WO2007029554A1 - マイクロパターニング培養基板、マイクロパターニング培養構築物及びこれらの作成方法 - Google Patents

マイクロパターニング培養基板、マイクロパターニング培養構築物及びこれらの作成方法 Download PDF

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WO2007029554A1
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water
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micropatterning
culture
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Inventor
Kazunori Kataoka
Akihiro Hirano
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The University Of Tokyo
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the present invention relates to a micropatterning culture substrate used for micropatterning of cells, a micropatterning culture construct constructed using this micropatterning culture substrate, and methods for producing these.
  • a cell-based biosensor (CBB) using a cell as a probe is one of the tools for comprehensively evaluating the response of an organism to external stimuli. It is thought that the series of reactions can be efficiently analyzed, so various searches in combination with microchips such as searching for new differentiation-inducing factors in regenerative medicine and drug candidates in drug discovery are possible. Application to screening systems is expected.
  • the cell adhesion position and morphology on the microchip are appropriately controlled, and the functions of various cells in the living body can be controlled in a culture environment. It is necessary to maintain for a long time. Micropatterning of cells on a culture substrate is a very important issue in the practical application of cell sensors.
  • the inventors have heretofore made polyethylene glycol (PEG) that suppresses non-specific adsorption.
  • PEG polyethylene glycol
  • Hepatocyte spheroid array Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • the immobilized hepatocyte spheroids have been confirmed to maintain hepatocyte-specific functions in vitro for at least one month, and the constructed hepatocyte array may be applicable to drug screening.
  • Patent Document 1 Pamphlet of International Publication No. 03/010302
  • Non-patent literature l H. Otsuka, A. Hirono, Y. Nagasaki, T. Okano, Y. Horiike and K. Kataoka, ChemBioChem 5 (2004) 850-855
  • the present invention provides a micro patterning culture substrate capable of micro patterning cells by a simple method and a method for solving the problems.
  • the micropatterning culture substrate of the present invention is characterized by comprising a cell culture substrate and a water-soluble photocurable polymer patterned on the cell culture substrate.
  • the cell culture substrate is characterized by comprising a physiologically active substance.
  • the physiologically active substance is characterized by comprising an extracellular matrix constituent.
  • the extracellular matrix constituent component is a cell adhesion protein.
  • the water-soluble photocurable polymer has a phenyl azide group.
  • the method for producing a micropatterning culture substrate of the present invention comprises a water-soluble photocurable polymer coating step of coating a cell culture substrate with a water-soluble photocurable polymer, and the water-soluble photocurable polymer coating step. And a patterning step of patterning the water-soluble photocurable polymer on the cell culture substrate by irradiating the water-soluble photocurable polymer applied in step 1 through a mask pattern.
  • the cell culture substrate is characterized by comprising a cell adhesion protein.
  • the water-soluble photocurable polymer has a phenyl azide group.
  • the micropatterning culture construct of the present invention is characterized by comprising cells cultured on a cell culture substrate patterned with a water-soluble photocurable polymer.
  • the cell culture substrate has a cell adhesive protein strength.
  • the water-soluble photocurable polymer has a phenyl azide group.
  • the cell is characterized by comprising a first cell and a second cell cultured on the first cell to form a spheroid.
  • the first cell is an endothelial cell
  • the second cell is a hepatocyte
  • the method for producing a micropatterning culture construct of the present invention is characterized by comprising a culture step of culturing cells on a cell culture substrate patterned with a water-soluble photocurable polymer.
  • the cell culture substrate is characterized by comprising a cell adhesion protein.
  • the water-soluble photocurable polymer has a phenyl azide group.
  • the culturing step is cultivated in a first culturing step of culturing first cells on a cell culturing substrate patterned with a water-soluble photocurable polymer, and in the first culturing step. And a second culture step for culturing second cells that form spheroids on the first cells.
  • the first cell is an endothelial cell
  • the second cell is a hepatocyte
  • the biosensor of the present invention includes the micropatterning culture construct of the present invention. And features.
  • a water-soluble photocurable polymer is put on the cell culture substrate using a simple method called photolithography. By doing so, it becomes possible to perform micro patterning of cells in an environment of normal temperature and normal pressure with ease, high accuracy, and low cost.
  • FIG. 1 is a schematic view showing one embodiment of a micropatterning culture substrate of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing an example of a method for producing a micropatterning culture substrate of the present invention.
  • FIG. 3 Phase contrast after developing a substrate patterned with a compound having the structure of Chemical Formula 1 with water Micrograph ( a ) and after developing a substrate patterned with a compound having the structure of Chemical Formula 2 with water It is a phase contrast micrograph (b).
  • FIG. 4 A micrograph (a) showing the result of immunostaining on a substrate patterned with a compound having the structure of Chemical Formula 1 (a) and the result of immunostaining on a substrate patterned with a compound having the structure of Chemical Formula 2. It is a micrograph (b).
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing adhesion of hepatocytes on a substrate patterned with a compound having the structure of Chemical Formula 2.
  • FIG. 6 A micrograph (a) showing the result of examining the loss of liver parenchymal cells using a substrate not coated with collagen, and the result of examining the loss of liver parenchymal cells using a substrate coated with collagen. It is a micrograph (b) which shows a fruit.
  • the micropatterning culture substrate of the present invention comprises a cell culture substrate and a water-soluble photocurable polymer patterned on the cell culture substrate.
  • the water-soluble photocurable polymer used here is a polymer material that is used as a substrate-modifying material for patterning cells, and is cured by a crosslinking reaction when irradiated with ultraviolet light.
  • This water-soluble photocurable polymer is called a negative resist, and is irradiated with light through a mask pattern and cured without light irradiation. It is possible to perform patterning leaving a portion irradiated with light. This patterning is a technique widely used in a semiconductor process called optical lithography, and is extremely effective as a technique for easily creating a micropattern.
  • the photocurable polymer used in the present invention is water-soluble, water can be used instead of an organic solvent for cleaning after light irradiation, so the structure and function of the cell culture substrate coated on the substrate Will not be adversely affected.
