WO2005111618A1 - 物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体 - Google Patents

物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体 Download PDF

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WO2005111618A1
WO2005111618A1 PCT/JP2005/009100 JP2005009100W WO2005111618A1 WO 2005111618 A1 WO2005111618 A1 WO 2005111618A1 JP 2005009100 W JP2005009100 W JP 2005009100W WO 2005111618 A1 WO2005111618 A1 WO 2005111618A1
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WO
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substance
group
substrate
water
soluble polymer
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PCT/JP2005/009100
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshihiro Ito
Kaoru Omura
Original Assignee
Riken
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a substance immobilizing agent for immobilizing a desired substance such as a polypeptide, a nucleic acid, or a lipid on a substrate, a substance immobilizing method using the same, and a substance immobilizing method using the same. It relates to a dani base.
  • the method using physical adsorption while applying force has a problem in that the stability of the substrate obtained by fixing a substance having a weak bond between the substrate and the fixing material is insufficient.
  • proteins such as serum albumin (BSA), casein, skim milk, etc.
  • BSA serum albumin
  • skim milk casein
  • DNA DNA
  • a protein or nucleic acid is immobilized on a substrate by covalently bonding a functional group on the substrate and a functional group of a protein or nucleic acid to be immobilized.
  • the functional group used is in or near the active site of the substance, the activity of the substance is lost by immobilization.
  • the immobilization cannot be performed by this method.
  • non-specific adsorption is prevented by blocking, but its effect is not always satisfactory. Not something that can be done.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 11 337551
  • Patent Document 2 JP 2001-337089 A
  • Non-Patent Document 1 Y. Ito and M. Nogawa, Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay, "Biomaterials, 24, 3021-3026 (2003)
  • Non-Patent Document 2 One Dictionary of Nanotechnology (Published by the Industrial Research Institute, Ltd. (December 25, 2003)) Pages 838-839
  • Non-Patent Document 3 Japan Nanonet Bulletin No. 58 (March 16, 2004)
  • an object of the present invention is to provide a substance immobilizing agent which can fix various substances to be immobilized on a substrate by covalent bonding and has an excellent effect of preventing non-specific adsorption.
  • An object of the present invention is to provide a material fixing method using the same and a substance fixing substrate using the same.
  • an object of the present invention is to enable a desired substance such as a polypeptide, a nucleic acid, or a lipid to be immobilized on a metal surface such as gold regardless of its type, and to suppress nonspecific adsorption. It is an object of the present invention to provide a substance immobilizing agent, a method for immobilizing a substance using the same, and a substance immobilizing substrate using the same.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies and have found that a mixture of a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule and a water-soluble polymer that is electrically neutral as a whole molecule. It has been found that by using as a substance immobilizing agent, various substances to be immobilized on a substrate can be immobilized by covalent bonding, and the effect of preventing non-specific adsorption is excellent. 7 bats.
  • the present invention provides a desired substance on a substrate, comprising: a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule; and a water-soluble polymer that is electrically neutral as a whole molecule.
  • a substance immobilizing agent for immobilizing the compound to provide a substance immobilizing agent for immobilizing the compound.
  • the present invention provides a method for applying an aqueous solution or aqueous suspension containing a substance to be immobilized on a substrate and the substance-immobilizing agent of the present invention to the substrate, and irradiating the substrate with light.
  • a method for fixing a substance is provided.
  • the present invention provides a substrate on which the substance is immobilized by the method of the present invention.
  • an amphoteric or nonionic water-soluble compound having a photoreactive group and having a group capable of covalently bonding or coordinating with a metal By using a polymer as a substance fixing agent for fixing a desired substance, a desired substance can be fixed to a metal and an interaction with the desired substance can be examined. It has been found that non-specific adsorption of other substances can be effectively suppressed. Further, instead of the above water-soluble polymer, a bipolar or non-ionic water-soluble polymer having at least two photoreactive groups in one molecule and a group capable of forming a covalent bond or a coordination bond with a metal can be used.
  • a mixture with a compound having the above formula, or an amphoteric or nonionic water-soluble polymer It has been found that a similar effect can be obtained by using a mixture of a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in a molecule and a compound having a group capable of covalently bonding or coordinating with a metal. .
  • the present invention relates to a bipolar or non-ionic water-soluble polymer having at least one photoreactive group and capable of forming a covalent bond or a coordinate bond with a metal.
  • a substance fixing agent for fixing a substance to a metal comprising a polymer having the same.
  • the present invention relates to a bipolar or non-ionic water-soluble polymer having at least two photoreactive groups in one molecule and capable of forming a covalent bond or a coordinate bond with a metal.
  • a substance immobilizing agent for immobilizing a substance on a metal which comprises a low-molecular compound having a basic group.
  • the present invention provides a water-soluble polymer having an ambipolar or nonionic nature, a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule, and a group capable of covalently bonding or coordinating with a metal.
  • a substance fixing agent for immobilizing a substance on a metal comprising: Further, in the present invention, an aqueous solution or an aqueous suspension containing the substance to be immobilized on the substrate and the substance fixing agent or the substance fixing agent of the present invention is applied to the substrate and irradiated with light.
  • a method for immobilizing a substance on a substrate comprising: Further, the present invention provides a substrate on which the substance is immobilized on a metal by the method of the present invention.
  • a substance immobilizing agent which can immobilize various substances to be immobilized on a substrate by covalent bonding and has an excellent effect of preventing non-specific adsorption, A method for fixing a substance and a substrate for fixing the substance using the same are provided.
  • a substance to be immobilized can be fixed by a covalent bond regardless of its type, and a stable fixed substrate can be obtained. Further, when the substance is fixed using the substance fixing agent of the present invention, non-specific adsorption is effectively prevented.
  • the patterning of the immobilized substance can be performed by performing selective exposure, and the substance can be easily formed into an arbitrary pattern such as a microarray. It can be fixed.
  • a desired substance such as a polypeptide, a nucleic acid, or a lipid can be immobilized on a metal surface such as gold irrespective of its type, and nonspecific adsorption can be suppressed.
  • a solid substance fixing agent was provided. Since the photoreactive group also bonds to a carbon atom in the organic compound, the use of the substance fixing agent of the present invention enables the organic substance to be fixed to the metal surface regardless of the type. In addition, nonspecific adsorption is effectively suppressed by the bipolar or nonionic water-soluble polymer. Therefore, the present invention is considered to greatly contribute to QCM measurement and SPR measurement of the interaction between various biomolecules and other substances.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the average surface roughness of a substrate and the luminescence intensity in the immunoassay performed in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a method of performing QCM measurement using a crystal resonator microbalance measurement device.
  • FIG. 3 shows a time-dependent change in frequency when QCM measurement is performed on a reaction between the substance fixing agent prepared in Example 6 of the present invention and a gold electrode of a sensor chip of a quartz crystal microbalance measuring device.
  • FIG. 4 is a diagram showing a time-dependent change in frequency when QCM measurement was performed on the antigen-antibody reaction of Example 1.
  • the substance immobilizing agent according to the first aspect of the present invention comprises a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule and a water-soluble electrically neutral molecule as a whole. And a hydrophilic polymer.
  • Preferable examples of the photoreactive group possessed by the photocrosslinking agent include an azide group (-N).
  • photocrosslinking agent a diazide conjugate having two azide groups is preferable, and a water-soluble diazido conjugate is particularly preferable.
  • the photocrosslinking agent used in the present invention include a diazide conjugate represented by the following general formula [III]. [0020] [Formula 1]
  • R represents a single bond or an arbitrary group.
  • -R- is not particularly limited, because it has a structure only connecting two phenylazide groups.
  • Preferred examples of -R- include a single bond (that is, two ferrazide groups are directly connected) and an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (including one or two carbon-carbon unsaturated bonds. One or two carbon atoms may be double-bonded to oxygen to form a carboxy group,) (particularly preferably a methylene group), -0-, -SO-, -SS-, -S-,-R 2 JJ_LY R 3- (However, Nini has a single or double bond.
  • Y represents a cycloalkylene group having 3 to 8 carbon atoms
  • R 2 and R 3 each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (which may contain one or two carbon-carbon unsaturated bonds, The bond between the carbon atom at the base end of the alkylene group and Y may be a double bond), and one or two carbon atoms are double-bonded to oxygen to form a carboxy group, ),
  • the cycloalkylene group may be substituted with one or more optional substituents (if substituted, preferably the carbon atom constituting the cycloalkylene group) , One or two of which is double-bonded to oxygen to form a carbonyl group, and is substituted by Z or 1 or 2 alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • each benzene ring in the general formula [II] may have one or more optional substituents (preferably Alternatively, it may be substituted with a halogen, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a hydrophilic group such as sulfonic acid or a salt thereof.
  • Water-soluble for an optical crosslinking agent refers to an aqueous solution having a concentration of 0.5 mM or more, preferably 2 mM or more. It means that you can exempt.
  • the concentration of the photocrosslinking agent when used is not particularly limited, but is preferably 1 M to 2 mM, more preferably O. OlmM to 0.5 mM. .
  • the amount added to the water-soluble polymer is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 50% by weight, particularly 1 to 30% by weight, and more preferably 1 to 10% by weight.
  • the water-soluble polymer contained in the substance immobilizing agent of the present invention is a water-soluble polymer that is electrically neutral as a whole molecule.
  • ⁇ electrically neutral as a whole molecule '' means that the compound does not have a group that becomes ionized by ionization in an aqueous solution having a neutral pH (pH 6 to 8)! ! /, Which has both cations and anions, meaning that the sum of its charges is substantially zero.
  • “substantially” means a force that becomes the total force of the electric charge ⁇ , or a force that is small enough to not adversely affect the effect of the present invention even if it does not become zero.
  • the solubility of the water-soluble polymer used in the present invention in water is preferably 5 or more.
  • Preferable examples of the water-soluble polymer include a non-ionic water-soluble polymer.
  • the nonionic water-soluble polymer has an excellent effect of preventing non-specific adsorption, and has the advantage that it can be produced or obtained at low cost.
  • non-ionic means that there is substantially no group that becomes an ion when ionized in an aqueous solution having a pH around neutrality (pH 6 to 8).
  • substantially means that such a group is not contained at all or is contained in such a small amount that does not adversely affect the effects of the present invention (for example, the number of such groups is small). (1% or less of carbon number).
  • the molecular weight (average molecular weight, the same applies hereinafter) of the nonionic water-soluble polymer is not particularly limited. Usually, the molecular weight of the nonionic water-soluble polymer is about 3.5 to 5,000,000. Crosslinking between the functional polymers increases, and a reaction occurs between the immobilized material and the material used for the reaction with the immobilized material (hereinafter, may be referred to as “reactant” for convenience). Since it may be difficult, it is preferable to be about 500 to several hundred thousand.
  • Preferred nonionic water-soluble polymers used in the present invention include, for example, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol; Norecone, methyl vinyl ether, vinylpyrrolidone, vinyloxazolidone, bininolemethyloxazolidone, 2-butylpyridine, 4-butylpyridine, N-bulsuccinimide, N-bulformamide, N-bul-N-methylformamide , N-butylacetamide, N-ville-N-methylacetamide, 2-hydroxyethyl methacrylate, polyethylene glycol methacrylate, polyethylene glycol acrylate, acrylamide, methacrylamide, ⁇ , ⁇ -dimethyl Acrylamide, ⁇ -iso-propylacrylamide, diacetone acrylamide, methylol acrylamide, atariloylmorpholine, atariloylpyrrolidine, atariloylbiperidine, st
  • Gelatin casein, collagen, gum arabic, xanthan gum, gum tragacanth, guar gum, pullulan, pectin, sodium alginate, hyaluronic acid, chitosan, chitin derivatives, color -Nan, starches (carboxymethyl starch, aldehyde starch), natural polymers such as dextrin, cyclodextrin, methylcellulose, viscose, hydroxyxetinoresenolerose, hydroxyethinomethinoresenorelose, canoleboximetinolose Examples include, but are not limited to, natural polymers such as water-soluble cellulose derivatives such as cellulose and hydroxypropylcellulose.
  • polyethylene glycol-based polymers polyethylene glycol, vinyl polymer of vinyl conjugate having a polyethylene glycol moiety
  • poly (meth) acrylamide in the present specification and claims, "( “Meth) acryl” means “methacryl” or “acryl”) and poly (glycidyl (meth) atalylate), of which polyethylene glycol-based polymers are particularly preferred.
  • the water-soluble polymer include a water-soluble polymer having a unit having a structure represented by the following general formula [I].
  • unit [1] The unit having the structure represented by the general formula [I] may be hereinafter referred to as "unit [1]" for convenience.
  • the above-mentioned phosphorylcholine-containing polymer utilizes a polymer containing phosphorylcholine, which is a component of the biomembrane, focusing on the fact that nonspecific adsorption hardly occurs even though the biomembrane is in contact with various substances.
  • the present invention has been made based on the idea that non-specific adsorption can be effectively prevented by immobilizing a desired substance on a substrate.
  • the unit [I] is a unit containing a phosphorylcholine group, and X represents a polymerizable atomic group in a polymerized state. X is preferably a bullet monomer residue.
  • X is preferably a bullet monomer residue.
  • X ′ represents a methacryloxy group, a methacrylamide group, an acryloxy group, an acrylamide group, a styryloxy group or a styrylamide group in which the vinyl moiety is obtained by addition polymerization
  • R 1 is a single bond Or carbon number 1 to: represents an alkylene group of LO (however, it may be substituted with one or two hydroxy groups).
  • Preferable specific examples of such a unit include 2-methacryloyloxyshethylphosphorylcholine, 2-atalyloyloxhetylphosphorylcholine, N- (2-methacrylamido) ethylphosphorylcholine, and 4-methacryloyloxy.
  • a unit derived from 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine is particularly preferred.
  • the water-soluble polymer containing the unit [I] may be a polymer obtained by polymerizing only the unit [I].
  • a copolymer of the unit [I] and another polymerizable monomer that does not adversely affect the effects of the present invention.
  • the other polymerizable monomer (meth) acrylic acid or a salt or ester thereof (preferably lower alkyl (C1-6) ester) is particularly preferable, which is preferably a vinyl monomer.
  • the ratio of the unit [I] constituting the copolymer to another polymerizable monomer is not particularly limited, but is preferably 1: 0.7 or less, particularly preferably 1: 0.5 or less in molar ratio. .
  • a compound having both a hydrophilic group and a hydrophobic group is used as the photocrosslinking agent
  • a monomer containing both a hydrophilic group and a hydrophobic group such as alkyl (meth) acrylate (preferably having 3 to 6 carbon atoms in the alkyl moiety) is used. It is preferred to polymerize.
  • the molecular weight of the water-soluble polymer containing the unit [I] is not particularly limited, but is usually about 1,000 to 2,000,000, preferably about 5,000 to 1,500,000.
  • the concentration of the water-soluble polymer when used is not particularly limited, but is usually 0.005% by weight to 10% by weight, preferably 0.04% by weight to 1% by weight. %.
  • the substance fixing agent of the present invention may further contain a solvent in addition to the above-mentioned photocrosslinking agent and water-soluble polymer.
  • a solvent water, lower alcohol (preferably ethanol) which is mixed with water in an arbitrary ratio, and a mixture thereof can be used, and water is preferred.
  • the photocrosslinking agent and the water-soluble polymer contained in the substance immobilizing agent of the present invention are known per se, can be produced by a known production method, and some are commercially available.
  • the substance immobilized using the substance immobilizing agent of the present invention is not particularly limited, but includes polypeptides (including glycoproteins and lipoproteins), nucleic acids, lipids, and cells (animal cells, plant cells). , Microbial cells, etc.) and their components (nuclei, mitochondria, etc. Organelles, cell membranes and membranes such as unit membranes).
  • the azide group used as a photoreactive group in the substance immobilizing agent of the present invention releases a nitrogen molecule upon irradiation with light and generates a nitrogen radical, and this nitrogen radical is an amino group ⁇ ⁇ ⁇ a carboxyl group or the like. Since it is possible to bond not only to a functional group but also to a carbon atom constituting an organic compound, almost all organic substances can be fixed.
