JP7130919B2 - 生体物質固定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質、ペプチド、核酸及びこれらの混合物から成る生体物質を基体上に安定に固定する生体物質固定化方法に関する。本発明は、特に、生体物質を固定した後、抗原抗体反応を発現させ、この抗原抗体反応を検査分析する方法に好適に使用可能である。
ここでいうペプチドとは、構成アミノ酸残基数がおよそ５０以下のポリペプチドの総称とする。

基体表面に小スポット状にＤＮＡやタンパク質などの多種類の生体物質を被固定化物質として配したマイクロアレイ型計測法では、基体上に被固定化物質をスポットして固定する、あるいは基体上で所望の生体物質を合成する方法がある。

マイクロアレイ型計測を行う免疫測定のためのタンパクチップには、抗体又は抗原を何らかの形で基体上に固定化することが必要である。合成法が主流となっているＤＮＡチップに対して、タンパクチップやペプチドチップでは合成法は難しい。すなわち、現在、ＤＮＡチップでは、基板上で望みの配列のヌクレオチドを合成する方法が広く採用されている。しかし、タンパク質を基板上で合成することは現状では不可能であり、ペプチドについても合成しただけでは充分な純度が得られないため、タンパクチップやペプチドチップでは、精製タンパク質やペプチドを基体表面上に直接スタンプする方法が主流である。

このため、ガラスやプラスチック表面に易固定化のためのカルボキシ基（-COOH）あるいはアミノ基（-NH₂）などの官能基を導入した基体が市販されている。また、光官能基を配して有機物は何でも固定できる光固定法も実用化されている。

前記以外の多種類の生体物質の分析検査法として、被固定化物質を微粒子（ビーズとも言う）に固定し、溶液中で分析に供する方法がある。しかし、該微粒子を介在してスライドガラスやチップなどの基体上に固定するアレイ技術はいまだ実用化されていない（非特許文献１）。

特開２００５－１４３３７０号公報 特開２０１０－１０１６６１号公報 国際公開第２０１４／００７０３４号

Victor ET Mancilla and Rudolf Volkmer "Peptide arrays on planar supports", Methods in Molecular Biology, 1352, 3-17 (2015) Tinashe B Ruwona, Ryan Mcbride, Rebecca Chappel, Steven R Head, Phillip Ordoukhanian, Dennis R. Burton, and Mansun Law "Optimization of peptide arrays for studying antibodies to hepatitis C virus continuous epitopes" J Immunol Methods. 15, 35-42 (2014)

前記のように、基体上に種々の固定化すべき生体物質を共有結合により固定化する方法が開発されてきた。また、非特異的吸着の防止効果に優れた生体物質固定化剤やそれを用いた生体物質固定化方法、生体物質固定化基体などの発明も行われてきたが、タンパクチップやペプチドチップで診断チップとしての信頼性を確立するには至っていない。タンパク質の三次元構造やそれに基づく生理機能を保持したまま、再現性良く固定するのが困難であることがその最大の理由である。加えて、タンパク質より格段に小さな分子であるペプチドでは、単に固定量を確保するだけでなく、分子の配向をそろえて固定する必要がある。また、抗原抗体反応のように最終的にタンパク質との相互作用を利用して検出する場合には、立体障害を回避することも重要な課題として残っている。
なお、非特異的吸着とは、抗体分子がその相手以外の分子あるいはポリマーなどの有機物質や無機物質表面にも結合することを言う。化学反応でないので吸着と言う。また、抗体分子がその相手の抗原分子と結合する反応を抗原抗体の特異的反応と言う。

基体上にタンパク質を固定化する方法の１つとして、光固定法が知られている（特許文献１）。これは基体上に予め光官能基をつけておき、固定化すべきタンパク質のアミノ酸側鎖と共有結合させることにより、基体上にタンパク質を固定化する。具体的には、アジド基などの光反応性官能基を持つポリマーを塗布したコート面にタンパク質等をスポットし、光照射してラジカル反応を起こし、被固定物質を共有結合するものである。この方法は被固定物質を選ばず何でも固定できるのが特徴であるが、光官能基の反応確率は１００％でなく固定効率が高くないこと、ペプチドのような低分子には光官能基の密度に限界があるため適用できないこと、また被固定分子の結合部位を選択できないことが問題であった。

