composition II-1 was applied to the rate and the drying conditions were 60 ° C for 30 minutes.
  • Figure 7 (b) shows 5 ⁇ L of photosensitive composition ⁇ -1 applied to the collagen-coated plate and dried.
  • Fig. 7 (c) shows the condition when the condition is 37 ° C for 30 minutes.
  • Fig. 7 (c) shows the amount of photosensitive composition VI-1 applied to the collagen-coated plate at 10 L, and the drying condition is 60 ° C for 30 minutes.
  • the figure shows the condition after 10L of photosensitive composition VI-1 was applied to a collagen-coated plate and the drying condition was 60 ° C for 15 hours, after being immersed in a phosphate buffer solution for 21 days.
  • the hydrophilic film on the bottom surface of each well did not change in surface shape before and after immersion, and the film did not peel or collapse due to swelling, and the shape 'structure was stable. From this, the hydrophilic coating provided on the bottom surface of each well in the cell culture container obtained by the production method according to the present invention has resistance and functions in a short-term to long-term culture operation. We were able to confirm that it could be maintained.

Abstract

生化学実験・臨床実験・薬剤の開発研究などで好適に使用できる細胞培養容器を提供する。 細胞を培養する領域となる凹状区画（ウェル）を複数個備えた細胞培養容器本体１の該ウェルの底面に、親水性感光性組成物を塗布して塗膜３を形成した後、前記塗膜３をパターン露光及び現像して未硬化領域を除去することにより、前記ウェルの底面にパターン状の光硬化物からなる親水性被膜が設けられた細胞培養容器を得る。

Description

明 細 書
細胞培養容器の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、生化学実験 ·臨床実験 ·薬剤の開発研究などで好適に使用できる細胞 培養容器の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 生化学実験 ·臨床実験 ·薬剤の開発研究の分野にぉ 、て、様々な細胞培養容器が 使用されている。例えば、スライドガラスやカバーガラス、プラスチック性の平板上に、 細胞接着抑制層を形成あるいは細胞接着抑制層をパターン状に形成する試みが多 くなされている。ここで、平板状の基板上に、細胞接着抑制層として水溶性高分子を 主体とした光感光性組成物のパターン状の光硬化物を形成した細胞培養容器が提 案されている（特許文献 1参照)。この技術によると、基板に感光性組成物をスピンコ ートで塗布するなど、平板基板を使用することで生産性が高く精度の高いパターンを 容易に得ることができる。
[0003] し力しながら、一般に平板上にパターンが構築された基板を生化学実験 ·臨床実験 •薬剤の開発研究の分野等で細胞培養用に使用する場合には、その基板を培養用 容器の一種であるディッシュの表面に接着した後ディッシュに細胞含有水溶液を入 れる工程、又は、その基板を細胞含有水溶液の入っている培養用ディッシュに沈め る工程が必要であり、前者は、接着する作業が煩雑なだけでなく使用した接着剤によ つてはそこ力も溶出してくる化合物が細胞に悪影響を与える傾向があるという問題が ある。また、後者は、沈めた基板のパターン構築された表面だけでなぐ裏面に細胞 が回りこむという問題がある。
[0004] 特許文献 1 :特開 2005— 280076号公報 (請求項 9、段落番号 [0093]、 [0094]等 )
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明はこのような事情に鑑み、生化学実験 ·臨床実験'薬剤の開発研究などで好 適に使用できる細胞培養容器の製造方法を提供することを課題とする。 課題を解決するための手段
[0006] 上記課題を解決する本発明の第 1の態様は、細胞を培養する領域となる凹状区画
(ゥエル)を複数個備えた細胞培養容器本体の該ゥエルの底面に、親水性感光性組 成物を塗布して塗膜を形成した後、前記塗膜をパターン露光及び現像して未硬化領 域を除去することにより、前記ゥエルの底面にパターン状の光硬化物力 なる親水性 被膜が設けられた細胞培養容器を得ることを特徴とする細胞培養容器の製造方法に ある。
[0007] 本発明の第 2の態様は、前記親水性感光性組成物が、水溶性高分子の主鎖と光 架橋性の感光基とを有する感光性榭脂を含有することを特徴とする第 1の態様に記 載の細胞培養容器の製造方法にある。
