JPH06506961A - Ｃｅ（４）塩及び電磁線を用いた処理によるポリマー表層の改質 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 Ｃｅ（ＩＶ）塩及び電磁線を用いた処理によるポリマー表層の改質発明の分野 本発明はポリマー表層にタンパク質及びその他の種類の分子を固定化させるため に、ポリマー表層を改質及び活性化するための方法に関する。本発明は更に、改 質されている形態におけるポリマー及びその表層に例えばタンパク質のような分 子が固定化されているポリマーに関する。

発明の背景 ポリマー表層は、医薬的診断、科学及び工業における生物学的高分子のための支 持体として広い用途を有する。免疫収着分析、例えばｒＲＭＡ　（免疫放射測定 アッセイ）　、ＥＬＩＳＡ（酵素結合化免疫収着アッセイ）、ＩＦＭＡ　（免疫 蛍光測定アッセイ）　／ＦＬＡ（蛍光免疫アッセイ）及びＩＬＭＡ　（免疫ルミ ノ測定アッセイ／ＬＥＡ（ルミネッセント免疫アラ酵素、ＤＮＡ等の固定化が利 用されている。更に、低分子量試薬のポリマー固定が生物学的ポリマー、例えば ペプチド（Ｅ、Ｔ、Ｋａｉｓｅｒ：”５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅ ｓ　ｔｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎ ｄＰｒｏｔｅｉｎｓ　［ｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅｓ″　Ａｃｃ、Ｃｈｅ ｍ、Ｒｅｓ、２２．４７−５４（１９８９））　及び核酸（Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕ ｔｈｅｒｓ″Ｇｅｎｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｍａｃｈｉｎｅｓ″Ｓｃｉ’ｅｎ ｃｅ　２３０　。

２８１−２８５（１９８５））の固相合成にとって本質的である。

吸着による非共育的固定化は数多くの目的にとっては十分であるか、ポリマーへ のリガンドの共有結合を必要とする一定の分子にとってはこれはしばしば有効で ない。常用の有機ポリマー（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリ レート等）への直接的な共有結合は不可能であり、従ってしばしば多大な費用及 び難しさを伴って、改質化モノマーからポリマーを作る（　Ａｄｖａ口ｃｅｓ　 ｉｎ　ＰｏｌｙｍｅｒＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　（Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ 　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１第３Ｉ巻）Ｂ、Ｍ。

Ｃｕ１ｂｅｒｔｓｏｎ　ａｎｄ　Ｊ、Ｅ、ＭｃＧｒｏｔｈ、Ｐｌｅｎｕｍｓ　Ｐ ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８５）か、又は重合の後に通常の表層を活性 化させることか必要とされる。技術的及び経済的観点から、重合後改質が好まし い。

これは当業界において時折り認識され、そして種々の手法がこの問題を解決する ために提案されている。

ところで、これらの手法は非常に有害な化学物質もしくは処理、及び／又はｌも しくは数回のめんとうな工程の利用をしばしば包含する。例えばメリフィールド （Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄｓ）ペプチド樹脂の製造は非常に発癌性である化学物質 、クロロメチルメチルエーテルを包含する。更なる例はＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ、　３　、１５５−１６５（１９８１）に詳細のポリマーの表層へ のアミノ基の導入であり、これは有害な化学物質、メタンスルホン酸、氷酢酸及 び発煙硝酸を必要とし、そして三日間かかる。

更に、このような方法において用いられる溶媒はコントロール不能なポリマー表 層の物理的変質をしばしば生じせしめ、その理由はこのポリマー自体が溶媒に可 溶性であるためである。これはその後に分光光度測定を利用するときに大きな問 題を提供する。

製造中に反応基、例えば−０Ｈ１−３Ｏ，Ｈ又は−ＮＯ３によって予備修飾され たポリスチレンは市販されている。しかしながら、これらは特定の修飾されたポ リスチレンから所望の製品を独立して製造することを必要とする。

電磁線の利用はＥＰ公開番号第１５５２５２号において提示されており、これに 関してはポリマー表層を放射線によって活性化させ、非常に特異的な条件のもと てビニルモノマーをグラフトさせている。

しかしながらこのプロセスは、唯一適用する放射線源であるγ−線によってさえ も非常に時間がかかり、その反応時間は１０〜１２時間である。更にγ−線はポ リマー表層を脱色させる傾向を有し、これによって吸光光度測定にそれが適さな いようにする。

このような目的のための電磁線のその他の提案されている利用はＤＨ公開番号第 ３４３５７４４号に示され、これに関しては、プロティンＡをアリールアジドを 含む二官能性スペーサー分子とコンジュゲートさせ、その後このコンジュゲート を光に暴露せしめることによってこのコンジュゲートをポリマー表層に結合させ ている。