ペプチドのような低分子を固定する光固定法として、１分子中に少なくとも光反応基とエポキシ基のような室温反応性の官能基を有する固定化剤を利用する方法が提案されている（特許文献２）。光反応基とエポキシ基を有する固定剤をスタンプ溶液に混ぜて使用することにより、基体面上でペプチドのアミノ基を固定剤と常温で反応させ、さらに乾燥後、光固定させるものである。しかし、この方法は、ペプチド中のすべてのアミノ基と結合する可能性があるため、すなわちペプチドを構成するアミノ酸の一種のリシン（lysine）の持つ側鎖中のアミノ基とも結合してしまい、ペプチドN末端で固定化物質面に配向して固定されていることを保証できなかった。

前記の欠点を克服する方法として、非特許文献２の方法がある。これはN末端側のアミノ基をオキシアミノ基とすることにより、ペプチドの側鎖アミノ基と差別化しオキシアミノ基のみ基体上の官能基とエステル結合するような反応条件を可能としたものである。しかし、このためには基体表面にはオキシラン系の官能基をつけておく必要があり、さらに固定後、不要なオキシラン系の官能基を不活性化することが必要であり、また非特異的吸着によるバックグラウンドノイズの増加を防止する措置が必要となる。

特許文献３には、磁性微粒子の凝集を防ぐ方法及び磁性微粒子を保持層に固定する方法が記載されている。しかし、機能付与した磁性微粒子を所定の場所（スポット）に決められた間隔で固定する方法は開示されていない。

本発明の目的は、タンパク質、ペプチド、核酸及びこれらの混合物から成る生体物質まで広く使用できる効率的な生体物質固定化方法を提供することにある。

前記目的を達成するために、請求項１に記載の発明の生体物質固定化方法は、生体物質からなる被固定化物質を固定化するために固定化担体を用い、前記固定化担体表面に前記被固定化物質を予め固定しておき、前記固定化担体を生体物質固定化用基体に保持するための層を設け、当該層の上に前記固定化担体をスポット状にスタンプすることを特徴とする。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の生体物質固定化方法において、前記固定化担体として、有機微粒子または無機微粒子、あるいは磁性微粒子を用いることを特徴とする。

請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の生体物質固定化方法において、前記固定化担体を生体物質固定化用基体に固定化する方法として、１分子中に少なくとも２個の光反応基を有する光架橋剤を用いることを特徴とする。

請求項４に記載の発明は、請求項１ないし３のいずれかに記載の生体物質固定化方法において、前記固定化担体を前記生体物質固定化用基体に保持するための層の上に、当該層と前記固定化担体とを架橋する架橋剤及び前記固定化担体をスポット状にスタンプする方法として、前記架橋剤と前記固定化担体を混合した混合液をスタンプする混合スタンプ法、または、先ず前記架橋剤をスタンプし、次に前記固定化担体をスタンプする分離スタンプ法、を採用することを特徴とする。

請求項５に記載の発明は、請求項１ないし４のいずれかに記載の生体物質固定化方法において、前記固定化担体を前記生体物質固定化用基体に保持するための層として、水溶性ポリマーを塗布したことを特徴とする。