  • the substrate is not particularly limited as long as at least its surface is made of a substance capable of binding to the photoreactive group.
  • the substrate include polystyrene widely used in microplates and the like, acrylic resin, and acrylic resin. Examples which can also have organic properties such as polyethylene terephthalate, polycarbonate and polypropylene can be given.
  • a glass plate coated with a silane coupling agent can also be used. Further, those obtained by organically treating the gold surface with an alkyl thiol or the like can be preferably used.
  • the form of the base is not limited, and a plate-like one such as a microarray substrate, a bead-like one, a fibrous one, or the like can be used.
  • the substance immobilizing agent of the present invention is particularly suitable for microarrays. Further, when the average surface roughness of the substrate is 14 / zm to 17 / ⁇ , particularly 15 ⁇ m, the reaction between the substance to be immobilized and the reactant is particularly likely to occur, so that it is preferable.
  • the average surface roughness can be measured by a commonly used surface roughness meter.
  • the immobilization of a desired substance on a substrate using the substance immobilizing agent of the present invention can be performed as follows. First, an aqueous solution or an aqueous suspension containing the substance to be fixed on the substrate and the substance fixing agent of the present invention is applied to the substrate. In this case, preferred concentrations of each component of the substance fixing agent in the aqueous solution are as described above.
  • the concentration (by weight) of the substance to be immobilized is usually about 10 to 200 times, preferably about 20 to 100 times, the substance immobilizing agent used.
  • the applied liquid is preferably dried and then irradiated with light.
  • the light is light by which the photoreactive group used can generate a radical.
  • an azide group is used as the photoreactive group, ultraviolet light is preferable.
  • the dose of the irradiated light beam is not particularly limited, but is usually about lmW to 100 mW per 1 cm 2 .
  • a photoreactive group in the photocrosslinking agent By irradiating light, a photoreactive group in the photocrosslinking agent generates a radical, and the photocrosslinking agent is covalently bonded to both the substrate and the substance to be immobilized. As a result, the substance to be immobilized is immobilized on the substrate via the photocrosslinking agent.
  • the water-soluble polymer is also immobilized on the substrate via the photocrosslinking agent.
  • the azide group used as a photoreactive group emits nitrogen molecules upon irradiation with light and generates nitrogen radicals.
  • These nitrogen radicals are not only functional groups such as amino groups and carboxyl groups but also organic compounds. Since most of the organic substances can be fixed, it can be bonded to the constituent carbon atoms. In the method of the present invention, since a binding reaction is carried out by using a radical generated by a photoreactive group, the binding is carried out at a random site rather than at a particular site of the substance to be fixed.
  • the photoreactive group does not bind to the substrate and the substance to be immobilized in the vibrating portion not irradiated with light
  • the photocrosslinking agent and the substance to be immobilized are removed by washing. Therefore, by performing selective exposure through a photomask or the like, a substance to be fixed can be fixed in an arbitrary pattern. Therefore, the substance to be fixed in various shapes such as a microarray can be fixed by selective exposure, which is very advantageous.
  • a mixture of the substance immobilizing agent of the present invention and the substance to be immobilized may be microspotted on a substrate, and the entire surface of the substrate may be irradiated with light.
  • Microspotting is a method of applying a liquid to a very narrow area on a substrate, and is commonly used for the production of DNA chips and the like.Equipment for this is also commercially available. be able to.
  • the substance-immobilizing agent of the present invention may be coated on the entire surface of the substrate, microspotted with the substance to be immobilized thereon, and then the entire surface of the substrate may be irradiated with light.
  • a spot of the substance to be immobilized is formed on the layer of the substance immobilizing agent, and the proportion of the substance that is covalently immobilized on the substrate via the photocrosslinking agent increases.
  • the substance immobilizing agent of the present invention is microspotted on a substrate, and immobilized thereon. The substance to be formed may be microspotted, and then the entire surface of the substrate may be irradiated with light. In this case as well, a spot of the substance to be immobilized is formed on the layer of the substance immobilizing agent (separated spots) and is immobilized covalently to the substrate via a photocrosslinking agent. Is higher.
  • the method of the present invention includes preparing an immunoassay plate on which an antibody or an antigen-binding fragment thereof or an antigen is immobilized, a nucleic acid chip on which DNA or RNA is immobilized on a substrate, a microarray, or the like.
  • an immunoassay plate on which an antibody or an antigen-binding fragment thereof or an antigen is immobilized
  • a nucleic acid chip on which DNA or RNA is immobilized on a substrate, a microarray, or the like.
  • the present invention can also be applied to immobilization of whole cells and components thereof.
  • the substance immobilizing agent according to the second aspect of the present invention is a bipolar or non-ionic water-soluble polymer, having one or more photoreactive groups, Further, it is composed of a polymer having a group capable of covalently bonding or coordinating with a metal.
  • the term “ambipolar” refers to a group having a group which becomes a cation and a group which becomes an anion when ionized in an aqueous solution having a pH around neutrality (pH 6 to 8), and the sum of the charges is substantially equal. Means 0.
  • “substantially” also mean that small enough not to adversely affect the effects of the present invention as not to force or 0 to a total force s ⁇ charge.
  • nonionic means that there is substantially no group that becomes ionized by ionization in an aqueous solution having a pH near neutrality (pH 6 to 8).
  • substantially means that such a group is not contained at all, or even if contained, in such a small amount that the effect of the present invention is not adversely affected (for example, when the number of such groups is (1% or less of the prime number).
  • the solubility of the water-soluble polymer in water is preferably 5 or more.
  • photoreactive group examples include an azido group (-N).
  • Preferable examples of the water-soluble polymer used in the present invention include a unit having a structure represented by the following general formula [I] (same as the above general formula D) and a unit represented by the following general formula [ ⁇ ] Examples include a polymer containing a unit having a structure.
  • the preferred water-soluble polymer described below has a photoreactive group, but a group capable of covalent or coordinating with a metal has not been introduced yet. A group capable of covalent or coordinating with a metal is added to the water-soluble polymer later. Introduced by the method described in.
  • X and Y each independently represent a polymerizable atomic group in a polymerized state
  • R 1 represents an atomic group having a photoreactive group.
  • the units represented by the general formulas [I] and [II] are as follows: [I] is 2 or more, [II] is 1 or more, and the number of units represented by the general formula [I] Is greater than the number of units represented by the general formula [II]).
  • unit [1] A unit having the structure represented by the general formula [I] may be referred to as “unit [1]” for convenience in the present specification as described above.
  • the unit having the structure represented by may be hereinafter referred to as “unit [11]” for convenience.
  • the phosphorylcholine-containing polymer uses a polymer containing phosphorylcholine which is a constituent of the biomembrane.
  • the invention was invented based on the idea that non-specific adsorption could be effectively prevented by immobilizing a desired substance on a substrate.
  • the unit [I] is a unit containing a phosphorylcholine group, and X represents a polymerizable atomic group in a polymerized state. X is preferably a bullet monomer residue.
  • a unit represented by the following general formula [r] (same as the above general formula [r]) is preferable. [0068] [Formula 12]
  • X ′ represents a methacryloxy group, a methacrylamide group, an acryloxy group, an acrylamide group, a styryloxy group or a styrylamide group in which a butyl moiety is subjected to addition polymerization to form a R
  • Such a unit include 2-methacryloyloxyshethylphosphorylcholine, 2-atalyloyloxhetylphosphorylcholine, ⁇ - (2-methacrylamido) ethyl phosphorylcholine, and 4-methacryloyloxy. Derived from butylphosphorylcholine, 6-methacryloyloxyhexylphosphorylcholine, 10-methacryloyloxydecylsylphosphorylcholine, ⁇ -methacryloyldioxyethylenephosphorylcholine, or 4-styroxybutylphosphorylcholine (that is, these units are polymerized). Units). Among these, a unit derived from 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine is particularly preferred.
  • photoreactive group in the unit [II] include an azido group (- ⁇ ).
  • the present invention is not limited to this.
  • ⁇ in the general formula [II] a vinyl monomer residue is preferable.
  • Preferred examples of the unit [II] include those represented by the following general formula [VI].
  • Y ′ represents a methacryloxy group, a methacrylamide group, an acryloxy group, an acrylamide group, a styryloxy group or a styrylamide group in a state in which the bullet portion undergoes addition polymerization
  • R 2 represents a single bond
  • the number of the units [I] is larger than the number of the units [II], and the ratio thereof is not particularly limited, but is preferably about 100: 1 to 100: 50, particularly 100: 1 to: LOO: 20. The degree is preferred.
  • the polymer mainly includes the unit [I] having a phosphorylcholine group, nonspecific adsorption is effectively prevented.
  • the molecular weight of the water-soluble polymer is not particularly limited, but is usually about 1,000 to 2,000,000, preferably about 5,000 to 1,500,000.
  • the water-soluble polymer may include a unit derived from another polymerizable monomer in a range that does not adversely affect the effects of the present invention.
  • the proportion of such other units is not particularly limited as long as it does not adversely affect the effects of the present invention, but is usually 70 mol% or less, preferably 50 mol% or less, of all units in the polymer. .
  • Preferred examples of the water-soluble polymer include those represented by the following general formula [V].
  • n and m are independent of each other, n is an integer of 2 or more, m is an integer of 1 or more, and n is a unit containing X ′ which is larger than m Units containing the position and Y 'are linked in a random order.
  • n is a unit in which the phosphorylcholine-containing unit larger than m and the azidophenol group-containing unit are bonded in random order.
  • n is preferably from 10 to 6000, and m 'is preferably from 1 to 200.
  • the water-soluble polymer can be produced by simply polymerizing the units [I] and [II].
  • a main chain polymer containing no side chain (phosphorylcholine group-containing group and photoreactive group-containing group) may be synthesized first, and the side chain may be bonded later.
  • the unit [I] having a phorolylcholine group-containing group and the unit [II] having no photoreactive group may be first polymerized, and the photoreactive group-containing group may be bonded later.
  • the following embodiment employs this method.
  • the polymerization of the monomer and the bonding of the side chains can be easily carried out according to the common technical knowledge of those skilled in the art, and one example is specifically described in the following Examples.
  • the phosphorylcholine-containing water-soluble polymer described above preferably has a free carboxyl group in order to introduce a group capable of covalent bonding or coordination bonding with a metal, as described later. .
  • a free carboxyl group has a power to further copolymerize a carboxyl group-containing vinyl monomer such as methacrylic acid or acrylic acid, or a light to react when a photoreactive group-containing group is bonded to a side chain.
  • the number of moles of free carboxyl groups is preferably about 5% to 50%, based on the total number of moles of all units constituting the water-soluble polymer molecule.
  • a non-ionic water-soluble polymer in addition to the above-mentioned ambipolar polymer containing a phosphorylcholine moiety, a non-ionic water-soluble polymer can also be preferably used.
  • the non-ionic water-soluble polymer has the same nonspecific adsorption preventing effect as the above-mentioned phosphorylcholine-containing polymer, but has the advantage that it can be produced or obtained at a lower cost than the phosphorylcholine-containing polymer.
  • the molecular weight of the non-ionic water-soluble polymer is not particularly limited, but is usually about 350 to 5,000,000, preferably about 500 to several hundred thousand.
  • a preferred example of such a non-ionic water-soluble polymer is polyethylene glycol.
  • Polyalkylene glycols such as (PEG) and polypropylene glycol; Burr alcohol, methyl vinyl ether, vinylpyrrolidone, vinyloxazolidone, vinylmethyloxazolidone, 2-bulpyridine, 4-bulpyridine, N-bulsuccinimide, N-bulpho Lumamide, N-Butyl-N-methylformamide, N-Buruacetoamide, N-Buru-N-methylacetoamide, 2-hydroxyethyl methacrylate, polyethylene glycol methacrylate, polyethylene glycol acrylate, acrylamide, methacryl Amide, ⁇ , ⁇ -dimethylacrylamide, ⁇ -iso-propylacrylamide, diacetone acrylamide, methylolatarylamide, atariloylmorpholine, atariloylpyrrolidine, atariloylbiperidine, Tylene, chloromethylstyrene, bromomethylstyrene, butyl acetate, methyl me
  • Examples include, but are not limited to, natural polymers. Of these, particularly preferred are polyethylene glycol-based polymers, poly (meth) acrylamide and poly (glycidyl (meth) atalylate). Of these, polyethylene glycol-based polymers are particularly preferred. Polyethylene glycol (meth) acrylate.
  • the above-mentioned non-ionic water-soluble polymer has a photoreactive group.
  • the number of photoreactive groups per molecule of the nonionic water-soluble polymer is not particularly limited as long as it is one or more, but two or more are preferred. Since the adsorption may increase, the number of carbon atoms constituting the polymer (not including the carbon in the side chain) is preferably 10% or less, more preferably 5% or less.
  • Azide group (-N) is a preferred example of the photoreactive group.
  • the photoreactive group examples include a phenylazide group, an acetyl group and a benzoyl group. Particularly preferred is a phenylazide group.
  • the photoreactive group such as an azide group may be directly bonded to the non-ionic water-soluble polymer, but may be bonded to the non-ionic water-soluble polymer via an arbitrary spacer structure. Usually, the latter is preferable because of easy production.
  • the spacer structure includes, but is not limited to, an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms (however, it may be substituted with one or two hydroxyl groups), a phenylene group. (However, it may be substituted with 1-3 alkyl groups or hydroxyl groups having 1 to 4 carbon atoms).
  • a photoreactive group into the non-ionic water-soluble polymer can be easily carried out by a conventional method.
  • a nonionic water-soluble polymer having a functional group can be reacted with an azide compound having a functional group that reacts with the functional group to bond the azide group to the non-ionic water-soluble polymer.
  • polyethylene diol glycol which is a preferred zo-on water-soluble polymer
  • polyethylene glycol having an amino group and a carboxyl group at both ends is commercially available.
  • the azide group containing the azide group is reacted with the functional group of Can be combined.
  • nonionic water-soluble polymer when the nonionic water-soluble polymer is formed by polymerization of a monomer, such as a water-soluble vinyl polymer, a vinyl-based monomer which is a main structural unit of the water-soluble vinyl-based polymer, A nonionic water-soluble polymer having a photoreactive group can also be produced by copolymerizing with a photoreactive vinyl monomer.
  • a photoreactive water-soluble vinyl polymer obtained by this method include poly ((meth) acrylamide-photoreactive (meth) acrylamide) copolymer and poly (daricidyl (meth) atalylate).
  • One-photoreactive (meth) acrylic amide) copolymer (polyethylene glycol mono (meth) acrylate) one-photoreactive acrylamide copolymer, etc. ) Acrylate (photoreactive acrylamide) copolymers are preferred.
  • the above-mentioned non-ionic water-soluble polymer preferably has a free carboxyl group in order to introduce a group capable of forming a covalent bond or a coordinate bond with a metal, as described later. Better.
  • a free carboxyl group can be easily provided, for example, by further copolymerizing a vinyl monomer having a propyloxyl group such as methacrylic acid or acrylic acid.
  • the number of moles of free carboxyl groups is preferably about 5% to 50% based on the total number of moles of all units constituting the water-soluble polymer.
  • the water-soluble polymer used in the present invention has a group capable of covalently bonding or coordinating with a metal.
  • gold used in QCM and SPR is important as metal.
  • the group that can be covalently bonded to gold include a thiol group. It is known that a thiol group is covalently bonded to gold. For example, Japan Nanonet Bulletin No. 58 (March 16, 2004) [described here!
  • a thiol group for example, the thiol group of a compound such as a 2-mercaptoethylamine having both an amino group and a thiol group in one molecule is protected. Then, the amino group and the above-mentioned free carboxyl group in the water-soluble polymer may be bonded with a cross-linking agent such as carbodiimide, and then the thiol group may be deprotected.
  • a cross-linking agent such as carbodiimide
  • the thiol group can be protected by, for example, converting a compound such as 2-mercaptoethylamine having an amino group and a thiol group in one molecule into a disulfide dimer. Deprotection, on the other hand, leads to disulfide dimers, It can be carried out by reacting a reducing agent such as ositol, which cleaves a disulfide bond, to cleave the disulfide bond to generate a free thiol group.