[0008] 本発明の第 3の態様は、前記パターン露光を行う際に、前記ゥエル内に挿入される 凸部を有すると共に該凸部の前記ゥエルの底面に対向する先端部に所望のパター ンを有するマスクを使用し、前記先端部を前記ゥエルに装着し、前記先端部を前記 塗膜に密着又は近接させた状態で露光することを特徴とする第 1又は 2の態様に記 載の細胞培養容器の製造方法にある。
発明の効果
[0009] 本発明の細胞培養容器の製造方法によれば、細胞を培養する領域となるゥエルを 複数個備え、このゥエルの底面にパターン状の細胞接着抑制層が形成されている細 胞培養容器を容易に製造することができ、この細胞培養容器は生化学実験 ·臨床実 験'薬剤の開発研究などで好適に使用できるという効果を奏する。 図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を示す図である。
[図 2]本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を示す図である。
[図 3]マスクの具体例を示す図である。
[図 4]本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を示す図である。
[図 5]本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を示す図である。
[図 6]実施例 11で用いたマスクの概略を示す図である。 [図 7]試験例の結果を示す図である。
符号の説明
[0011] 1 細胞培養容器本体
2 ゥエル
3 塗膜
4 ホール
5 パターン
10、 20 マスク
11 マスク本体
12 凸部
13 先端部
14 パターン
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、本発明について詳細に説明する。
[0013] 本発明の細胞培養容器の製造方法は、細胞を培養する領域となる凹状区画 (ゥ ル)を複数個備えた細胞培養容器本体のゥエルの底面に、親水性感光性組成物を 塗布して塗膜を形成した後、この塗膜をパターン露光及び現像して未硬化領域を除 去することにより、ゥエルの底面にパターン状の光硬化物力もなる親水性被膜が設け られた細胞培養容器を得るものである。
[0014] 細胞培養容器本体は複数のゥエルを有するものであればよぐ例えば、従来から広 く使用されているゥエルの個数力 ½個、 12個、 48個、 96個又は 384個などのマルチ ゥエルプレート、具体例としては、市販されているゥ ル（直径： 7mm、深さ：約 12mm ) 96個を備えたマルチウエルプレート（縦： 75mm、横： 115mm)などを使用すること ができる。
[0015] また、細胞培養容器本体の材質は特に限定されな!、が、培養中の細胞の挙動を観 察するためには少なくともゥ ルの底面が無色透明又は無色透明に近 、ものである ことが好ましい。この観点から、プラスチック、ガラスなどが好ましぐ塩化ビニル、ポリ スチレン、ポリプロピレン、アクリル系などのプラスチックが特に好ましい。なお、ゥエル の底面に親水性被膜を形成する際に露光プロセスを使用して!/ヽるので、ゥエル側面 力 の光の散乱等を抑制する観点からは、ゥエルの側面が着色して 、る細胞培養容 器本体が好ましい。
[0016] さらに、本発明で使用する細胞培養容器本体は、表面が修飾されたものであっても よい。表面を修飾する方法は公知の方法でよぐ例えば、表面のプラズマ処理による 親水化処理ポリスチレンや、ポリ L リジン、ラミニン、フイブロネクチン、コラーゲン などの生理活性物質コート処理プレートなどが挙げられる。
[0017] 細胞培養容器本体のゥエルに塗布する親水性感光性組成物は、親水性感光性榭 脂を含有することが好ましい。親水性感光性榭脂は、その光硬化物が細胞の接着を 抑制することができる限り特に限定はないが、細胞の接着抑制能の発揮という観点か ら、主鎖骨格は水溶性高分子でこの水溶性高分子に光架橋性の感光基を側鎖とし て又は主鎖末端基として導入した感光性榭脂であることが好ましい。なお、低分子量 の光架橋剤など、低分子量の感光性化合物を含有した親水性感光性組成物を使用 すると、未反応の低分子量の感光性化合物が残存して後の細胞培養時に溶出し、 自然な細胞挙動を阻害する要因になる可能性がある。し力しながら、この点を考慮し 残存物の影響がな 、細胞培養系、あるいは残存物の残存をゼロにできる管理が可 能であれば、低分子量の感光性化合物を使用することもできる。
[0018] 親水性感光性榭脂の主鎖骨格となる水溶性高分子としては、例えば、ポリエチレン グリコール、ポリビュルアルコールが挙げられる。また、水溶性高分子に導入される光 架橋性の感光基は、アジド基を有することが好ましい。アジド基を有する感光基として は、アジド安息香酸などが挙げられ、これらを例えばポリエチレングリコールの両末端 に導入したものを、親水性感光性榭脂として使用することができる。また、水溶性高 分子に導入される光架橋性の感光基としては、水溶性高分子への導入の容易さなど から、下記式（1)で示される感光基が好ましい。
[0019] [化 1]
Figure imgf000007_0001
N — R3
[0020] (Rは下記式（2)から選択される基、 Rは下記式（3)から選択される基であり、 R及
1 2 1 び Rの少なくとも一方は少なくとも 1個のアジド基を有する。 Rは、水素原子、アルキ
2 3
ル基、ァセタール基を有するアルキル基、ァリール基、ァラルキル基、又は塩基性窒 素を含有する置換基であり、好ましくは、水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、ァセ タール基を有するアルキル基、ァリール基、ァラルキル基、又は塩基性窒素を含有す る置換基である。 )
[0021] [化 2]
Figure imgf000007_0002
[0023] 上記式（1)の具体例としては、下記表 1に示す構造（1) 1〜（1) 15を挙げるこ とができる。これらの構造は、上記式（1)において置換基 R〜Rに表 1に示される置 換基を有する。例えば、構造 (1) (1)— 4は Rとしてアジド基を有し、（1)— 5は
R及び R共にアジド基を有する。特に、 Rが下記式 (4)で、 Rが下記式（5)である とが好ましい
[0024] [化 4]
Figure imgf000008_0001