  • water-soluble photocurable polymer those having cell non-adhesiveness are preferably used. This is because the cells are prevented from adhering onto the water-soluble photocurable polymer, and the cells are allowed to adhere only to the cell culture substrate and cultured.
  • water-soluble photocurable polymer those containing polybulal alcohol or polyethylene glycol as a main skeleton are preferably used.
  • a compound into which a group and a pyridine group are introduced can be suitably used.
  • Both of the compound having the structure of Chemical Formula 1 and the compound having the structure of Chemical Formula 2 have cell patterning ability.
  • the compound having the structure of ⁇ 2 has a wider range of cell types. It can be used more suitably because it exhibits extremely high cell non-adhesiveness.
  • the cell culture substrate is not limited to a specific substrate as long as it can culture cells, but in order to culture cells more reliably, a substrate made of a physiologically active substance is preferable. It is used well.
  • the physiologically active substance is not limited to a specific substance as long as it affects the activity of living organisms represented by cells and the like, but those having cell adhesiveness are preferably used, and particularly extracellular. Those composed of a cell adhesion protein which is one of matrix components are preferably used.
  • the cell adhesion protein is a general term for proteins that are easily adhered to cells, and is not limited, but preferably includes collagen, vitronectin, fibronectin, laminin and the like. Among these, collagen is particularly preferred because it is inexpensive, easily available, and has high cell adhesion.
  • the cell culture substrate may have a single-layer structure or a multilayer structure.
  • a multilayer structure it is preferable that at least one layer to which cells adhere is composed of bioactive substances.
  • the cell culture substrate may be coated on a substrate.
  • the substrate is not particularly limited as long as the cell culture substrate can be coated uniformly.
  • an acrylic substrate, a glass substrate, an amino group-introduced glass, or the like can be used.
  • the substrate is not limited to one having a planar structure, and substrates having various shapes can be used as necessary.
  • the shape and size of the region of the cell culture substrate exposed to the outside by patterning the water-soluble photocurable polymer is not limited to a specific shape or size, but cells are cultured in this region.
  • a small region such as a circle, a polygon or an ellipse having an area force of 000 to 200,000 ⁇ m 2 , preferably 1500 to 50,000 xm 2 is used.
  • the shape is most preferably circular, but in this case, the diameter of the small region is preferably 40 to 500 zm, and more preferably 50 to 200 zm.
  • a water-soluble photocurable polymer is patterned so that many small regions are formed and regularly arranged at regular intervals, it can be effectively used as a substrate for producing a cell sensor.
  • the distance of the combined small area is preferably 10 to 1000 ⁇ m, and more preferably 50 to 200 ⁇ m.
  • the arrangement pattern of the small areas is not limited to a specific pattern, but is preferably a square pattern or an equidistant grid pattern in which each is arranged at a vertex of a triangle.
  • a cell array can be constructed by culturing cells in a small region thus arranged.
  • FIG. 1 shows a schematic cross-sectional view on the left and a schematic top view on the right as an example of the micro patterning culture substrate of the present invention.
  • Reference numeral 1 denotes a substrate.
  • a layer of a cell culture substrate 2 is formed on the substrate 1, and a water-soluble photocurable polymer 3 is patterned on the cell culture substrate 2.
  • a water-soluble photocurable polymer 3 is patterned on the cell culture substrate 2.
  • circular regions with a diameter of 100 ⁇ m where the cell culture substrate 2 is exposed to the outside are regularly arranged in the vertical and horizontal directions with an interval of 100 ⁇ m. is doing.
  • the method for producing a micropatterning culture substrate of the present invention uses photolithography, and includes a water-soluble photocurable polymer coating step of coating a water-soluble photocurable polymer on a cell culture substrate, and the water-soluble polymer. And a patterning step of patterning the water-soluble photocurable polymer on the cell culture substrate by irradiating the water-soluble photocurable polymer applied in the photocurable polymer coating step with light through a mask pattern.
  • the mask pattern those usually used in photolithography can be used.
  • a quartz mask is preferably used.
  • a cell culture substrate coating step of coating the cell culture substrate on the substrate may be provided. If this cell culture substrate coating step is included, the water-soluble photocurable polymer coating step is applied, and the cell culture substrate coating step is applied to the cell culture substrate coating step. Apply photocurable polymer.
  • step 1 substrate 1 is prepared, and cell culture in step 2 is performed.
  • the cell culture substrate 2 is coated on the substrate 1 in the substrate coating step.
  • step 3 apply water-soluble photo-curable polymer, and apply water on cell culture substrate 2.
  • Step 4 and Step 5 are patterning processes.
  • the water-soluble photocurable polymer 3 is irradiated with light through the mask pattern 4.
  • the water-soluble photocurable polymer 3 that has not been cured without being irradiated with light is washed away with water to remove the water-soluble photocurable polymer 3 on the cell culture substrate 2. Patter Jung.
  • cell adhesion protein as a cell culture substrate, cells can be reliably adhered onto the cell culture substrate.
  • the micropatterned Jung culture construct of the present invention is constructed using the micropatterned culture substrate of the present invention, and a cell cultured on a cell culture substrate patterned with a water-soluble photocurable polymer. It is provided. That is, the cells are cultured on the cell culture substrate exposed to the outside after the water-soluble photocurable polymer is removed by photolithography. Further, this cell may be a single type of cell or may be composed of a plurality of types of cells.
  • the cell may be composed of a first cell and a second cell cultured on the first cell to form a spheroid.
  • the second cell used here is not limited to a specific cell as long as it forms a spheroid by co-culture with the first cell described later.
  • Examples include cells, knee beta cells, cardiomyocytes, glial cells, skin epithelial cells, chondrocytes, bone cells, embryonic or adult stem cells.
  • a parenchymal cell is a cell that functions as a part of a tissue or organ.
  • the first cell is not limited to a specific cell as long as it is a cell that can survive and function when the second cell is co-cultured with the second cell,
  • endothelial cells preferably endothelial cells, epithelial cells, fibroblasts and the like can be mentioned.
