JP2020078309A - 細管形成を促進するためのヒドロゲル組成物 - Google Patents
細管形成を促進するためのヒドロゲル組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020078309A JP2020078309A JP2020002977A JP2020002977A JP2020078309A JP 2020078309 A JP2020078309 A JP 2020078309A JP 2020002977 A JP2020002977 A JP 2020002977A JP 2020002977 A JP2020002977 A JP 2020002977A JP 2020078309 A JP2020078309 A JP 2020078309A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- cells
- hydrogel
- derived
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
- A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L31/145—Hydrogels or hydrocolloids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
- A61L29/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. lubricating compositions
- A61L29/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/80—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special chemical form
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00596—Solid-phase processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/20—Small organic molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
- C12N2537/10—Cross-linking
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2610/00—Assays involving self-assembled monolayers [SAMs]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
Abstract
Description
配列表の紙コピーおよびサイズが11,539バイト(MICROSOFT WINDOWS(登録商標)EXPLORER内で測定)である「P140314WO01_ST25.txt」と称するファイルを含む配列表のコンピューターに読み込み可能な形式は、本明細書において提供され、参照することによって本明細書に援用される。配列表は、配列番号:1-47からなる。
関連出願の相互参照
本出願は、2014年4月10日出願の米国仮出願第61/978,032号に対する優先権を主張する。上記出願の開示の全体を参照することにより本出願に含める。
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、本発明は、米国政府の支援を受け、国立衛生研究所によって与えられた契約番号HL093282のもとで行われた。米国政府は本発明に関して権利を有する。
本開示は、一般に、生体材料組成物および生体材料組成物の使用方法に関する。さらに詳しくは、本開示は、ヒドロゲル組成物、特に、ヒドロゲルアレイ、ヒドロゲル組成物を用いて細胞基質相互作用をスクリーニングする方法、およびヒドロゲル組成物を用いて細管形成を促進する方法に関する。
他に特記しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、本開示が属する当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。本命最初に記載の方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料は、以下に記載される。
本開示は、ヒドロゲル組成物の製造方法および得られる組成物の使用に関する。ヒドロゲルアレイを製造するために用いられる場合、製造方法は、一般に、基質にヒドロゲル前駆体溶液を接触させること(ここで、基質は疎水性領域と親水性領域を含む);ヒドロゲル前駆体溶液が基質と表面修飾基質との間に位置するように、表面修飾基質をヒドロゲル前駆体溶液上に置くこと;ヒドロゲル前駆体溶液を重合させること;および基質から表面修飾基質を分離して、ヒドロゲルアレイを得ること;を含む(図1A-1B参照)。このように、ポリマーヒドロゲル前駆体溶液を基質と表面修飾基質との間で重合させ、得られるヒドロゲルを表面修飾基質がヒドロゲルアレイを含むように表面修飾基質とともに移す。1つの実施態様において、以下に詳述するように、ヒドロゲルを含まないバックグラウンドによって囲まれるヒドロゲルスポットのアレイを含むように、ヒドロゲルアレイをパターニングすることができる。もう1つの実施態様において、以下に詳述するように、ヒドロゲルバックグラウンド内にヒドロゲルを含まないスポット(またはプール)のアレイが形成されるように、ヒドロゲルアレイをパターニングすることができる。
さらにもう1つの態様において、本開示は、分子−分子相互作用をスクリーニングする方法に関する。方法は、ヒドロゲル組成物を製造すること(ここで、ヒドロゲル組成物は、少なくとも1つの可溶性因子結合剤を含む);少なくとも1つの可溶性因子結合剤と相互作用することが知られているか、または相互作用すると思われる分子に、ヒドロゲル組成物を接触させること;およびヒドロゲル組成物を分析すること;を含む。
材料および方法
PEG-ノルボルネン合成
末端ヒドロキシル基(-OH)を有し、分子量20 kDaである8-アームポリ(エチレングリコール)(PEG)をJenKem Technology USA(テキサス州、アレン)から購入した。無水ピリジン、4-(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)、5-ノルボルネン-2-カルボン酸、ジエチルエーテル、および0.03 % v/v テトラメチルシラン(TMS)を含む重水素化クロロホルム(CDCl3、99.8%)をSigma Aldrich(ミズーリ州、セントルイス)から購入した。N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、無水ジクロロメタン(DCM)をACROS Organics(ベルギー、ヘール)から購入した。3.5K分子量カットオフのスネークスキン(SNAKESKIN)透析チューブをThermo Fisher Scientific(マサチューセッツ州、ウォルサム)から購入した。
これらの実験に用いたヒドロゲルアレイは、シラン化ガラス基質に固定されたヒドロゲルスポットから構成された。ヒドロゲルスポットは、金の、異なる湿潤性をもつことにより、エラストマーステンシルによってパターンが定義される領域を有するようにパターニングされた表面を用いて形成された。ヒドロゲルアレイの製造方法を、以下にさらに記載する。
ガラスカバースリップおよび塩酸(HCl)溶液をThermo Fisher Scientific(マサチューセッツ州、ウォルサム)から購入した。トルエン、メタノール、エタノール、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(3-MPTS)およびジチオスレイトール(DTT)をSigma Aldrich(ミズーリ州、セントルイス)から購入した。低圧プラズマシステムをDiener Electronic(ドイツ、エブハウゼン)から購入した。
シリコンウェハーをWRS Materials(カリフォルニア州、サンノゼ)から購入した。SU-8 100フォトレジストをMicroChem(マサチューセッツ州、ニュートン)から購入した。Sylgard 184シリコンエラストマーキットをDow Corning Corporation(ミシガン州、ミッドランド)から購入した。
金コートテストスライド(25 mm x 75 mm x 1 mmのガラス上の50 Åのチタン金属薄膜上に1,000 Åの金)をEvaporated Metal Films(ニューヨーク州、イサカ)から購入した。過フッ素化アルカンチオール(HS-(CH2)11-O-(CH2)2-(CF2)5-CF3)をProChimia Surfaces(ポーランド、ソポト)から購入した。既述されたように、ヒドロキシル末端アルカンチオール(HS-C11-(O-CH2-CH2)3-OH)を合成した(Prime and Whitesides J. Am. Chem. Soc. 1993、115:10714-10721)。
上述のように、PEG-NBを官能化した。二官能性PEGジチオール(PEG-DT)架橋剤(3.4 kDa)をLaysan Bio(アラバマ州、アラブ)から購入した。IRGACURE 2959光開始剤をCiba/BASF(ドイツ、ルートヴィヒスハーフェン)から購入した。システイン末端ペプチドをGenScript USA(ニュージャージー州、ピスカタウェイ、NJ)から購入した。オムニキュアシリーズ1000 UVスポット硬化ランプ(波長365 nm)、ライトガイドおよびコリメートアダプタをLumen Dynamics Group(カナダ、オンタリオ)から購入した。上記と同じ手順を用い、所望のヒドロゲルスポット高さに対応する厚さ寸法をもつPDMSスペーサーを製造した。