[0025] [表 1]
Figure imgf000009_0001
このような親水性感光性榭脂を製造する方法は特に限定されず公知の方法で製造 すればよい。例えば、上記式（1)で表される感光基を水溶性高分子に導入した親水 性感光性榭脂を製造する方法としては、アミノ基を側鎖、あるいは末端に有する水溶 性高分子と、このアミノ基と結合して当該アミノ基と共に上記式（1)の構造を形成する 化合物とを反応させればょ 、。あるいはァセタール基とアミノ基とを共に有する化合 物のアミノ基と結合して当該アミノ基と共に上記式（1)の構造を形成する化合物を反 応させた後、残るァセタール基とヒドロキシ基を有する高分子を反応させてもよい。
[0027] アミノ基を有する水溶性高分子ある!/ヽはァセタールイ匕合物と結合してそのアミノ基と 共に上記式（1)の構造を形成する化合物としては、例えば、 4一（(4 アジドフエ- ル)メチレン）—2 フエ-ル— 1, 3—ォキザゾリン— 5—オン (光官能性ィ匕合物 1)、 4 — ( (4 アジドフエ-ル)メチレン一 2— (3 ピリジル） 1, 3—ォキザゾリン一 5—ォ ン）（光官能性化合物 2)、 2— (4 アジドフヱ-ル）—4— (3 ピリジルメチレン）— 1 , 3—ォキザゾリン 5 オン（光官能性化合物 3)、 2—（2—（4 アジドフエ-ル）ビ -ル）ー4一（3—ピリジルメチレン）—1, 3—ォキサゾリン 5—オン（光官能性化合 物 4)、 4一（4 アジドー 13ーメチルーシンナミリデン） 2 フエ-ルー 2—ォキザゾ リン— 5—オン (光官能性ィ匕合物 5)、 4— (4—アジド— /3—メチル—シンナミリデン） - 2- (3 ピリジル）ー2—ォキザゾリンー5 オン (光官能性ィ匕合物 6)など、公知文 献 (特開 2003— 292477号）に記載される感光基ユニットが挙げられる。なお、この 光官能性ィ匕合物は、前記公知文献に記載される方法で製造することができる。
[0028] 親水性感光性組成物は、通常、上記親水性感光性榭脂を溶媒に溶解させた溶液 である。溶媒は、親水性感光性榭脂を溶解でき、細胞培養容器本体に障害を与えな い限り特に限定されないが、水、水と相溶性のある有機溶媒、又はそれらの混合物が 好ましい。水と相溶性のある有機溶媒としては、例えば、エタノールなどのアルコール 類、ジメチルスルフォキシドなどが挙げられる。これらの中で水が特に好ましい。有機 溶媒を使用した場合には、細胞培養容器本体に悪影響を及ぼしたり、光硬化後の残 存溶媒が細胞に悪影響を及ぼす場合があるためである。
[0029] 親水性感光性組成物は、光硬化物を形成することを阻害しな！、範囲で添加物を含 有していてもよい。添加物としては、例えば感光性組成物の pHを調整するための酸 として、鉱酸、有機酸などを、塩基として、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、アンモ- ァ水溶液などを挙げることができる。また、塩強度を調整するための塩ィ匕ナトリウムな どの塩や、 pHを安定ィ匕させるためのリン酸緩衝液などの緩衝液、消泡剤なども添カロ することができる。 [0030] この親水性感光性組成物を露光すると、光架橋反応が起こり親水性の光硬化物と なる。本発明においては、ゥエルの底面に親水性感光性組成物を塗布して塗膜を形 成した後、この塗膜をパターン露光及び現像することにより、未硬化領域である未露 光領域を除去する。これにより、ゥエルの底面にパターン状の光硬化物力もなる親水 性被膜が設けられた細胞培養容器を得ることができる。
[0031] 細胞培養容器本体のゥエルの底面に親水性感光性組成物を塗布する方法は、ゥ エルの底面に実質的に均一に塗布することができる方法である限り特に限定されな い。例えば、所定量ピペット操作による分注により、あるいは定容量ディスペンサーを 使用して行うことが好ましい。また、感光性組成物を塗布する量はゥエルの容量により 適宜決めればよいが、細胞培養容器本体として例えば直径が 7mm、深さが 12mm 程度のゥエルを 96個備えた市販の 96穴マルチウエルプレートに塗布する場合、塗布 量は 5〜200 μ Lが好ましぐ 5〜50 μ Lが特に好ましい。親水性感光性組成物の塗 膜の厚さは均一であることが好ましぐ塗膜の厚さは、 5ηπ！〜 10 /z m程度が好ましい 。膜厚が 5nm未満では、均一に膜形成されているかを確認することが容易ではなぐ また、膜厚が 10 mを超えるものを作成する場合は、感光性組成物の溶液の粘度を 高くすることが必要となり、塗布工程上の問題が発生しやすくなるためである。
[0032] なお、感光性組成物を塗布して塗膜を形成した後、露光を行う前に、必要に応じて 加熱処理を行ってもよい。加熱処理条件は、細胞培養容器や親水性感光性組成物 に悪影響を及ぼさない条件である限り特に限定されないが、通常は 4〜70°Cで 1分 〜24時間程度、好ましくは 20〜40°Cで 5分〜 1時間程度である。
[0033] この親水性感光性組成物の塗膜のパターン露光は、従来公知のパターン露光手 段で行えばよぐ通常は、所望のパターンを有するマスクを使用する。所望のパター ン状の光硬化物を構築させるためのマスクとして、所望の光硬化物のパターンに対 応する領域が露光する光を透過し、その領域以外の領域が露光する光を透過しな ヽ マスクを使用することが好ましい。例えば、露光する光を透過する材質、例えば、ガラ ス、石英、ポリメチルメタタリレートなどからなるマスク本体に、ェマルジヨンマスクゃク ロムをパターン形状に蒸着させたクロムマスクを使用することができる。
[0034] パターンを有するマスクの大きさは、ゥエルの底面の面積より小さくてもよぐこの場 合、塗膜上に各々独立に配置することになる。また、ゥエルの底面の面積より大きぐ ゥ ル内に挿入される凸部を有すると共にこの凸部のゥ ルの底面に対向する先端 部に所望のパターンを有するマスクを使用してもよぐこの場合、マスクの先端部を各 ゥエルに装着し、この先端部を塗膜に密着又は近接するように配置する。ゥエル底面 の面積より大き 、マスクを使用する方力 生産性がょ 、ため好まし 、。