  • endothelial cells more preferably vascular endothelial cells, particularly preferably umbilical vein vascular endothelial cells are used.
  • fibroblasts that play an important role in the morphogenesis of the organ in which the second cells are present are also preferably used.
  • the first cell and the second cell may be derived from any organism, but are preferably derived from animals.
  • the first cells When the first cells are cultured on a cell culture substrate, they form a substantially monolayer of cultured cells as anchorage-dependent cells or feeder cells.
  • the second cell when the second cell is cultured on the first cell, the first cell and the second cell have atypical interaction, and the function specific to the second cell is stable over a long period of time. Retained.
  • a micropatterning culture construct is constructed from a spheroid composed of a feeder layer constructed by the first cells and the second cells co-cultured thereon.
  • the spheroid refers to an agglutination soul formed by gathering a plurality of one or more types of cells, but is not limited to, but is mainly an agglutination soul of parenchymal cells.
  • the method for producing a micro pattern ung culture construct of the present invention uses the micro pattern ung culture substrate of the present invention and cultures cells on a cell culture substrate on which a water-soluble photocurable polymer is patterned.
  • a culturing process is provided. This culturing step includes a first culturing step for culturing a first cell on a cell culture substrate patterned with a water-soluble photocurable polymer, and a first cell cultivated in the first culturing step. And a second culturing step for culturing second cells that form spheroids.
  • Micro patterning with high-precision cell micro patterning that is shaped to fit the pattern without selectively attaching cells onto the cellulable polymer but selectively attaching cells only on the cell culture substrate A culture construct can be provided.
  • micro pattern Jung culture construct prepared in this manner is capable of suppressing cell detachment from the substrate and maintaining the cells on the substrate for a long period of time.
  • a biosensor for examining the toxicity of cells that form spheroids, and a screening for substances that activate the function of cells that form spheroids may be configured.
  • a water-soluble photocurable polymer there are two types of water-soluble negative resists having a non-cell-adhesive property and each having a polybutyl alcohol and a polyethylene glycol as molecular skeletons.
  • a compound having a structure was used.
  • a collagen membrane as a cell culture substrate was prepared by applying a porcine type I collagen solution to a circular acrylic resin having a diameter of 21 mm and a thickness of 0.5 mm, followed by drying for 1 hour. Subsequently, a compound having the chemical structure 1 or a compound having the chemical structure 2 was applied onto the collagen film by spin coating, and the film was formed by treating at 60 ° C. for 10 minutes.
  • a substrate coated with a compound having the structure of Chemical Formula 1 or a compound having the structure of Chemical Formula 2 was irradiated with light through a quartz mask as a mask pattern, and a pattern was formed through water development.
  • FIG. 3 shows the results of observation of the substrate after development with water using a phase contrast microscope. It was confirmed that a good pattern was formed on the collagen membrane both when the compound having the structure of chemical formula 1 was used (a) and when the compound having the structure of chemical formula 2 was used (b).
  • Example 2 [0069] [Detection of precoated collagen by immunofluorescence staining]
  • Fig. 4 shows the result of immunostaining on a substrate patterned with a compound having the structure of (a) (a) and the result of immunostaining on a substrate patterned with the compound of the formula (b). Indicates. Fluorescence derived from the secondary antibody was confirmed in a manner consistent with the micropattern defined by the compound having the chemical structure 1 or the compound having the chemical structure 2.
  • Endothelial cells were seeded on a substrate prepared by applying collagen and cultured for 24 hours. Endothelial cells were shown to adhere to the substrate in the shape defined by the micropattern
  • liver parenchymal cells collected from a 5-week-old Wistar rat were seeded on endothelial cell micropatterns and cultured for 24 hours. There was a difference in inhibition of cell adhesion between the compound having the structure of Chemical Formula 1 and the compound having the structure of Chemical Formula 2, and it was confirmed that the compound having the structure of Chemical Formula 2 has higher cell non-adhesiveness.
  • FIG. 5 shows adhesion of hepatocytes on a substrate patterned with a compound having the structure of Chemical Formula 2. Almost no non-specific adsorption of hepatocytes to resist photocuring sites confirmed Was not.
  • the substrate coated with porcine type I collagen solution and the porcine type I collagen solution were not coated.
  • the adhesion was compared.
  • a substrate patterned with a compound having the chemical structure 2 was used as the substrate.
  • FIG. 6 shows the adhesion pattern of cells after washing with PBS (-) for a substrate coated with collagen or a substrate not coated with collagen.
  • PBS PBS
  • the constructed array can be applied to drug screening and the like.