  • a method for introducing a thiol group by such a method is specifically described in Examples below. The method of introducing a thiol group is not limited to the above method.
  • the number of moles of the thiol group is preferably from 0.1 to: LOO mole, particularly preferably about 1 to 50 mole per one molecule of the water-soluble polymer.
  • the thiol group in the water-soluble polymer binds to gold only by bringing the solution of the water-soluble polymer into contact with gold at room temperature.
  • examples of the group capable of coordinating with gold include a carboxyl group and an amino group.
  • the carboxyl group the free carboxyl group contained in the water-soluble polymer described above can be used as it is.
  • the amino group can be easily introduced by bonding the free carboxyl group to the diamine conjugate using a cross-linking agent such as carbodiimide.
  • the present invention relates to a bipolar or non-ionic water-soluble polymer having at least two photoreactive groups in one molecule and a metal or a covalent bond or a metal.
  • a substance-immobilizing agent for immobilizing a substance on a metal comprising: a low-molecular compound having a group capable of coordinate bonding.
  • the water-soluble polymer having at least two photoreactive groups in one molecule is as described above (however, it is necessary to introduce at least two photoreactive groups in one molecule). And it is not necessary to introduce a group capable of forming a covalent bond or a coordination bond with a metal, so that the above-mentioned free carboxyl group is not included).
  • the low-molecular weight compound having a group capable of forming a covalent bond or a coordinate bond with a metal is preferably the thiol described above. It is a low molecular compound having a group, a carboxyl group or an amino group, and is not particularly limited as long as it has these groups. Preferred examples include alkylthiols such as octadecanethiol, mercaptoalkyl alcohols such as mercaptoethanol, alkylamines and alkylcarboxylic acids (the alkyl group in these compounds preferably has 2 carbon atoms). ⁇ 20).
  • the term "low molecular weight compound” means a compound having a molecular weight of 1,000 or less, and preferably has a molecular weight of about 50 to 500.
  • the mixing ratio of the water-soluble polymer and the low-molecular compound is not particularly limited, but is preferably 1 to 50, more preferably a molar ratio of the low-molecular compound to 100 of the water-soluble polymer. It is about 5 to 50.
  • the present invention also provides an amphoteric or nonionic water-soluble polymer, a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule, and a covalent bond or a coordinate bond with a metal. Also provided is a substance immobilizing agent for immobilizing a substance on a metal, comprising a low molecular compound having a possible group.
  • amphoteric or non-ionic water-soluble polymer is the same as the above-mentioned water-soluble polymer (however, it is necessary to introduce at least two photoreactive groups in one molecule, and Since it is not necessary to introduce a group capable of forming a covalent bond or a coordination bond with a metal, the above-mentioned free carboxyl group is not contained, and since the photoreactive group is not required, the water-soluble polymer power is also reduced. -With the N group removed or without the unit [II]
  • the “low-molecular compound having a group capable of covalent or coordinating with a metal” is as described above.
  • photoreactive group of the photocrosslinking agent include an azide group (-N).
  • a diazide conjugate having two azide groups is preferable, and a water-soluble diazido conjugate is particularly preferable.
  • a photocrosslinking agent represented by the following general formula [III] is used in the substance immobilizing agent according to the first aspect of the present invention.
  • R represents a single bond or an arbitrary group.
  • -R- is not particularly limited, since it has a structure only connecting two phenylazide groups.
  • Preferred examples of -R- include a single bond (that is, two ferrazide groups are directly connected) and an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (including one or two carbon-carbon unsaturated bonds. One or two carbon atoms may be double-bonded to oxygen to form a carboxy group,) (particularly preferably a methylene group), -0-, -SO-, -SS-, -S-,-R 2 JJ_LY R 3- (However, Nini has a single or double bond.
  • Y represents a cycloalkylene group having 3 to 8 carbon atoms
  • R 2 and R 3 each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (which may contain one or two carbon-carbon unsaturated bonds, The bond between the carbon atom at the base end of the alkylene group and Y may be a double bond), and one or two carbon atoms are double-bonded to oxygen to form a carboxy group, ),
  • the cycloalkylene group may be substituted with one or more optional substituents (if substituted, preferably the carbon atom constituting the cycloalkylene group) , One or two of which is double-bonded to oxygen to form a carbonyl group, and is substituted by Z or 1 or 2 alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • each benzene ring in the general formula [III] has one or more optional substituents (preferably Properly halogen, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, may be substituted with a sulfonic acid or a hydrophilic group of the salt).
  • substituents preferably Properly halogen, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, may be substituted with a sulfonic acid or a hydrophilic group of the salt.
  • preferable diazido conjugates include the above-described diazido conjugates, which are preferably used as a photocrosslinking agent in the substance fixing agent according to the first aspect of the present invention. Can be exemplified.
  • Water-soluble for an optical cross-linking agent means that an aqueous solution having a concentration of 0.5 mM or more, preferably 2 mM or more can be administered.
  • the mixing ratio of the water-soluble polymer, low-molecular compound and crosslinking agent is not particularly limited.
  • the low-molecular compound is present in a molar ratio of 1 to 50, more preferably 100 to water-soluble polymer 100.
  • the molar ratio of the crosslinking agent is about 1 to 50, and more preferably about 1 to 30.
  • the substrate on which the substance is immobilized using the substance immobilizing agent of the present invention has a metal surface and is used for QCM measurement or SPR measurement. Preferable! / ⁇ Can be mentioned as an example.
  • the immobilization of a desired substance on a substrate using the substance immobilizing agent of the present invention can be performed as follows. First, an aqueous solution or an aqueous suspension containing the substance to be fixed on the substrate and the substance fixing agent of the present invention is applied to the substrate.
  • the concentration (by weight) of the water-soluble polymer in the aqueous solution is not particularly limited, but is usually about 0.005% to 10%. And preferably about 0.04 to 1%.
  • the concentration of the substance to be immobilized (on a weight basis) is usually about 10 to 200 times, preferably about 20 to 100 times, the amount of the water-soluble polymer used.
  • the group capable of covalently bonding or coordinating with the metal binds to the substrate, whereby the water-soluble polymer (the polymer is capable of covalently bonding or coordinating with the metal) Or the above-mentioned low molecular compound is bonded to the substrate.
  • the substance-immobilizing agent contains the above low-molecular compound
  • the low-molecular compound is first allowed to act on the substrate to bind to the substrate, and then the aqueous solution or the aqueous suspension containing the substance to be immobilized and the water-soluble polymer is used.
  • a liquid or an aqueous solution or suspension containing a substance to be fixed, a water-soluble polymer, and a crosslinking agent is applied to the substrate.
  • the applied liquid is preferably dried, and then irradiated with light.
  • the light is light by which the photoreactive group used can generate a radical.
  • an azide group is used as the photoreactive group, ultraviolet light is preferable.
  • the dose of the irradiated light beam is not particularly limited, but is usually about lmW to 100 mW per 1 cm 2 .
  • Irradiation with light generates a photoreactive substrate S radical.
  • the water-soluble polymer has both a group capable of forming a covalent bond or a coordination bond with a metal and a photoreactive group
  • the substance to be immobilized on the photoreactive group of the water-soluble polymer bound to the substrate are covalently bonded, whereby the substance to be fixed is bonded to the substrate via the water-soluble polymer.
  • the water-soluble polymer has at least two photoreactive groups in one molecule and a low molecular weight compound having a group capable of covalently bonding or coordinating with a metal is used in combination, it is bonded to the substrate.
  • the water-soluble polymer is covalently bonded to the low-molecular compound, and the substance to be immobilized is covalently bonded to the water-soluble polymer.
  • the water-soluble polymer does not contain a photoreactive group and a low-molecular compound having a group capable of covalent or coordinating with a metal and a photocrosslinking agent are used in combination, the low-molecular compound bonded to the substrate is used.
  • the water-soluble polymer is covalently bonded to the polymer via a photocrosslinking agent, and the substance to be fixed is covalently bonded to the water-soluble polymer. Therefore, in any case, the substance to be fixed is fixed to the base.
  • the azido group used as a photoreactive group is irradiated with light so that a nitrogen molecule is released and a nitrogen radical is generated. Since it is possible to bond not only to a functional group such as a group but also to a carbon atom constituting an organic compound, it is possible to fix most organic substances.
  • a binding reaction is carried out by using a radical generated by a photoreactive group, it binds to a random site rather than to a specific site of a substance to be immobilized. Therefore, it is considered that some molecules may lose their activity due to binding of the active site, but some molecules may bind at a site that does not affect the active site. For example, even if a substance has been conventionally difficult to be fixed by a covalent bond due to the presence of an appropriate substituent at or near the active site, the covalent bond does not cause loss of activity as a whole. It can be fixed to the substrate.
  • the substance to be fixed Since the photoreactive group does not bind to the substance to be fixed in the vibrating part where the light is not irradiated, the substance to be fixed is removed by washing. Therefore, by performing selective exposure through a photomask or the like, a substance can be fixed in an arbitrary pattern. Therefore, the substance can be fixed in any of various shapes such as a microarray by selective exposure, which is very advantageous.
  • a mixture of the substance-immobilizing agent of the present invention and the substance to be immobilized may be microspotted on a substrate, and the entire surface of the substrate may be irradiated with light.
  • Microspotting is a method of applying a liquid to a very narrow area on a substrate, and is commonly used for the production of DNA chips and the like.Equipment for this is also commercially available. be able to.
  • the substance-immobilizing agent of the present invention may be coated on the entire surface of the substrate, microspotted with the substance to be immobilized thereon, and then the entire surface of the substrate may be irradiated with light.
  • a spot of the substance to be immobilized is formed on the layer of the substance immobilizing agent, and the proportion of the substance immobilized by covalent bonding to the substrate via the substance immobilizing agent increases.
  • the substance fixing agent of the present invention is microspotted on the substrate, the substance to be fixed is microspotted thereon, and then the entire surface of the substrate is irradiated with light. Also in this case, spots of the substance to be immobilized are formed on the layer of the substance fixing agent (separated spots), and the ratio of the substance immobilized on the substrate via the substance fixing agent is high. Become.
  • the method of the present invention provides a method for immobilizing an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or an antigen. It can be suitably used for the preparation of assay plates and for the preparation of nucleic acid chips and microarrays in which DNA or RNA is immobilized on a QCM or SPR substrate, but is not limited thereto.
  • the present invention can also be applied to fixing the components.
  • Methacryloyloxetyl phosphorylcholine (In the general formula [ ⁇ ], R 1 is -CH-
  • the MPC-methacrylic acid copolymer or MPC-butyl methacrylate copolymer produced as described above or a commercially available polyethylene glycol (average molecular weight: 1000) was used as the water-soluble polymer. Each water-soluble polymer was dissolved in water and adjusted to a concentration of 0.5% by weight.
  • Sodium 4,4'-diazidostilbene-2,2'-disulfonate (commercially available) was used as a photocrosslinking agent.
  • the water-soluble polymer prepared in 1 (2) and the optical crosslinking agent were mixed such that the concentration of the photocrosslinking agent was 0.25 mM.
  • the obtained mixture (1 mL) was mixed with A antigen-positive panel blood cells (1 mL).
  • the resulting blood cell suspension was spotted on a polystyrene dish in 0.5 L portions. After drying, the panel blood cells were fixed by UV irradiation (wavelength 260 nm, irradiation amount 40 mW / cm 2 , 10 seconds) (the water-soluble polymer was also fixed).
  • the measured luminescence intensity is shown in Table 1 below.
  • polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 (PEG1000) (a commercial product), polyethylene glycol having an average molecular weight of 10,000 (PEG10000) (a commercial product), or the MPC-butyl methacrylate copolymer prepared in Example 1 is used.
  • PEG1000 polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000
  • PEG10000 polyethylene glycol having an average molecular weight of 10,000
  • MPC-butyl methacrylate copolymer prepared in Example 1 is used.
  • Each water-soluble polymer was dissolved in water to a concentration of 0.125% by weight.
  • Each of the obtained aqueous solutions of the water-soluble polymers was mixed with a photocrosslinking agent (sodium 4,4′-diazidostilbene-2,2) (the final concentration of the optical crosslinking agent was 0.125 mM).
  • the plate After washing with PBS (0.1% Tween20 (registered trademark)), the plate was reacted with a Sgia allergen antibody (commercially available) at room temperature for 3 hours. After washing with PBS (0.1% T wee n20 (registered trademark)), HRP-labeled secondary antibody ( ⁇ ) At room temperature for 1 hour. After washing with PBS (0.1% T wee n20 (TM)), was added chemiluminescent reagent, and the emission intensity was measured. For comparison, the same operation as above was performed using a mite allergen antibody (commercially available) in place of the Sgia allergen antibody.
  • a mite allergen antibody commercially available
  • Photoreactive polyethylene glycol is obtained by combining lOOmg of poly (ethylene glycol) bis (3-aminopropyl) terminal (sold by Aldrich, average molecular weight 1500) and 68.6mg of N- (4-azidobenzyloxy) succinimide. It is obtained by dissolving in 10 ml of formamide, stirring at 4 ° C for 24 hours at pH 6 and reacting.
  • PMAc is a random copolymer of 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine (90%) and methacrylic acid (10%)
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • Example 3 The same operation as in Example 1 was performed, except that a polystyrene substrate having an average surface roughness of 0.2 ⁇ m or 0.4 ⁇ m or an acrylic substrate having an average surface roughness of 2.5 m to 20 m was used as the substrate (
  • the water-soluble polymer used was polyethylene glycol).
  • FIG. 1 shows the results. As shown in Fig. 1, when the average surface roughness of the substrate was 15 m, the emission intensity was clearly higher than that of the substrates with other surface roughness.
  • water-soluble polymer in addition to the above-mentioned polymer of polyethylene glycol metathallate, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 (PEG1000) (commercially available), polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 (PEG10000) (commercially available) or Examples
  • PEG1000 polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000
  • PEG10000 polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000
  • MPC-butyl methacrylate copolymer prepared in 1 was used.
  • Each water-soluble polymer was dissolved in water to a concentration of 0.125% by weight.
  • Each of the obtained aqueous polymer solutions was mixed with a photocrosslinking agent (sodium 4,4'-diazidostilbene-2,2'-disulfonate). weight%).
  • a photocrosslinking agent sodium 4,4'-diazidostilbene-2,2'-disulfonate. weight%.
  • Each of the aqueous solutions of the obtained water-soluble polymers was mixed 1: 1 with an aqueous solution of mite allergen (commercially available) (0.25% by weight). The resulting mixture was spotted on a polystyrene dish in 50 nL increments. After drying, mite allergen was immobilized by UV irradiation (wavelength 290 to 390 nm, illuminance 17 mW / cm 2 , 10 seconds) (the water-soluble polymer was also immobilized).
  • a methacryloyloxetyl phosphorylcholine (MPC) polymer was synthesized by a conventional method.
  • the mixing ratio of 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine and methacrylic acid was 9: 1 (hereinafter, “MPC 9: 1”), 7: 3 (hereinafter, “MPC 9: 1”) in molar ratio (ratio of n and m in the following formula).
  • MPC7: 3”) and 5: 5 hereinafter, “MPC5: 5” were synthesized.
  • the synthesized polymer is a random copolymer.
  • the average molecular weights of the synthesized MPC polymers were 215,000 for MPC9: 1, 550000 for MPC7: 3, and 1104000 for MPC5: 5. [0135] [Formula 18]
  • 2-mercaptoethylamine dimer was produced by the basis (20 ° C, 48 hours).
  • the product was 3-carboxyl cccll produced by the Ellman reaction of 5-5 'dithiobis 2-nitrobenzene.
  • MPC polymer As for the azide group introduced into one molecule, MPC9: 1 was 1 lmol, MPC7: 3 was 29.4 mol, and MPC5: 5 was 99.5 mol.