[0035] このようなマスクを使用して塗膜をパターン露光する際には、マスクを塗膜に密着さ せて配置する、マスクを塗膜の上に塗膜に対し不活性な液体層を介して近接配置す る、又は、マスクを塗膜の上に気体層を介して近接配置することが好ましい。マスクを 塗膜に密着又は近接させると、露光する光の干渉が抑制されるため、パターン露光 を所望の特定領域に限定して行うことができ、現像後に特に優れたパターン状の親 水性硬化被膜を形成することができるためである。このようにマスクを配置した場合、 マスクの塗膜とは反対側から露光を行う。また、塗膜が形成された細胞培養容器本体 が透明の場合には、細胞培養容器本体の塗膜の設けられて ヽる側とは反対側の面 に、パターンを有するマスクを密着又は近接させて配置し、そのマスク側力 露光を 行うようにしてもよい。なお、マスクを塗膜に密着又は近接させる際のマスクの配置方 法は、マスクや塗膜を傷つけない限り特に限定されない。
[0036] 塗膜をパターン露光する際の光源は、親水性感光性組成物を感光させることが可 能な光源であれば特に限定されない。例えば、光源として X線、電子線、エキシマレ 一ザ一（F、 ArF、 KrFレーザーなど）及び固体紫外線レーザーをそれぞれ発生させ
2
る光源、メタルノ、ライドランプ、キセノンランプ、又は高圧水銀灯を使用することができ る。露光エネルギーは感光性の官能基の構造、使用する光源のエネルギーに応じて 適宜設定すればよぐ通常 0. ln3jZcm2〜5000mjZcm2であり、特に lmjZcm2
〜1000miZcm2程度が好ましい。
[0037] なお、必要に応じて露光後加熱処理を行ってもよ!、。この加熱処理の条件は、感光 性組成物を塗布した後露光する前に適宜行う加熱処理の条件と同様でよい。
[0038] 現像液を使用し現像により未硬化領域を除去してパターン状の光硬化物を形成す る方法は、未硬化領域の塗膜を溶解することができる方法であれば特に限定されな い。好適な方法としては、露光後の細胞培養容器本体ごとを現像液に浸漬する方法 、細胞培養容器本体に現像液を塗付もしくはスプレーする方法などを挙げることがで きる。例えば露光後の細胞培養容器を現像液に浸漬する方法では、現像液槽に 1分 間浸漬することで良好なパターン状の光硬化物を得ることができる。現像によりバタ ーン状の光硬化物を形成した後に、必要に応じてリンスを行ってもよい。
[0039] 現像する際の現像液につ!ヽては、未硬化領域と硬化領域との溶解度差を十分に 有しており、細胞培養容器に変性などの悪影響を与えない限り特に限定されない。 感光性組成物塗膜の未硬化領域を溶解できる溶媒としては、水や、水と相溶性のあ る有機溶媒、あるいはその混合溶液等を使用することができる。水と相溶性のある有 機溶媒の非限定的な例として、エタノールなどのアルコール類、ジメチルスルフォキ シド等などが挙げられる。これらの中で水が特に好ましい。親水性感光性組成物の溶 媒と同様に、有機溶媒の残存による細胞への影響が無いからである。これらの溶媒を 使用すると、現像残りの無いパターンを作製することができる。また、現像液は上述し たように混合溶液としてもよぐその濃度は未硬化領域を溶解することができる限り特 に限定的ではないが、例えば、現像液が水とエタノールとの混合溶液であれば、エタ ノールの含有割合力 ^重量％より大きく 100重量％未満の任意の値をとることができ る。
[0040] 現像後乾燥する工程は、現像液を除去することができる限り特に限定されないが、 恒温乾燥機、ホットプレート、エアドライヤーなどを使用することができる。恒温乾燥機 を使用して一定温度で乾燥することが好ましい。乾燥の条件は、通常は 30〜70°Cで 1分〜 24時間程度、好ましくは 30〜40°Cで 3分〜 1時間程度である。
[0041] このように簡単な方法で、ゥエルの底面にパターン状の光硬化物力 なる親水性被 膜が設けられた細胞培養容器を製造することができる。なお、本発明の製造方法で 製造される細胞培養容器はそのまま生化学実験 ·臨床実験 ·薬剤の開発研究の細胞 培養容器として使用することができ、一般に平板上にパターンが構築された基板を細 胞培養用に使用する場合に必要な、基板を培養用容器の一種であるディッシュの表 面に接着した後ディッシュに細胞含有水溶液を入れる工程や基板を細胞含有水溶 液の入っている培養用ディッシュに沈める工程が不要である。従って、接着剤から溶 出してくる化合物が細胞に悪影響を与えるという問題や、沈めた基板のパターン構築 された面の裏面に細胞が回りこむという問題も生じない。
[0042] ゥエルの底面に形成されたこの親水性被膜は乾燥状態、溶液中の何れの環境下で も、安定にその構造を維持できる。乾燥状態、加湿状態においても十分にその構造 を維持することが可能であるのみならず、 37°C程度の水中又は水系溶媒中下にお いても、長期間、例えば 1日以上、さらに 10日以上安定にその構造を維持する。溶 液下、特に水又は水と相溶性のある有機溶媒中下で安定に存在できることは重要で あり、特に細胞培養容器の各ゥエルの底面は乾燥状態や水溶液、さらには有機溶媒 溶液にさらされることがあり、そのどれにも耐性を有していることが求められるからであ る。ここで水系溶媒とは、水を含有している溶液であれば特に限定されない。水系溶 媒としては、例えば、エタノールなどのアルコール類、ジメチルスルフォキシドなど水と 相溶する有機溶媒と水との混合物、リン酸-水素カリウム 'リン酸水素-ナトリウム水 溶液、炭酸水素ナトリウム '炭酸ナトリウム水溶液などの緩衝液、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕 カリウム、塩ィ匕アンモ-ゥムなどの無機'有機塩水溶液、グルコース、ガラクトース、ブ ドウ糖、澱粉、へパリン、へパラン硫酸などの、単糖、多糖を含む糖類水溶液、タンパ ク質水溶液、 DNA、 RNA水溶液、液体培地、さらにはそれらの混合物を挙げること ができる。また水中又は水系溶媒中に溶解せず分散するものを含んでいてもよぐ例 えば、クレイなどの鉱物類、金ナノ粒子などの金属微粒子、ポリスチレンビーズ、ラテ ックス粒子などの高分子微粒子、動物細胞、植物細胞、微生物、ウィルスなどや、こ れらの混合物を挙げることができる。また、本発明で製造される細胞培養容器を使用 することができる温度は、細胞培養容器が変質'変形等悪影響を受けない限り特に 限定されないが、通常は、— 80°C〜70°Cが好ましぐ特に好ましくは 20〜40°Cであ る。 70°Cを超えると感光性榭脂の感光基などが分解され光硬化物が安定に存在し 得なくなる可能性があるからである。