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Abstract

簡便な方法で細胞のマイクロパターニングが可能なマイクロパターニング培養基板及びその作成方法を提供する。細胞培養基材２と、細胞培養基材２上にパターニングされた水溶性光硬化性ポリマー３とを備えた。細胞培養基材２上に水溶性光硬化性ポリマー３を塗布し、水溶性光硬化性ポリマー３へマスクパターン４を介して光照射して細胞培養基材２上に水溶性光硬化性ポリマー３をパターニングすることで作成される。

Description

明 細 書
マイクロパターユング培養基板、マイクロパターユング培養構築物及びこ れらの作成方法
技術分野
[0001] 本発明は、細胞のマイクロパターエングに用いられるマイクロパターニング培養基 板と、このマイクロパターユング培養基板を用いて構築されたマイクロパターニング培 養構築物及びこれらの作成方法に関する。 背景技術
[0002] 近年、 DNAチップ等に代表される各種マイクロアレイを用いた解析手法が脚光を 浴びている。この手法によれば、微小空間内に各種のプローブを高密度かつ高精度 に固定化し、これらプローブに対して検体を反応させることで、微小サンプルから大 量の情報を効率よく取り出すことができる。プローブとしては、 DNAのほか、最近で はタンパク質や糖鎖、細胞を用いることが試みられている。
[0003] 特に、細胞をプローブとする細胞センサー（CBB： Cell-based Biosensor)は、外部 刺激に対する生物体の応答をトータルに評価するためのツールの 1つであって、各 種外部刺激に対する細胞の一連の反応を効率的に解析可能であると考えられること から、再生医療における新規な分化誘導因子の探索や創薬における薬物候補物質 の探索など、マイクロチップなどと組み合わせた形での種々のスクリーニングシステム への応用が期待されている。
[0004] 細胞をセンサー素子として有効かつ効率的に利用するためには、マイクロチップ上 での細胞の接着位置や形態を適切にコントロールし、生体内における各種細胞が有 する機能を培養環境下で長期間にわたって維持することが必要となる。そして、細胞 を培養基板上でマイクロパターニングすることは、細胞センサーの実用化において非 常に重要な課題である。
[0005] し力し、これまでの技術では、簡便な手法で細胞をマイクロパターユングするための 基板を作成することは困難であった。
[0006] 発明者らはこれまでに、非特異的な吸着を抑制するポリエチレングリコール (PEG) 修飾基板上にプラズマ微細加工技術を用いることで、マイクロオーダーでパターン化 した細胞接着部位を作製し、この基板上で内皮細胞をフィーダ一として肝細胞を培 養することで、肝細胞を三次元凝集魂であるスフヱロイドとして極めて高密度に培養 することに成功し、マイクロパターン化した内皮細胞と肝細胞の組み合わせにより、従 来は困難であった肝細胞スフエロイドの基板上高密度培養が可能であることを示した (肝細胞スフエロイドアレイ）（特許文献 1、非特許文献 1)。固定化された肝細胞スフェ ロイドは肝細胞特異的機能を生体外において少なくとも 1ヶ月にわたつて維持するこ とが確認され、構築した肝細胞アレイは薬物スクリーニングへの応用が可能と考えら れる。
特許文献 1：国際公開第 03/010302号パンフレット
非特許文献 l : H.Otsuka, A.Hirano, Y.Nagasaki, T.Okano, Y.Horiike and K.Kataoka , ChemBioChem 5 (2004) 850-855·
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] し力しながら、上記の方法は、高真空の装置を必要とするプラズマ微細加工技術を 用いる方法であるために高い設備コストを要するほか、高真空を必要とすることから チップの生産工程が煩雑となって時間あたりのチップの生産性が低くなるという問題 があった。
[0008] そこで、本発明は上記問題点に鑑み、簡便な方法で細胞のマイクロパターユングが 可能なマイクロパターユング培養基板及びその作成方法を提供することを目的とする 課題を解決するための手段
[0009] 本発明のマイクロパターニング培養基板は、細胞培養基材と、この細胞培養基材 上にパターユングされた水溶性光硬化性ポリマーとを備えたことを特徴とする。
[0010] また、前記細胞培養基材は生理活性物質からなることを特徴とする。
[0011] また、前記生理活性物質は細胞外マトリックス構成成分からなることを特徴とする。
[0012] また、前記細胞外マトリックス構成成分は細胞接着性タンパク質であることを特徴と する。 [0013] また、前記水溶性光硬化性ポリマーはフエニルアジド基を有することを特徴とする。
[0014] 本発明のマイクロパターニング培養基板の作成方法は、細胞培養基材上に水溶性 光硬化性ポリマーを塗布する水溶性光硬化性ポリマー塗布工程と、この水溶性光硬 化性ポリマー塗布工程において塗布された水溶性光硬化性ポリマーへマスクパター ンを介して光照射して細胞培養基材上に水溶性光硬化性ポリマーをパターニングす るパターユング工程とを備えたことを特徴とする。
[0015] また、前記細胞培養基材は細胞接着性タンパク質からなることを特徴とする。
[0016] また、前記水溶性光硬化性ポリマーはフエニルアジド基を有することを特徴とする。
[0017] 本発明のマイクロパターニング培養構築物は、水溶性光硬化性ポリマーがパター ニングされた細胞培養基材上に培養された細胞を備えたことを特徴とする。
[0018] また、前記細胞培養基材は細胞接着性タンパク質力 なることを特徴とする。
[0019] また、前記水溶性光硬化性ポリマーはフエニルアジド基を有することを特徴とする。
[0020] また、前記細胞は第 1の細胞と、この第 1の細胞上に培養されスフエロイドを形成し た第 2の細胞とからなることを特徴とする。
[0021] また、前記第 1の細胞は内皮細胞であって、前記第 2の細胞は肝細胞であることを 特徴とする。