請求項１に記載の発明によれば、タンパク質、ペプチド、核酸及びこれらの混合物から成る生体物質まで広く使用できる効率的な生体物質固定化方法を提供することができる。
請求項２に記載の発明によれば、前記固定化担体として、有機微粒子または無機微粒子、あるいは磁性微粒子を用いることで、固定化担体への生体物質の固定と、固定化担体の当該層への固定との二つの固定化工程を分けて行うため反応条件を最適化できるので、高固定量、高安定性を保証し、再現性良く固定できる。
請求項３に記載の発明によれば、１分子中に少なくとも２個の光反応基を有する光架橋剤を架橋剤として用いることで、光を照射する簡単な操作で共有結合を形成でき、当該層と固定化担体を安定に固定できる。
請求項４に記載の発明によれば、混合スタンプ法と分離スタンプ法の両者を選択することができる。混合スタンプ法は、工程が簡略で、スポッタの精度に依存しない。一方、分離スタンプ法は、高精度のスポッタにより、スポット形状の均一性が得られ、撮像品質を高めることができる。
請求項５に記載の発明によれば、親水性の非特異的吸着防止剤を使用するので、疎水性の非特異的吸着防止剤を使用する場合に比べて、余分なタンパク質が捕捉されることを防止でき、検査分析精度を向上させることができる。

図１は本発明の実施例１の生体物質固定化基体の構成断面の説明図である。 図２は本発明の実施例１のタンパク質及びペプチドを微粒子担体に固定した状態の説明図である。 図３は本発明の基となる生体物質を検出するプロセスの一例を示す説明図であり、一例としてアレルギー診断への応用、いわゆる抗原抗体反応とその解析結果例を示す。 図４は、本発明の実施例１において、タンパク質を固定するためにビーズ担体を使用した場合の発光信号強度の優位性を示した説明図である。 図５は、本発明の実施例１において、ペプチドを固定するためにビーズ担体を使用した場合の発光信号強度の優位性を示した説明図である。 図６は本発明の実施例２の混合スタンプ法と分離スタンプ法の比較を示した説明図である。 図７は本発明の実施例２のインクジェットスタンパを使用して微粒子担体を基体表面に均一に固定した状態の説明図である。 図８は本発明の実施例３の大径担体を基体表面に固定した状態の説明図である。 図９は本発明の実施例４の磁性ビーズ担体を基体表面に固定した状態の説明図である。

（実施の形態の概要）
本願発明者らは、鋭意研究の結果、親水性ポリマーからなる非特異的吸着防止剤を基体上に塗布し、この上に、所望のたんぱく質やペプチドなどの被固定化物質を所望の条件や配向で固定した微粒子（固定化担体）を、前記非特異的吸着防止剤を塗布したコート面にスポットした後、微粒子自体を固定する二段階固定法を発明し、再現性良くかつ高精度に固定が図れることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、親水性ポリマーからなる非特異的吸着防止剤を塗布し非特異的吸着を防止した基体面の上に、前もって十分な反応時間を与えてタンパク質あるいはペプチドをその表面に固定した微粒子と、１分子中に２つの光反応基を有する光架橋剤とを混合してあるいは重ねてスポットする二段階の物質固定化方法を提供する。

従来の固定化技術は、基体（生体物質固定化用基体）表面にスポットした被固定化物質を含む液滴が乾燥するまでの短い時間内に、例えばエステル結合などの所望の化学反応をおこし、基体への結合を行う一段階の方法であった。
これに対して、予め溶液反応で被固定化物質を微粒子に固定した後、光架橋剤で微粒子を基体に固定する本二段階法は、適正な条件下で再現性良く反応させることで、固定率を安定させ、固定密度を上げることができる。

微粒子径は数１００μｍ以下、好ましくは５μｍ以下であり、タンパク質に比べて圧倒的に大きく、光架橋剤の密度を過度に高くすることなく確実に固定が可能となる。

微粒子担体表面へのタンパク質、あるいはペプチドの固定条件と、微粒子担体の基体表面への固定条件は別個のものであり、それぞれを最適化できる。

微粒子は反応操作がし易く、抗体をＦｃ領域で微粒子上に配向させて固定したり、ペプチドを末端特異的に固定することも可能であり、従来の固定法の弱点を克服できる。したがって、本発明では、生体物質であるタンパク質やペプチドのような被固定化物質を基体上に固定するに当たり、直接被固定化物質を基体表面に固定するのではなく、微粒子の担体（ビーズ担体）を介在させることによって、被固定化物質と担体との固定化の反応条件および担体と基体との固定化の反応条件をそれぞれ最適化することができるようになった。これにより、タンパク質の三次元構造やそれに基づく生理機能を保持したまま、再現性良く固定したり、ペプチドで分子の配向をそろえて固定したりすることも可能となる。よって、タンパクチップやペプチドチップで診断チップとしての信頼性を向上させることができる。また、抗原抗体反応のように最終的にタンパク質との相互作用を利用して検出する場合には、立体障害を回避することもできる。