[0043] 本発明の製造方法で得られる細胞培養容器は、ゥエルの底面に、親水性被膜が設 けられた領域、すなわち細胞非接着性の領域と、細胞培養容器のゥ ルの底面が露 出している領域、すなわち細胞接着性の領域とが設けられているため、細胞をパター ン状に培養する用途など新しい培養系に使用するのに好適である。具体的には、細 胞を懸濁させた液体培地を本発明で得られる細胞培養容器のゥエルに入れると、ゥ エルの底面におけるパターン状の親水性被膜以外の領域に細胞を付着させることが できる。そのため、ゥエルの底面にてパターン状に細胞を培養することができる。なお 、親水性被膜のパターンの形状は、マスクの設計により、容易にホール、ドットあるい はストライプなど所望の形状とすることができる。また、本発明の細胞培養容器はゥェ ルを複数備えているので、必要に応じて、ゥエル間で互いに異なっている細胞を培養 することが可能であり、細胞培養に関係した各種の評価'研究開発を行う上で、好都 合である。さらには、細胞培養に日常的に多く使用されているマルチウエルプレート の上にパターンを形成できることから、従来から多く導入されて 、るマルチウエルプレ ート用の機器、例えばィムノリーダーなどの蛍光測定機や多量のマルチウエルプレー トを一度に処理できる自動培地交 などが、そのまま使用できるという効果を奏す る。
[0044] 以下、本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を、図 1〜5を使用して 説明する。図 1 (a)は細胞培養容器本体の上面図、図 1 (b)は図 1 (a)の A— 矢視 断面図、図 2 (a)はゥエルの底面に親水性感光性組成物の塗膜を形成した細胞培養 容器本体の上面図、図 2 (b)は図 2 (a)の A— 矢視断面図、図 3はマスクの断面図 、図 4はマスクを親水性感光性組成物の塗膜を形成した細胞培養容器本体に配置し た状態を示す断面図、図 5 (a)は製造された細胞培養容器の上面図、図 5 (b)は図 5 (a)の A— 矢視断面図である。
[0045] 図 1に示すように、細胞培養容器本体 1はゥエル 2を 6個有する。この細胞培養容器 本体 1の各ゥエル 2の底面に、図 2に示すように、水溶性感光性組成物を塗布して塗 膜 3を形成する。次に、図 3に示すマスク 10を用いて塗膜 3をパターン露光する。マス ク本体 11は透明な材料で作成されており、図 3に示すように、ゥエル 2内に挿入され る円柱状の凸部 12を有すると共に、円柱状の凸部 12のゥエル 2の底面に対向する 先端部 13、すなわち塗膜 3が形成された面に対向する先端部 13に、クロム蒸着によ り形成され光を透過しないドットが 16個形成されたパターン 14を有する。図 4に示す ように、このマスク 10の先端部 13をゥエル 2に装着し、先端部 13を塗膜 3に密着又は 近接させた状態で、マスク 10の上部力も露光することにより、塗膜 3をパターン露光 する。露光された領域は架橋して硬化するので、未露光領域を現像して除去すること により、図 5に示すように、ゥエル 2の底面に親水性感光性組成物の光硬化体からな る被膜にドット状のホール 4を有するパターン 5 (請求項の「パターン状の光硬化物」 に相当する）が形成される。
実施例
[0046] 以下、本発明について実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何 ら限定されるものではない。
(合成例 1 )感光性榭脂 Aの合成
ポリエチレングリコールジァミン（日本油脂 (株)製、数平均分子量 1000) 7. 9g、光 官能性化合物 4 (2— (2- (4 アジドフエ-ル）ビュル） 4一（3 ピリジルメチレン） —1, 3—ォキサゾリン一 5—オン）を 10. Og (ポリエチレングリコールジァミンのァミノ 基に対して 2. 0倍モル当量）、テトラヒドロフラン (THF) 70gを混合して、 25°Cで 18 時間反応させた。反応終了後、 THFをエバポレートして除去し、その後水 50g、酢酸 ェチル 50gを添加して分液抽出操作を行った。有機層を捨て、新たに酢酸ェチルを 50g添加して再度分液抽出操作を行い、静置後三相に分かれた一番下相のオイル 相を得た。このオイル相を凍結乾燥することにより、下記式 (a)で表され n= 23の感 光性榭脂 A7. 2gを得た。得られた感光性榭脂 Aを1 H—NMR測定したところ、 3. 5p pmに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、 6. 8ppmから 8. 7ppmに見られる光官能性ィ匕合物 4に由来する芳香環のプロトンピークにより目的 の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性ィ匕合物 4の導入率は 95%であった。
[0047] [化 5]
Figure imgf000016_0001
[0048] (合成例 2)感光性榭脂 Bの合成
ポリエチレングリコールジァミン（日本油脂 (株)製、数平均分子量 2000) 7. 9g、光 官能性化合物 4 (2— (2- (4 アジドフエ-ル）ビュル） 4一（3 ピリジルメチレン） —1, 3—ォキサゾリン一 5—オン）を 6. Og (ポリエチレングリコールジァミンのアミノ基 に対して 2. 4倍モル当量）とした他は、合成例 1と同様の操作を行い、分液抽出操作 で水相を有機相で 2回洗浄した後、水相を凍結乾燥することにより、上記式 (a)で表 され n=45の感光性榭脂 Bを 7. Og得た。得られた感光性榭脂 Bを1 H— NMR測定し たところ、 3. 5ppmに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと 、 6. 8ppmから 8. 7ppmに見られる光官能性ィ匕合物 4に由来する芳香環のプロトン ピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性ィ匕 合物 4の導入率は 96%であった。