パターニングされたアルカンチオレート自己組織化単分子膜(SAM)で、金基質を修飾して、周囲の疎水性領域によって分離される単離された親水性領域を提供した (図1A-1Bに示す)。図2A(図1Aにも)に示すように、金コートスライド上の疎水性および親水性SAM形成を、接触角測定によって確認した。図2Bは、疎水性パターニング前のステップにおける金基質 100;フッ素SAMを有する基質 110;エッチング後の基質 120;および親水性パターニング後の基質 130;のパターニング中の端面図を提供する。
上述のように(図1A-1B参照)、金基質上のパターニングされた疎水性/親水性自己組織化単分子膜を用いて、アレイにおける各ヒドロゲルスポットの形状を定義し、含量を限定するように、ポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルアレイを形成した。UV開始チオール-エン架橋は、同時にヒドロゲルを重合させ、ヒドロゲルスポットをガラス上に固定して、ヒドロゲルアレイをもたらした。図9に示すように、ヒドロゲルアレイを、64ウェルマイクロアレイアドオン(オーランド州、ベンドのGrace Bio-Labsから市販)に適合する寸法で製造することができた。
詳しくは、パターニングされたヒドロゲルアレイは、ノルボルネンで官能化された8-アーム,20 kDaのポリ(エチレングリコール)から構成された。パターニングされたヒドロゲルアレイは、30-60 mg/mLの、MMP分解架橋ペプチド(KCGGPQGIWGQGCK(配列番号:27)またはKCGGPQGIAGQGCK(配列番号:28))で30-70% 架橋しているPEG、および0.25-2 mMの細胞接着性ペプチド(CRGDS(配列番号:2))を含有するヒドロゲルスポットを含んだ。パターニングされたヒドロゲルアレイスポットに、各細胞型用の標準増殖培地(HUVEC用のMedium 199およびEGM-2 BULLETKIT(商標)(Lonza、スイス、バーゼル)、iPSC-ECおよびhESC-EC用のVASCULIFE(登録商標)およびVEGF LifeFactors (Lifeline Cell Technology、メリーランド州、フレデリック))を含有する培養培地中のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト人工多能性幹細胞由来の内皮細胞(iPSC-EC)およびヒト胚性幹細胞由来の内皮細胞(hESC-EC)を播種した。
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をLonza(メリーランド州、ウォーカーズビル)から購入し、EGM-2 Bulletkit(Lonza)を補足したMedium 199(M199)(Mediatech Inc.、バージニア州、マナッサス)中で培養した。培地補足剤は、2%ウシ血清アルブミン ならびにヒドロコルチゾン、hFGF-B、VEGF、R3-IGF-l、アスコルビン酸、ヘパリン、FBS、hEGFおよびGA-1000を含有した。単純化のために、EGM-2を補足したM199を「増殖培地」と称する。増殖培地を、1日おきに交換し、細胞を4-5日ごとに継代した。0.05% トリプシン溶液(HyClone、Lagan、lIT)を用いて細胞継代を行ない、剥離した細胞を、10%宇宙の子牛血清(HyClone)を補足したM199中に回収した。すべての培地に100 U/mLペニシリン/l00 μg/mLストレプトマイシン(HyClone)を補足した。5% CO2、37℃の加湿したインキュベーター内で細胞を維持し、すべての実験において7〜16の集団倍加を用いた。
PEG-ノルボルネン(PEGNB)を以下のとおり合成した。無水ジクロロメタン(Fisher Scientific、マサチューセッツ州、ウォルサム)に、固体8-アームPEG-OH(分子量20 kDa、トリペンタエリスリトールコア、Jenkem USA、テキサス州、アレン)、ジメチルアミノピリジンおよびピリジン(Sigma Aldrich、ミズーリ州、セントルイス)を溶解した。別の反応容器にて、無水ジクロロメタンに、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(Thermo Scientific、マサチューセッツ州、ウォルサム)およびノルボルネンカルボン酸(Sigma Aldrich)を溶解した。PEG溶液とノルボルネン溶液を合わせ、無水条件下で反応混合物を一夜攪拌することによってカルボキシル基を介して、PEG-OHに、ノルボルネンカルボン酸を共有的に結合させた。ガラスフリット付き漏斗を用いて反応混合物から尿素を除去し、冷ジエチルエーテル(Fisher)中でろ液を沈殿させた。沈殿したPEGNBを集め、ブフナー漏斗で一夜乾燥した。不純物を除去するために、クロロホルム(Sigma Aldrich)に、PEGNBを溶解し、ジエチルエーテル中で沈殿させ、ブフナー漏斗で二回目の乾燥をした。過剰のノルボルネンカルボン酸を除去するために、PEGNBを脱イオン水に溶解し、脱イオン水中で1週間透析し、孔径0.4 μmのシリンジフィルターでろ過した。水性PEGNB溶液を、液体窒素を用いて凍結させ、凍結乾燥した。プロトン核磁気共鳴分光法(NMR)を用いて、ノルボルネン基によるPEGの官能化(図13A)を定量して、6.8-7.2 PPMに位置する結合アルケン基を検出した。これらの実験において、PEG-OHアームへのノルボルネンカップリングの官能化効率は、すべてのPEGNBについて、88%を超えた。
凍結乾燥PEGNBを、10 mM リン酸緩衝生理食塩水(1 x PBS)に、10 mMの濃度(80 mMノルボルネン基)の濃度で溶解し、0.05% w/vのIRGACURE 2959光開始剤(I2959)(Ciba Specialty Chemicals、ニューヨーク州、タリタウン)ならびに2 x モル過剰のアミド化Cys-Arg-Gly-Asp-Ser(CRGDS)接着ペプチド(配列番号:2)またはアミド化Cys-Arg-Asp-Gly-Ser(CRDGS)(配列番号:32)スクランブル非官能性ペプチド(Genscript、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)のいずれかと合わせた。混合物を365 nm UV光下、線量率4.5 mW/cm2で3分間反応させて、チオレン反応を介して、チオール-エン反応を介して、ペプチドをノルボルネン基(図13A)に共有的に結合させた。装飾されたPEGNBから緩衝塩および未反応ペプチドを除去するために、反応混合物を脱イオン水で2日間透析した。透析された溶液を液体窒素で凍結させ、凍結乾燥した。プロトンNMRを用いて、ペプチドへのPEGNBのカップリング効率を定量して、ペプチドのノルボルネン基への共有結合によって引き起こされた6.8-7.2 PPMに位置する結合アルケンプロトンの消失を検出した。単純化のために、予めカップリングさせたPEGNB分子をPEGNB-CRGDS(配列番号:2)およびPEGNB-CRDGS(配列番号:32)と称する。
2つの別のヒドロゲルからヒドロゲルアレイ構築物を形成した:3.4 kDa PEG-ジチオール(PEG-DT)(図13A)架橋分子(Laysan Bio、アラバマ州、アラブ)を用いて架橋される不活性ヒドロゲル「バックグラウンド」(図13B)、および接着ペプチドで装飾され、MMP分解性 KCGGPQGIWGQGCKペプチド(配列番号:27)(図13A)(Genscript)を用いて架橋される「ヒドロゲルスポット」(図13C)。すべてのヒドロゲル溶液は、無血清M199中で作成され、PEGNB、0.05% w/v I2959およびPEGNBに対して2xモル過剰の架橋分子から構成されて、50%架橋密度(図13)を達成した。ヒドロゲルへの細胞接着を変化させるために、予めカップリングさせたPEGNB-CRGDS(配列番号:2)およびPEGNB-CRDGS(配列番号:32)分子を溶液に加えて、すべての溶液に包含されれる合計2 mMのペンダントペプチドによる所望の接着ペプチド濃度を達成した。バックグラウンドヒドロゲルの弾性率を変化させるために、PEGNBとPEG-DTを合わせた重量%を4、6または8% w/vに変化させた。ヒドロゲルスポットの弾性率を変化させるために、PEGNB、分解性架橋分子および接着ペプチドを合わせた重量%を4.2、5および7% w/vに変化させた。
バックグラウンドヒドロゲルサンプルおよびヒドロゲルスポットのバルクサンプルにおいて質量平衡膨潤比およびせん断弾性率を測定した。質量平衡膨潤比(Q)を測定するために、20 μL液滴のヒドロゲル溶液を平らなテフロン表面上に分注し、365 nm UV光下、線量率90 mW/cm2で2秒間架橋させた。無血清M199中で24時間サンプルを膨潤させ、膨潤重量(Ws)を秤量した。その後、サンプルを脱イオン水で一夜洗浄して、ヒドロゲルからM199成分を除去し、-80℃にて2時間凍結させ、凍結乾燥した。乾燥したポリマーの乾燥重量(WD)を測定し、下記方程式により質量平衡膨潤比を計算した:
質量平衡膨潤比 Q=:WS/WD
従来のフォトリソグラフィー技術を用いて、ヒドロゲルアレイステンシルを製作し、2つの別のエラストマーパーツから形成した:マイクロウェルの厚さ200 μmのシートのおよび厚さ1 mmのベース。簡単に述べると、シリコンウェハー(University Wafer、マサチューセッツ州、ボストン)上への200 μm層のSU-8 100(Microchem、マサチューセッツ州、ニュートン)のスピンコーティングによってシリコンマスターモールドを製作した。配置された1 mm径柱のフォトレジストを、フォトマスク(Imagesetter、ウィスコンシン州、マディソン)を用いて決定した。Sylgard PDMS溶液と架橋溶液(Dow Corning、Midland、MI)を、体積比10:1にて組み合わせることによって、ポリ(ジメチルシロキサン(PDMS)を製造した。溶液を真空下で45分間脱気し、シリコンマスターモールドに注ぎいれ、ホットプレート上で85℃にて4時間架橋させ、シートの全厚さを貫通するマイクロウェルの厚さ200 μmのシートを形成した。ヒドロゲルアレイステンシルのベースを形成するために、ガラススライドの間にPDMS溶液を注ぎいれて、厚さ1 mmのシートを形成し、ホットプレート上で85℃にて4時間硬化させた。両方のステンシル構成要素を、ソックスレー抽出器によってヘキサン(Fisher)で洗浄し、真空下で残留溶媒を除去した。完成PDMSステンシルを、厚さ200 μmのシートを厚さ1 mmのベースの上に置くことによって形成した。