図３に、生体物質をいかに固定化したかを検出するプロセスの一例を示す。具体例としてアレルギー診断チップにおいて、抗原抗体反応によってアレルゲンを検出し解析するプロセスを示す。
図３において、先ず、予め複数種のアレルゲンをスポットしておいた診断チップに血液検体（全血、血清、血漿いずれも可）を注入する。そして所定時間反応させた後、洗浄する。この例では、特異的ＩｇＥ抗体ＡがアレルゲンＡに反応し、特異的ＩｇＥ抗体ＣはアレルゲンＡ，Ｂに反応していないことを示している。洗浄の目的は、反応していない特異的ＩｇＥ抗体Ｃを除去するためである。次に、ＩｇＥ抗体を認識するための酵素標識２次抗体を該チップに注入し、所定時間反応させる。反応後、ＩｇＥ抗体と結合していない２次抗体を除去するために洗浄する。その後、化学発光試薬を該チップに注入する。カメラにより、スポットの発光像を撮影し解析する。得られる発光信号強度は、抗原抗体反応の強度に比例するので、アレルギーに感作している度合を計測することができる。なお、生体物質の検出プロセスは、図３に示した方法によらず、適宜最適な方法を選択できる。

また、微粒子表面には、タンパク質を既存の種々の方法で固定することができる。このため、微粒子表面をカルボキシ基、アミノ基などで修飾した微粒子（ビーズとも言う）が市販されている。

自動ペプチド合成機に用いられているビーズも合成終了後、未反応物を洗浄除去した後、ペプチド担体微粒子としてそのまま利用することもできる。

微粒子表面をエポキシ化あるいはＮ-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）-エステル化して、オキシアミノ化ペプチドと反応させればN末端選択的な固定も可能となる。また、ストレプトアビジンあるいはニュートロアビジンを表面に結合した微粒子をＮ末端ビオチン化したペプチドと反応させることで、効率良くＮ末端特異的な固定ができる。

表面にアルキンを導入した微粒子とＮ末端アジド化ペプチド、もしくは表面にアジド基を導入した微粒子とＮ末端アルキン化ペプチドを組み合わせることにより、クリック・ケミストリーを利用した、Ｎ末端特異的な共有結合でペプチドを固定することができる。

前記の非特異的吸着防止剤は、親水性の性質を有することが必須である。もし疎水性の場合、疎水基に余分のタンパク質が吸着して検査分析精度を損なう。

前記の微粒子の粒径は、タンパク質等の易捕捉性及び易操作性から、サブμmから数μm程度の粒径を用いることが好ましい。一例として、２．８μｍ径Dynabeads（登録商標）などを使用することができる。
なお、タンパク質やペプチドなどの被固定化物質の種類によって、固定量や安定性、再現性が最適となる微粒子を選択する必要がある。

本発明によれば、固定化すべき生体物質を共有結合により安定に固定化することができる。本発明の方法を用いてタンパク質を固定化すると、固定化表面積を大幅に増やして立体障害を防ぐとともに、機能を保持した状態で固定することができ、抗原抗体反応や酵素反応など、タンパク質の機能を利用した感度の高い分析が可能となる。また、ペプチドをＮ末端のみで確実に固定できる。さらに、非特異的吸着が効果的に防止され、高精度の検査分析が可能となる。よって、高感度で信号／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比の高い生体物質固定化基体が得られる。