  • the thiol group and azide group-containing MPC9: 1, MPC7: 3, and MPC5: 5 prepared in Example 5 were fixed to the gold sensor chip electrode portion of the crystal resonator microbalance measurement device by the following method. . First, a piranha solution (hydrogen peroxide solution: concentrated sulfuric acid 1: 3) was placed on the electrode portion of the sensor chip, allowed to stand for 5 minutes, washed with water, and then blown with air to remove water. This operation was repeated. The sensor chip was set on the quartz crystal microbalance measurement device as shown in Fig. 2, and immersed in water until the baseline stabilized. In FIG. 2, reference numeral 1 denotes a sensor chip, and reference numeral 2 denotes pure water.
  • MPC7: 3 prepared in Example 1 and a commercial mite allergen antibody were mixed in a buffer at a weight ratio of 0.5: 1, and the resulting aqueous solution (MPC7: 3 polymer concentration 0.125% by weight) was placed on a sensor chip. 1 ⁇ L was spotted. After drying, it was fixed by ultraviolet irradiation (10 seconds, dose: 40 mWZcm 2 ). The sensor chip was set in 2 ml of PBS (1% BSA). After the baseline was stabilized, 10 L of mite allergen (100 g / ml), which had been previously concentrated, was added dropwise. The frequency change was measured over time by QCM. On the other hand, a control containing no mite allergen antibody was similarly fixed on a sensor chip and measured.
  • FIG. 4 shows the results. After dropping the mite allergen, the MPC polymer alone showed almost no change in frequency, whereas the frequency of the sensor chip with the mite allergen antibody fixed changed by about 500 Hz. This frequency change is due to the change in the weight of the sensor surface due to the antigen-antibody reaction, demonstrating that the mite allergen antibody immobilized with the MPC polymer can recognize the allergen. As a result, it became clear that allergens can be detected by QCM using the substance immobilizing agent of the present invention.
  • Sodium 4,4'-diazidostilbene-2,2'-disulfonate (commercially available) was used as a photocrosslinking agent.
  • the photo-crosslinking agent was mixed such that the concentration of the photo-crosslinking agent was 0.003125%, the concentration of the water-soluble polymer was 0.0625%, and the concentration of BSA (manufactured by Aldrich) was 0.125%.
  • the resulting aqueous solution was treated with a Biacore SPR gold substrate for 20 minutes with mercaptoethanol, and then 20 ⁇ L was applied onto a 7 ⁇ 7 mm 2 area and dried (film thickness: about 0.2 ⁇ m). Next, BSA was fixed by UV irradiation (black light for 7 minutes).
  • the SPR sensitivity (RU) was 300.
  • the QCM frequency change (Hz) was 1000.

Abstract

　基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤が開示されている。また、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を、その種類に関わらず金等の金属表面に固定化することができ、かつ、非特異吸着を抑制することができる物質固定化剤が開示されている。基体上に所望の物質を固定化するための物質固定化剤は、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーとを含む。金属に物質を固定化するための物質固定化剤は、両極性又はノニオン性の水溶性ポリマーであって、１個以上の光反応性基を有し、かつ、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有するポリマーから成る。

Description

明 細 書
物質固定化剤、それを用いた物質固定ィ匕方法及びそれを用いた物質固 定化基体
技術分野
[0001] 本発明は、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を基体上に固定ィ匕するため の物質固定化剤、それを用いた物質固定ィ匕方法及びそれを用いた物質固定ィ匕基体 に関する。
背景技術
[0002] 従来より、抗体又は抗原をプレート上に固定ィ匕した、免疫測定のためのィムノブレ ートや、核酸をチップ上に固定ィ匕した DNAチップ等が広く用いられている。従来、基 体上にタンパク質や核酸を固定ィ匕する方法の 1つとして、物理吸着が広く用いられて いる。すなわち、例えばポリスチレンのような疎水性の基体と、基体上に固定化すべ きタンパク質や核酸の水溶液とを接触させて放置することにより、物理吸着によってタ ンパク質や核酸が基体上に固定化される。
[0003] し力しながら、物理吸着を用いる方法では、基体と固定ィ匕物質との結合が弱ぐ物 質を固定ィ匕した基体の安定性が不十分であるという問題がある。また、目的のタンパ ク質ゃ核酸で被覆されな力つた領域への非特異吸着を防止するために、ゥシ血清ァ ルブミン (BSA)、カゼイン、スキムミルク等のタンパク質 (タンパク質を固定ィ匕する場合） や、サケ精子 DNA等の DNA(DNAを固定化する場合）でブロッキングすることが行 われて 、るが、ブロッキングによる非特異吸着の防止効果も必ずしも満足できるもの ではない。
[0004] また、基体上の官能基と、固定ィ匕すべきタンパク質や核酸の官能基とを共有結合さ せることにより基体上にタンパク質や核酸を固定ィ匕することも行われて 、る。しかしな がら、この方法では、用いる官能基が物質の活性部位の中又はその近傍にある場合 には、固定ィ匕により物質の活性が失われてしまう。また、適当な官能基が存在しない 場合には、この方法により固定ィ匕することができない。また、物理吸着の場合と同様、 ブロッキングにより非特異吸着が防止されているが、その防止効果は必ずしも満足で きるものではない。
[0005] 一方、光反応性基を利用して物質を基板に固定ィ匕することも知られている (Y. Ito and . Nogawa, Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay," Biomaterials, 24、 3021—3026 (2003》。し力しなが ら、この方法では、非特異吸着を防止するための配慮は特にされてはいない。
[0006] また、ある物質と他の物質との相互作用を調べる方法として、水晶発振子 (QCM)や 表面プラズモン共鳴 (SPR)が広く用いられている。これらの方法は、物質間の反応をリ アルタイムで検出することができるという優れた利点を有しており、化学分野における 様々な研究に広く用いられている。これらの方法を用いる場合には、被検物質を金に 結合することが必要である。
[0007] 従って、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質と他の物質の相互作用、例えば 、抗原抗体反応や核酸間のハイブリダィゼーシヨンを QCMや SPRで検出しょうとする 場合には、これらの生体分子を金表面に結合することが必要になる。生体分子を金 表面に結合するために、従来、アミノ基ゃカルボキシル基のような官能基を生体分子 に導入したり、ピオチンや Fcセグメントを生体分子に導入することが必要であった。こ のため、金表面に固定ィ匕できないか又は固定ィ匕すると活性が失われて目的とする反 応を行なうことができない場合も多力つた。また、金表面に生体分子が結合できる場 合であっても、該生体分子との反応を調べようとする物質が金表面に非特異的に吸 着し、所望の反応を特異的に検出することが困難になる場合もしばしばあった。
[0008] 特許文献 1 :特開平 11 337551号公報
特許文献 2：特開 2001— 337089号公報
非特干文献 1： Y. Ito and M. Nogawa, Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay," Biomaterials, 24、 3021-3026 (2003)
非特許文献 2：ナノテクノロジ一大辞典（ (株)工業調査会発行 (2003年 12月 25日）） 838〜839頁
非特許文献 3 : Japan Nanonet Bulletin第 58号（2004年 3月 16日）
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0009] 従って、本発明の目的は、基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固 定ィ匕することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それ を用いた物質固定ィ匕方法及びそれを用いた物質固定ィ匕基体を提供することである。
[0010] また、本発明の目的は、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を、その種類に 関わらず金等の金属表面に固定ィ匕することができ、かつ、非特異吸着を抑制すること ができる物質固定化剤、それを用いた物質固定ィ匕方法及びそれを用いた物質固定 化基体を提供することである。
課題を解決するための手段
[0011] 本願発明者らは、鋭意研究の結果、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有す る光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーとの混合物を物質固 定化剤として用いることにより、基体上に種々の固定ィ匕すべき物質を共有結合により 固定ィ匕することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れることを見出し本発明を 兀成し 7こ。
[0012] すなわち、本発明は、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有する光架橋剤と、 分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーとを含む、基体上に所望の物質を固 定ィ匕するための物質固定化剤を提供する。また、本発明は、基体に固定化すべき物 質と、上記本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布 し、光照射することを含む、基体上への物質の固定ィ匕方法を提供する。さらに、本発 明は、上記本発明の方法により前記物質が固定化された基体を提供する。
[0013] また、本願発明者らは、鋭意研究の結果、光反応性基を有し、かつ、金属と共有結 合又は配位結合可能な基を有する両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマーを、所望 の物質を固定ィ匕するための物質固定化剤として利用することにより、金属に所望の 物質を固定ィ匕することができ、かつ、該所望の物質との相互反応を調べようとする他 の物質の非特異吸着を効果的に抑制することができることを見出した。さらに、上記 水溶性ポリマーに代えて、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有する両極性若 しくはノ-オン性の水溶性ポリマーと、金属と共有結合若しくは配位結合可能な基を 有する化合物との混合物、又は両極性若しくはノニオン性の水溶性ポリマーと、 1分 子中に少なくとも 2個の光反応性基を有する光架橋剤と、金属と共有結合又は配位 結合可能な基を有する化合物との混合物を用いても、同様の効果が得られることを 見出した。
[0014] すなわち、本発明は、両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマーであって、 1個以上 の光反応性基を有し、かつ、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有するポリマ 一から成る、金属に物質を固定ィ匕するための物質固定化剤を提供する。また、本発 明は、両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマーであって、 1分子中に少なくとも 2個の 光反応性基を有する水溶性ポリマーと、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有 する低分子化合物とを含む、金属に物質を固定化するための物質固定化剤を提供 する。さらに、本発明は、両極性又はノニオン性の水溶性ポリマーと、 1分子中に少な くとも 2個の光反応性基を有する光架橋剤と、金属と共有結合又は配位結合可能な 基を有する低分子化合物とを含む、金属に物質を固定化するための物質固定化剤 を提供する。さらに、本発明は、基体に固定ィヒすべき物質と、上記本発明の物質固 定化剤又は物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照 射することを含む、基体上への物質の固定ィ匕方法を提供する。さらに、本発明は、上 記本発明の方法により、前記物質が金属上に固定化された基体を提供する。
発明の効果
[0015] 本発明により、基体上に種々の固定ィ匕すべき物質を共有結合により固定ィ匕すること ができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質 固定ィ匕方法及びそれを用いた物質固定ィ匕基体が提供された。本発明によれば、固 定化すべき物質を、その種類に関係なく共有結合により固定ィ匕することができ、安定 な固定ィ匕基板を得ることができる。また、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固 定化すると、非特異吸着が効果的に防止される。さらに、本発明の物質固定化剤を 用いて物質を固定ィ匕する場合、選択露光を行うことにより、固定ィ匕物質のパターニン グも可能であり、容易にマイクロアレイ等の任意のパターンに物質を固定ィ匕すること ができる。
[0016] また、本発明により、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を、その種類に関わ らず金等の金属表面に固定ィ匕することができ、かつ、非特異吸着を抑制することがで きる物質固定化剤が初めて提供された。光反応性基は、有機化合物中の炭素原子 とも結合するので、本発明の物質固定化剤を用いれば、有機物をその種類に関わら ず金属表面に固定ィ匕することができる。また、両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマ 一により非特異吸着が効果的に抑制される。従って、本発明は、各種生体分子と他 の物質との相互作用の QCM測定や SPR測定に大いに寄与するものと考えられる。 図面の簡単な説明
[0017] [図 1]本発明の実施例 3で行った免疫測定における基板の平均表面粗さと発光強度 との関係を示す図である。
[図 2]水晶発振子マイクロバランス測定装置を用いて QCM測定する方法を模式的に 示す図である。
[図 3]本発明の実施例 6で調製した物質固定化剤と、水晶発振子マイクロバランス測 定装置のセンサチップの金電極との反応を QCM測定した際の、周波数変化の経時 変化を示す図である。
[図 4]本発明の実施例 7で行った、本発明の物質固定化剤を用いてダニアレルゲン 抗体を水晶発振子マイクロバランス測定装置のセンサチップの金電極に固定ィ匕し、 ダニアレルゲンとの抗原抗体反応を QCM測定した際の、周波数変化の経時変化を 示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 上記の通り、本発明の第 1の局面の物質固定化剤は、 1分子中に少なくとも 2個の 光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーと を含む。
[0019] 光架橋剤が有する光反応性基の好ま ヽ例として、アジド基 (-N )を挙げることがで
3
きるがこれに限定されるものではない。光架橋剤としては、アジド基を 2個有するジァ ジドィ匕合物が好ましぐ特に水溶性ジアジドィ匕合物が好ましい。本発明に用いられる 光架橋剤の好まし 、例として、下記一般式 [III]で表されるジアジドィ匕合物を挙げるこ とがでさる。 [0020] [化 1]
Figure imgf000008_0001