電磁線を用いる更なる提案されている利用はＥＰ公開番号第３１９９５７号に詳 細され、ここでは一定のポリ環状光反応性化合物を紫外線に特異的にかけ、ポリ マー表層の基とその後反応するようにこの光反応性化合物を活性化させている。

その後、リンカ−分子を介してタンパク質がこの表層に結合することができる。

発明の概要 本発明はその第一の態様において、新規且つ効率的な方法であって、ポリマー表 層がＣｅ（ＩＶ）塩及び電磁線による照射に基づいて化学的に改質し、これによ ってタンパク質及びその他のリガンドがより強く、可能性として共有結合にてさ えもこの表層に結合することができ、そしてそれ故固定化される方法に間する。

その第二の態様において、本発明はタンパク質又はその他のりガントとの共有結 合の樹立のために調製した改質形態におけるポリマーに関し、これによってこれ らのリガンドはこのポリマー表層に固定化される。

その第三の態様において、本発明はタンパク質又はその他のリガンドか固定化さ れている本発明の改質ポリマーに関する。

第四の態様において、本発明は分析技術、例えば免疫収着分析（ＩＲＭＡ、　Ｅ ＬＩＳＡ、　ＩＦＭＡ／ＦＩＡ、　ＩＬＭＡ／ＬＩＡ）における、もしくはより 一般的にはポリマー支持技術における前記の方法又は改質ポリマーの利用に関す る。

第五の態様において、本発明はタンパク質又はその他のりガントの固定化のため のポリマーを用意するための、このポリマー表層を改質するのに適切な一連の化 学物質と組合せた、特定の所望の末端利用のために所望される形態において形成 された未改質ポリマーを含んで成る包装品に関する。

図面の簡単な説明 図面において、図１はポリマー表層へのタンパク質の結合における、Ｃｅ（■） 塩及び電磁線の効果、並びにベロール（Ｂｅｒｏｌ：商標）又はエタノールアミ ンの添加の効果を示す。

図２は照射時間と、リガンドのポリマー表層への相対的結合性との間の関係を示 す。

図３はＣｅ（ＩＶ）塩の濃度と相対的結合性の関係を示す。

図４はマイクロタイターウェルに加えた結合すべき競合性未標識物質濃度の対数 関数としての、一定濃度での酵素コンジュゲート化酵素の結合性、並びにベロー ル（商標）及びエタノールアミンの添加の効果を示す。

図５はポリスチレン表層へのビオチンアミン（時折りＢｉｏＮＨ２として略す） の結合性を示す。

図６は照射時間の関数としての、本発明に従って活性化させた多数のポリマー表 層へのスペルミジンの結合性を示す。

図７は活性化処理の関数としての１２５　■−標識化タンパク質の結合性を示す 。

図８はＣＡＮ活性化ポリマー表層へのタンパク質の結合性における、ジビニルス ルホン処理の効果を示す。

図９はビオチンアミンコート化ＣＡＮプレートへのアビジン結合性の飽和を示す 。一定量のアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート及び種々の量のアビジン を用いた。Ｘ−Ｘ−Ｘ：ビオチンコート化ＣＡＮ−活性化プレート、◆−◆−◆ ：　ＣＡＮ−活性化プレート、ローローロ：未処理プレート。

図１Ｏは、ＣＡＮ−活性化プレート（ローローロ）及びビオチン−コート化ＣＡ Ｎ−プレート（Ｘ−Ｘ−Ｘ）における、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲー トの結合性における活性化において用いたＣＡＮの濃度の影響を示す。

図１１はＣＡＮ活性化プレートへのビオチンアミンの結合性におけるスペルミン の効果を示す。このプレートを（１）ＣＡＭ活性化し、（２）表示濃度のスペル ミンとインキュベートし、（３）洗い、（４）ビオチンアミンによってコートし 、そして（５）アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートによってアッセイした 。

図１２はＣＡＮ−活性化プレートへのビオチンメルカプタンの結合性におけるメ ルカプトエタノールの効果を示す。実験は図１１の通りであるか、ただしビオチ ンアミンをビオチンメルカプタンに、そしてスペルミンを２−メルカプトエター ルに代えた。

図１３はＣＡＮ活性化ポリスチレンプレートへのビオチンアミン又はビオチンメ ルカプタンの結合性におけるスペルミン及びメルカプトエタノールの混合物の効 果を示す。実験は図１１及び１２の通りであり、１００、ｃｚｇ／ｍｌのスペル ミン及び１００ｍｇ／ｍｌ　（１０％）の２−メルカプトエタノールを用いた。

図１４はＣＡＮ活性化プレートの安定性を示す。このプレートはＯ日月に活性化 させ、そして封をしたプラスチックバッグの中で４°Ｃ（×）又は２０°Ｃ（’ ）で保湿した。表示の時間にてこのプレートをビオチンアミンによってコートし 、そしてアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートによってアッセイした。