PDMSステンシルウェルに、0.4 μl液滴としてヒドロゲルスポット溶液を加えた(図14)。乾燥前にヒドロゲルスポットを固化させるために、5滴ずつパターニングした後に、365 nm UV光下、線量率90 mW/cm2で2秒間、液滴を架橋させた。フォトマスクを用いて、すでに硬化したスポットへの多重UV曝露を防止した。
ヒドロゲルアレイスポットへの制御可能なペプチド組み込みを検証するために、上記手順を用いて濃度0、0.01、0.1、1、2 mMのCRGDS(配列番号:2)がアレイにパターニングされるようなPEGNB、PEGNBに対して2xモル過剰の3.4 kDa PEGジチオールおよびPEGNB-CRGDS(配列番号:2)からなる12% w/v 総ポリマーのヒドロゲル溶液。バックグラウンドヒドロゲルは、スポットと組成的に同一であったが、 CRGDS(配列番号:2)を欠いた。ペプチドのN末端をフルオレセインで標識することによって、CRGDS(配列番号:2)濃度を検証した。簡単に述べると、PBS中のフルオレセイン複合スルホジクロロフェノールエステル(Invitrogen、ニューヨーク州、グランドアイランド)の3 μM溶液でアレイを処理し、一夜インキュベートし、次いで、新しいPBS中で24時間濯いだ。Nikon TI Eclipse顕微鏡を用いて、蛍光標識されたスポットを写真撮影し、ImageJソフトウェアを用いて蛍光強度を定量した。
ヒドロゲルアレイ製作において、ヒドロゲルスポットは、2 x 107細胞/mLの密度にてHUVECを包含した。PEGNB-CRGDS(配列番号:2)を添加して、CRGDS接着ペプチド(配列番号:2)の濃度を、0、0.25、0.5、1.0および2.0 mMに調節し、PEGNB-CRDGS(配列番号:2)を添加して、すべてのヒドロゲルスポット中の総ペンダントペプチド濃度を2 mMに維持した。総ポリマー重量%は、ヒドロゲルスポット中、4.2、5および7% w/vに変化させたが、バックグラウンド中、4、6および8% w/vに変化させ、低重量%ヒドロゲルスポットは低重量%バックグラウンドに対応し、高重量%ヒドロゲルスポットは高重量%バックグラウンドに対応した。生存能力実験において、封入された細胞のアレイを、増殖培地単独中で、または公知のVEGFR2シグナル伝達インヒビターである10 μM SU5416(Sigma Aldrich)を含む増殖培中で、48時間培養した。封入の24時間後に培地を交換した。48時間培養した後、アレイを無血清M199で洗浄し、M199中、5 μMのセルトラッカーグリーン(Invitrogen)で45分間染色した。15分間染色した後、染色溶液にヘキスト核染料(Invitrogen)を補足して、最終濃度10 μg/mLを達成した。染色後、アレイを無血清M199で洗浄し、2 μMのエチジウムホモダイマー(Invitrogen)を含む増殖培地中で30分間インキュベートした。次いで、アレイを1X PBSで洗浄し、10%中緩衝ホルマリン(Fisher)中で30分間固定した。アレイを1X PBS中に一夜浸漬し、48時間の固定中に、Nikon TE300蛍光顕微鏡を用いて写真撮影した。生細胞核の数を、柱内の核の総数で割ることによって生存能力を定量した。
HUVECを、5.0 x 104細胞/cm2の密度で組織培養ポリスチレン(TCPS)24-ウェルプレートに置いた。細胞を、増殖培地単独中で、または10 μM SU5416を含む増殖培中で、24時間増殖させた。その後、培地を、10 μM SU5416および20 μM EdUを含むか、または含まない新鮮な増殖培地と交換したClick-iT EdU 594増殖キット(Invitrogen)。5時間のインキュベーション後、細胞を、10%緩衝ホルマリン中で30分間固定し、Click-iT EdU 488増殖キット(Invitrogen)を用いて染色した。染色手順を、製造者の使用説明書とは僅かに変更し、アレクサフルオロ(登録商標)488を推奨濃度の半分に希釈した。細胞を、Nikon TE300蛍光顕微鏡を用いて写真撮影し、EdUに対する核染色ポジティブを計数し、核の総数に対して正規化することによって、増殖を定量した。
HUVECを、2 x 107細胞/mLの密度で増殖因子低減(growth factor-reduced)マトリゲル(登録商標)(BD Biosciences、カリフォルニア州、サンノゼ)中に懸濁させた。厚さ200 μmのマイクロウェルのPDMSシートをガラススライドの上に置き、マトリゲル(登録商標)-細胞懸濁液を、0.4 μlの液滴としてマイクロウェルに分注した。マトリゲル(登録商標)「スポット」のアレイを、37℃にて30分間インキュベートし、増殖培地単独中、または10 μM SU5416を含む増殖培地中に浸漬した。48時間の培養後、アレイを、PEGヒドロゲル中での生存能力アッセイと同様にセルトラッカーグリーンで染色したが、ヘキスト核染料またはエチジウムホモダイマーは用いなかった。アレイを、1X PBSで洗浄し、10%緩衝ホルマリン中で30分間固定した。封入の48時間後に、Nikon TI Eclipse顕微鏡を用いて、各スポットの緑色蛍光および位相差zスタック画像を撮影した。個々のスポット内の総CLS長さを手作業で定量した。
10 μl容のヒドロゲル中のHUVEC細管形成を定性的に評価して、CLS形成におけるヒドロゲル閉じ込めの効果を決定した。ここで、ヒドロゲルは、4.2% w/vの総ポリマー、PEGNBに対して2Xモル過剰の細胞分解性化合物共ペプチドおよびPEGNB-CRGDS(配列番号:2)を含み、2 mMのCRGDS(配列番号:2)の濃度を確立した。これらのヒドロゲルにおいて用いたHUVECを、トリプシン処理前に、1 μMのセルトラッカーグリーンで処理した。簡単に述べると、細胞を無血清M199で洗浄し、Ml99中、セルトラッカーグリーンで45分間染色した。染色後、細胞を無血清M199で洗浄し、増殖培地中で30分間インキュベートした。トリプシン処理後、2 x 107細胞/mLの密度で細胞をPEGヒドロゲル溶液に懸濁させた。
等分散を仮定する、両側スチューデントT検定を用いて、統計的差異を計算した。統計的有意さをp<0.05として示した。
ヒドロゲル平衡膨潤比および複合せん断弾性率
分解性ヒドロゲルスポットおよび不活バックグラウンドヒドロゲルの性膨潤特性および弾性率を、製剤に含まれるポリマーの重量%を調節することによって制御した。4.2、5および7% w/vのポリマーを含有するヒドロゲルスポット製剤の質量平衡膨潤比は、それぞれ、42.1±2.1、28.7±2.9および21.6±0.4であった。4、6および8% w/vのポリマーを含有するバックグラウンドヒドロゲルの平衡膨潤比は、それぞれ、34.9±0.9、23.9±0.9および21.3±1.1であった(図15A)。培養中にスポットを係留するための、より安定な基質を提供するために、バックグラウンドヒドロゲルは、ヒドロゲルスポットと類似しているが、わずかに低い膨潤比を持つように設計された。4.2、5および7% w/vのポリマーを含有するヒドロゲルスポット製剤の弾性率は、それぞれ、260±140 Pa、980±210 Paおよび3220±610 Paであった。したがって、データの表示を明確にするために、実験期間中、4.2、5および7% w/vのヒドロゲルを「低」、「中」および「高」弾性率ヒドロゲルと称する。4、6 and 8% w/vのポリマーを含有するバックグラウンドヒドロゲルの弾性率は、それぞれ、1040±100 Pa、3100±220 Paおよび4160±350 Paであった(図15B)。実施例用に選ばれた弾性率の範囲(〜260-3220 Pa)は、機械的特性ならびに血管新生の程度において異なる組織の2つの例である、声帯ヒダ基底膜などの軟組織、ならびに正常乳房組織およびガン性乳房組織などの広範囲の組織に及ぶ。
本実施例におけるヒドロゲル構築物は、制御された濃度のCRGDS(配列番号:2)を含有する配置されたPEGヒドロゲルスポットからなった。CRGDS(配列番号:2)またはCRDGS(配列番号:32)によるPEGNBの官能化効率を、NMRを用いて確認した。接着ペプチドCRGDS(配列番号:2)およびCRDGS(配列番号:32)を、2Xモル過剰にてPEGNBに反応させて、細胞接着ペプチドで、平均してPEGNB分子の8アームの2つを装飾した。PEGNBに対して2xモル過剰のCRGDS(配列番号:2)の存在は、PEG分子上に存在するアルケンプロトンの24.8±4.1 %の減少をもたらし、PEGNBに対して2xモル過剰のCRDGS(配列番号:32)の存在は、アルケンプロトンの25.7±4.9%の減少をもたらした(図15C)。これは、予想どおり、所定のPEGNB分子上の8つの利用可能なノルボルネン基のうちのおよそ2つが、接着ペプチドに結合したことを示す。
次いで、封入されたHUVECの生存能力を定量して、細胞が、封入およびアレイパターニング過程を持ちこたえることを検証し、細胞生存を維持することにおける接着リガンド密度および剛性の効果を評価した。細胞生存能力は、一般に、CRGDS(配列番号:2)を増加させると増加し、高弾性率条件は、生存能力を抑制した。すべての条件において、HUVECは、総封入細胞の40%以上の生存能力レベルを提示し、最低の生存能力レベルは、0 mMのCRGDS(配列番号:2)を含有するスポットにおいて観察された。 CRGDS(配列番号:2)濃度の増加は、すべての弾性率条件において生存能力を増加させ、最大の生存能力は、0.5および1.0 mMのCRGDS(配列番号:2)において観察された。これらのCRGDS(配列番号:2)濃度において、低弾性率ヒドロゲルは、高弾性率条件での等価なCRGDS(配列番号:2)濃度と比較して、最高の生存能力レベルを促進した。しかしながら、CRGDS(配列番号:2)濃度が1.0から2.0 mMに増加した場合、低および中弾性率ヒドロゲル中での生存能力は減少した。この減少は、0 mMのCRGDS(配列番号:2)濃度で観察されたレベルより下へは生存能力を低下させず、2.0 mMのCRGDS(配列番号:2)濃度が、有害ではないが、非接着条件と比較して、HUVECの生存能力にとって準最適であることが示された。高弾性率条件では、1.0 mMのCRGDS(配列番号:2)と比較した場合、2.0 mMではHUVECの生存能力において有意な減少はなく、高濃度のCRGDS(配列番号:2)の存在下で生存能力を維持することにおける剛性の役割が示唆された(図16A)。