[0022] 本発明のマイクロパターニング培養構築物の作成方法は、水溶性光硬化性ポリマ 一がパターニングされた細胞培養基材上に細胞を培養する培養工程を備えたことを 特徴とする。
[0023] また、前記細胞培養基材は細胞接着性タンパク質からなることを特徴とする。
[0024] また、前記水溶性光硬化性ポリマーはフエニルアジド基を有することを特徴とする。
[0025] また、前記培養工程は、水溶性光硬化性ポリマーがパターニングされた細胞培養 基材上に第 1の細胞を培養する第 1の培養工程と、この第 1の培養工程において培 養された第 1の細胞上にスフエロイドを形成する第 2の細胞を培養する第 2の培養ェ 程とを備えたことを特徴とする。
[0026] また、前記第 1の細胞は内皮細胞であって、前記第 2の細胞は肝細胞であることを 特徴とする。
[0027] 本発明のバイオセンサーは、本発明のマイクロパターニング培養構築物を備えたこ とを特徴とする。
発明の効果
[0028] 本発明のマイクロパターニング培養基板、マイクロパターニング培養構築物及びこ れらの作成方法によれば、光リソグラフィという簡便な方法を用いて細胞培養基材上 に水溶性光硬化性ポリマーをパターユングすることによって、常温、常圧の環境下に おいて、簡便かつ高精度、低コストにて細胞のマイクロパターユングが可能となる。
[0029] また、水溶性光硬化性ポリマーを用いることによって、光照射後の洗浄に水を用い ること力 Sでき、細胞培養基材の構造、機能に悪影響を与えることなぐ細胞のマイクロ パターユングが可能となる。
[0030] また、細胞培養基材として細胞接着性タンパク質を用いることにより、細胞培養基材 上に確実に細胞を接着させることができる。
図面の簡単な説明
[0031] [図 1]本発明のマイクロパターニング培養基板の一実施例を示す模式図である。
[図 2]本発明のマイクロパターニング培養基板の作成方法の一実施例を示す模式図 である。
[図 3]化 1の構造を有する化合物をパターニングした基板を水で現像した後の位相差 顕微鏡写真 (a)と化 2の構造を有する化合物をパターユングした基板を水で現像した 後の位相差顕微鏡写真 (b)である。
[図 4]化 1の構造を有する化合物をパターニングした基板における免疫染色法による 結果を示す顕微鏡写真 (a)と化 2の構造を有する化合物をパターユングした基板に おける免疫染色法による結果を示す顕微鏡写真 (b)である。
[図 5]化 2の構造を有する化合物をパターニングした基板における肝実質細胞の接着 を示す顕微鏡写真である。
[図 6]コラーゲンを塗布しない基板を用レ、て肝実質細胞の脱落を調べた結果を示す 顕微鏡写真 (a)とコラーゲンを塗布した基板を用レ、て肝実質細胞の脱落を調べた結 果を示す顕微鏡写真 (b)である。
符号の説明
[0032] 1 基板 2 細胞培養基材
3 水溶性光硬化性ポリマー
4 マスクパターン
発明を実施するための最良の形態
[0033] はじめに、本発明のマイクロパターユング培養基板について説明する。本発明のマ イクロパタ一二ング培養基板は、細胞培養基材と、この細胞培養基材上にパターニン グされた水溶性光硬化性ポリマーとを備えたものである。
[0034] ここで用いられる水溶性光硬化性ポリマーは、細胞をパターニングするための基板 修飾用材料として用いられ、紫外光を照射すると架橋反応が起こって硬化する高分 子材料である。この水溶性光硬化性ポリマーはネガ型レジストと呼ばれ、マスクパタ ーンを介して光照射し、光照射せず硬化してレ、なレ、部分を水で洗浄して除去するこ とによって、光照射した部分を残したパターユングを行うことができる。このパターニン グは光リソグラフィと呼ばれる半導体プロセスなどに幅広く用いられている手法であり 、マイクロパターンを簡便に作成するための手法として、極めて有効である。なお、本 発明で用いる光硬化性ポリマーは水溶性であるため、光照射後の洗浄に有機溶剤 ではなく水を用いることができるので、基板上に塗布された細胞培養基材の構造、機 能に悪影響を与えることがない。
[0035] また、通常、半導体プロセスにおける光リソグラフィでは洗浄で除去しきれないポリ マーをプラズマアツシングで除去する必要がある力 水溶性光硬化ポリマーの硬化し てレ、なレ、部分は細胞培養基材として後述するコラーゲンなどの細胞接着性タンパク 質に対する剥離性が極めて良好であって、水で洗浄するだけで十分に除去できるの で、プラズマアツシングが不要となる。したがって、細胞培養基材がプラズマによるダ メージを受けることもない。
[0036] また、水溶性光硬化性ポリマーとしては、細胞非接着性を有するものが好適に用い られる。水溶性光硬化性ポリマー上に細胞が接着することを防止し、細胞培養基材 上にのみ細胞を接着させて培養するためである。
[0037] 水溶性光硬化性ポリマーとしては、ポリビュルアルコール又はポリエチレングリコー ルを主骨格として含むものなどが好適に用いられ、化 1に示すポリビュルアルコール を主骨格、及びその側鎖に光反応性部位としてフエニルアジド基、水溶性を向上さ せる官能基としてピリジン基を導入した化合物、化 2に示すポリエチレングリコールを 主骨格とし、その両末端にそれぞれフエニルアジド基とピリジン基を導入した化合物 などを好適に用いることができる。
[0038] [化 1]
Figure imgf000008_0001
[0039] [化 2]
Figure imgf000008_0002
なお、化 1の構造を有する化合物、化 2の構造を有する化合物の両者とも細胞のパ ターニング能を有するが、特に、ィ匕 2の構造を有する化合物の方がより幅広い細胞種 に対して利用可能であり、極めて高い細胞非接着性を示すので、より好適に用いら れる。
[0041] 細胞培養基材としては、細胞を培養することのできる基材であれば特定のものに限 定されないが、より確実に細胞を培養するためには、生理活性物質からなるものが好 ましく用いられる。
[0042] 生理活性物質としては、細胞等に代表される生命体の活動に影響を与えるもので あれば特定のものに限定されないが、細胞接着性を有するものが好適に用いられ、 特に細胞外マトリックス構成成分の 1つである細胞接着性タンパク質からなるものが 好適に用いられる。なお、細胞接着性タンパク質とは、細胞が接着しやすいタンパク 質の総称であり、限定されるものではないが好適にはコラーゲン、ビトロネクチン、フィ ブロネクチン、ラミニンなどが挙げられる。これらの中でも安価で入手しやすく高い細 胞接着性を有するという理由から、特にコラーゲンが好適に用いられる。