図１５はポリスチレン表層の局所的照射依存性活性化の例を示す。

図１６は用いた種々のビオチン誘導体の式を示す。

発明の詳細な説明 本発明はその第一の態様において、ポリマー表層を改質するための方法であって 、 ａ）このポリマーの表層にＣｅ（ＩＶ）塩の溶液を適用しこれによってこの表層 をこの溶液によって被覆し、 ｂ）この溶液被覆化表層に電磁線を照射し、これによってこの表層を活性化し、 Ｃ）この活性化表層を１回又は繰り返し洗うこと、を含んで成る方法に関する。

本発明に関して利用されるポリマーは任意の適切なポリマーてあり、そしてこれ はポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリカーボネ ート、ポリエチレンテレフタレートグリコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニ ル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート 、ポリテトラフルオロエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオ ロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジェンゴム、天然ゴム、ポリ−４−メチ ルペンチレン及びポリエステルより成る群から好適に選ばれつる。

セリウム（ＩＶ）塩は任意のＣｅ（■）塩てよいか、しかしながら好ましくはＣ ｅ　（ＩＶ）Ｘ２”型（ここでＸは適切な陽イオン、例えばＮＨ，”　、　Ｌビ 、Ｎａ”、に＋又はＣｓ”　、好ましくはＮＨ４＋である）の陽イオンの、適当 な数の１もしくは複数個の適切な陰イオンとの組合せにおける錯体塩、好ましく は硝酸塩であり、しかしながら電磁線にかけられることに基づいてラジカルを生 じせしめることのできる任意のその他の型のＣｅ（ＩＶ）塩も適切である。特定 の種類の活性剤塩の特定の例は、「複」塩、例えばＣ５ＮＨ＝　［Ｃｅ（Ｎｏｔ ）−］であり、これは「純粋」な塩としてまさに本発明にとって青用である。

塩溶液を作るために任意の適切な溶媒か用いられうる。適切な例には水、ジメチ ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　、アセトニトリル及び酸性水性媒体か含まれる。

本発明の目的のためには酸性水性媒体か好ましい。酸は形成されるラジカルを安 定化することのできるものとして選ばれるべきであり、そして硝酸塩に関連して 、窒素含有酸、好ましくはＨＮＯ３か適切であろう。

用いる電磁線は典型的には紫外可視光、好ましくは可視に近いＵ■光であるが、 しかしＣｅ（ＩＶ）塩からラジカルを発生せしめることのできるその他の種類の 電磁線も適切である。これはＸ−線又はγ−線でもよい。

照射は表面に拡散的に適用してよいか、しかし一定の利用にとっては局所的及び ／又は直接的適用が、そしである場合においては指定的適用でさえもか好ましい 。

洗浄工程において、種々の液体、例えば水又は緩衝液か利用されうる。

この活性化ポリマー表層の化学的改質を含んで成る更なる段階を上記の方法に加 えることができることか予想される。この活性化表面のこのような更なる改質は ： ｉ）アルコールをもたらす加水分解反応、ｉｉ）アルケンをもたらす脱離反応、 ｉｉ）エポキシド、アルデヒド及びカルボン酸をもたらす酸化反応、及び ｉｖ）例えばハロゲン化物をもたらす付加反応、にょって例示される。

改質試薬には特に塩基（ＮａＯＨ）　、酸（Ｈ，５Ｏ４）、過酸化物（Ｈ２Ｏ２ ゜ＲＣＯ２０Ｈ）　、ＣｒｚＯｎ”−、Ｍｎ０４−　、ハロゲン（１２，８ｒ２ ．　Ｃｌ２）及びシュードハロゲン（ＢｒＣＮ）が含まれる。

この方法を介して、タンパク質又はその他の物質か、可能としては共有結合を介 して効率的に固定化されていることのある活性化ポリマー表層が得られる。

酸性媒体（硝酸）中のセリウム（ＵＶ’）ジアンモニウムへキサニトレート、Ｃ ｅ（ＮＨｎ）ｚ（ＮＯｓ）ｓ（ＣＡＮ）の照射は酸化性の高い硝酸ラジカル（Ｎ Ｏｚ’　）を発生せしめることか詳しく開示されている。（Ｅ、　Ｂａｃｈｉｏ ｃｃｈｉら、”Ｃｅｒｉｕｍ（■）Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｎ１ｔｒａｔｅ　Ｃａｔ ａｌｙｚｅｄ　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｕｔ。

−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓ″Ｔｅｔｒａｈｅｄ ｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、２６．３３５３−３３５６（１９８５））。トルエンのＣＡ Ｎ及び長い波長の紫外線照射（ＯＶＡ）による処理は、ベンジルアルコールへと 容易に加水分解される高収量の硝酸ベンジルをもたらす（Ｂａｃｈｉｏｃｃｈｉ ら、前記）。