S期の封入されたHUVECの核を標識し、定量することによって、増殖における細胞接着および剛性の効果を決定した。すべての弾性率条件において、ヒドロゲルへのCRGDS(配列番号:2)の添加は、CRGDS(配列番号:2)を欠いているスポットを大きく越えて細胞増殖を増加させた(図17A)。増殖は、CRGDS(配列番号:2)の増加に関しては単調な傾向に従わず、高弾性率ヒドロゲルは、低および中弾性率条件と比較して、増殖を抑制する傾向にあった。特に、低および中弾性率条件における増殖は、増加するCRGDS(配列番号:2)に対して二相性の応答を示した。増殖は、低弾性率条件において、0.25および2.0 mMのCRGDS(配列番号:2)と比較して、0.5 mMのCRGDS(配列番号:2)の方がより低く、中弾性率条件において、2.0 mMのCRGDS(配列番号:2)と比較して、0.5および1.0 mMのCRGDS(配列番号:2)の方がより低かった。高弾性率条件において、全体的な増殖率は、低および中弾性率条件における増殖率よりも有意に低く、CRGDS(配列番号:2)を含む条件間で有意な差異は存在しなかった。増殖におけるECM効果に加えて、大部分の増殖細胞が、多細胞構造と共局在したことが定性的に注目される(図17D)。
細胞接着およびヒドロゲル剛性は、ヒドロゲルスポットにおける総毛細管様構造(CLS)長さに有意に影響を及ぼし、CRGDS(配列番号:2)濃度および弾性率の最適レベルは、試験した条件の範囲におけるCLS形成を最大化した。すべての弾性率条件において、CLS形成は、CRGDS(配列番号:2)の不在下では稀であった。低弾性率条件において、CLS形成は、1.0 mMの濃度までCRGDS(配列番号:2)の増加とともに増加し、2.0 mMのCRGDS(配列番号:2)において減少した。この傾向は、中弾性率条件においては観察されず、形成は、2.0 mMのCRGDS(配列番号:2)まで上昇したままであった(図18A)。高弾性率条件において、CLS形成は、CRGDS(配列番号:2)を欠いている条件と比較して、0.25、0.5および1.0 mMのCRGDS(配列番号:2)にて有意に増加したが、この上昇は、2.0 mMのCRGDS(配列番号:2)においてはもはや有意ではなかった。0.5 mMのCRGDS(配列番号:2)でのCLS形成は、高弾性率条件において、低弾性率条件と比較して有意に低く、1.0および2.0 mMのCRGDS(配列番号:2)でのCLS形成は、高弾性率条件において、中弾性率条件と比較して有意に低く、剛性の高さが、これらのヒドロゲルにおけるCLS形成を妨げた。総合すれば、これらの結果は、細管形成が、CRGDS(配列番号:2)の増加とともに増加するが、最も有意な増加は、過度に柔軟または剛性でない最適中弾性率条件において観察されることを示唆する。
SU5416は、VEGFR2リン酸化に対するインヒビターであり、増殖培地にSU5416を添加することによってVEGFシグナル伝達を阻害することが、従来の細胞培養系においてHUVEC増殖および細管形成を低下させることが確認された。特に、HUVECを組織培養ポリスチレン(TCPS)表面上に播種し、増殖についてアッセイした場合、VEGFR2阻害は、増殖培地コントロールと比較して、増殖において20%の減少をもたらした(図19A)。HUVECを増殖因子低減マトリゲル(登録商標)中に封入し、CLS形成についてアッセイした場合、VEGFR2阻害は、増殖培地のみでインキュベートされたHUVECと比較して、総細管長さにおいて50%の減少をもたらした(図19Bおよび19C)。
これは、HUVEC生存能力との関連において、VEGFR2とインテグリン媒介性細胞接着との間の相乗的相互作用も示唆する。しかしながら、正常なVEGFR2は、通常、阻害されたVEGFR2と比較して生存能力レベルを増加させたが、正常なVEGFR2条件と阻害された条件との間の差異は、CRGDS(配列番号:2)濃度が増加すると減少した。すべての弾性率条件において、VEGFR2阻害による生存能力の低下は、2 mMのCRGDS(配列番号:2)を含むスポットにおいては有意ではなく、増加したCRGDS(配列番号:2)の存在下での生存能力を調節することにおけるVEGFR2の役割が弱いことを示す。さらに、生存能力におけるVEGFR2阻害の効果は、CRGDS(配列番号:2)濃度が0.5 mM以上である場合、高弾性率条件において有意ではなく(図16C)、VEGFR2の役割が、低弾性率ヒドロゲルと比較して、高弾性率において実質的ではなかったことを示す。
多くの先行研究と比較した場合に、本実施例にて提供されるヒドロゲルアレイの1つの特徴は、ヒドロゲルが物理的に拘束される度合いである。たとえば、標準的プラスチックウェルプレートまたはエラスロマーデバイスにて形成されたヒドロゲルは、典型的に、高度に拘束されるが、本開示のアレイプラットホームにおけるヒドロゲルスポットは、バックグラウンドヒドロゲルと共同して膨潤する。堅い基質に拘束されたヒドロゲル中のCLS形成と、非拘束ヒドロゲルとの比較をさらに理解するために、48ウェルプレートに拘束されるか、または基質から離脱したヒドロゲルにおけるCLS形成空間分布を定性的に観察し、培地中で自由に膨潤させた。拘束されたヒドロゲルは、膨潤中に物理的な「座屈」の影響を受けやすく、ヒドロゲルの真中に、焦点外領域をもたらした(図20A)。座屈は、座屈したヒドロゲル領域の端の周りを形成する構造の大部分において、CLS形成中に不均質を引き起こした。対照的に、非拘束ヒドロゲルにおけるCLS形成は、本実施例のヒドロゲルアレイスポットにおける観察と同様に、ヒドロゲルの体積全体に均質に起こった(図20B)。これらの観察は、拘束されたヒドロゲルにおける細胞封入が、3D新血管新生実験の結果に有意に影響を及ぼす、膨潤における潜在的な変数を導入しうることを示唆する。
本発明は、次の態様を含む。
[1] 細管形成促進剤および抗細管形成剤のスクリーニング方法であって、
ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、細胞接着ペプチドおよび可溶性因子結合剤を含む)を製造すること;
細管形成を促進または減少させると思われる作用剤を提供すること;
細胞を、ヒドロゲル組成物および作用剤に接触させること;および
細胞を分析すること;を含む方法。
[2] 該剤がヒドロゲル組成物にカップリングする、[1]に記載の方法。
[3] 該剤が細胞培養培地内に含まれ、細胞培養培地がヒドロゲル組成物に接触する、[1]に記載の方法。
[4] 細胞接着ペプチドが、CRGDS(配列番号: 2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD[Fd]C(配列番号:33)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、CPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)、RKRLQVQLSIRT(配列番号:37)、IKVAV(配列番号:38)、YIGSR(配列番号:39)、KRTGQYKL(配列番号:40)、TYRSRKY(配列番号:41)、KRTGQYKLGSKTGPGQK(配列番号:42)、QAKHKQRKRLKSSC(配列番号:43)、およびSPKHHSQRARKKKNKNC(配列番号:44)から選ばれる、[1]に記載の方法。
[5] 架橋ペプチドが、KCGGPQGIWGQGCK(配列番号:27)およびKCGGPQGIAGQGCK(配列番号:28)から選ばれるアミノ酸配列を含む、[1]に記載の方法。
[6] 可溶性因子結合剤が、配列番号:22-26から選ばれるアミノ酸配列を含む、[1]に記載の方法。
[7] 細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の神経細胞、胚性幹細胞由来の神経前駆細胞、胚性幹細胞由来の星状膠細胞、胚性幹細胞由来の小膠細胞、胚性幹細胞由来の内皮細胞、胚性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、誘導多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞由来の神経前駆細胞、誘導多能性幹細胞由来の星状膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の小膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、間葉系幹細胞、臍帯静脈内皮細胞、NIH 3T3線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、線維肉腫細胞、弁間質細胞、心筋細胞、誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞、内皮前駆細胞、循環脈管形成細胞、神経細胞、周皮細胞、癌細胞、肝細胞、膵臓β細胞、膵島細胞およびその組合せから選ばれる、[1]に記載の方法。
[8] 細管形成を促進する方法であって、
ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、細胞接着ペプチドおよび可溶性因子結合剤を含む)を製造すること;
ヒドロゲル組成物に接触している培養培地を提供すること;
ヒドロゲル組成物に接触している培養培地に、細胞を接触させること;および
細胞を分析すること;を含む方法。