[0021] 一般式 [I]中、 Rは単結合又は任意の基を示す。 -R-は、 2個のフエニルアジド基を 連結するだけの構造であるから、特に限定されない。好ましい- R-の例として、単結合 (すなわち、 2個のフエ-ルアジド基が直接連結される）、炭素数 1〜6のアルキレン基 ( 1個又は 2個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよぐ 1個又は 2個の炭素原子が 酸素と二重結合してカルボ二ル基を構成して 、てもよ 、）（特に好ましくはメチレン基） 、 - 0-、 -SO -、 -S-S -、 -S -、 - R2JJ_LY R3- (ただし、ニニは単結合又は二重結合を
2
示し、 Yは炭素数 3〜8のシクロアルキレン基、 R2及び R3は互いに独立に炭素数 1〜6 のアルキレン基（1個又は 2個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよぐ該アルキレン 基の基端の炭素原子と Yとの結合が二重結合であってもよく）、 1個又は 2個の炭素 原子が酸素と二重結合してカルボ-ル基を構成して 、てもよ 、）を示し、シクロアルキ レン基は、 1個又は 2個以上の任意の置換基で置換されていてもよく（置換されている 場合、好ましくはシクロアルキレン基を構成する炭素原子のうち、 1個若しくは 2個が 酸素と二重結合してカルボ二ル基を構成し、及び Z若しくは 1個若しくは 2個の炭素 数 1〜6のアルキル基で置換されている）を挙げることができ、また、一般式 [II]中のそ れぞれのベンゼン環は、 1個又は 2個以上の任意の置換基 (好ましくはハロゲン、炭 素数 1〜4のアルコキシル基、スルホン酸若しくはその塩等の親水性基)で置換され ていてもよい。好ましい- R-の具体例として次のものを例示することができる。一、 -CH 一、一 0 -、一 SO -、一 S— S―、一 S―、一 CH=CH―、一 CH=CH— CO -、一 CH=CH— CO— CH=CH -
2 2
、一 CH=CH -、 [0022] [化 2]
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
[0023] 好ましいジアジドィ匕合物の具体例として、下記のものを例示することができる。
[0024] [化 3]
Figure imgf000009_0003
Figure imgf000009_0004
Figure imgf000010_0001
00254 [0027] [化 6]
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
[0028] [化 7]
Figure imgf000011_0003
本発明に用いられる光架橋剤の内、特に好ましいのは水溶性のものである。光架 橋剤についての「水溶性」とは、 0.5mM以上、好ましくは 2mM以上の濃度の水溶液を 与免ることができることを意味する。
[0030] 光架橋剤の使用時の濃度 (被固定化物質と混合する前の濃度)は、特に限定され ないが、 1 Mないし 2mMが好ましぐさらに好ましくは O.OlmMないし 0.5mMである。ま た、水溶性ポリマーに対する添加量としては、特に制限はないが、好ましくは 0.1〜50 重量％、特に 1〜30重量％、更には 1〜10重量％である。
[0031] 本発明の物質固定化剤に含まれる水溶性ポリマーは、分子全体として電気的に中 性な水溶性ポリマーである。ここで、「分子全体として電気的に中性」とは、中性付近 の pH (pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を有さな!/、か、又は有して!/、て も陽イオンになるものと陰イオンになるものを有していて、その電荷の合計が実質的 に 0になることを意味する。ここで「実質的に」とは、電荷の合計力^になる力、又は 0 にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に小さいことを意味する
[0032] 本発明に用いられる水溶性ポリマーの水に対する溶解度 (水 lOOgに溶解するダラ ム数）は、好ましくは 5以上である。
[0033] 水溶性ポリマーの好ましい例として、ノ-オン性水溶性ポリマーを挙げることができ る。ノ-オン性水溶性ポリマーは、優れた非特異吸着防止効果を有し、また、安価に 製造又は入手可能であると 、う利点を有する。
[0034] ここで、「ノ-オン性」とは、中性付近の pH (pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンに なる基を実質的に有さないことを意味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全 く含まないか、又は含んでいるとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微 量 (例えば、このような基の数が炭素数の 1%以下)であることを意味する。
[0035] ノニオン性水溶性ポリマーの分子量 (平均分子量、以下同じ）は、特に限定されず、 通常、 350〜500万程度である力 ノ-オン性水溶性ポリマーの分子量が大きいと、 ノニオン性水溶性ポリマー同士の架橋が多くなり、被固定ィ匕物質と、被固定化物質と の反応に供される物質 (以下、便宜的に「反応物質」と呼ぶことがある）との反応が起 きにくくなる場合があるので、 500〜数 10万程度が好ましい。
[0036] 本発明で用いられるノニオン性水溶性ポリマーの好まし 、例として、ポリエチレング リコール (PEG)やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール；ビュルァ ノレコーノレ、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルォキサゾリドン、ビニノレメ チルォキサゾリドン、 2-ビュルピリジン、 4-ビュルピリジン、 N-ビュルサクシンイミド、 N- ビュルホルムアミド、 N-ビュル- N-メチルホルムアミド、 N-ビュルァセトアミド、 N-ビ- ル- N-メチルァセトアミド、 2-ヒドロキシェチルメタタリレート、ポリエチレングリコールメ タクリレート、ポリエチレングリコールアタリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、 Ν,Ν- ジメチルアクリルアミド、 Ν- iso-プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロ ールアクリルアミド、アタリロイルモルホリン、アタリロイルピロリジン、アタリロイルビペリ ジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビュル、メチルメタ タリレート、ブチルアタリレート、メチルシアノアクリレート、ェチルシアノアクリレート、 n- プロピルシアノアクリレート、 iso-プロピルシアノアクリレート、 n-ブチルシアノアクリレー ト、 iso-ブチルシアノアクリレート、 tert-ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレ ート、ェチルビ-ルエーテル、 n-プロピルビュルエーテル、 iso-プロピルビュルエーテ ル、 n-ブチルビ-ルエーテル、 iso-ブチルビ-ルエーテル、 tert-ブチルビ-ルエー テルなどのモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノ-オン性のビュル系高 分子；ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、 グァーガム、プルラン、ぺクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチ ン誘導体、カラギーナン、澱粉類 (カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン）、 デキストリン、サイクロデキストリン等の天然高分子、メチルセルロース、ビスコース、ヒ ドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレメチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセ ルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然 高分子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特に 好ましいものはポリエチレングリコール系ポリマー（ポリエチレングリコール、ポリエチレ ングリコール部分を有するビニルイ匕合物のビュル重合体）、ポリ（メタ)アクリルアミド（ 本明細書及び特許請求の範囲において、「(メタ)アクリル」は、「メタクリル」又は「ァク リル」を意味する)及びポリ（グリシジル (メタ)アタリレート)であり、これらの中で特に好 ましくは、ポリエチレングリコール系ポリマーであり、更には、疎水性の主鎖に親水性 の側鎖がついたポリエチレングリコール (メタ)アタリレートのビュル重合体力 Sもっとも好 ましい効果を有する。 [0037] 水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式 [I]で表される構造を有する単位を 有する水溶性ポリマーを挙げることができる。
[0038] [化 8]
Figure imgf000014_0001
[0039] (ただし、一般式 [I]中、 Xは、重合した状態の重合性原子団を表わす）
[0040] なお、上記一般式 [I]で表される構造を有する単位を以下、便宜的に「単位 [1]」と言 うことがある。
[0041] 上記ホスホリルコリン含有ポリマーは、生体膜が種々の物質と接触するにもかかわら ず、非特異吸着がほとんど起きないことに着目し、生体膜の構成成分であるホスホリ ルコリンを含む高分子を利用して、所望の物質を基体に固定ィ匕することにより非特異 吸着を有効に防止できるのではないかという着想に基づいて発明されたものである。
[0042] 単位 [I]は、ホスホリルコリン基を含む単位であり、 Xは重合した状態の重合性原子 団を表す。 Xとしては、ビュル系モノマー残基が好ましい。単位 [I]としては、下記一般 式 [ で示されるものが好まし 、。
[0043] [化 9]
Figure imgf000014_0002
[0044] (ただし、 X'は、ビニル部分が付加重合して ヽる状態のメタクリルォキシ基、メタクリル アミド基、アクリルォキシ基、アクリルアミド基、スチリルォキシ基又はスチリルアミド基 を表し、 R1は単結合又は炭素数 1〜： LOのアルキレン基 (ただし 1個又は 2個のヒドロキ シル基で置換されて 、てもよ 、）を表す）
[0045] このような単位の好ましい具体例として、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコ リン、 2—アタリロイルォキシェチルホスホリルコリン、 N— (2—メタクリルアミド）ェチル ホスホリルコリン、 4ーメタクリロイルォキシブチルホスホリルコリン、 6—メタクリロイルォ キシへキシルホスホリルコリン、 10-メタクリロイルォキシデシルシルホスホリルコリン、 ω メタタリロイルジォキシエチレンホスホリルコリン又は 4 スチリルォキシブチルホ スホリルコリンに由来する（すなわち、これらの単位を重合させた)単位を挙げることが できる。これらの中でも 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンに由来する単 位が特に好ましい。
[0046] 単位 [I]を含有する水溶性ポリマーは、単位 [I]のみが重合したものであってもよいし
、単位 [I]と、本発明の効果に悪影響を与えない他の重合性モノマーとの共重合体で あってもよい。他の重合性モノマーとしては、ビニル系モノマーが好ましぐ特に (メタ） アクリル酸又はその塩若しくはエステル (好ましくは低級アルキル (炭素数 1〜6)エス テル)が好ましい。共重合体の場合、共重合体を構成する単位 [I]と他の重合性モノ マーとの比率は、特に限定されないが、モル比で 1 : 0.7以下、特に 1:0.5以下が好まし い。なお、光架橋剤として親水性基と疎水性基の両方を有する化合物を用いる場合
、ミセルイ匕を防ぐため、（メタ)アクリル酸アルキルエステル (アルキル部分の炭素数が 好ましくは 3〜6)のような親水性基と疎水性基 (アルキルエステル部分)の両方を含 むモノマーと共重合することが好まし 、。
[0047] 単位 [I]を含有する水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、 1,000 〜2, 000,000程度であり、好ましくは、 5,000〜1,500,000程度である。
[0048] 水溶性ポリマーの使用時の濃度 (被固定ィ匕物質と混合する前の濃度）は、特に限 定されないが、通常、 0.005重量％〜10重量％、好ましくは 0.04重量％〜1重量％程 度である。
[0049] 本発明の物質固定化剤は、上記した光架橋剤及び水溶性ポリマーに加え、さらに 溶媒を含んでいてもよい。溶媒としては、水、水と任意の割合で混じり合う低級アルコ ール (好ましくはエタノール)及びこれらの混合物を用いることができ、水が好まし 、。
[0050] 本発明の物質固定化剤に含まれる光架橋剤及び水溶性ポリマーは、それ自体公 知であり、公知の製造方法により製造可能であり、また、市販されているものもある。
[0051] 本発明の物質固定化剤を用いて固定化される物質は、特に限定されないが、ポリ ペプチド (糖タンパク質及びリポタンパク質を包含する）、核酸、脂質並びに細胞 (動 物細胞、植物細胞、微生物細胞等)及びその構成要素 (核、ミトコンドリア等の細胞内 小器官、細胞膜や単位膜等の膜等を包含する）を例示することができる。本発明の物 質固定化剤に光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素 分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基ゃカルボ キシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合すること が可能であるので、ほとんどの有機物を固定ィ匕することが可能である。
[0052] 基体としては、少なくともその表面が、上記光反応性基と結合し得る物質から成るも のであれば特に限定されず、マイクロプレート等で広く用いられているポリスチレンを はじめ、アクリル榭脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートやポリプロピレン 等の有機物力も成るものを例示することができる。ガラス板にシランカップリング剤をコ 一ティングしたもの等も用いることができる。更には、金表面をアルキルチオールなど で有機処理されたものも好ましく使用可能である。また、基体の形態は何ら限定され るものではなぐマイクロアレイ用基板のような板状のものや、ビーズ状、繊維状のも の等を用いることができる。さらに、板に設けられた穴や溝、例えば、マイクロプレート のゥエル等も用いることができる。本発明の物質固定化剤は、これらのうち、特にマイ クロアレイ用に適している。また、基体の平均表面粗さが 14 /z mないし 17 /ζ πι、特に 15 μ mである場合に、被固定化物質と反応物質との反応が特に起きやすくなるので 好ましい。なお、平均表面粗さは、通常使用されている表面粗さ計により測定すること ができる。
[0053] 本発明の物質固定化剤を用いて、基体上に所望の物質を固定ィ匕することは、次の ようにして行うことができる。先ず、基体に固定ィ匕すべき物質と、本発明の物質固定 ィ匕剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布する。この場合、水溶液中の 物質固定化剤の各成分の好ましい濃度は上記した通りである。また、固定化すべき 物質の濃度 (重量基準）は、通常、用いる物質固定化剤の 10倍ないし 200倍程度で あり、好ましくは 20倍ないし 100倍程度である。
[0054] 次に、塗布した液を好ましくは乾燥した後、光を照射する。光は、用いる光反応性 基がラジカルを生じさせることができる光であり、光反応性基としてアジド基を用いる 場合には、紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、 lcm2当たり lmW〜100mW程度である。 [0055] 光を照射することにより、光架橋剤中の光反応性基がラジカルを生じ、光架橋剤が 基体及び固定化すべき物質の双方と共有結合する。その結果、固定化すべき物質 が光架橋剤を介して基体に固定化される。また、水溶性ポリマーも光架橋剤を介して 基板に固定化される。光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することに より窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基ゃ カルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合す ることが可能であるので、ほとんどの有機物を固定ィ匕することが可能である。なお、本 発明の方法では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、 固定ィ匕すべき物質の特定の部位と結合するのではなぐランダムな部位と結合する。 従って、活性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も当然出てくると考えられる 力 活性部位に影響を与えない部位で結合する分子も当然存在するので、本発明の 方法によれば、従来、適当な置換基が活性部位又はその近傍にあるために、共有結 合で固定ィ匕することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させるこ となぐ共有結合により基体に固定ィ匕することができる。
[0056] 光が照射されな力つた部分では、光反応性基が基体及び固定ィ匕すべき物質に結 合しないので、洗浄すれば光架橋剤も固定化すべき物質も除去される。従って、フォ トマスク等を介して選択露光を行うことにより、任意のパターンで固定ィ匕すべき物質を 固定ィ匕することができる。従って、選択露光により、マイクロアレイ等の任意の種々の 形状に固定ィ匕すべき物質を固定ィ匕することができるので、非常に有利である。
[0057] あるいは、本発明の物質固定化剤と、固定化すべき物質の混合物を基体上にマイ クロスポッティングし、基体の全面を光照射してもよい。マイクロスポッティングは、液を 基体上に非常に狭い領域に塗布する手法であり、 DNAチップ等の作製に常用されて おり、そのための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことが できる。あるいは、先ず、基体上に本発明の物質固定化剤を全面にコーティングし、 その上に固定ィ匕すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射 してもよい。この場合、固定ィ匕すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層の上に形 成され、光架橋剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。 さらに、基体上に本発明の物質固定化剤をマイクロスポッティングし、その上に固定 化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。こ の場合にも固定ィ匕すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層（それぞれ分離したス ポット）の上に形成され、光架橋剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割 合が高くなる。