本発明に従って本発明者は、ポリマー表層をＣｅ（ＩＶ）塩及び電磁線によって 処理することによるより一般的な方法においてこの種類の光化学物質を適用し、 次いてここで得られる表層の特性、即ちタンパク質及び低分子量アミンと結合す るその能力を試験した。

得られる結果を裏付けするメカニズムに関係する任意の特定の理論に何ら拘束さ れることなく、我々はこのポリマー表層の活性化は、このポリマー表層にＣｅ　 （ＩＶ）塩を適用するために用いた媒体中において安定であるラジカルの形成を 介して得られるものと考えている。

このラジカルは水素引抜きプロセスを介してそれが形成された後にこのポリマー において活性化基を生じせしめ、この基は分子における一定の基との可能として は共有結合の形成を伴う反応を受け易い。

更なる態様において、この活性化基を以降スペーサー分子又はスペーサーと称す る中間体分子と結合させてよく、これは利用する目的に従ってホモ官能性、即ち このスペーサーが１種類の反応基（例えば−Ｎ）１２．−ＯＨもしくは−ＣＯＯ ）ｌ）のみを含むことを意味するが、又はへテロ官能性、即ちこのスペーサーが １より多くの種類の反応基（例えば−ＮＨ，、−ＳＨ及び＝Ｏｆ（）を含むこと を意味するものであってよい。このスペーサーは通常、通称二官能性であり、こ れはこのスペーサーが２個の反応基を含み、その一方はポリマー表層基に結合し 、そして他方は固定すべき物質に結合することを目的としている。

しかしながら、このスペーサーは多官能性でもよく、これは１個のスペーサーが 複数の物質をこのポリマー表層に結合させることができることを意味する。

このスペーサーは複数の目的、例えば共有結合の形成をコントロール且つ調節す るためにこのポリマーにおける高反応性活性基を安定化せしめること、又はかさ 高いリガンドの場合においてこのスペーサーがこのリガンドにとっての立体的障 害に関連する問題の解決を提供し、これによってこのリガンドにポリマー表層へ の「接近性」を提供すること、において利用される。

活性化基及び／又はスペーサーの更なる改質は通称リンカ−試薬の利用を介して 得ることかできる。

本発明の目的に適切なホモ三官能性リンカー試薬はニジビニルスルホン、０−フ ェニレンジマレイミド、ジメチルアジピミデート、グルタルアルデヒド、グルタ コンアルデヒド、カルボジイミド、トリレン−２，４−ジイソシアネート、ジス クシンイミジルスベラーテ、ヒス−オキシラン、ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシン イミドエステルでよく、好ましくはジビニルスルホンである。

適切なヘテロ三官能性リンカー試薬はマレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミドエステルでありうる。

以上は本発明にとって適切なスペーサー及び／又はリンカ−を何ら限定すること を目的としなく、適切なスペーサー及びリンカ−試薬の例示にすぎない。

本発明の好ましい態様に従い、ポリスチレン表層、例えばＥＬＩＳＡマイクロタ イタープレートにおけるウェルを、水性硝酸中のＣＡＮによって処理し、そして ＵＶＡによって照射せしめる。このことは、硝酸ラジカルを作り上げるものと考 えられ、これはポリマーから水素を引き抜いて硝酸エステルの形成、ヒドロ過酸 化（ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄａ−ｔｉｏｎ）　、ヒドロキシル化又は他の酸化 等をもたらす。

リンカ−試薬としてジビニルスルホンを用いる種々の方法において、このビニル 基の一方はこのポリマー表層上の活性化基との化学結合を樹立し、そして他方の ビニル基は所望のりガントに対する共存結合を樹立するのに育用であると考えら れている。

改質ポリスチレン表層の化学的構造を我々は未だ知らないが、トルエン等によっ て形成される生成物との類似性を引用することにより、我々はとりわけこの表層 上に硝酸エステルか形成されているものと考えている。これは次にタンパク質の アミン基と直接的に反応スル力、又はアルコールへの加水分解の後にジビニルス ルホンによってタンパク質に架橋できる。上記した通り、得られる表層の特性、 即ち吸着及び共有結合の両方によるタンパク質と結合するその能力を試験した（ 以下参照）。

ポリスチレンへのタンパク質の吸着は、コーティング用混合物に清浄剤を含ませ ることによって低めることのできる疎水的及び静電的相互作用におそらく最も原 因するであろう。試験のため、我々はベロール（商標）　ＥＭＬＩ−０４３を選 び、これは非イオン性であり且つ本目的に関して化学的に不活性であり、そして 下記の例Ｉに関連する図１において示す通り、この清浄剤は未処理ポリスチレン へのタンパク質（抗体）の吸着を阻害する。非共有結合を試験するため、我々は タンパク質の共存結合の主たる要因である２種の官能基（−ＮＨ２゜−ＯＨ）を 含むエタノールアミンを含ませることによって共有結合を抑えた。エタノールア ミンは未改質ポリスチレンへのタンパク質吸着に何ら阻害効果を有さなかった（ 例１１図１）。