[9] 細胞接着ペプチドが、CRGDS(配列番号: 2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD[Fd]C(配列番号:33)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、CPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)、RKRLQVQLSIRT(配列番号:37)、IKVAV(配列番号:38)、YIGSR(配列番号:39)、KRTGQYKL(配列番号:40)、TYRSRKY(配列番号:41)、KRTGQYKLGSKTGPGQK(配列番号:42)、QAKHKQRKRLKSSC(配列番号:43)、およびSPKHHSQRARKKKNKNC(配列番号:44)から選ばれる、[8]に記載の方法。
[10] 架橋ペプチドが、KCGGPQGIWGQGCK(配列番号:27)およびKCGGPQGIAGQGCK(配列番号:28)から選ばれるアミノ酸配列を含む、[8]に記載の方法。
[11] 可溶性因子結合剤が、配列番号:22-26から選ばれるアミノ酸配列を含む、[8]に記載の方法。
[12] 細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の神経細胞、胚性幹細胞由来の神経前駆細胞、胚性幹細胞由来の星状膠細胞、胚性幹細胞由来の小膠細胞、胚性幹細胞由来の内皮細胞、胚性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、誘導多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞由来の神経前駆細胞、誘導多能性幹細胞由来の星状膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の小膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、間葉系幹細胞、臍帯静脈内皮細胞、NIH 3T3線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、線維肉腫細胞、弁間質細胞、心筋細胞、誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞、内皮前駆細胞、循環脈管形成細胞、神経細胞、周皮細胞、癌細胞、肝細胞、膵臓β細胞、膵島細胞およびその組合せから選ばれる、[8]に記載の方法。
[13] 細管形成が、内皮細胞細管ネットワーク形成を含む、[8]に記載の方法。
[14] ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、細胞接着ペプチドおよび可溶性因子結合剤を含むヒドロゲル組成物。
[15] ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールが、ノルボルネンで官能化された8-アーム,20 kDaのポリエチレングリコールを含む、[14]に記載のヒドロゲル組成物。
[16] 細胞接着ペプチドが、CRGDS(配列番号: 2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD[Fd]C(配列番号:33)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、CPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、CRDGS(配列番号:32)、環状RGD[Fd]C(配列番号:33)、RKRLQVQLSIRT(配列番号:37)、IKVAV(配列番号:38)、YIGSR(配列番号:39)、KRTGQYKL(配列番号:40)、TYRSRKY(配列番号:41)、KRTGQYKLGSKTGPGQK(配列番号:42)、QAKHKQRKRLKSSC(配列番号:43)、およびSPKHHSQRARKKKNKNC(配列番号:44)から選ばれる、[14]に記載のヒドロゲル組成物。
[17] 可溶性因子結合剤が、配列番号:22-26から選ばれるアミノ酸配列を含む、[14]に記載のヒドロゲル組成物。
[18] 約0.1 kPa〜約300 kPaの範囲の弾性率を有する、[14]に記載のヒドロゲル組成物。
[19] ポリエチレングリコールの濃度が、約36 mg/mL〜約70 mg/mLである、[14]に記載のヒドロゲル組成物。
[20] 約30%〜約70%の架橋を含む、[14]に記載のヒドロゲル組成物。
Claims (20)
- 細管形成促進剤および抗細管形成剤のスクリーニング方法であって、
ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、細胞接着ペプチドおよび可溶性因子結合剤を含む)を製造すること;
細管形成を促進または減少させると思われる作用剤を提供すること;
細胞を、ヒドロゲル組成物および作用剤に接触させること;および
細胞を分析すること;を含む方法。 - 該剤がヒドロゲル組成物にカップリングする、請求項1に記載の方法。
- 該剤が細胞培養培地内に含まれ、細胞培養培地がヒドロゲル組成物に接触する、請求項1に記載の方法。
- 細胞接着ペプチドが、CRGDS(配列番号: 2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD[Fd]C(配列番号:33)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、CPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)、RKRLQVQLSIRT(配列番号:37)、IKVAV(配列番号:38)、YIGSR(配列番号:39)、KRTGQYKL(配列番号:40)、TYRSRKY(配列番号:41)、KRTGQYKLGSKTGPGQK(配列番号:42)、QAKHKQRKRLKSSC(配列番号:43)、およびSPKHHSQRARKKKNKNC(配列番号:44)から選ばれる、請求項1に記載の方法。
- 架橋ペプチドが、KCGGPQGIWGQGCK(配列番号:27)およびKCGGPQGIAGQGCK(配列番号:28)から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 可溶性因子結合剤が、配列番号:22-26から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の神経細胞、胚性幹細胞由来の神経前駆細胞、胚性幹細胞由来の星状膠細胞、胚性幹細胞由来の小膠細胞、胚性幹細胞由来の内皮細胞、胚性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、誘導多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞由来の神経前駆細胞、誘導多能性幹細胞由来の星状膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の小膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、間葉系幹細胞、臍帯静脈内皮細胞、NIH 3T3線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、線維肉腫細胞、弁間質細胞、心筋細胞、誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞、内皮前駆細胞、循環脈管形成細胞、神経細胞、周皮細胞、癌細胞、肝細胞、膵臓β細胞、膵島細胞およびその組合せから選ばれる、請求項1に記載の方法。
- 細管形成を促進する方法であって、
ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、細胞接着ペプチドおよび可溶性因子結合剤を含む)を製造すること;
ヒドロゲル組成物に接触している培養培地を提供すること;
ヒドロゲル組成物に接触している培養培地に、細胞を接触させること;および
細胞を分析すること;を含む方法。 - 細胞接着ペプチドが、CRGDS(配列番号: 2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD[Fd]C(配列番号:33)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、CPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)、RKRLQVQLSIRT(配列番号:37)、IKVAV(配列番号:38)、YIGSR(配列番号:39)、KRTGQYKL(配列番号:40)、TYRSRKY(配列番号:41)、KRTGQYKLGSKTGPGQK(配列番号:42)、QAKHKQRKRLKSSC(配列番号:43)、およびSPKHHSQRARKKKNKNC(配列番号:44)から選ばれる、請求項8に記載の方法。
- 架橋ペプチドが、KCGGPQGIWGQGCK(配列番号:27)およびKCGGPQGIAGQGCK(配列番号:28)から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
- 可溶性因子結合剤が、配列番号:22-26から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
- 細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の神経細胞、胚性幹細胞由来の神経前駆細胞、胚性幹細胞由来の星状膠細胞、胚性幹細胞由来の小膠細胞、胚性幹細胞由来の内皮細胞、胚性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、誘導多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞由来の神経前駆細胞、誘導多能性幹細胞由来の星状膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の小膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、間葉系幹細胞、臍帯静脈内皮細胞、NIH 3T3線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、線維肉腫細胞、弁間質細胞、心筋細胞、誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞、内皮前駆細胞、循環脈管形成細胞、神経細胞、周皮細胞、癌細胞、肝細胞、膵臓β細胞、膵島細胞およびその組合せから選ばれる、請求項8に記載の方法。