[0058] 本発明の方法は、抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原を固定ィ匕した免疫 測定用プレートの作製、 DN Aや RN Aを基板上に固定ィ匕した核酸チップ、マイクロア レイ等の作製に好適に用いることができるがこれらに限定されるものではなぐ例えば
、細胞全体やその構成要素の固定ィ匕等にも適用することができる。
[0059] 一方、上記の通り、本発明の第 2の局面の物質固定化剤は、両極性又はノ-オン 性の水溶性ポリマーであって、 1個以上の光反応性基を有し、かつ、金属と共有結合 又は配位結合可能な基を有するポリマーから成る。ここで、「両極性」とは、中性付近 の pH (pH6〜8)の水溶液中で電離して陽イオンになる基と陰イオンになる基を有して いて、その電荷の合計が実質的に 0になることを意味する。ここで「実質的に」とは、 電荷の合計力 s〇になる力、又は 0にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与え ない程度に小さいことを意味する。また、「ノ-オン性」とは、上記したとおり、中性付 近の pH (pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を実質的に有さないことを意 味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全く含まないか、又は含んでいるとし ても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微量 (例えば、このような基の数が炭 素数の 1%以下)であることを意味する。
[0060] 上記水溶性ポリマーの水に対する溶解度 (水 lOOgに溶解するグラム数）は、好まし くは 5以上である。
[0061] 上記光反応性基の好ま 、例としてアジド基 (-N )を挙げることができるが、これに
3
限定されるものではない。
[0062] 本発明に用いられる水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式 [I] (上記一般 式 D]と同じ)で表される構造を有する単位と、下記一般式 [Π]で示される構造を有する 単位を含むポリマーを挙げることができる。なお、以下に説明する好ましい水溶性ポリ マーは、光反応性基を有するが、金属と共有結合又は配位結合可能な基はまだ導 入されていない。金属と共有結合又は配位結合可能な基は、該水溶性ポリマーに後 で説明する方法により導入される。
[0063] [化 10]
Figure imgf000019_0001
[0064] [化 11]
Figure imgf000019_0002
[0065] (ただし、一般式 [I]及び [II]中、 X及び Yは、互いに独立して、重合した状態の重合性 原子団を表し、 R1は光反応性基を有する原子団を表し、一般式 [I]及び [II]で表される 単位は、 [I]は 2個以上で [II]は 1個以上であり、かつ、一般式 [I]で表される単位の数 は、一般式 [II]で表される単位の数よりも大きい)。
(上記一般式 [I]で表される構造を有する単位を、上記の通り本明細書にぉ 、て便宜 的に「単位 [1]」と言うことがある。また、上記一般式 [Π]で示される構造を有する単位を 、以下、便宜的に「単位 [11]」と言うことがある。 )
を挙げることができる。
[0066] 上記ホスホリルコリン含有ポリマーは、生体膜が種々の物質と接触するにもかかわら ず、非特異吸着がほとんど起きないことに着目し、生体膜の構成成分であるホスホリ ルコリンを含むポリマーを利用して、所望の物質を基体に固定ィ匕することにより非特 異吸着を有効に防止できるのではないかという着想に基づいて発明されたものであ る。
[0067] 単位 [I]は、ホスホリルコリン基を含む単位であり、 Xは重合した状態の重合性原子 団を表す。 Xとしては、ビュル系モノマー残基が好ましい。単位 [I]としては、下記一般 式 [r] (上記一般式 [r]と同じ）に示されるものが好ましい。 [0068] [化 12]
Figure imgf000020_0001
[0069] (ただし、式中、 X'は、ビュル部分が付加重合して 、る状態のメタクリルォキシ基、メ タクリルアミド基、アクリルォキシ基、アクリルアミド基、スチリルォキシ基又はスチリル アミド基を表し、 R1は単結合又は炭素数 1〜10のアルキレン基 (ただし 1個又は 2個 のヒドロキシル基で置換されて 、てもよ 、）を表す)。
[0070] このような単位の好ましい具体例として、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコ リン、 2—アタリロイルォキシェチルホスホリルコリン、 Ν— (2—メタクリルアミド）ェチル ホスホリルコリン、 4ーメタクリロイルォキシブチルホスホリルコリン、 6—メタクリロイルォ キシへキシルホスホリルコリン、 10-メタクリロイルォキシデシルシルホスホリルコリン、 ω メタタリロイルジォキシエチレンホスホリルコリン又は 4 スチリルォキシブチルホ スホリルコリンに由来する（すなわち、これらの単位を重合させた)単位を挙げることが できる。これらの中でも 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンに由来する単 位が特に好ましい。
[0071] 一方、単位 [II]中の光反応性基の好ま 、例としてアジド基 (-Ν )を挙げることができ
3
るがこれに限定されるものではない。また、一般式 [II]の Υとしては、ビニル系モノマー 残基が好ましい。単位 [II]の好ましい例として、下記一般式 [VI]で示されるものを挙げ ることがでさる。
[0072] [化 13] [VI]
I
[0073] (ただし、 Y'は、ビュル部分が付加重合して 、る状態のメタクリルォキシ基、メタクリル アミド基、アクリルォキシ基、アクリルアミド基、スチリルォキシ基又はスチリルアミド基 を表し、 R2は単結合、炭素数 1〜： LOのアルキレン基 (ただし 1個又は 2個のヒドロキシ ル基で置換されていてもよい）、フエ-レン基 (ただし、 1〜3個の炭素数 1〜4のアル キル基又はヒドロキシル基で置換されて 、てもよ 、。 )
[0074] 単位 [I]の数は単位 [II]の数よりも大きぐその比率は、特に限定されないが、 100 : 1 〜 100 : 50程度が好ましぐ特に 100 : 1〜： LOO : 20程度が好ましい。このように、ポリ マーは、ホスホリルコリン基を有する単位 [I]から主として成ることにより、非特異吸着が 効果的に防止される。また、水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常 、 1,000〜2,000,000程度であり、好ましくは、 5,000〜1,500,000程度である。
[0075] 上記水溶性ポリマーは、本発明の効果に悪影響を与えな 、範囲で他の重合性モノ マー由来の単位を含んでいてもよい。このような他の単位の割合は、本発明の効果 に悪影響を与えない範囲であれば特に限定されないが、通常、ポリマー中の全単位 中の 70モル％以下、好ましくは 50モル％以下である。
[0076] 上記水溶性ポリマーの好まし 、例として、下記一般式 [V]で表すものを挙げることが できる。
[0077]
Figure imgf000021_0001
[0078] (ただし、式中、 X'、 Y'、
Figure imgf000021_0002
R2は上記定義と同じ意味を表し、 n及び mは、互いに独 立して、 nは 2以上、 mは 1以上の整数であり、かつ、 nは mよりも大きぐ X'を含む単 位と Y'を含む単位はランダムな順序で結合している。 )
[0079] 上記一般式 [V]で示される化合物の中でも、特に下記式 [IV]で示されるポリマーが 好ましい。 [0080] [化 15]
Figure imgf000022_0001
[0081] (ただし、 η'は 2以上の整数、 m'は 1以上の整数を表し、かつ nは mよりも大きぐホス ホリルコリン含有単位と、アジドフエ-ル基含有単位はランダムな順序で結合して 、る
) o
なお、 nは 10〜6000が好ましぐ m'は 1〜200が好ましい。
[0082] 上記水溶性ポリマーは、上記した単位 [I]及び単位 [II]を単に重合させることにより製 造することができる。あるいは、側鎖 (ホスホリルコリン基含有基及び光反応性基含有 基)を含まない主鎖のポリマーを先に合成し、後から側鎖を結合してもよい。また、ホ ルホリルコリン基含有基を有する単位 [I]と、光反応性基を有さな 、単位 [II]とを先ず重 合し、後から光反応性基含有基を結合させてもよい。下記の実施例ではこの方法を 採用している。なお、モノマーの重合や、側鎖の結合は、当業者の技術常識に従つ て容易に実施することができるし、下記の実施例にもその一例が具体的に記載され ている。
[0083] なお、上記したホスホリルコリン含有水溶性ポリマーは、後述の通り、金属と共有結 合又は配位結合可能な基を導入するために、遊離のカルボキシル基を有して 、るこ とが好ましい。このような遊離のカルボキシル基は、メタクリル酸やアクリル酸のような カルボキシル基含有ビニルモノマーをさらに共重合させる力、又は、光反応性基含 有基を側鎖に結合させる際に、反応させる光反応性基含有基のモル数を、遊離の力 ルポキシル基のモル数よりも少なくして、光反応性基含有基を側鎖に導入した後にも 遊離のカルボキシル基が残留するようにすることにより、水溶性ポリマー中に含めるこ とができる。なお、遊離のカルボキシル基のモル数は、水溶性ポリマー分子を構成す る全ての単位の合計のモル数を基準として、 5%〜50%程度が好まし 、。
[0084] また、本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては、上記した、ホスホリルコリン部分 を含有する両極性ポリマーの他に、ノ-オン性水溶性ポリマーも好ましく用いることが できる。ノ-オン性水溶性ポリマーは、上記したホスホリルコリン含有ポリマーと同等の 非特異吸着防止効果を有し、それでいてホスホリルコリン含有ポリマーよりも安価に 製造又は入手可能であると 、う利点を有する。
[0085] ノ-オン性水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、 350〜500万 程度であり、好ましくは、 500〜数 10万程度である。
[0086] このようなノ-オン性水溶性ポリマーの好ましい例として、ポリエチレングリコール
(PEG)やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール；ビュルアルコール 、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルォキサゾリドン、ビニルメチルォキ サゾリドン、 2-ビュルピリジン、 4-ビュルピリジン、 N-ビュルサクシンイミド、 N-ビュルホ ルムアミド、 N-ビュル- N-メチルホルムアミド、 N-ビュルァセトアミド、 N-ビュル- N-メチ ルァセトアミド、 2-ヒドロキシェチルメタタリレート、ポリエチレングリコールメタタリレート 、ポリエチレングリコールアタリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、 Ν,Ν-ジメチルァ クリルアミド、 Ν- iso-プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアタリ ルアミド、アタリロイルモルホリン、アタリロイルピロリジン、アタリロイルビペリジン、スチ レン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビュル、メチルメタタリレート、 ブチルアタリレート、メチルシアノアクリレート、ェチルシアノアクリレート、 n-プロビルシ ァノアクリレート、 iso-プロピルシアノアクリレート、 n-ブチルシアノアクリレート、 iso-ブ チルシアノアクリレート、 tert-ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタタリレート、ェチ ルビ-ルエーテル、 n-プロピルビュルエーテル、 iso-プロピルビュルエーテル、 n-ブ チルビ-ルエーテル、 iso-ブチルビ-ルエーテル、 tert-ブチルビ-ルエーテルなど のモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノ-オン性のビニル系ポリマー；ゼ ラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グァーガ ム、プルラン、ぺクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体 、カラギーナン、澱粉類 (カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン）、デキストリ ン、サイクロデキストリン等の天然ポリマー、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシ ェチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレメチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロース 、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然ポリマーを 挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特に好ましいも のはポリエチレングリコール系ポリマー、ポリ（メタ）アクリルアミド及びポリ（グリシジル ( メタ）アタリレート）であり、これらの中で特に好ましくは、ポリエチレングリコール系ポリ マーであり、更にはポリエチレングリコール (メタ)アタリレートである。
[0087] 上記したノ-オン性水溶性ポリマーは、光反応性基を有する。ノニオン性水溶性ポ リマー 1分子当りの光反応性基の数は、 1個以上であれば、特に限定されるものでは ないが、 2個以上が好ましぐ一方、あまりに多すぎると、非特異吸着が増大する恐れ があるので、ポリマーを構成する炭素数 (側鎖の炭素を含まな 、）の 10%以下が好ま しぐさらに好ましくは 5%以下である。光反応性基の好ましい例としてアジド基 (-N )
3 を挙げることができるがこれに限定されるものではな、。光反応性基の具体例として フエニルアジド基、ァセチル基、ベンゾィル基が挙げられる力 特に好ましくはフエ- ルアジド基である。アジド基等の光反応性基は、ノ-オン性水溶性ポリマーに直接結 合していてもよいが、任意のスぺーサー構造を介してノ-オン性水溶性ポリマーに結 合されていてもよぐ通常、後者の方が製造が容易であり好ましい。後者の場合、ス ぺーサ一構造は、何ら限定されるものではなぐ例えば炭素数 1〜10のアルキレン基 (ただし 1個又は 2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フエ-レン基 (ただし 、 1〜3個の炭素数 1〜4のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい） 等を挙げることができる。
[0088] ノ-オン性水溶性ポリマーへの光反応性基の導入は、常法に基づき容易に行うこと ができる。例えば、官能基を有するノニオン性水溶性ポリマーと、該官能基と反応す る官能基を有するアジド化合物を反応させて、ノ-オン性水溶性ポリマーにアジド基 を結合させることができる。好ま ゾ-オン性水溶性ポリマーであるポリエチレンダリ コールを用いる場合、両末端にアミノ基ゃカルボキシル基を有するポリエチレングリコ ールが巿販されているので、このような巿販の官能基含有ポリエチレングリコールの 官能基に、アジド基含有ィ匕合物を反応させてポリエチレングリコールにアジド基を結 合させることができる。あるいは、ノニオン性水溶性ポリマーが水溶性ビニル系ポリマ 一のように、モノマーの重合により形成されるものである場合には、水溶性ビニル系ポ リマーの主な構成単位となるビニル系モノマーと、光反応性ビニル系モノマーとを共 重合させることにより光反応性基を有するノ-オン性水溶性ポリマーを製造することも できる。この方法により得られる光反応性水溶性ビニル系ポリマーの好まし 、例として 、ポリ（ (メタ)アクリルアミドー光反応性 (メタ)アクリル酸アミド）共重合体及びポリ（ダリ シジル (メタ）アタリレート一光反応性 (メタ)アクリル酸アミド)共重合体、（ポリエチレン グリコールモノ (メタ)アタリレート一光反応性アクリル酸アミド)共重合体等を挙げるこ とができ、特に (ポリエチレングリコールモノ (メタ)アタリレート—光反応性アクリル酸ァ ミド)共重合体が好ましい。
[0089] なお、上記したノ-オン性水溶性ポリマーは、後述の通り、金属と共有結合又は配 位結合可能な基を導入するために、遊離のカルボキシル基を有して 、ることが好まし い。このような遊離のカルボキシル基は、例えば、メタクリル酸やアクリル酸のような力 ルポキシル基含有ビニルモノマーをさらに共重合させることにより容易に付与すること ができる。なお、遊離のカルボキシル基のモル数は、水溶性ポリマーを構成する全て の単位の合計のモル数を基準として、 5%〜50%程度が好まし 、。
[0090] 上記の通り、本発明に用いられる水溶性ポリマーは、金属と共有結合又は配位結 合可能な基を有する。ここで、金属としては、 QCMや SPRに用いられている金が重要 である。金と共有結合可能な基としては、チオール基を挙げることができる。なお、チ オール基が金と共有結合すること自体は公知であり、例えば、 Japan Nanonet Bulletin第 58号（2004年 3月 16曰）【こ記載されて! /、る。
[0091] 上記した水溶性ポリマーにチオール基を導入する方法としては、例えば、ァミノ基と チオール基の両方を 1分子中に有する 2-メルカプトェチルァミン等の化合物のチォ 一ル基を保護し、そのアミノ基と、水溶性ポリマー中の上記した遊離のカルボキシル 基とをカルポジイミド等の架橋剤で結合し、次いで、チオール基を脱保護する方法を 挙げることができる。チオール基の保護は、例えば、 1分子中にアミノ基とチオール基 を有する 2-メルカプトェチルァミンのような化合物をジスルフイドダイマーに変換する こと〖こより行なうことができる。一方、脱保護は、ジスルフイドダイマーを、例えばジチ オスレィトールのようなジスルフイド結合を切断する還元剤を作用させてジスルフイド 結合を切断して遊離のチオール基を生じさせることにより行うことができる。このような 方法によりチオール基を導入する方法が、下記実施例に具体的に記載されている。 なお、チオール基の導入方法は、上記の方法に限定されるものではない。チオール 基のモル数は、水溶性ポリマー 1分子中に 0. 1〜： LOOモル、特に 1〜50モル程度が 好ましい。
[0092] 水溶性ポリマー中のチオール基は、水溶性ポリマーの溶液を金に常温で接触させ るだけで金と結合する。
[0093] 一方、金と配位結合可能な基としては、カルボキシル基及びアミノ基を挙げることが できる。カルボキシル基は、上記した、水溶性ポリマー中に含まれる遊離のカルボキ シル基をそのまま利用することができる。また、アミノ基は、該遊離のカルボキシル基 に、カルポジイミドのような架橋剤を用いてジァミンィ匕合物を結合させることにより容易 に導入することができる。