ＣＡＮ及びＵＶＡによるポリスチレン表層の処理はタンパク質と結合するその能 力に複数の効果を有する。第一に、全結合性は約７０％低下した。第２に、残っ ている結合性の６０％がベロール（商標）の存在に影響されず、残っている結合 性がエタノールアミンの包含によって約４０％まで下った（例ＩＳ図１）。

これらの結果から我々は、このポリスチレン表層の物理的及び化学的性質はＣＡ Ｎ及びＯＶＡによる処理によって有意に変質されたものと推測する。これらの結 果は更に、６０％以上のタンパク質がこの表層に共有結合していることを強く示 唆した。

リンカ−又はカップリング活性剤を含ませること、例えばこの工程にジビニルス ルホンカップリング段階及び段階Ｃ）とｄ）の間に洗浄段階を挿入することは、 ベロール（商標）の存在下において固定化されるタンパク質の量を約５０％上昇 （図８を参照）させ、更にこの結果の精度、即ち平行実験間の標準偏差の低下が 改善された。

従ってジビニルスルホン処理を、下記の特性記述実験において本発明の態様とし て含ませた。

その他の概念は、本発明の方法の好ましい態様においてリンカ−試薬を含ませて いることにあり、これは本発明が更にポリマー表層を改質するための方法に関す ることを意味し、ここでこの方法は、ａ）　Ｃｅ　（ＩＶ）硝酸塩及び窒素含有 酸の溶液のこのポリマーの表層への適用、 ｂ）長い波長の紫外光によるこの表層の照射、Ｃ）この表層の１回又は繰り返し 洗浄、ｅ）このポリマー表層とリンカ−試薬のインキュベーション、及びｆ）こ の表層の１回又は繰り返し洗浄、を含んで成る。

この方法を介して、リンカ−試薬によって処理されていない表層よりも、タンパ ク質又はその他の物質か固定化されるのにより適しうるポリマー表層が得られる 。

この態様に関して、この活性化ポリマー表層の化学的改質を含んで成る更なる段 階（ｄ）を上記の方法に加えることができることも予想される。この活性化表層 のこのような更なる改質は上記に例示した。

本発明は更なる態様において、ポリマー表層へのタンパク質又はその他の物質の 固定化方法であって、上記の段階（ａ）から（Ｃ）。

（ｄ）又は（ｆ）に加えて、以下の段階：ｇ）この活性化し且つ洗浄した表層へ のタンパク質又はその他の物質の適用、及び ｈ）この表層の洗浄、を含んで成る。

利用する物質は任意の種類の分子、例えばタンパク質（酵素、抗体、抗原）、ペ プチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、炭水化物、脂質、アミノ酸、ヌクレオシド 、アミン、チオール、アルコールであるが、又は触媒、蛍光化合物及び／もしく は無機成分の可能としてはキレート剤を介する結合を含むポリマー表層上の固定 化を所望するいづれのものであってよい。

本発明の内容において、固定化する物質は細胞、ウィルス、微生物等も含むこと を意味する。

段階（ｇ）において適用するタンパク質又はその他の物質は従ってこのポリマー 表層上に固定化されている。

ポリスチレン表層の改質をもたらす反応を特徴付けするため、我々は金属塩及び その濃度、照射の時間及び波長並びにタンパク質濃度を変え、そしてインヒビタ ー（ベロール（商標）／アミノエタノール）の非存在下及び存在下の両方におい てこの表面のタンパク質（酵素−コンジュゲート化抗体）と結合する能力を分析 した。

ＣＡＮの濃度を変えた効果を図３に示す。改質の程度は約４ｍＭのＣＡＮ濃度で プラトーに達することが見い出せた。同様に、改質の最大の程度は、用いた装置 によって１０分以内の照射において到達した（図２）。

ＣＡＮの照射による硝酸ラジカルの形成はフラッシュ光分解（Ｒ，Ｗ。

Ｇｌａｓｓ　ａｎｄ　Ｔ、Ｗ、Ｍａｒｔｉｎ：　”Ｆ１ａ５ｈ　Ｇｅｎｅｒａｔ ｊｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｃａｙ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｎ１ｔｒａｔｅ 　Ｒａｄｉｅａｌ’　！ｎ　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｎ１ｔｒＩＣＡｃ１ｄ　５ＯＩＵ ｔｌＯｎＳ−Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　９２．５０８４−５０９３（１９７０））によって検出で きる。

本発明の重要な特徴がラジカル、特に硝酸ラジカルの形成にあるかのようである ため、本発明の改質は蒸気相中での硝酸ラジカルによるこのポリマー表層の処理 によっても行うことかできる。