- 細管形成が、内皮細胞細管ネットワーク形成を含む、請求項8に記載の方法。
- ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、細胞接着ペプチドおよび可溶性因子結合剤を含むヒドロゲル組成物。
- ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールが、ノルボルネンで官能化された8-アーム,20 kDaのポリエチレングリコールを含む、請求項14に記載のヒドロゲル組成物。
- 細胞接着ペプチドが、CRGDS(配列番号: 2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、環状RGD[Fd]C(配列番号:33)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号:29)、CPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号:30)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号:31)、CRDGS(配列番号:32)、環状RGD[Fd]C(配列番号:33)、RKRLQVQLSIRT(配列番号:37)、IKVAV(配列番号:38)、YIGSR(配列番号:39)、KRTGQYKL(配列番号:40)、TYRSRKY(配列番号:41)、KRTGQYKLGSKTGPGQK(配列番号:42)、QAKHKQRKRLKSSC(配列番号:43)、およびSPKHHSQRARKKKNKNC(配列番号:44)から選ばれる、請求項14に記載のヒドロゲル組成物。
- 可溶性因子結合剤が、配列番号:22-26から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載のヒドロゲル組成物。
- 約0.1 kPa〜約300 kPaの範囲の弾性率を有する、請求項14に記載のヒドロゲル組成物。
- ポリエチレングリコールの濃度が、約36 mg/mL〜約70 mg/mLである、請求項14に記載のヒドロゲル組成物。
- 約30%〜約70%の架橋を含む、請求項14に記載のヒドロゲル組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461978032P | 2014-04-10 | 2014-04-10 | |
US61/978,032 | 2014-04-10 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016561787A Division JP2017513473A (ja) | 2014-04-10 | 2015-04-10 | 細管形成を促進するためのヒドロゲル組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020078309A true JP2020078309A (ja) | 2020-05-28 |
JP2020078309A5 JP2020078309A5 (ja) | 2020-07-09 |
Family
ID=54264594
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016561792A Pending JP2017513474A (ja) | 2014-04-10 | 2015-04-10 | 細胞伸長および分化における使用のためのヒドロゲル組成物 |
JP2016561787A Pending JP2017513473A (ja) | 2014-04-10 | 2015-04-10 | 細管形成を促進するためのヒドロゲル組成物 |
JP2020002977A Ceased JP2020078309A (ja) | 2014-04-10 | 2020-01-10 | 細管形成を促進するためのヒドロゲル組成物 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016561792A Pending JP2017513474A (ja) | 2014-04-10 | 2015-04-10 | 細胞伸長および分化における使用のためのヒドロゲル組成物 |
JP2016561787A Pending JP2017513473A (ja) | 2014-04-10 | 2015-04-10 | 細管形成を促進するためのヒドロゲル組成物 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US10195313B2 (ja) |
EP (2) | EP3129494B1 (ja) |
JP (3) | JP2017513474A (ja) |
WO (2) | WO2015157732A1 (ja) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3080246A4 (en) * | 2013-12-11 | 2017-05-24 | The Regents of The University of California | Compositions and methods for producing and administering brown adipocytes |
CA2976005A1 (en) | 2015-02-06 | 2016-08-11 | Cell Idx, Inc. | Antigen-coupled immunoreagents |
WO2017036533A1 (en) | 2015-09-03 | 2017-03-09 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Three-dimensional hydrogels for culturing adult epithelial stem cells and organoids |
US20200292944A1 (en) | 2015-11-18 | 2020-09-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of making a patterned hydrogel and kit to make it |
CN108368481A (zh) * | 2015-12-28 | 2018-08-03 | 日本瑞翁株式会社 | 培养细胞的分化促进方法以及培养细胞分化促进剂 |
JP7130919B2 (ja) * | 2016-03-11 | 2022-09-06 | 三菱瓦斯化学株式会社 | 生体物質固定化方法 |
US20190298851A1 (en) * | 2016-06-01 | 2019-10-03 | The Texas A&M University System | Sequential click reactions for the synthesis and functionalization of hydrogel microspheres and substrates |
CN109716130B (zh) * | 2016-07-18 | 2023-05-23 | 赛尔伊迪克斯公司 | 抗原偶联的杂交试剂 |
KR102350656B1 (ko) | 2017-02-17 | 2022-01-12 | (주)옵토레인 | 면역진단 카트리지 |
WO2018168955A1 (ja) * | 2017-03-15 | 2018-09-20 | メカノジェニック株式会社 | 細胞のin vivoでの特性を反映した細胞の反応の評価 |
WO2018222611A1 (en) | 2017-05-30 | 2018-12-06 | Stem Pharm, Incorporated | Visible light polymerization of polyethylene glycol (peg) hydrogels |
US10927148B2 (en) * | 2017-11-06 | 2021-02-23 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Wet adhesive peptide materials and their use |
US11298441B2 (en) * | 2017-11-08 | 2022-04-12 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Biodegradable biomimetics of growth plate cartilage for the treatment of physeal injuries |
JP2021506319A (ja) * | 2017-12-22 | 2021-02-22 | アンスティテュ・パストゥール | ヒドロゲル型の生体機能チップマイクロ流体デバイス |
US10875891B2 (en) * | 2018-05-13 | 2020-12-29 | Mackay Memorial Hospital | Short synthetic peptide and uses thereof |
US11090651B2 (en) | 2018-05-31 | 2021-08-17 | University Of Washington | Fluidic patterning of hydrogel partitions |
EP3859005A4 (en) * | 2018-09-28 | 2022-06-29 | Zeon Corporation | Cardiotoxicity assessment method |
CN109593704B (zh) * | 2019-01-31 | 2022-02-11 | 北京华龛生物科技有限公司 | 一种三维微载体细胞吸附培养的方法 |