[0094] なお、上記方法では、光反応基を有する水溶性ポリマーに、金属と共有結合又は 配位結合可能な基を導入する態様を記載したが、金属と共有結合又は配位結合可 能な基を先にポリマーに結合し、後から光反応性基を導入してもよい。これは、上記 した遊離のカルボキシル基を利用して先にチオール基等を導入し、次に、余っている 遊離のカルボキシル基を利用して上記のように光反応性基を導入することにより行う ことができる。また、光反応性基と、金属と共有結合又は配位結合可能な基を同時に ポリマーに導入することも可能である。
[0095] 上記の通り、本発明は、両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマーであって、 1分子 中に少なくとも 2個の光反応性基を有する水溶性ポリマーと、金属と共有結合又は配 位結合可能な基を有する低分子化合物とを含む、金属に物質を固定化するための 物質固定化剤をも提供する。ここで、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有す る水溶性ポリマーは、上記した通りである（ただし、光反応性基は 1分子中に少なくと も 2個導入する必要があり、また、金属と共有結合又は配位結合可能な基を導入する 必要がないので、上記した、遊離のカルボキシル基は含まない)。一方、金属と共有 結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物は、好ましくは上記したチオール 基又はカルボキシル基若しくはアミノ基を有する低分子化合物であり、これらの基を 有するものであれば特に限定されない。好ましい例として、ォクタデカンチオールのよ うなアルキルチオール、メルカプトエタノールのようなメルカプトアルキルアルコール、 アルキルアミン及びアルキルカルボン酸等を挙げることができる（これらの化合物中の アルキル基の炭素数は好ましくは 2〜20)。また、「低分子化合物」とは、分子量が 10 00以下の化合物を意味し、好ましくは、分子量は、 50〜500程度である。
[0096] 上記水溶性ポリマーと、上記低分子化合物との混合比率は、特に限定されないが、 好ましくは、水溶性ポリマー 100に対して低分子化合物がモル比で 1〜50、さらに好 ましくは 5〜50程度である。
[0097] 上記の通り、本発明はまた、両極性又はノニオン性の水溶性ポリマーと、 1分子中 に少なくとも 2個の光反応性基を有する光架橋剤と、金属と共有結合又は配位結合 可能な基を有する低分子化合物とを含む、金属に物質を固定化するための物質固 定化剤をも提供する。ここで、「両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマー」は、上記し た水溶性ポリマーと同様である（ただし、光反応性基は 1分子中に少なくとも 2個導入 する必要があり、また、金属と共有結合又は配位結合可能な基を導入する必要がな いので、上記した、遊離のカルボキシル基は含まない。また、光反応性基が不要であ るので、上記水溶性ポリマー力も- N基を除去したもの又は単位 [II]を含まないもので
3
よい)。また、「金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物」は、 上記の通りである。
[0098] 光架橋剤が有する光反応性基の好ま ヽ例として、アジド基 (-N )を挙げることがで
3
きるがこれに限定されるものではない。光架橋剤としては、アジド基を 2個有するジァ ジドィ匕合物が好ましぐ特に水溶性ジアジドィ匕合物が好ましい。本発明に用いられる 光架橋剤の好ましい例として、下記一般式 [III] (上記一般式 [III]と同じ)で表される、 本発明の第 1の局面の物質固定化剤において光架橋剤として好ましく用いられるジ アジドィ匕合物を挙げることができる。 [0099] [化 16]
Figure imgf000028_0001
[0100] 一般式 [III]中、 Rは単結合又は任意の基を示す。 -R-は、 2個のフ ニルアジド基を 連結するだけの構造であるから、特に限定されない。好ましい- R-の例として、単結合 (すなわち、 2個のフエ-ルアジド基が直接連結される）、炭素数 1〜6のアルキレン基 ( 1個又は 2個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよぐ 1個又は 2個の炭素原子が 酸素と二重結合してカルボ二ル基を構成して 、てもよ 、）（特に好ましくはメチレン基） 、 - 0-、 -SO -、 -S-S -、 -S -、 - R2JJ_LY R3- (ただし、ニニは単結合又は二重結合を
2
示し、 Yは炭素数 3〜8のシクロアルキレン基、 R2及び R3は互いに独立に炭素数 1〜6 のアルキレン基（1個又は 2個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよぐ該アルキレン 基の基端の炭素原子と Yとの結合が二重結合であってもよく）、 1個又は 2個の炭素 原子が酸素と二重結合してカルボ-ル基を構成して 、てもよ 、）を示し、シクロアルキ レン基は、 1個又は 2個以上の任意の置換基で置換されていてもよく（置換されている 場合、好ましくはシクロアルキレン基を構成する炭素原子のうち、 1個若しくは 2個が 酸素と二重結合してカルボ二ル基を構成し、及び Z若しくは 1個若しくは 2個の炭素 数 1〜6のアルキル基で置換されている）を挙げることができ、また、一般式 [III]中の それぞれのベンゼン環は、 1個又は 2個以上の任意の置換基 (好ましくはハロゲン、 炭素数 1〜4のアルコキシル基、スルホン酸若しくはその塩等の親水性基)で置換さ れていてもよい。好ましい- R-の具体例として次のものを例示することができる。一、 -CH―、— 0—、 -SO―、— S— S―、— S―、— CH=CH―、— CH=CH— CO—、
2 2
一 CH=CH— CO— CH=CH―、一 CH=CH -、
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
[0102] 好ましいジアジドィ匕合物の具体例としては、本発明の第 1の局面の物質固定化剤 にお 、て光架橋剤として好ましく用いられる、上記したジアジドィ匕合物の好まし 、具 体例を例示することができる。
[0103] 本発明に用いられる光架橋剤の内、特に好ましいのは水溶性のものである。光架 橋剤についての「水溶性」とは、 0.5mM以上、好ましくは 2mM以上の濃度の水溶液を 与免ることができることを意味する。
[0104] 上記水溶性ポリマー、低分子化合物及び架橋剤の混合比率は、特に限定されな ヽ 力 好ましくは、水溶性ポリマー 100に対して低分子化合物がモル比で 1〜50、さら に好ましくは 5〜50程度であり、架橋剤がモル比で 1〜50、さらに好ましくは 1〜30 程度である。
[0105] 上記本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定ィ匕する基体としては、表面が金属 であり、 QCM測定や SPR測定にぉ 、て用いられて 、る表面が金製の基板を好まし!/ヽ 例として挙げることができる。
[0106] 本発明の物質固定化剤を用いて、基体上に所望の物質を固定ィ匕することは、次の ようにして行うことができる。先ず、基体に固定ィ匕すべき物質と、本発明の物質固定 ィ匕剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布する。この場合、水溶液中の 水溶性ポリマーの濃度 (重量基準）は、特に限定されないが、通常、 0.005%〜10%程 度であり、好ましくは 0.04〜1%程度である。また、固定化すべき物質の濃度 (重量基 準）は、通常、用いる水溶性ポリマーの 10倍ないし 200倍程度であり、好ましくは 20 倍ないし 100倍程度である。塗布後、室温で 15分間〜 1時間程度放置すると、金属 と共有結合又は配位結合可能な基が基体と結合し、それによつて水溶性ポリマー（ 該ポリマーが金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する場合)又は上記低分 子化合物が基体に結合される。なお、物質固定化剤が上記低分子化合物を含む場 合、該低分子化合物を先ず基体に作用させて基体に結合させ、次いで固定化すべ き物質と水溶性ポリマーとを含む水溶液若しくは水懸濁液、又は固定ィ匕すべき物質 と水溶性ポリマーと架橋剤とを含む水溶液若しくは水懸濁液を前記基体に塗布して ちょい。
[0107] 次に、塗布した液を好ましくは乾燥した後、光を照射する。光は、用いる光反応性 基がラジカルを生じさせることができる光であり、光反応性基としてアジド基を用いる 場合には、紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、 lcm2当たり lmW〜100mW程度である。
[0108] 光を照射することにより、光反応性基力 Sラジカルを生じる。水溶性ポリマーが、金属 と共有結合又は配位結合可能な基及び光反応性基の両者を有する場合には、基体 に結合された水溶性ポリマーの光反応性基に、固定ィ匕すべき物質が共有結合され、 これにより固定ィ匕すべき物質が、水溶性ポリマーを介して基体に結合される。また、 水溶性ポリマーが 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有し、金属と共有結合又 は配位結合可能な基を有する低分子化合物が併用される場合には、基体に結合し た低分子化合物に水溶性ポリマーが共有結合し、かつ、固定すべき物質が水溶性 ポリマーに共有結合される。また、水溶性ポリマーが光反応性基を含まず、金属と共 有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化合物及び光架橋剤が併用される 場合には、基体に結合した低分子化合物に光架橋剤を介して水溶性ポリマーが共 有結合し、かつ、固定すべき物質が水溶性ポリマーに共有結合される。従って、いず れの場合も固定ィ匕すべき物質が基体に固定化される。
[0109] なお、光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が 離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基ゃカルボキシル 基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能 であるので、ほとんどの有機物を固定ィ匕することが可能である。なお、本発明の方法 では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、固定化すべ き物質の特定の部位と結合するのではなぐランダムな部位と結合する。従って、活 性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も当然出てくると考えられるが、活性 部位に影響を与えない部位で結合する分子も当然存在するので、本発明の方法に よれば、従来、適当な置換基が活性部位又はその近傍にあるために、共有結合で固 定ィ匕することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させることなぐ 共有結合により基体に固定ィ匕することができる。
[0110] 光が照射されな力つた部分では、光反応性基が固定ィ匕すべき物質に結合しないの で、洗浄すれば固定ィ匕すべき物質は除去される。従って、フォトマスク等を介して選 択露光を行うことにより、任意のパターンで物質を固定ィ匕することができる。従って、 選択露光により、マイクロアレイ等の任意の種々の形状に物質を固定ィ匕することがで きるので、非常に有利である。
[0111] あるいは、本発明の物質固定化剤と、固定化すべき物質の混合物を基体上にマイ クロスポッティングし、基体の全面を光照射してもよい。マイクロスポッティングは、液を 基体上に非常に狭い領域に塗布する手法であり、 DNAチップ等の作製に常用されて おり、そのための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことが できる。あるいは、先ず、基体上に本発明の物質固定化剤を全面にコーティングし、 その上に固定ィ匕すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射 してもよい。この場合、固定ィ匕すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層の上に形 成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くな る。さらに、基体上に本発明の物質固定化剤をマイクロスポッティングし、その上に固 定ィ匕すべき物質をマイクロスポッティングし、次 、で基体の全面に光照射してもょ 、。 この場合にも固定ィ匕すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層（それぞれ分離した スポット）の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に固定化される物質の割合が 高くなる。
[0112] 本発明の方法は、抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原を固定ィ匕した免疫 測定用プレートの作製、 DNAや RNAを QCMや SPRの基板上に固定化した核酸チッ プ、マイクロアレイ等の作製に好適に用いることができるがこれらに限定されるもので はなぐ例えば、細胞全体やその構成要素の固定ィ匕等にも適用することができる。
[0113] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0114] 1. 水溶性ポリマーの調製
(1) メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン (MPC) (—般式 [Γ]中、 R1が- C H -で
2 4
X'が- CH - C(CH XCOO-)-)-メタクリル酸共重合体及び MPC-ブチルメタタリレート共
2 3
重合体の製造
MPCは市販品を用いた。 MPCとメタクリル酸又はブチルメタタリレートとを通常の方 法によりランダム共重合した。以上により MPC-メタクリル酸共重合体 (MPC:メタクリル 酸（モル比） = 9:1)及び MPC-ブチルメタタリレート共重合体 (MPC:ブチルメタクリレー ト (モル比） = 3:7)を得た。
[0115] (2) 水溶性ポリマー水溶液の調製
上記の通り製造した MPC-メタクリル酸共重合体若しくは MPC-ブチルメタタリレート 共重合体又は市販のポリエチレングリコール (平均分子量 1000)を水溶性ポリマーと して用いた。各水溶性ポリマーを水に溶解し、 0.5重量％の濃度に調整した。
[0116] 2. A抗原陽性パネル血球の固定ィ匕
4,4'-ジアジドスチルベン- 2,2'-ジスルホン酸ナトリウム（市販品）を光架橋剤として用 いた。光架橋剤の濃度が 0.25mMになるように、 1(2)で調製した水溶性ポリマーと光架 橋剤を混合した。得られた混合物（lmL)と A抗原陽性パネル血球（lmL)を混合した。 得られた血球浮遊液をポリスチレンディッシュに 0.5 Lずつスポットした。乾燥後、 U V照射（波長 260nm、照射量 40mW/cm2、 10秒間)によりパネル血球を固定ィ匕した (水 溶性ポリマーも固定ィ匕される）。
[0117] 3. A抗原の免疫測定
PBS(0.1% Tween20 (登録商標） )で洗浄後、モノクローナル A抗体（市販品）と室温 で 2時間反応させた。 PBS(0.1% Tween20 (登録商標））で洗浄後、セィヨウヮサビペル ォキシダーゼ (HRP)標識二次抗体 (市販品）と室温で 1時間反応させた。 PBS(0.1% TWeen20 (登録商標)）で洗浄後、化学発光試薬を添加し、発光強度を測定した。
[0118] 4. 結果
測定した発光強度を下記表 1に示す。
[0119] [表 1]
Figure imgf000033_0001
[0120] 表 1に示すように、いずれの水溶性ポリマーを用いた場合にも、有意な発光強度が 得られ、免疫測定が可能であることがわかる。また、水溶性ポリマーとして、 MPC-ブ チルメタタリレートを用いた場合の方力 SMPC-メタクリル酸を用いた場合よりも発光強 度が大きくなつているのは、 MPC-ブチルメタタリレートが親水性基と疎水性基 (ブチ ル基)を有し、光架橋剤とミセルを作りにくぐより効率的な反応が可能であったためと 考えられる。
実施例 2
[0121] スギアレルゲンの免疫測定
水溶性ポリマーとして、平均分子量 1000のポリエチレングリコール (PEG1000) (巿 販品）、平均分子量 10000のポリエチレングリコール (PEG10000) (市販品）又は実施 例 1で製造した MPC-ブチルメタタリレート共重合体を用いた。各水溶性ポリマーを、 0.125重量％の濃度になるように水に溶解した。得られた各水溶性ポリマー水溶液を 、光架橋剤 (4,4'-ジアジドスチルベン- 2,2しジスルホン酸ナトリウム）と混合した (光架 橋剤の終濃度は 0.125mM)。得られた各水溶性ポリマー水溶液を、スギアレルゲン（ 市販品）水溶液 (0.25重量0 /0)と 1： 1で混合した。得られた混合液をポリスチレンデイツ シュに 0.5 Lずつスポットした。乾燥後、 UV照射（波長 260nm、照射量 40mW/cm2、 10秒間)によりスギアレルゲンを固定ィ匕した (水溶性ポリマーも固定ィ匕される）。
PBS(0.1% Tween20 (登録商標） )で洗浄後、スギアレルゲン抗体（市販品）と室温で 3 時間反応させた。 PBS(0.1% Tween20 (登録商標））で洗浄後、 HRP標識二次抗体 (巿 販品）と室温で 1時間反応させた。 PBS(0.1% Tween20 (登録商標)）で洗浄後、化学 発光試薬を添加し、発光強度を測定した。また、比較のため、スギアレルゲン抗体に 代えてダニアレルゲン抗体 (市販品）を用いて上記と同じ操作を行なった。
[0122] さらに、比較のため、本願発明者らが、先に発明し、国際特許出願
(PCT/JP2004/004510)して!/、る、光反応性ポリエチレングリコール又は光反応性 MPC ポリマーを物質固定化剤として用い、上記と同様の操作を行なった。光反応性ポリエ チレングリコールは、 lOOmgのポリ（エチレングリコール）ビス（3-ァミノプロピル)末端（ Aldrich社より巿販、平均分子量 1500)と 68.6mgの N- (4-アジドベンジロキシ)スクシンィ ミドをジメチルホルムアミド 10mlに溶解し、 pH6で 4°Cで 24時間攪拌して反応させて得 られたものである。また、光反応性 MPCポリマーは、 2mLの PMAc水溶液 (5wt%=50m g/mL)(PMAcは 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン (90%)とメタクリル酸 (10%)のランダム共重合体)に 12.44mgの 4 アジドア-リンと、 17.47mgの水溶性カル ボジイミド (WSC)を混合し，最終的に純水で lOOmLにメスアップし、 pH7で 24時間撹拌 (冷蔵庫中 4°C)して反応させて得られたものである。
[0123] 結果を下記表 2に示す。表 2に示されるように、ダニアレルゲン抗体を一次抗体とし て用いた場合の発光強度が 0であり、スギアレルゲン抗体を一次抗体として用いた場 合にはいずれの水溶性ポリマーを用いた場合も大きな発光強度が測定されたので、 本発明の物質固定化剤により非特異吸着を防止して免疫測定が可能であることが明 らかになつた。なお、先に国際特許出願している光反応性ポリエチレングリコール又 は光反応性 MPCポリマーを物質固定化剤を用いた場合の発光強度は、 PEG1000を 用いた場合と同等であった。