次に図面を参照しながら、本発明の実施の形態の具体例（以下、実施例と記載する）を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

生体物質を固定した微粒子を、光架橋剤を用いて基体に固定する光固定法の実施例について説明する。図１に基体とその表面に作製する層構成を示す。

基体としては特に限定されず、マイクロプレート等で広く用いられているポリスチレンをはじめ、アクリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、シクロオレフィンポリマー（COP）、シクロオレフィンコポリマー（COC）等の有機物から成るものを例示することができる。また、ガラス等を用いることができる。

非特異的吸着防止剤として使用可能な水溶性ポリマーとしては、一例としてポリエチレングリコール（PEG）メタクリレートを使用することができる。

光架橋剤が有する光反応基の好ましい例としてアジド基（-N₃）があり、これを２個持つ分子としてジアジドスチルベンが挙げられる。

本発明に用いられる光架橋剤のうち、特に好ましいのは水溶性のものである。光架橋剤の使用時の濃度は、特に限定されない。

非特異的吸着防止のための水溶性ポリマーは、それ自体公知であり、公知の製造方法により製造可能であり、また、市販されているものもある。また非特異的吸着防止層の形成法についても公知である（特許文献１）。

本発明により固定化される物質は特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、核酸などを例示することができる。

本発明の光反応基として用いられるアジド基あるいはジアジリン基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルあるいは炭素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルあるいは炭素ラジカルは、アミノ基やカルボキシ基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物と架橋することができる。したがって、微粒子表面を構成する炭素原子と、非特異的吸着防止層を構成するポリマーやプラスチックなどの基体表面に存在する炭素原子とを結合することができる。

本発明により、所望の物質を固定化した微粒子は、次のようにして基体上に固定することができる。先ず、基体上に非特異的吸着防止剤（水溶性ポリマー）をコーティングする。混合スタンプ法では、微粒子と光固定化剤の混合物を非特異的吸着防止剤上にスポットした後、乾燥し、光照射する。分離スタンプ法では、非特異的吸着防止剤上に光固定化剤をまずスポットし、次いで固定化すべき微粒子をその上にスポットした後、乾燥し、光照射する。微粒子周辺には多数の光架橋剤が存在し、非特異的吸着防止剤ポリマーと微粒子の間に多数の共有結合架橋ができ、微粒子を安定に固定できる。

照射する光は、用いる光反応基がラジカル反応を生じさせることができる光であり、光反応基としてアジド基あるいはジアジリン基を用いる場合には、３００～４００nmの紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常１cm²当たり１mW～１００mW程度である。

タンパク質の固定用微粒子担体としては、例えばInvitrogen社製、２．８μｍ径Dynabeads（登録商標）M-270カルボキシ基付を使用できる。図２（１）にタンパク質を微粒子担体に固定した状態を示す。

Invitrogen社のプロトコルに従って、微粒子をMES（Methyl Ethane Sulfonate）緩衝液で洗浄後、EDC（N-Ethyl-N’-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride）溶液で活性化する。これをタンパク質溶液中に加え、室温で攪拌しながら一晩反応させる。反応後、洗浄した微粒子をPBS（Phosphate Buffered Saline）緩衝液内で保存する。

ペプチドのＮ末端を使った配列固定用の微粒子担体としては、例えばInvitrogen社製、Dynabeads（登録商標）M-270 エポキシ基付を使用できる。

Invitrogen社のプロトコルに従って、微粒子をMES緩衝液で洗浄後、これをペプチド溶液中に加え、ｐH８の条件で室温で攪拌しながら一晩反応させる。反応後、洗浄した微粒子をPBS緩衝液に保存する。ただし、ペプチドはN末端をオキシアミノ化しておく必要がある。ｐH８ではオキシ化アミノは反応するが、側鎖のアミノ基は活性化されていないため微粒子上のエポキシ基と反応することはない。図２（２）にペプチドを微粒子担体に固定した状態を示す。