US20200318075A1 (en) * | 2019-04-02 | 2020-10-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Human pluripotent stem cell-derived brain organoids for cancer modeling and drug screening |
US11426959B2 (en) | 2019-11-06 | 2022-08-30 | Innovega, Inc. | Apparatuses and methods for multistage molding of lenses |
US20230212516A1 (en) * | 2020-06-02 | 2023-07-06 | Cornell University | Methods for expanding hematopoietic stem cells |
CN115043969B (zh) * | 2021-03-08 | 2024-03-29 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种具有表面图案化的凝胶、制备方法和用途 |
EP4337791A1 (en) * | 2021-05-10 | 2024-03-20 | Trustees of Boston University | Printed biogel nanosensors |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130296177A1 (en) * | 2012-05-07 | 2013-11-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chemically-defined arrays for screening cell-substrate interactions |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7902121B2 (en) * | 2001-07-02 | 2011-03-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | MHC-antigen arrays for detection and characterization of immune responses |
US20060134781A1 (en) * | 2004-12-07 | 2006-06-22 | Bacterin International, Inc. | Three-dimensional cell culture system |
US8062890B2 (en) * | 2005-08-15 | 2011-11-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Defined surfaces of self-assembled monolayers and stem cells |
US20100015709A1 (en) * | 2006-02-10 | 2010-01-21 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Regulating Stem Cell Differentiation By Controlling 2D and 3D Matrix Elasticity |
US20070217019A1 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Wen-Kuei Huang | Optical components array device, microlens array and process of fabricating thereof |
US9297005B2 (en) * | 2009-04-13 | 2016-03-29 | President And Fellows Of Harvard College | Harnessing cell dynamics to engineer materials |
US20100291045A1 (en) * | 2009-05-15 | 2010-11-18 | University Of Delaware | Dynamic vibrational method and device for vocal fold tissue growth |
EP2504432B1 (en) | 2009-11-10 | 2018-02-14 | The Johns Hopkins University | Hydrogel-based vascular lineage cell growth media and uses thereof |
KR101067827B1 (ko) * | 2010-03-19 | 2011-09-27 | 포항공과대학교 산학협력단 | 3차원 인공 지지체 및 그 제조방법 |
US20110269231A1 (en) * | 2010-04-22 | 2011-11-03 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Proteoglycan-binding peptides that modulate stem cell behavior |
US8778869B2 (en) * | 2010-06-09 | 2014-07-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Tissue regeneration system |
WO2011156686A2 (en) | 2010-06-11 | 2011-12-15 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Method for synthesizing a cyclic multivalent peptide using a thiol-mediated reaction |
US9315772B2 (en) | 2010-06-22 | 2016-04-19 | Universite De Rouen | Crosslinked hyaluronan hydrogels for 3D cell culture |
JP2013538864A (ja) | 2010-10-08 | 2013-10-17 | ソルヴェイ(ソシエテ アノニム) | 生物活性アミノ酸配列及びその使用 |
US9234171B2 (en) | 2010-12-08 | 2016-01-12 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Stem cell differentiation using novel light-responsive hydrogels |
CN103146572B (zh) * | 2011-12-07 | 2016-01-06 | 清华大学 | 一种实现细胞集落均质性生长的装置和方法 |
EP2666486A1 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-27 | Université de Mons | Micro-engineered hydrogels |
EP2684601B1 (en) * | 2012-07-13 | 2019-11-20 | Karlsruher Institut für Technologie | Formation of droplet or hydrogel arrays using hydrophilic-hydrophobic patterned surfaces for high-throughput screening applications |
US9402710B2 (en) | 2012-07-16 | 2016-08-02 | The Board Of Trustees For The Leland Stanford Junior University | Macroporous 3-D scaffolds for tissue engineering |
EP2885015B1 (en) * | 2012-08-17 | 2022-09-28 | AMSilk GmbH | Use of self-assembling polypeptides as tissue adhesives |
KR101311325B1 (ko) * | 2012-09-13 | 2013-09-30 | 이상재 | 합성 디자인된 3차원 미세환경 구조물 |
WO2014052458A1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Yale University | Differentiation of human ips cells to human alveolar type ii via definitive endoderm |
CN103864900A (zh) * | 2014-03-28 | 2014-06-18 | 甘少磊 | 一种诱导成骨短肽及其制备方法和用途 |
-
2014
- 2014-07-24 US US14/339,938 patent/US10195313B2/en active Active
-
2015
- 2015-04-10 EP EP15775947.3A patent/EP3129494B1/en active Active
- 2015-04-10 US US14/684,120 patent/US9683213B2/en active Active
- 2015-04-10 JP JP2016561792A patent/JP2017513474A/ja active Pending
- 2015-04-10 JP JP2016561787A patent/JP2017513473A/ja active Pending
- 2015-04-10 WO PCT/US2015/025473 patent/WO2015157732A1/en active Application Filing