[0124] [表 2]
Figure imgf000034_0001
実施例 3 [0125] 基板として、平均表面粗さ 0.2 μ m若しくは 0.4 μ mのポリスチレン基板又は平均表 面粗さ 2.5 mないし 20 mのアクリル基板を用いることを除き、実施例 1と同じ操作 を行った (用いた水溶性ポリマーはポリエチレングリコール)。
[0126] 結果を図 1に示す。図 1に示されるように基板の平均表面粗さが 15 mの場合に、 他の表面粗さの基板よりも明らかに発光強度が高くなつた。
実施例 4
[0127] ダニアレルゲンの免疫測定
ポリエチレングリコールモノメタタリレート（ポリエチレングリコール部分子量 352) 4.5 gを 50mlの酢酸ェチルに溶解し、 AIBNを開始剤として 14.03mg加え、 60°Cで 6時 間反応させた。反応液はエバポレーターにて溶媒を取り除いた後、水で溶解し、限 外ろ過を行い未反応のモノマーを取り除いた。ゲル濾過クロマトグラフィー（GPC)に てポリマー生成を確認した。
[0128] 水溶性ポリマーとして、上記ポリエチレングリコールメタタリレートのポリマー以外に、 平均分子量 1000のポリエチレングリコール (PEG1000) (市販品）、平均分子量 1000 0のポリエチレングリコール (PEG10000) (市販品）又は実施例 1で製造した MPC-ブチ ルメタタリレート共重合体を用いた。
[0129] 各水溶性ポリマーを、 0.125重量％の濃度になるように水に溶解した。得られた各水 溶性ポリマー水溶液を、光架橋剤（4,4'-ジアジドスチルベン- 2,2'-ジスルホン酸ナトリ ゥム）と混合した (光架橋剤の添加量はポリマーに対して 5重量％)。得られた各水溶 性ポリマー水溶液を、ダニアレルゲン (市販品）水溶液 (0.25重量％)と 1： 1で混合し た。得られた混合液をポリスチレンディッシュに 50nLずつスポットした。乾燥後、 UV 照射（波長 290〜390nm、照度 17mW/cm2、 10秒間)によりダニアレルゲンを固定ィ匕し た (水溶性ポリマーも固定化される)。
[0130] 本実施例では、処理時間の短縮を図るベぐ以下の処理はすべてミキサーを用い て行った。 PBS(0.1% Tween20 (登録商標））で洗浄後、ダニアレルゲン抗体 (市販品） と室温で 20分反応させた。同様に PBS(0.1% Tween20 (登録商標））で洗浄後、 HRP標 識二次抗体 (市販品）と室温で 20分反応させた。 PBS(0.1% Tween20 (登録商標)）で 洗浄後、化学発光試薬を添加し、発光強度を測定した。 [0131] 結果を下記表 3に示す。表 3に示されるように、ポリエチレングリコールモノメタクリレ ートポリマー (PEGMAP)を用いた場合が、もっとも大きな発光強度が測定された。これ はポリエチレングリコールモノメタタリレートポリマー力 蛋白固定に適した疎水性構造 と水溶性を併せ持つているためと考えられる。このため、従来の 1Z4以下の時間で 充分な発光強度を得ることが出来、診断現場での即日検査が可能になった。
[0132] また、上記ダニアレルゲン固定ィ匕チップを 30°Cで 1ヶ月保存した後、同様にダニ アレルゲン抗体と反応させ、そのときの発光強度も表 3の下段に示した。安定性にお いてもポリエチレングリコールモノメタタリレートポリマーが優れていることが明らかにな つた o
[0133] [表 3]
一次抗体 水溶性ボリマ · 発光強度 （相対値) ダニアレルゲン抗体 PEG 1000 2 1500
ダニアレルゲン抗体 PEG 10000 2 0000
ダニアレルゲン抗体 MPC -ブチルメタクリ レー ト 23000
ダニアレルゲン抗体 PEGMAP 40000
( 1ヶ月保存後）
ダニアレルゲン抗体 PEG 1000 1 9000
ダニアレルゲン抗体 PEG 10000 1 6000
ダニアレルゲン抗体 MPC -ブチルメタクリ レー ト 2 1000
ダニアレルゲン抗体 PEGMAP 40000 実施例 5
[0134] 1. MPCポリマーの合成
下記の合成スキームに従い、常法によりメタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン (MPC)ポリマーを合成した。なお、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンとメ タクリル酸の配合比率をモル比（下記式中の nと mの比）で 9:1 (以下、「MPC9:1」）、 7:3 (以下、「MPC7:3」）、 5:5 (以下、「MPC5:5」）とした 3種類のポリマーを合成した。な お、合成したポリマーは、ランダム共重合体である。合成された MPCポリマーの平均 分子量は、 MPC9:1が 215000、 MPC7:3が 550000、 MPC5:5が 1104000であった。 [0135] [化 18]
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
[0136] 2. MPCポリマーへのチオール基およびアジド基の導入
(1) 2-メルカプトェチルァミンダイマーの調製
2-メルカプトェチルァミン水溶液 NaOHにより pH8.5に調o整 ccclll ）を攪拌しながらインキュ
H H一一
ベーシヨン（20°C、 48時間）により 2-メルカプトェチルァミンダイマ Ί.ーを生成した。なお 、生成物は、 5-5'ジチォビス 2-ニトロベンゼンのエルマン反応の産生した 3-カルボキ cccll
シレート 4 -トロチオフイノィレート（TNB)の 412nmの吸光度から評価した。
[0137] (2) MPCポリマーへのチォーノレ基の導入
各 MPCポリマーに、 2-メルカプトェチルァミンダイマー（メタクリル酸モル濃度の 2倍 濃度)及び水溶性カルポジイミド (メタクリル酸モル濃度の 2倍濃度）の水溶液を添カロ し、 4°C、 pH7.0で 24時間インキュベートした。次いでジチオトレイトール（DTT) (メタク リル酸モル濃度の 2倍濃度）を添加し、ジスルフイドダイマーを還元した (pH10、 12時 間）。透析によりポリマー以外の未反応物を除去した。導入されたチオールの量を、 エルマン反応により定量した。 MPCポリマー 1分子中に導入されたチオール基は、 MPC9:1が 0.14mol、 MPC7:3が 7.5mol、 MPC5:5が 10.3molであった。
[0138] (3) MPCポリマーへのアジド基の導入
チオール基を導入した MPCポリマーを、アジドア-リン (メタクリル酸モル濃度の 2倍 濃度）と水溶液中で 4°Cで 24時間、 pH7.0で反応させ、透析により未反応物を除去し た。得られた生成物を凍結乾燥し、アジド基を吸光度測定より定量した。 MPCポリマ 一 1分子中に導入されたアジド基は、 MPC9:1が l.lmol、 MPC7:3が 29.4mol、 MPC5:5 が 99.5molであった。
実施例 6
[0139] 金製基板との結合
実施例 5で調製した、チオール基及びアジド基含有 MPC9:1、 MPC7:3、 MPC5:5を 以下の方法により、水晶発振子マイクロバランス測定装置の金製のセンサチップ電極 部分に固定ィ匕した。先ず、センサチップの電極部分にピランハ溶液 (過酸ィ匕水素水： 濃硫酸 1 : 3)をのせ、 5分間静置し、水で洗浄後、エアーを吹付け、水を取り除いた。 この操作を繰り返した。センサチップを水晶発振子マイクロバランス測定装置に図 2 のようにセットし、水に浸してベースラインが安定するのを待った。なお、図 2中、参照 番号 1がセンサチップ、 2が純水である。安定後、サンプル（チオール基及びアジド基 含有 MPC9:1、 MPC7:3又は MPC5:5の水溶液）を添加し、センサー部への結合量を 周波数変化として測定した。対照として、チオール基を導入していない MPC7:3の水 溶液も同様にして基板に滴下し、測定した。
[0140] 結果を図 3及び表 4に示す。サンプル添加後、コントロールのチオール基の導入し て ヽな ヽ MPCポリマーではほとんど変化が見られな 、のに対して、チオール基を導 入した MPCポリマーではどの条件でも周波数に変化が生じた。周波数変化は表 4に 示すように、平均分子量の大きい順、 1分子中に含まれるチオール基の量の順に変 化量が大きぐ予想したデータと同じ結果となった。これにより金表面とチオール基と の共有結合を確認することができた。
[0141] [表 4]
サンプルの 波数変化
Figure imgf000038_0001
実施例 7
QCMによるダニアレルゲンの免疫測定
市販のダニアレルゲンを透析により脱塩し、凍結乾燥により 25倍に濃縮した。一方、 実施例 1で調製した MPC7:3と市販のダニアレルゲン抗体を重量比 0.5： 1で緩衝液中 で混合し、得られた水溶液 (MPC7:3ポリマー濃度 0. 125重量 %)をセンサチップ上に 1 μ Lスポットした。乾燥後、紫外線照射（10秒間、線量 40mWZcm2)により固定ィ匕し た。 PBS (l%BSA) 2mlにセンサチップをセットした。ベースライン安定後、先に濃縮し たダニアレルゲン（100 g/ml) 10 Lを滴下した。周波数変化を QCMにより経時的に 測定した。一方、対照として、ダニアレルゲン抗体を含まないものも同様にセンサチッ プに固定ィ匕し、測定した。
[0143] 結果を図 4に示す。ダニアレルゲン滴下後、 MPCポリマーのみではほぼ周波数に 変化が無いのに対して、ダニアレルゲン抗体を固定ィ匕したセンサチップでは、周波数 が約 500Hz変化した。この周波数変化は抗原抗体反応によるセンサ表面の重量変化 に由来するものであり、 MPCポリマーで固定化したダニアレルゲン抗体がアレルゲン を認識できることを実証することができた。これにより、本発明の物質固定化剤を用い た QCMによりアレルゲンを検知することが可能であることが明らかになった。
実施例 8
[0144] 1. 水溶性ポリマーの調製
ポリエチレングリコールモノメタタリレート（ポリエチレングリコール部分子量 350) 4.5 gを 50mlの酢酸ェチルに溶解し、 AIBNを開始剤として 14.03mg加え、 60°Cで 6時 間反応させた。反応液はエバポレーターにて溶媒を取り除いた後、水で溶解し、限 外ろ過を行い未反応のモノマーを取り除いた。ゲル濾過クロマトグラフィー（GPC)に てポリマー生成を確認した。
[0145] 2. 水溶性ポリマー水溶液の調製及び固定ィ匕
4,4'-ジアジドスチルベン- 2,2'-ジスルホン酸ナトリウム（市販品）を光架橋剤として用 いた。光架橋剤の濃度が 0.003125%、上記水溶性ポリマーの濃度が 0.0625%、 BSA (Aldrich社製)濃度が 0.125%となるように混合した。得られた水溶液を、ビアコア社製 SPR用金基板をメルカプトエタノールで 20分間処理した後、その上に 7 X 7mm2の 面積に 20 μ L塗布し、乾燥した (膜厚約 0.2 μ m)。次 、で、 UV照射 (ブラックライトで 7 分間)により BSAを固定ィ匕した。
[0146] 3. 測定 PBS(0.1% Tween20 (登録商標））で洗浄後、抗 BSAゥサギ IgG (市販品）（20 gZ mL)を使用して、 SPR測定を実施した。
[0147] 4. 結果
測定の結果、 SPR感度 (RU)は 300であった。
実施例 9
[0148] 1. 水溶性ポリマーの調整
実施例 8と同様に処理した。
[0149] 2. 水溶性ポリマー水溶液の調製及び固定ィ匕
ィ-シアム社製 QCM用センサーチップの電極部分に ImMメルカプトエタノールを 5 μ L滴下し、 20分静置した後、超純水で洗浄し、乾燥させた。 4,4'-ジアジドスチル ベン- 2,2'-ジスルホン酸ナトリウム (市販品）を光架橋剤として用いて、光架橋剤の濃 度が 0.003125%、上記水溶性ポリマーの濃度が 0.0625%、 BSA(Aldrich社製)濃度 力 .125%となるように混合した溶液を、チップに 0.5 L滴下し、乾燥させた。次いで 、 UV照射 (ブラックライトで 7分間)により BSAを固定ィ匕した。
[0150] 3.測定
PBS(0.1% Tween20 (登録商標））で洗浄後、抗 BSA抗体 (30 g/ml)を結合させ、 QCMにより周波数の変化を測定した。
[0151] 4.結果
測定の結果、 QCM周波数変化 (Hz)は 1000であった。

Claims

請求の範囲
[1] 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気 的に中性な水溶性ポリマーとを含む、基体上に所望の物質を固定化するための物質 固定化剤。
[2] 前記光反応性基がアジド基である請求項 1記載の物質固定化剤。
[3] 前記光架橋剤が水溶性のジアジド化合物である請求項 2記載の物質固定化剤。
[4] 前記水溶性ポリマーが、ノ-オン性ポリマーである請求項 1な 、し 3の 、ずれか 1項 に記載の物質固定化剤。
[5] 前記ノ-オン性ポリマーが、ポリアルキレングリコールである請求項 4記載の物質固 定化剤物質固定化剤。
[6] 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項 5記載の物質 固定化剤。
[7] 前記ノ-オン性ポリマーが、ポリエチレングリコールモノ (メタ）アタリレートのビュル 重合体である請求項 4記載の物質固定化剤。
[8] 前記水溶性ポリマーが、下記一般式 [I]で表される構造を有する単位を含む、請求 項 1な 、し 3の 、ずれか 1項に記載の物質固定化剤。
[化 1]
Figure imgf000041_0001
(ただし、一般式 [I]中、 Xは、重合した状態の重合性原子団を表わす)。
[9] Xがビュル系モノマー由来である請求項 8記載の物質固定化剤。
[10] 前記水溶性ポリマーが、下記一般式 [Γ]で表される構造を有する単位を含む、請求 項 8記載の物質固定化剤。
[化 2]
Figure imgf000042_0001
(ただし、 X'は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルォキシ基、メタクリル アミド基、アクリルォキシ基、アクリルアミド基、スチリルォキシ基又はスチリルアミド基 を表し、 R1は単結合又は炭素数 1〜： LOのアルキレン基 (ただし 1個又は 2個のヒドロキ シル基で置換されて 、てもよ 、）を表す）
[11] X，を含む単位力 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン、 2—アタリロイル ォキシェチルホスホリルコリン、 Ν— (2—メタクリルアミド）ェチルホスホリルコリン、 4 メタクリロイルォキシブチルホスホリルコリン、 6—メタクリロイルォキシへキシルホスホリ ルコリン、 10-メタクリロイルォキシデシルホスホリルコリン、 ω—メタクリロイルジォキシ エチレンホスホリルコリン又は 4ースチリルォキシブチルホスホリルコリンに由来する請 求項 10記載の物質固定化剤。
[12] 前記一般式 [I]で示される単位力 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンに 由来する請求項 8記載の物質固定化剤。
[13] 基体に固定ィ匕する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要 素から成る群力も選ばれる請求項 1ないし 12のいずれか 1項に記載の物質固定化剤
[14] 基体に固定ィ匕すべき物質と、請求項 1ないし 13のいずれか 1項に記載の物質固定 ィ匕剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基 体上への物質の固定化方法。
[15] 基体に固定ィ匕する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要 素から成る群力も選ばれる請求項 14記載の方法。
[16] 前記光を選択照射することにより、物質を固定ィ匕する領域をパターニングすることを 含む請求項 14又は 15記載の方法。
[17] 請求項 14ないし 16のいずれか 1項に記載の方法により前記物質が固定ィ匕された 基体。
[18] 前記基体が榭脂製である請求項 17記載の基体。
[19] 前記基体の平均表面粗さが 14 mないし 17 mである請求項 18記載の基体。
[20] 請求項 1ないし 13に記載の組成物の、物質固定化剤としての使用。
[21] 両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマーであって、 1個以上の光反応性基を有し、 かつ、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有するポリマー力も成る、金属に物 質を固定ィ匕するための物質固定化剤。
[22] 金属と共有結合可能な基がチオール基である請求項 21記載の物質固定化剤。
[23] 前記金属が金である請求項 21又は 22記載の物質固定化剤。
[24] 前記水溶性ポリマーが、下記一般式 [I]で表される構造を有する単位と、下記一般 式 [Π]で示される構造を有する単位を含む水溶性ポリマーに、前記光反応性基及び 金属と共有結合又は配位結合可能な基が導入されたものである請求項 21ないし 23 の!、ずれか 1項に記載の物質固定化剤。
[化 3]
Figure imgf000043_0001
[化 4]
—— Y [ Π ]
R1
(ただし、一般式 [I]及び [II]中、 X及び Yは、互いに独立して、重合した状態の重合性 原子団を表し、 R1は光反応性基を有する原子団を表し、一般式 D]で表される単位は 2個以上、一般式 [II]で表される単位は 1個以上であり、かつ、一般式 [I]で表される 単位の数は、一般式 [II]で表される単位の数よりも大き 、)。
[25] 前記光反応性基がアジド基である請求項 21な 、し 24の 、ずれか 1項に記載の物 質固定化剤。
[26] 両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマーであって、 1分子中に少なくとも 2個の光反 応性基を有する水溶性ポリマーと、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する 低分子化合物とを含む、金属に物質を固定化するための物質固定化剤。
[27] 両極性又はノ-オン性の水溶性ポリマーと、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性 基を有する光架橋剤と、金属と共有結合又は配位結合可能な基を有する低分子化 合物とを含む、金属に物質を固定化するための物質固定化剤。
[28] 基体に固定ィ匕すべき物質と、請求項 21ないし 27のいずれか 1項に記載の物質固 定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、 基体上への物質の固定化方法。
[29] 前記物質固定化剤が、請求項 26又は 27記載の物質固定化剤であり、前記低分子 化合物を先ず基体に作用させ、次 、で前記水溶性ポリマー又は前記水溶性ポリマ 一と前記架橋剤とを作用させる請求項 28記載の方法。
[30] 基体に固定ィ匕する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要 素から成る群力も選ばれる請求項 29記載の方法。
[31] 請求項 28ないし 30記載の方法により、前記物質が金属上に固定化された基体。
[32] 請求項 21ないし 25のいずれ力 1項に記載のポリマーの、物質固定化剤のとしての 使用。
[33] 請求項 26又は 27記載の組成物の、物質固定化剤としての使用。
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