ポリマー表層改質のために有用でありうるその他の遷移金属塩をスクリーンする ため、Ｔｃ及び放射性アクチノイドを除く実際上の全ての金属及びメタロイドの 硝酸塩により、硝酸塩を形成することのできるそれらの最も通常の酸化状態にお いて、フラッシュ光分解実験を行った。Ｃｅ　（ＩＶ）以外はニトロ化できない か、又はその他のラジカルが検出された。従って、ＣＬＩ（ＮＯ３）２又はＦｅ （ＮＯ３）ｚのような塩によるポリスチレン表層の光化学改質はＥＬＩＳＡにお けるこの表層のタンパク質結合特性を変化させなかった。これらの結果はラジカ ルメカニズムを裏付けする。

本発明に従うポリマー表層への物質の結合性の更なる特徴付けにおいて、結合す る物質の濃度の効果も調へ、そしてこの改質ポリスチレン表層へのタンパク質結 合は約３μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で飽和となり、これは未改質表層に関して 測定されたものと類似していた。

ＣＡＮ及びＯＶＡによるこのポリスチレン表層の活性化は、その表層にアミン及 びメルカプタンを結合せしめる能力における劇的な上昇（２４０倍）をもたらし た。これはビオチンアミン（６−ピオチニルアミノヘキサンー１−アミン）及び ビオチンメルカプタン（６−ピオチニルアミノヘキサンー１−チオール）のマイ クロタイタブレートへの結合性（これはその後のアビジンーペルオキシダーセコ ンソユゲートの結合によって検出される）（図２．　５．　９及１２）、及びス ペルミジンのポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリメチルメタ クリレートチューブへの結合性（図６）によって例示する。

特別のケースとして、巨大分子に一３Ｈ又は−ＭＨｚ　リンカ−を化学的／光化 学的に付加することか可能であり、ポリスチレンチューブへのチオール化ＤＮＡ の結合性によって例示した通り（表１）、これによってこれらは活性化表層に固 定化されつる。

表　１ ポリスチレンチューブへのチオール化ＤＮＡの結合処理　結合ＤＮＡ（ｃｐｍ） 　％付加ＤＮＡビオチンアミンを介してのＣＡＮ活性化ポリスチレン＾、のアビ ジン−ペルオキシダーゼの結合量（図５、第５列）は、吸着を介しての未処理ポ リスチレンへのそれらの結合量（清浄剤の非存在下２図５、第１列）と等しいこ とが特に注目される。図８は、リンカ−、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）を含ませ ることは、ＣＡＮ活性化ポリスチレンへのへロール（商標）耐性（共有結合）タ ンパク質結合を約２倍上昇させることを示す。

ＣＡＮ−活性化マイクロタイターウェルへのＩｇＧの結合のケースとまさに同様 に、ビオチンコート化ＣＡＮ−活性化プレートへのアビジンの結合性は高いアビ ジン濃度で飽和となり（図９）、そしてこの飽和は〜１μｇ／ｍｌの濃度にて、 即ちＩｇＧで観察されたのと似た濃度で起きている。

ビオチンアミンコーティングに関する活性化のための最適ＣＡＮ濃度（〜２　ｍ Ｍ）もＩｇＧコーティングについて測定されたのと似ており（図１Ｏ）、両方の ケースにおける活性化にとって同一の基本的光化学が要因であることを示唆する 。

このＣＡＮ活性化ポリスチレン表層の［化学的特異性ｊを、ビオチン誘導体であ る図１６（ここでＸはビオチニルである）において示した、（１）ビオチン−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミド（ビオチン活性エステル）、（２）ビオチンアミン 、（３）ｔ−Ｂｏｃ−ビオチンアミン、（４）ビオチンヘキシル、（５）ビオチ ンへブタン、（６）ビオチンメルカプタン及び（７）ビオチンジスルフィド、並 びにクエンチャ−であるスペルミン及びメルカプトエタノールを用いて調へた。

これらの試験からの結果のいくつかを以下の表２に示す。

表２ ビオチン誘導体　％結合性 表２かられかる通り、−ＮＨ，又は−ＳＨ基を含むビオチン誘導体のみがこの活 性化表層に結合し、−ＯＨ又は保護化−Ｎ８２基を含む誘導体は結合しなかった 。関連して、ビオチンアミンの結合性はスペルミンにより（図１１）、そしてビ オチンメルカプタンの結合性はメルカプトエタノールによって（図１２）阻害さ れた。ビオチンアミンの結合性はメルカプトエタノールよりもスペルミンによっ てより強く阻害され、そして同様にビオチンメルカプタンの結合性はスペルミン よりもヘルカプトエタノールによってより強く阻害されることが注目される（図 １３）。これらの結果は、少なくとも２種の型の改質がこの表層にて生じている ことが明らかであることを示し、その一方はアミンと幾分よりよく反応し、他方 はメルカプタンとよく反応するよってある。