- 2015-04-10 US US14/684,062 patent/US9688957B2/en active Active
- 2015-04-10 EP EP15777338.3A patent/EP3129465B1/en active Active
- 2015-04-10 WO PCT/US2015/025479 patent/WO2015157737A1/en active Application Filing
-
2017
- 2017-05-16 US US15/596,529 patent/US20170246357A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-01-10 JP JP2020002977A patent/JP2020078309A/ja not_active Ceased
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130296177A1 (en) * | 2012-05-07 | 2013-11-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chemically-defined arrays for screening cell-substrate interactions |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BIOMACROMOLECULES, vol. 12, no. 7, JPN6019002843, 6 June 2011 (2011-06-06), pages 2715 - 2722, ISSN: 0004447710 * |
BIOMATERIALS, vol. 35, no. 7, JPN6019002840, 11 December 2013 (2013-12-11), pages 2149 - 2161, ISSN: 0004447709 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2017513474A (ja) | 2017-06-01 |
US20150291930A1 (en) | 2015-10-15 |
EP3129494A1 (en) | 2017-02-15 |
US9688957B2 (en) | 2017-06-27 |
US10195313B2 (en) | 2019-02-05 |
EP3129465B1 (en) | 2019-09-04 |
WO2015157732A1 (en) | 2015-10-15 |
EP3129465A4 (en) | 2017-04-19 |
EP3129494B1 (en) | 2019-09-18 |
WO2015157737A1 (en) | 2015-10-15 |
US20150293073A1 (en) | 2015-10-15 |
US20150291929A1 (en) | 2015-10-15 |
EP3129465A1 (en) | 2017-02-15 |
US9683213B2 (en) | 2017-06-20 |
JP2017513473A (ja) | 2017-06-01 |
EP3129494A4 (en) | 2017-04-12 |
US20170246357A1 (en) | 2017-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2020078309A (ja) | 細管形成を促進するためのヒドロゲル組成物 | |
Revzin et al. | Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography | |
Xia et al. | A review of gradient stiffness hydrogels used in tissue engineering and regenerative medicine | |
Karp et al. | A photolithographic method to create cellular micropatterns | |
Hynd et al. | Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces | |
Revzin et al. | Surface engineering with poly (ethylene glycol) photolithography to create high-density cell arrays on glass | |
Nagase et al. | Temperature-responsive intelligent interfaces for biomolecular separation and cell sheet engineering | |
Hong et al. | Protein surface patterning using nanoscale PEG hydrogels | |
Teare et al. | Cellular attachment to ultraviolet ozone modified polystyrene surfaces | |
Krsko et al. | Electron-beam surface-patterned poly (ethylene glycol) microhydrogels | |
Aydin et al. | Polymeric substrates with tunable elasticity and nanoscopically controlled biomolecule presentation | |
You et al. | Multilayered heparin hydrogel microwells for cultivation of primary hepatocytes | |
Kumar et al. | Spatially controlled cell engineering on biomaterials using polyelectrolytes | |
Le et al. | Hydrogel arrays formed via differential wettability patterning enable combinatorial screening of stem cell behavior | |
US9694338B2 (en) | Covalently-immobilized hydrogel arrays in multi-well plates | |
He et al. | Origami-based self-folding of co-cultured NIH/3T3 and HepG2 cells into 3D microstructures | |
Cėpla et al. | Photografting and Patterning of Poly (ethylene glycol) Methacrylate Hydrogel on Glass for Biochip Applications | |
WO2007029554A1 (ja) | マイクロパターニング培養基板、マイクロパターニング培養構築物及びこれらの作成方法 | |
Erkoc‐Biradli et al. | Bioinspired hydrogel surfaces to augment corneal endothelial cell monolayer formation | |
Jayasinghe et al. | Formation of stem cell aggregates and their differentiation on surface-patterned hydrogels based on poly (2-hydroxyethyl methacrylate) | |
Pandala et al. | Screen printing tissue models using chemically cross-linked hydrogel systems: a simple approach to efficiently make highly tunable matrices | |
US20200017823A1 (en) | Hydrogel compositions for use in neural cell expansion and differentiation | |
Choi et al. | Photo-Crosslinkable Polymeric Coatings Providing Chemically Versatile Reactive Surfaces on Various Substrates | |
US20080113334A1 (en) | Test method using cells and test kit therefor | |
Aware et al. | Polymethylmethacrylate Copolymer-Based Microcarriers for Culturing Mammalian Cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200207 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200526 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210519 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210914 |
|
A045 | Written measure of dismissal of application [lapsed due to lack of payment] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A045 Effective date: 20220125 |