[0043] また、細胞培養基材は 1層構造であっても多層構造であってもよい。多層構造の場 合には、細胞が接着する少なくとも 1つの層を生理活性物質力ら構成するのが好まし い。
[0044] また、細胞培養基材は基板上に塗布されたものであってもよぐこの場合、基板とし ては、細胞培養基材を均一に塗布することができるものであれば特定のものに限定さ せず、例えば、アクリル基板、ガラス基板、アミノ基導入ガラスなどを用いることができ る。なお、基板は平面構造を有するものに限られず、必要に応じて種々の形状のもの を用いることができる。
[0045] 水溶性光硬化性ポリマーのパターニングによって外部に露出した細胞培養基材の 領域の形状や大きさは、特定の形状や大きさに限定されるものではないが、この領域 で細胞を培養してスフエロイドを形成させるために、面積力 000〜200000 μ m2、 好ましくは 1500〜50000 x m2の円形、多角形、楕円形などの小領域とする。形状と しては円形が最も好ましいが、この場合、小領域の直径は 40〜500 z mとするのが 好ましぐさらに好ましくは 50〜200 z mとする。例えば、この小領域を多数形成し、 かつ等間隔に規則正しく配列させるように水溶性光硬化性ポリマーをパターユングす れば、細胞センサー作成用の基板として有効に用いることができる。この場合、隣り 合った小領域の距離は 10〜1000 μ mとするのが好ましぐさらには 50〜200 μ mと するのが好ましい。小領域の配列パターンとしては、特定のパターンに限定されるも のではないが、方陣状、もしくは各々が三角形の頂点に配置された等間隔格子状で あることが望ましい。このように配列した小領域内で細胞を培養することによって、細 胞アレイを構築することができる。
[0046] ここで、図 1に、本発明のマイクロパターユング培養基板の一実施例として、左に断 面模式図、右に上面模式図を示す。 1は基板であり、基板 1上には細胞培養基材 2の 層が形成され、細胞培養基材 2上には水溶性光硬化性ポリマー 3がパターニングさ れている。本実施例では、水溶性光硬化性ポリマー 3のパターユングによって、細胞 培養基材 2が外部に露出した直径 100 μ mの円形の領域が 100 μ mの間隔をおい て上下左右方向に規則正しく配列している。
[0047] つぎに、本発明のマイクロパターニング培養基板の作成方法について説明する。
本発明のマイクロパターニング培養基板の作成方法は、光リソグラフィを利用するも のであって、細胞培養基材上に水溶性光硬化性ポリマーを塗布する水溶性光硬化 性ポリマー塗布工程と、この水溶性光硬化性ポリマー塗布工程において塗布された 水溶性光硬化性ポリマーへマスクパターンを介して光照射して細胞培養基材上に水 溶性光硬化性ポリマーをパターニングするパターユング工程とを備えている。
[0048] マスクパターンとしては、光リソグラフィにおいて通常用いられるものを用いることが でき、例えば、石英マスクが好適に用いられる。
[0049] なお、例えば、細胞培養基材が基板上に塗布されたものである場合には、基板上 に細胞培養基材を塗布する細胞培養基材塗布工程を備えていてもよい。この細胞 培養基材塗布工程を備えてレ、る場合、水溶性光硬化性ポリマー塗布工程にぉレ、て 、細胞培養基材塗布工程にぉレ、て塗布された細胞培養基材上に水溶性光硬化性 ポリマーを塗布する。
[0050] 本発明のマイクロパターニング培養基板の作成方法の一実施例を示す断面模式 図としての図 2を参照しながら説明すると、ステップ 1において、基板 1を準備し、ステ ップ 2の細胞培養基材塗布工程にぉレ、て、基板 1上に細胞培養基材 2を塗布する。 ステップ 3の水溶性光硬化性ポリマー塗布工程にぉレ、て、細胞培養基材 2上に水溶 性光硬化性ポリマー 3を塗布する。ステップ 4とステップ 5はパターユング工程であり、 ステップ 4において、水溶性光硬化性ポリマー 3へマスクパターン 4を介して光照射す る。最後のステップ 5において、水溶性光硬化性ポリマー 3の光照射されずに硬化し ていない部分を水で洗浄して除去することで、細胞培養基材 2上に水溶性光硬化性 ポリマー 3がパターユングされる。
[0051] このように、光リソグラフィという簡便な方法を用いて細胞培養基材上に水溶性光硬 化性ポリマーをパターユングすることによって、常温、常圧の環境下でも、簡便かつ 高精度、低コストにてマイクロパターニング培養基板を作成することができる。
[0052] また、水溶性光硬化性ポリマーを用いることによって、光照射後の洗浄に水を用い ること力 Sでき、細胞培養基材の構造、機能に悪影響を与えることなぐマイクロパター ユング培養基板を作成することができる。
[0053] また、細胞培養基材として細胞接着性タンパク質を用いることにより、細胞培養基材 上に確実に細胞を接着させることができる。
[0054] さらに、細胞非接着性の水溶性光硬化性ポリマーを用いることにより、水溶性光硬 化性ポリマー上には細胞を接着させず、細胞培養基材上にのみ選択的に細胞を接 着させて、パターユングに合わせた形状の高精度な細胞のマイクロパターユングが可 能となる。
[0055] つぎに、本発明のマイクロパターユング培養構築物について説明する。本発明のマ イクロパタ一ユング培養構築物は、本発明のマイクロパターユング培養基板を用いて 構築されたものであり、水溶性光硬化性ポリマーがパターニングされた細胞培養基材 上に培養された細胞を備えたものである。すなわち、細胞は、光リソグラフィにより水 溶性光硬化性ポリマーが除去されて外部に露出した細胞培養基材上において培養 されている。また、この細胞は、単一種の細胞であってもよ 複数種の細胞から構成 されるものであってもよい。
[0056] あるいは、例えば、この細胞は、第 1の細胞と、この第 1の細胞上に培養されスフヱ ロイドを形成した第 2の細胞とからなるものであってもよレ、。