下記の表３において、ポリスチレンプレートへのアビジン−ペルオキシダーゼコ ンジュゲートの結合性の再現性を示す。

表３ ＰＳ／　ＡｖＰｏ　−ツイーン（商’ＩＡ）１．０５３　１４　２５（３）ＰＳ ／ＡｖＰｏ＋ツイーン０．００２ ＣＡＮ　／ＡｖＰｏ＋ツイーン　０．１２７　３．７　５．９（３）ＣＡＮ　／ ＢｉｏＮＨｚ／ＡｖＰｏ＋ツイーン　２．６６８　２．０　１．８（３）ＰＳ： ポリスチレン；　ＡｖＰｏ　：アビジンベルオキシダーゼコンジュゲート：士ツ イーン（商標）：清浄剤ツイーン（商標）２ｏの有／無におけるタンパク質結合 性。ＣＡＮ：　ＣＡＮ活性化プレート。ＣＡＮ／　ＢＩＯＮＨ２ＣＡＮ活性化ビ オチン−コート化プレート。

表３より、再現性、即ち、ウェル内／プレート内偏差が未処理ポリスチレンと等 しい又はそれより優れていることが示される。

このＣＡＮ活性化プレートは、ビオチンアミンを結合させるその能力によってア ッセイされた通り（図１４）、４°Ｃ又は室温で保湿したときに少なくとも３０ 日間にわたって安定である。

最後に、照射コントロールによる局所的に表層を活性化する能力を示す。マイク ロタイタープレート由来の蓋の照射を、ｒＮＯＶＯＪ　と記したマスクを介して 行った。この活性化した蓋をビオチンアミンによってコートし、そして＋２５１ −ストレプトアビジン（４０μＣｉ／μｇ　、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってコ ートした後にＸ−線オートラジオグラフィーによって「現像」した。図１５はこ のような活性化を行う本発明の能力を示す。

例Ｉ ＥＬＩＳＡプレートへのＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体の結合ポリス チレンＥＬＩＳＡプレートの活性化ポリスチレンＥＬｒＳＡプレート（ＮＵＮＣ ，Ｄｅｎｍａｒｋ　４３９４５４号）における各ウェルに２ＭのＨＮＯｘ　（Ｍ ｅｒｃｋ、ｐｒｏ　ａｎａｌｙｓｉ）中の３．７ｍＭのＣＡＮ　１００μｌを加 えた。このプレートをその底を介して２０°Ｃて、２ｃｍ離れた５本の蛍光管（ Ｐｈｉｌｉｐｓ　ＴＬＤ　１５ワツト１０５、λ＝　３６５ｎｍ）由来の光によ って９分間照射せしめた。次にこのウェルを水で洗い、そして０．５ＭのＮａｚ ＣＯ３（Ｍｅｒｃｋ、ｐｒｏ　ａｎａｌｙｓｉ）ｐＨ１１、中の０．４２Ｍのソ ビニルスルホン（Ａｌｄｒｉｃｈ）　１００ｍ１と３０分間インキュベートした 。このウェルを水４００μｌで３回洗い、その後それらをタンパク質によるコー ティングのために用いた。

プレートのタンパク質コーティング 活性化ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、所望量のタンパク質を含む０、１５Ｍ のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、　１５３ｍＭのＮａ″″；４．２ｍＭのＫ”　； ９．６ｍＭのリン酸塩；　ｐＨ７，４）　１００μｍを加えた。インキュベーシ ョン後（通常は２０°Ｃて２時間）、このウェルを０．０５％のツイーン（商標 ）を含むＰＢＳで３回洗い、そして結合タンパク質の量を測定した。

結合タンパク質の定量 この［ｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化タンパク質 は、０．０３％のＨ２Ｏ２及び発色性基質としての１．２−フエニレンンアミン ニ塩酸塩（ＯＰＤ）錠剤（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）　ｏ、　５ａ＋ｇ／ｍｌを含む １００ｍＭのクエン酸緩衝液（Ｍｅｒｃｋ、ｒｅｉｎｓｔ）　ｐＨ５，２中にお けるベルオキシダーセ活性を測定することによって定量した。各ウェルにこの混 合物１００μＩを加え、そしてこのプレートを１０分間２０°Ｃてインキュベー トした。酵素反応は２ＮのＨ，ＳＯ，１００μＩを加えることにより停止させ、 そして比色反応は自動ＥＬＩＳＡスキャナー（ＥＡＲ４００，５ＬＴ−ＬＡＢ　 ＩＮＳＴＲＩＪＭＥＮＴＳ、Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）を用いてのＥ４，２の測定に よって定量した。

これらの測定からの結果を図１に示す。

本明細書のはじめに示した通り、本例は、本発明の方法かポリスチレン表層の吸 着容量を７０％下げ、そしてタンパク質を共存的に結合させる能力か最大吸着容 量の約１０％まで向上させることを示す。