[0049] (合成例 3)感光性榭脂 Cの合成
ポリエチレングリコールジプロピルァミン (和光純薬工業 (株)製、数平均分子量 9, 0 00〜： L0, 000) 23. 7g、光官能性化合物 4 (2—（2—（4 アジドフヱ-ル）ビュル） 4ー（3—ピリジノレメチレン）ー1, 3—ォキサゾリンー5 オン）を 4. Og (ポリエチレン グリコールジプロピルァミンのアミノ基に対して 2. 4倍モル当量）、テトラヒドロフラン 6 5g、ァセトニトリル 65gを混合した他は、合成例 1と同様の操作を行い、下記式 (b)で 表され n= 216の感光性榭脂 Cを 23. 2g得た。得られた感光性榭脂 Cを1 H— NMR 測定したところ、 3. 5ppmに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピ ークと、 6. 8ppmから 8. 7ppmに見られる光官能性化合物 4に由来する芳香環のプ 口トンピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能 性ィ匕合物 4の導入率は 90%であった。
[0050] [化 6]
Figure imgf000017_0001
[0051] (合成例 4)感光性榭脂 Dの合成
ポリエチレングリコールジァミン（日本油脂 (株)製、数平均分子量 2000) 17. 2g、 光官能性化合物 3 (2— (4 アジドフエ-ル）—4— (3 ピリジルメチレン）— 1, 3— ォキザゾリン 5 オン）を 6. Og (ポリエチレンダリコ一ルジァミンのアミノ基に対して 1 . 2倍モル当量）とした他は、合成例 1と同様の操作を行い、下記式 (c)で表され n=4 5の感光性榭脂 Dを 19. 7g得た。得られた感光性榭脂 Dを1 H— NMR測定したとこ ろ、 3. 5ppmに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、 6. 8 ppm力も 8. 7ppmに見られる光官能性ィ匕合物 3に由来する芳香環のプロトンピーク により目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性ィ匕合物 3 の導入率は 70%であった。
[0052] [化 7]
Figure imgf000018_0001
[0053] (合成例 5)感光性榭脂 Eの合成
ポリエチレングリコールジァミン（日本油脂 (株)製、分子量 2000) 15. lg、光官能 性化合物 6 (4— (4 アジド— 13—メチル—シンナミリデン） - 2- (3 ピリジル）—2 ォキザゾリン 5—オン）を 6. Og (ポリエチレンダリコ一ルジァミンのアミノ基に対し て 1. 2倍モル当量）とした他は、合成例 1と同様の操作を行い、下記式 (d)で表され n =45の感光性榭脂 Eを 18. 4g得た。得られた感光性榭脂 Eを1 H— NMR測定したと ころ、 3. 5ppmに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、 6. 8ppmから 8. 7ppmに見られる光官能性ィ匕合物 6に由来する芳香環のプロトンピーク により目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性ィ匕合物 6 の導入率は 71%であった。
[0054] [化 8]
Figure imgf000019_0001
[0055] (合成例 6)感光性榭脂 Fの合成
ポリビュルアルコール (EG— 30、 日本合成化学工業 (株)製） 50gを水 450gに溶 解し、これに、特開 2003— 292477号公報の合成例 5に従い合成した光官能性ィ匕 合物（2—（3—（4 アジドフエ-ル）プロプー 2 エノィルァミノ） N— (4, 4，ージメ トキシブチル）— 3— (3 ピリジル）プロプ— 2 ェンアミド）を 3. 5g、燐酸 1. 5gを加 え、 60°Cで 24時間反応した。ァセタールイ匕は 97%であった。燐酸をイオン交換処理 により除去し、感光基が PVAのヒドロキシ基に対し 0. 8mol%導入された感光性榭脂 Fを調製した。
[0056] (合成例 7)感光性榭脂 Gの合成
ポリビュルアルコール (EG 30、 日本合成化学工業 (株)製） lOOgを水 700g、メタ ノール 200gに溶解し、これに、特開 2003— 292477号公報の合成例 1に従い合成 した光官能性化合物（3— (4—アジドフエ-ル) N— (4, 4'ージメトキシブチル) 2 フエ-ルカルポ-ルァミノプロパー 2 ェンアミド）を 10g、燐酸 3gをカ卩え、 60°Cで 24時間反応した。ァセタールイ匕は 97%であった。燐酸をイオン交換処理により除去 し、感光基が PVAのヒドロキシ基に対し 0. 8mol%導入された感光性榭脂 Gを調製 した。
[0057] (合成例 8)感光性榭脂 Hの合成
ポリビュルアルコール (EG 30、 日本合成化学工業 (株)製） lOOgを水 900gに溶 解し、これに、特開 2003— 292477号公報の合成例 3に従い合成した光官能性ィ匕 合物（3— (4 アジドフエ-ル） N— (4, 4，—ジメトキシブチル）—2— [ (3 ピリジ ル）カルボ-ルァミノ]—プロパー 2 ェンアミド）を 10g、燐酸 3gを加え、 60°Cで 24時 間反応した。ァセタールイ匕は 97%であった。燐酸をイオン交換処理により除去し、感 光基が PVAのヒドロキシ基に対し 0. 8mol%導入された感光性榭脂 Hを調製した。
[0058] (合成例 9)感光性榭脂 Iの合成