[0057] ここで用いられる第 2の細胞は、後述する第 1の細胞との共培養によりスフヱロイドを 形成する細胞であれば特定の細胞に限定されないが、例えば、実質細胞としての肝 細胞、膝ベータ細胞、心筋細胞、グリア細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、胚 性または成体幹細胞などを挙げることができる。なお、実質細胞とは、組織または器 官においてその機能を司る部分となる細胞のことをいう。
[0058] また、第 1の細胞は、上記第 2の細胞と共培養したときに第 2の細胞を生存及び機 能させることができる細胞であれば特定の細胞に限定されなレ、が、例えば、内皮細胞 、上皮細胞、線維芽細胞などを挙げることができる。好ましくは、内皮細胞、さらに好 ましくは血管内皮細胞、特に好ましくは臍帯静脈血管内皮細胞が用いられる。あるい は、上記第 2の細胞の存在する臓器の形態形成に重要な役割を果たす線維芽細胞 も好ましく用いられる。
[0059] 第 1の細胞、第 2の細胞は、どのような生物体由来のものでもよいが、好適には動物 起源のものが望ましい。第 1の細胞を細胞培養基材上で培養すると、足場依存性細 胞またはフィーダ一細胞として実質的に培養細胞の単層を形成する。つぎに、この第 1の細胞上で第 2の細胞を培養すると、第 1の細胞と第 2の細胞が異型相互作用を行 レ、、第 2の細胞に特異的な機能が長期にわたって安定に保持される。このように、第 1の細胞により構築されたフィーダ一層と、その上に共培養された第 2の細胞からなる スフエロイドから、マイクロパターニング培養構築物が構築される。なお、スフヱロイドと は、一種類以上の細胞が複数個集まることで形成される凝集魂をさし、限定されるも のではないが実質細胞の凝集魂が主に用いられる。
[0060] つぎに、本発明のマイクロパターニング培養構築物の作成方法について説明する 。本発明のマイクロパターユング培養構築物の作成方法は、本発明のマイクロパター ユング培養基板を用レ、るものであり、水溶性光硬化性ポリマーがパターユングされた 細胞培養基材上に細胞を培養する培養工程を備えている。この培養工程は、水溶 性光硬化性ポリマーがパターユングされた細胞培養基材上に第 1の細胞を培養する 第 1の培養工程と、この第 1の培養工程において培養された第 1の細胞上にスフエロ イドを形成する第 2の細胞を培養する第 2の培養工程とを備えたものであってもよい。
[0061] ここで、細胞培養基材として細胞接着性タンパク質を用いることにより、細胞培養基 材上に確実に細胞を接着させることができる。
[0062] さらに、細胞非接着性の水溶性光硬化性ポリマーを用いることにより、水溶性光硬 化性ポリマー上には細胞を接着させず、細胞培養基材上にのみ選択的に細胞を接 着させて、パターユングに合わせた形状の高精度な細胞のマイクロパターユングを施 したマイクロパターユング培養構築物を提供することができる。
[0063] このようにして作成したマイクロパターユング培養構築物は、基板上からの細胞の 脱落が抑制され、細胞を基板上で長期にわたり維持することができる。
[0064] さらに、本発明のマイクロパターユング培養構築物を用いて、スフエロイドを形成す る細胞の毒性を検查するためのバイオセンサー、スフヱロイドを形成する細胞の機能 を賦活化する物質をスクリーニングするためのバイオセンサー、スフヱロイドを形成す る細胞不全の医療サポート用のバイオセンサー、実質細胞の生理作用の模擬試験 用のバイオセンサーなどを構成してもよい。
[0065] なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではなぐ本発明の思想を逸脱し なレ、範囲で種々の変形実施が可能である。
[0066] 以下、さらに具体的に本発明の実施例について説明する。
実施例 1
[0067] [基板の調整]
水溶性光硬化性ポリマーとして、細胞非接着性を有し、それぞれポリビュルアルコ ールとポリエチレングリコールを分子骨格として有する 2種の水溶性ネガ型レジスト、 化 1の構造を有する化合物と化 2の構造を有する化合物を用いた。直径 21mm厚さ 0 . 5mmの円形アクリル樹脂に対して、ブタ I型コラーゲン溶液を塗布した後に 1晚乾 燥させることで、細胞培養基材としてのコラーゲン膜を作製した。続いて、コラーゲン 膜上に化 1の構造を有する化合物または化 2の構造を有する化合物をスピンコートに より塗布し、 60°Cで 10分間処理することで膜形成を行った。化 1の構造を有する化 合物または化 2の構造を有する化合物を塗布した基板に対し、マスクパターンとして 石英マスクを介して光照射を行い、水現像を経てパターンを形成させた。
[0068] 図 3に水で現像を行った後の基板の位相差顕微鏡による観察結果を示す。化 1の 構造を有する化合物を用いた場合 (a)と化 2の構造を有する化合物を用いた場合 (b )の両方とも、コラーゲン膜上に良好なパターン形成がされることが確認された。 実施例 2 [0069] [免疫蛍光染色法によるプレコートコラーゲンの検出]
抗ブタ I型コラーゲン抗体（ゥサギ由来）を 0. 1%ゥシアルブミン/ PBS溶液を用い て至適濃度に抗体溶液を調製した後、実験 1で作製したコラーゲンを塗布した基板 を前記抗体溶液に 4°Cで 1晚放置することで 1次抗体を結合させた。続いて FITCラ ベルィ匕抗ゥサギ IgG抗体 (ャギ由来）を室温で 2時間反応させた後、蛍光顕微鏡によ り観察を行い、染色パターンを確認した。
[0070] 図 4に化 1の構造を有する化合物をパターニングした基板における免疫染色法によ る結果 (a)と化 2の構造を有する化合物をパターユングした基板における免疫染色法 による結果 (b)を示す。化 1の構造を有する化合物または化 2の構造を有する化合物 によって規定されたマイクロパターンと一致する形で 2次抗体に由来する蛍光が確認 された。
[0071] このことから、化 1の構造を有する化合物および化 2の構造を有する化合物の両方 とも、その塗布の際にコラーゲンの物性を変化させることなぐ水の現像によって容易 に取り除かれることが確認された。また、レジストが光硬化した部位では蛍光がまった く確認されなレ、ことから、レジストが存在する部位ではタンパク質の非特異的な吸着 が効果的に抑制されていることが確認された。