前記のように予めタンパク質やペプチドを固定した微粒子を、ポリエチレングリコール（PEG）メタクリレートを塗布した基体上にスタンプする。

スタンプ法には、混合スタンプ法と分離スタンプ法の２種類がある。図６に両スタンプ法の比較を示す。図６（１）に示す混合スタンプ法は、光架橋剤とビーズの混合液を基体上にスタンプする。図６（２）に示す分離スタンプ法は、初めに光架橋剤をスタンプし、次に、先にスタンプした光架橋剤の上に微粒子溶液をスタンプする。一般的に、両スタンプ法のどちらを使用するか及び得られる結果は、使用する光架橋剤及びビーズの種類や、ビーズに固定するタンパク質やペプチドの種類によって異なる。

混合スタンプ法は、光架橋剤とビーズ及び塩を含む混合液をワンステップで基板上にスポットするので工程は簡略かつスポッタの精度もそれほど必要としない。

分離スタンプ法は、第１ステップとして、通常塩を含まない光架橋剤を用いるのでほぼ円形状を均一に基板にスポットすることができる。よって、次のステップでは、ビーズと塩を含む混合液を前記の光架橋剤のスポット上あるいは該スポット内に円形状にスポットすることができる。即ちスポット形状の均一性を目指した技術である。但し、スポッタの中心精度を要する。つまり、第１ステップと第２ステップで同一中心にスポットすることが要点である。この分離スタンプ法により、撮像品質を高めることができる。

以下、混合スタンプ法によるタンパク質固定化ビーズの基体への固定化の一例を示す。
１）先ず、非特異的吸着防止剤をコートした基体を準備する。その真ん中に溶液を貯めるためのリングを設ける。
２）タンパク質を固定した直径μｍオーダーの微粒子懸濁液に、光架橋剤として１％ 4,4’-ジアジドスチルベン-2,2’-ジスルフォン酸（以下、ビスアジドと略す）を添加する。光架橋剤の濃度は、微粒子重量の０．０１～０．１％とする。
３）微粒子（ビーズ）のスタンプ
今回、現有のGeneqs社Genex Arrayerを用いた。Scienion社インクジェットスタンパまたは相当品を利用してもよい。スポット法は、格子点型多点分注スポット法とする。
４）乾燥
スポッティング後、真空乾燥機内で、室温で１０分乾燥する。真空度は０．０９ＭＰａになったところでバルブを閉じポンプを停止する。
５）光固定
乾燥後、乾燥機から取り出し、スタンプした基体をブラックライトで７分間露光する。

インクジェットスタンパを使用して、生体物質を固定化した微粒子を、１例として、以下の方法で基体表面に均一に分布固定させることができる。図７にその状態を示す。

内径５０μｍのノズルを用い最小吐出量５０pLとして、これを例えばノズルをＸ軸方向に移動させながら５０μｍごとに吐出する。さらにＹ軸方向にも移動した後で、これを繰り返すことにより、図７（１）に示すように０．４ｍｍ四方のスポットや他の任意の形状のスポットを形成できる。

被固定物質を替えた微粒子を用意し、同様なスポットを形成することにより、図７（２）に示すような３６種アレルゲンに対する診断チップを作製することができる。

牛乳の主要アレルゲンであるαカゼインおよびエポキシビーズに固定したαカゼインを各固定剤濃度につき3個ずつスポットし（N=3）、牛乳アレルギー患者の血漿を反応させた後、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体、ついでアルカリフォスファターゼ基質である発光試薬を反応させて検出した結果を図４に示す。

図４の画像から得られた発光信号強度を下記表１に示す。

図４および表１の結果から、固定剤濃度が低い場合、そもそもタンパク質が固定されない。逆に多すぎると多量のタンパク質が固定され、立体障害により血漿中のＩｇＥとの反応が阻害される。ビーズ担体の直径はμｍオーダーであり、タンパク質サイズ３～１０nmに比べて大きいので、単位面積当たりの固定剤量は１００分の１以下でよい。ビーズ担体を使用した場合、実効的なタンパク質の固定面積の拡大と固定剤の削減により、立体障害防止とタンパク質の機能保持効果が相まって信号値の増大となったと考えられる。したがって、図４および表１の結果から、前述の特許文献１等に記載の光固定化法において課題であった低い固定効率を向上させることができた。