下記式 (e)の各繰り返し単位を有し、主鎖の両末端がヒドロキシル基であるアミノ基 導入ポリエチレングリコール（日本油脂 (株)製、分子量 3200、平均の繰り返し単位 数 x= 3. l、y=60. 0) 0. 5g、前述の光官能性ィ匕合物 4 (2—（2—（4 アジドフエ- ル）ビュル）一 4— (3 ピリジルメチレン）一 1, 3—ォキサゾリン一 5—オン）を 0. 2g ( ポリエチレングリコール誘導体のアミノ基に対して 1. 5倍モル当量）、テトラヒドロフラ ン (THF) 7gを混合して、 25°Cで 19時間反応させた。反応終了後、 THFを減圧下 で除去し、その後水 7g、酢酸ェチル 7gを添加して分液抽出操作を行った。有機層を 捨て、新たに酢酸ェチルを 7g添加して再度分液抽出操作を行い、静置後水相を分 離した。この水相を凍結乾燥することにより、下記式 (f)の各繰り返し単位を有し、主 鎖の両末端がヒドロキシル基で、それぞれ平均の繰返し単位数は m= 3. 0、 n=60. 0、 p = 0. 1の感光性榭脂 Iを 0. 6g得た。得られた感光性榭脂 Iを1 H— NMR測定し たところ、 3. 5ppmに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと 、 6. 8ppmから 8. 7ppmに見られる光官能性ィ匕合物 4に由来する芳香環のプロトン ピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より mZ (m+n) は 0. 048であった。
[0059] [化 9]
(e)
Figure imgf000020_0001
[0060] [化 10]
Figure imgf000021_0001
[0061] (感光性組成物 Iの調製）
合成例 1で得られた感光性榭脂 Aを、塩酸で pH3に調製した水に対して固形分総 重量が表 2になるように混合した。得られた水溶液を 0. 45 mセルロースアセテート メンブレンフィルター（以下「フィルター」という）でろ過することにより、感光性組成物 I — 1を得た。
[0062] (感光性組成物 11(11 1〜11 4)〜IXの調製）
使用した感光性榭脂及び固形分総重量を表 2又は表 3に従 、、 pH3に調整した水 の代わりに純水を用いた以外は感光性組成物 Iの調製と同様にして、感光性組成物 I I〜IXを得た。
[0063] (実施例 1)
汎用マルチウエルプレートの基材として、ポリスチレン製 96穴マルチウエルプレート 平底タイプ (住友ベークライト（株）社製：商標「スミロンマルチプレート 96F」、 0. 32c m2Zゥヱル以下「ノンコート榭脂プレート」という。）を使用した。調製した感光性組成 物 1—1を、塗布量がそれぞれ 10 Lとなるように各ゥエル内にピペットで分注して、ゥ エル内に存在させた。その後、 60°Cに設定した恒温乾燥機内に静置して、 30分間 放置し、各ゥエル内に感光性組成物 I— 1の塗膜を得た。
[0064] 得られた各ゥエル内の塗膜上に、 4mm口（縦 4mm X横 4mm)内〖こ 150 μ ΐη φドッ トパターン (ドット数は 169。各ドットはクロム蒸着により形成されたもの。）が施された マスク (材質:石英)を、吸着ピンセットを使用することにより設置し、高圧水銀灯によ つてマスクを介して露光（lOOOmjZcm2)を行った。その露光処理により、塗膜のうち 露光された部分だけが光硬化した。その後水浴中にマルチウヱルプレートを浸漬し、 25°C、 1分間現像を行った後、 60°Cで 10分間乾燥を行い、 96穴マルチウエルプレ ートの各ゥエルの底面上に、前記ドットパターンに対応したドット状ホールの群を有す る感光性組成物 1-1の光硬化物が設けられた細胞培養容器を得た。なお、感光性組 成物の塗布量を 50 L及び 100 Lにしたものについても同様の操作を行い、それ ぞれ細胞培養容器を得た。
[0065] (実施例 2〜9)
使用した感光性榭脂、ゥエル内に存在させる各塗布量及び露光量を表 2又は表 3 に従った以外は、実施例 1と同様の操作を行い、 96穴マルチウエルプレートの各ゥェ ルの底面上に、前記ドットパターンに対応したドット状ホールの群を有する感光性組 成物の光硬化物が設けられた細胞培養容器を得た。なお、感光性組成物 Π— 1〜11 —4及び VI— 1〜VI— 4については、乾燥条件を、 60°C 1時間、 60°C 15時間、 37°C 30分及び 37°C 1時間としたものについても行った。また、感光性組成物 II— 1〜Π— 4及ひ 1 1〜¥1—4にっぃては、汎用ゥエルプレートの基材として、コラーゲン I型が コーティングされているポリスチレン製コラーゲン I型コーティング 96ゥエルプレート平 底タイプ (住友ベークライト (株)社製：商標「スミロンセルタイト C— 1プレート 96F」 0 . 32cm2Zゥエル。以下「コラーゲンコートプレート」という。）、ガラス製 96ゥエルプレ ート平底タイプ（日本板硝子 (株)製。以下「ノンコートガラスプレート」という。）、及び、 表面にアミノ基を有するアミノシランコート付ポリスチレン製 96ゥエルプレート平底タイ プ（住友ベークライト（株）製：商標「スミロンセルタイト PLプレート 96F」 0. 32cm2Zゥ エル。以下「APSコート榭脂プレート」という。）を使用してそれぞれ上記乾燥条件及 び表 3の条件下でも行った。
[0066] [表 2] 組成物名 感光性樹脂 露光量 塗布量 L )
名称 里里 mj/ cm " 実施例 1 1- 1 感光性樹脂 A 2. 5 100 50 10 1000 実施例 3 I I I- 1 感光性樹脂 2. 5 100 50 10 1000 実施例 4 IV-1 感光性樹脂 D 1. 0 100 50 10 1000 実施例 5 V -1 感光性榭脂 E 2. 5 100 50 10 1000 実施例 7 VI I-1 感光性樹脂 G 1. 0 100 50 10 15 実施例 8 VI I I- 1 感光性樹脂 H 0. 5 100 50 10 15 実施例 9 IX- 1 感光性樹脂 I 1. 0 100 50 10 100
[0067] [表 3]
組成物名 感光性樹脂 露光量 塗布量（μ L )
名称 am /。 mj/ cm' 実施例 2 II-1 感光性樹脂 B 2. 5 100 50 15 10 5 1000
II- 2 感光性樹脂 B 1. 0 100 50 15 10 5 1000
II- 3 感光性樹脂 B 0. 5 100 50 15 10 5 1000
II-4 感光性樹脂 B 0, 2 100 50 15 10 5 1000 実施例 6 VI- 1 感光性樹脂 F 2. 5 100 50 15 10 5 15