実施例 3
[0072] [肝細胞スフエロイドアレイの形成および維持の評価]
コラーゲンを塗布して調製した基板上に内皮細胞を播種し、 24時間の培養を行つ た。内皮細胞はマイクロパターンに規定された形状で基板に接着することが示された
[0073] パターン形成を確認した後、続いて内皮細胞マイクロパターン上に 5週齢のウイスタ 一ラットより採取した肝実質細胞を播種し 24時間の培養を行ったところ、内皮細胞の 場合とは異なり、化 1の構造を有する化合物と化 2の構造を有する化合物で細胞接着 抑制に差が見られ、化 2の構造を有する化合物の方が高い細胞非接着性を有するこ とが確認された。
[0074] 図 5に化 2の構造を有する化合物をパターユングした基板における肝実質細胞の 接着を示す。肝実質細胞のレジスト光硬化部位への非特異的な吸着はほとんど確認 されなかった。
[0075] スフヱロイド形成を確認した後、 PBS (―)による 3回の洗浄を行った後に新しい培 地をカ卩え、培養を継続した。以後の培地交換は一週間に 2回、 3または 4日間隔で適 宜行い、顕微鏡観察により経過観察を行った。
[0076] また、パターン化された細胞の接着強度に及ぼすコラーゲンの影響を検討するた め、ブタ I型コラーゲン溶液を塗布した基板とブタ I型コラーゲン溶液を塗布しなレ、基 板の細胞の接着を比較した。基板としては、化 2の構造を有する化合物をパターニン グした基板を用いた。
[0077] 図 6にコラーゲンを塗布した基板、またはコラーゲンを塗布していない基板につい て、 PBS (—）によって洗浄をした後の細胞の接着パターンを示す。コラーゲンをコー トしてレ、なレ、場合、 PBS (―)で洗浄を行うと半分以上の細胞が脱落してしまう（a)の に対し、コラーゲンが存在する場合には細胞の脱落はほとんど観察されなかった (b) 。長期培養を行った場合この差は顕著に表れ、コラーゲンが存在しない場合はアレイ の維持が極めて困難であった。
[0078] 以上の結果より、化 2の構造を有する化合物とコラーゲンの組み合わせにより、長期 にわたつてスフヱロイドを維持可能な基板を簡便に調製できることが確認された。
[0079] 肝細胞スフエロイドは肝細胞特異的機能を生体外において長期間維持することか ら、構築したアレイは薬物スクリーニングなどへ応用することができる。

Claims

請求の範囲
[I] 細胞培養基材と、この細胞培養基材上にパターニングされた水溶性光硬化性ポリマ 一とを備えたことを特徴とするマイクロパターユング培養基板。
[2] 前記細胞培養基材は生理活性物質からなることを特徴とする請求の範囲第 1項に記 載のマイクロパターユング培養基板。
[3] 前記生理活性物質は細胞外マトリックス構成成分力らなることを特徴とする請求の範 囲第 2項に記載のマイクロパターニング培養基板。
[4] 前記細胞外マトリックス構成成分は細胞接着性タンパク質であることを特徴とする請 求の範囲第 3項に記載のマイクロパターユング培養基板。
[5] 前記水溶性光硬化性ポリマーはフエニルアジド基を有することを特徴とする請求の範 囲第 1項〜第 4項のいずれ力 1項に記載のマイクロパターユング培養基板。
[6] 細胞培養基材上に水溶性光硬化性ポリマーを塗布する水溶性光硬化性ポリマー塗 布工程と、この水溶性光硬化性ポリマー塗布工程にぉレ、て塗布された水溶性光硬 化性ポリマーへマスクパターンを介して光照射して細胞培養基材上に水溶性光硬化 性ポリマーをパターユングするパターユング工程とを備えたことを特徴とするマイクロ パターニング培養基板の作成方法。
[7] 前記細胞培養基材は細胞接着性タンパク質力もなることを特徴とする請求の範囲第
6項に記載のマイクロパターユング培養基板の作成方法。
[8] 前記水溶性光硬化性ポリマーはフエニルアジド基を有することを特徴とする請求の範 囲第 6項又は第 7項に記載のマイクロパターニング培養基板の作成方法。
[9] 水溶性光硬化性ポリマーがパターニングされた細胞培養基材上に培養された細胞を 備えたことを特徴とするマイクロパターニング培養構築物。
[10] 前記細胞培養基材は細胞接着性タンパク質力もなることを特徴とする請求の範囲第
9項に記載のマイクロパターニング培養構築物。
[I I] 前記水溶性光硬化性ポリマーはフエニルアジド基を有することを特徴とする請求の範 囲第 9項に記載のマイクロパターニング培養構築物。
[12] 前記細胞は第 1の細胞と、この第 1の細胞上に培養されスフエロイドを形成した第 2の 細胞とからなることを特徴とする請求の範囲第 9項に記載のマイクロパターユング培 養構築物。
[13] 前記第 1の細胞は内皮細胞であって、前記第 2の細胞は肝細胞であることを特徴とす る請求の範囲第 12項に記載のマイクロパターニング培養構築物。
[14] 水溶性光硬化性ポリマーがパターニングされた細胞培養基材上に細胞を培養する 培養工程を備えたことを特徴とするマイクロパターニング培養構築物の作成方法。
[15] 前記細胞培養基材は細胞接着性タンパク質力もなることを特徴とする請求の範囲第 14項に記載のマイクロパターニング培養構築物の作成方法。
[16] 前記水溶性光硬化性ポリマーはフエニルアジド基を有することを特徴とする請求の範 囲第 14項に記載のマイクロパターユング培養構築物の作成方法。
[17] 前記培養工程は、水溶性光硬化性ポリマーがパターニングされた細胞培養基材上 に第 1の細胞を培養する第 1の培養工程と、この第 1の培養工程において培養された 第 1の細胞上にスフエロイドを形成する第 2の細胞を培養する第 2の培養工程とを備 えたことを特徴とする請求の範囲第 14項に記載のマイクロパターニング培養構築物 の作成方法。
[18] 前記第 1の細胞は内皮細胞であって、前記第 2の細胞は肝細胞であることを特徴とす る請求項 17記載のマイクロパターニング培養構築物の作成方法。
[19] 請求項 9〜： 13のいずれ力 1項記載のマイクロパターユング培養構築物を備えたことを 特徴とするバイオセンサー。
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