αカゼインの異なる部分ペプチドＡおよびＢ（それぞれ１５アミノ酸残基から成る）を直接、あるいはビーズに固定した後、基板に固定し、牛乳アレルギー患者の血漿を反応させた後、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体、ついでアルカリフォスファターゼ基質である発光試薬を反応させて検出した結果を図５に示す。

図５の画像から得られた発光信号強度を、下記表２に示す。

図５および表２の結果からペプチドを固定するに当たり、ビーズ担体を使用した場合のほうが、ビーズ担体を使用しない場合に比べて発光信号強度が３～６倍高いことがわかり、ビーズ担体の優位性を示すことができた。特に、ペプチドを固定する場合は、ビーズ担体を用いなければ実用化できないことを示唆している。したがって、前述の特許文献１等に記載の光固定化法では不可能であったペプチドのような低分子の固定が、ビーズ担体を用いることで可能となった。同時に、次項に述べるように、特定の部位で被固定分子を結合するという課題も解決されている。

ビーズ固定については、図５および表２の結果から、非修飾ペプチドをエポキシビーズに固定した場合に比べ、末端ビオチン修飾ペプチドをアビジンビーズに固定した場合には信号値は２倍高い。エポキシビーズでは、ペプチドのＮ末端だけでなく、ペプチド内に含まれるリシン残基の側鎖アミノ基でも固定されるため、異なる配向のペプチドがビーズ上に存在し、抗体との反応性が低下することが考えられる。アビジンビーズの場合は、アビジン-ビオチンの特異的反応により、Ｎ末端のみで固定され、ペプチドの配向が一定となるためと解釈される。したがって、図５および表２の結果から、ペプチドＮ末端で固定化物質面に固定されていることが保証できないというこれまでの問題が解消されている。

タンパク質やペプチドなどを固定したビーズを吐出する別の方法を説明する。図８にその方法を示す。公称１００μｍ径のポリマービーズを用いる。先ず、ビーズを溶液と共に粒径より太いキャピラリに挿入する。キャピラリの先端はＹ字構造とする。Ｙ字構造の一方は、ビーズより少し太い径のキャピラリとし、ビーズと同じ径の孔が開いた吐出ノズルを設ける。もう一方のＹ字構造のキャピラリの径は、ビーズよりも小さくする。細径のキャピラリのほうが太径のそれよりもビーズの流速を早くすることができるので、ビーズの径を分別できる。このようにして、所望の径のビーズのみ光架橋剤の上に１個ずつ固定することができる。

タンパク質やペプチドなどを固定した磁性ビーズを、磁化力を用いて凝集せずに固定化基体に保持する方法を説明する。図９にその方法を示す。２．８μｍ径Dynabeads（登録商標）M-270カルボキシ基付を用いる。基体裏面にオン／オフを切り換えられる磁界発生機構を設け、該基体表面には磁性ビーズを保持する保持層を設ける。初めに、基体裏面の磁界をオフの状態で磁性ビーズの分散溶液を基体表面に吐出する。吐出機構のノズル径は、マイクロ流路作製技術を用いて磁性ビーズの直径に合わせているので、磁性ビーズは１個ずつ吐出される。次に、磁界をオンにして液中の磁性ビーズを基体表面に引き付ける。基体に引き付けられた磁性ビーズを該保持層に固定させた後、磁界をオフする。これにより、固定化基体上に磁性ビーズを凝集させずに保持することができる。