VI- 2 感光性樹脂 F 1. 0 100 50 15 10 5 15
VI- 3 感光性樹脂 F 0. 5 100 50 15 10 5 15
VI-4 感光性樹脂 F 0. 2 100 50 15 10 5 15
[0068] (実施例 10)
汎用マルチウエルプレートの基材として、ポリスチレン製 12穴マルチウエルプレート 平底タイプ (住友ベークライト（株）社製：商標「スミロンマルチプレート 12F」、 3. 6cm 2Zゥエル)を使用した。実施例 2で調製した、感光性組成物 Π- 1を各ゥエル内に分 注して、 100 L塗布量を各ゥエル内に存在させた。その後、 60°Cに設定した恒温 乾燥機内に静置して、 30分間放置し、各ゥ ル内に感光性組成物 Π—1の塗膜を得 た。
[0069] 得られた各ゥエル内の塗膜上に、 10mm口（縦 lOmm X横 10mm)内に 150 /z m φドットパターン (ドット数 900。各ドットはクロム蒸着により形成されたもの。）が施され たマスク (材質:石英)を、吸着ピンセットを使用することにより設置し、高圧水銀灯に よってマスクを介して露光（lOOOmjZcm2)を行った。その露光処理により、塗膜のう ち露光された部分だけが光硬化した。その後水浴中にマルチウエルプレートを浸漬 し、 25°C、 1分間現像を行った後、 60°Cで 10分間乾燥を行い、 96穴マルチウエルプ レートの各ゥエルの底面上に、前記ドットパターンに対応したドット状ホールの群を有 する感光性組成物 π-iの光硬化物が設けられた細胞培養容器を得た。
[0070] (実施例 11)
4mm口内に 150 /ζ πι φドットパターンが施されたマスクを用いる代わりに、図 6に示 すマスクを使用し、感光性組成物 Π-1〜Π- 4を使用した以外は、実施例 1と同様の操 作を行い、 96穴マルチウエルプレートの各ゥエルの底面上に、ドットパターンに対応 したドット状ホールの群を有する感光性組成物 Π-1〜Π-4の光硬化物が設けられた 細胞培養容器を得た。なお、図 6 (a)は、実施例 11で用いたマスクの上面図であり、 図 6 (b)は図 6 (a)の凸部の先端部の一部を拡大した図、図 6 (c)は図 6 (a)の A— 矢視断面図である。図 6に示すように、マスク 20は、 115mm X 75mmの平板基板（ 材質：石英） 21上に 6mm φで 11. 6mmの高さを有する円柱（材質：石英） 22力 6 本マルチウエルプレートの各ゥエルの配置に対応して構築されており、その円柱 22の 先端部（頂部） 23に 100 μ τη φドット 24の群力もなるパターン（ドット 24の数は 135で 、各ドット 24はクロム蒸着により形成されたもの。）が施されている。
[0071] (実施例 12)
前記 4mm口内に 150 /ζ πι φドットパターンが施されたマスクを使用する代わりに、 1 15mm X 75mmの平板基板（材質：石英）上に 100 m φドットパターン（ドット数 16 9。各ドットはクロム蒸着により形成されたもの。）が施されたマスク (材質:石英)を使 用し、 96穴マルチウエルプレート裏面に密着させ裏面力も露光した以外は、実施例 1 と同様の操作を行い、 96穴マルチウエルプレートの各ゥエルの底面上に、ドットパタ ーンに対応したドット状ホールの群を有する感光性組成物 Π-1〜Π-4の光硬化物が 設けられた細胞培養容器を得た。
[0072] (試験例)溶媒暴露試験
実施例 1〜12で得られた各細胞培養容器について、各ゥエルに 25°C又は 37°Cの 水系溶媒を注入し、その後 3日経過した時点及び 21日経過した時点において、各ゥ エルの底面上の親水性被膜を観察して、親水性被膜の形状、ゥヱル底面力ゝらの剥離 の有無を調査した。なお、使用した水系溶媒は、純水又はリン酸-水素カリウム 'リン 酸水素-ナトリウム水溶液 (リン酸緩衝液、 pH7. 4)である。例示として、リン酸緩衝 液に 21日間浸漬した後の状態を図 7 (a)〜（d)に示す。図 7 (a)はコラーゲンコートプ レートに感光性組成物 II— 1を 5 μ L塗布し乾燥条件を 60°C30分としたもの、図 7 (b) はコラーゲンコートプレートに感光性組成物 Π— 1を 5 μ L塗布し乾燥条件を 37°C30 分としたもの、図 7 (c)はコラーゲンコートプレートに感光性組成物 VI— 1を 10 L塗 布量し乾燥条件を 60°C30分としたもの、図 7 (d)はコラーゲンコートプレートに感光 性組成物 VI— 1を 10 L塗布量し乾燥条件を 60°C15時間としたものを、リン酸緩衝 液に 21日間浸漬した後の状態である。
各ゥエルの底面上の親水性被膜は、浸漬前後で表面形状は変化が無く、また、膨 潤による被膜の剥離、または崩壊が起こっておらず、形状'構造が安定な状態であつ た。このことから、本発明に係る製造方法により得られた細胞培養容器における各ゥ エルの底面上に設けられている親水性被膜は、短期から長期までの培養操作におい て、耐性がありその機能を維持できることを確認することができた。

Claims

請求の範囲
[1] 細胞を培養する領域となる凹状区画 (ゥエル)を複数個備えた細胞培養容器本体の 該ゥエルの底面に、親水性感光性組成物を塗布して塗膜を形成した後、前記塗膜を ノターン露光及び現像して未硬化領域を除去することにより、前記ゥエルの底面にパ ターン状の光硬化物からなる親水性被膜が設けられた細胞培養容器を得ることを特 徴とする細胞培養容器の製造方法。
[2] 前記親水性感光性組成物が、水溶性高分子の主鎖と光架橋性の感光基とを有す る感光性榭脂を含有することを特徴とする請求項 1に記載の細胞培養容器の製造方 法。
[3] 前記パターン露光を行う際に、前記ゥエル内に挿入される凸部を有すると共に該凸 部の前記ゥエルの底面に対向する先端部に所望のパターンを有するマスクを使用し 、前記先端部を前記ゥエルに装着し、前記先端部を前記塗膜に密着又は近接させた 状態で露光することを特徴とする請求項 1又は 2に記載の細胞培養容器の製造方法
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