前記の磁界発生機構は、磁化力で磁性ビーズを基体表面上に保持するに足る０．１Ｔ（１KG）程度の磁束密度を要する。プリント基板作製技術を応用して、高透磁率の薄膜フェライトコアとこれを囲む薄膜コイルを形成する。これらの構成により、直径１ｍｍ以下のコイルの中心にフェライトコアを有する高磁束密度を発生する磁界発生機構が形成される。これをスポットする抗原を格子状に配置する寸法に合わせ、複数個配置する。複数個のコイルには、別に準備する直流電源とオン／オフ制御回路が接続される。磁性ビーズの吐出タイミングに合わせてオン／オフが制御される。

本発明の実施例は、抗体若しくは抗原を固定化した免疫測定用プレートの作製、ＤＮＡやＲＮＡを基体上に固定化した核酸チップ、ペプチドやタンパク質を固定化したマイクロアレイ等の作製に好適に用いることができるが、これらに限定されるものではない。

なお、前記固定化担体を前記生体物質固定化用基体に保持するための層なしでも、固定化担体（微粒子）に対する光架橋剤の濃度を、保持する層のある場合に比べて１０倍程度に増加することにより基体に直接固定することも可能であった。これに対して、本願発明では、生体物質固定化用基体に保持するための層を使用することで光架橋剤の濃度を１／１０程度にすることができる。

本発明は、前記実施例等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加えることができる。

本発明によれば、固定化すべき物質を配列や配向をそろえて固定化することができ、非特異的吸着が抑止された安定な固定化基体を得ることができる。これにより、例えば、種類の異なるたんぱく質やペプチドを複数個のスポットとして固定した検査基体を作製し、多項目の同時計測が可能となり、高精度かつ高信頼性の診断システムが実現できる。

Claims (12)

1. 生体物質固定化用基体に生体物質からなる被固定化物質および固定化担体を保持するための層を設ける工程と、
   前記生体物質固定化用基体に架橋剤をスポット状にスタンプする工程と、
   スタンプされた前記架橋剤の上に、表面に前記被固定化物質を固定化した前記固定化担体をスタンプする工程と、
   前記固定化担体と前記層とを架橋剤を介して共有結合させる工程と
   を含む、生体物質固定化基体の製造方法。
2. 前記固定化担体として、有機微粒子または無機微粒子、あるいは磁性微粒子を用いる、請求項１に記載の方法。
3. 前記架橋剤は、１分子中に少なくとも２個の光反応基を有する光架橋剤である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記層は、水溶性ポリマーを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記層の上に溶液を保持するための領域が設けられ、その領域において前記固定化担体がスポット状にスタンプされる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 生体物質を固定した基体であって、
   生体物質固定化用基体、
   前記生体物質からなる被固定化物質を固定化した固定化担体、および
   前記生体物質固定化用基体に設けられた、前記固定化担体を前記生体物質固定化用基体に保持するための層、
   を備え、前記固定化担体と前記層とが架橋剤を介して共有結合しており、前記架橋剤が前記層上にスポット状に存在し、前記固定化担体が前記架橋剤の存在するスポット上に存在する、基体。
   
7. 以下の（ａ）～（ｃ）の少なくとも１つの特徴を有する、請求項６に記載の基体。
   （ａ）前記固定化担体が、有機微粒子または無機微粒子、あるいは磁性微粒子である。
   （ｂ）前記架橋剤が、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤である。
   （ｃ）前記層が、水溶性ポリマーを含む。
8. 前記生体物質が、タンパク質、アレルゲン、ペプチド、アレルゲンの部分のいずれか一つ以上から選ばれる、請求項６または７に記載の基体。
9. 前記ペプチドおよび／またはアレルゲンの部分が、そのC末端またはN末端において、前記固定化担体に固定されている、請求項８に記載の基体。
10. 前記層の上に溶液を保持するための領域を有し、その領域において前記固定化担体がスポット状にスタンプされている請求項６～９のいずれか一項に記載の基体。
11. 生体物質の検出方法であって、
    請求項６～１０のいずれか一項に記載の基体に対して添加された検体に含まれる生体物質と、前記基体に固定された生体物質との相互作用を検出する工程を含む、方法。
12. 前記検体が血液である、請求項１１に記載の方法。

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