図２．３及び４は、本例と平行に行った、本発明の方法の他のパラメーターを変 えた実験において得られたデーターより成る。

図３は、遷移族金属塩（ＣＡＮ）の最適濃度が約４ｍＭであることを示し、そし て図２は本装置によるこの塩にとっての最適反応時間が８〜ｌＯ分てありうるこ とを示す。

例２ エリザ（ＥＬＩＳＡ）プレートに対する　１２５ヨウ素化ＩｇＧの結合プレート の活性およびコーチングを、例Ｉに記載した方法と同様の方法で行った。

ｒｇＧの＋２５ヨウ素化 ヨウ素化を、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の推めに従ってＮａ”５ｆ　（担体なし 、Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて行った。ラ ベル化１ｇＧの特異活性は、はぼ０．５μＣｉ／μｇであった。

結合タンパク質の定量 アグファ　キューリックス（Ａｇｆａ　Ｃｕｒｉｘ）ＲＰｌＸ線フィルムおよび プレートとフィルム間の７ｍｍのｍｉ下マスク用い、マイクロタイタープレート のオートラジオグラフィーにより、　１２６■−ラベル化タンパク質を定量した 。オートラジオダラムを、島原Ｃ５９３０デンントマータースキャナーを用い、 ５５０ｎｍでスキャンした。結果を図７に示す。

例３ エリザ（ＥＬＩＳＡ）プレートに対するビオチンアミン（６−ピオチニルアミノ ヘキサンー１−アミン）の結合 プレートの活性化を例１におけると同様に行ったか、但し、所望によりジビニル スルホン工程は省略した。ビオチンアミン（ＰＢＳ中１０μｇ　／ｍりを用いた インキュベーションを、２０°Ｃて３０分間行った。

引き続きＰＢＳ　、０．０５％のツイーン（ＴＷＥＥＮ）　（登録商標）２０を 用いてウェルを３回洗浄し、アビジンペルオキシダーゼ接合体（３６４ダコパツ ト、ＰＢＳ中１対４０００に希釈、０．０５％のツイーン（ＴＷＥＥＮ）　（登 録商標）２０）を用いて１２０分間インキュベー１−　Ｌ、次いて例１に示す如 く定量化した。結果を図２および図５に示す。図２は、ビオチナミン処理による 照射効果（◆）又はビオチナミン処理なしの照射効果（ロ）を示す。

例４ エリザ（ＥＬＩＳＡ）プレートに対するビオチンメルカプタン（６−ピオチニル アミノヘキサンー１−チオール）の結合これは、例３と同様の方法で行ったか、 但しビオチナミンの代りにビオチナミンメルカブタンを用いた。

例５ ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリメチレンチューブに 対するスバルミシンの結合チューブの活性化 ２ＭのＨＮＯ，に溶解した１ｍｌの３．７＋ｎＭ　ＣＡＮを、各チューブに充填 した。次いて、例１に記載した光源を用い、所望の長さの時間、低から各チュー ブを照射した。

チューブを水で洗浄し次いて１ｍｌのＮａＨＣＯ３（ｐＨ）に溶解した’Ｈ−ス ペルミジン（１μｇ／ｍＩ、１０’ｃｐｍ／μｇ、ニューイングランドニュクリ アー）と共に１６時間２０°Ｃてインキュベートした。チューブを水で３回洗浄 し次いて放射能の量を、［ｎ５ｔａ−Ｇｅｌ（登録商標）（ルーマック）中、シ ンチレーソヨン計測により測定した。Ｆｉｇ、　６は、放射時間の関数として３ Ｈ−スバルミシン結合による結果を示す。

例６ ポリスチレンチューブに対する千オール化ＤＮＡの結合１ｍｌのｌ０ｍＭ　トリ ス−１４ＣＩ中の”ｐ−エンドラベル化ＤＮＡ断片（プラスミドｐＵｃ１９の９ ０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕｌｌ断片に−ルセン等、バイオチミストリー訂、　 （１９８８）６３３８−６３４３）１００μｇの子ウシ胸腺ＤＮＡおよび１０μ ｇのブソラレンージスルフィド（エレスナー等、Ａｎａｌｙｔ　ｉｃａｌＢｉｏ ｃｈｅｍ、　１４９　、　（１９８５）５７８−５８１）の混合物を、ＣＡＮ活 性化に対して用いた光源で６０分間放射した。１０μｌの０．１ｍジチオトレイ トールを添加し、次いでＤＮＡを、２［＋１１のエタノール、０．２Ｍ酢酸ナト リウムを用いて沈殿させた。沈殿物を遠心分離により単離し、エタールで洗浄し 、乾燥し、次いで１．２［１１１の水に再溶解した。ポリスチレンチューブを例 ５で記載の如く活性化し、次いで上記チオール化ＤＮＡ　１０μｇを含有するＩ 　ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液、２００ａＩの１０ｍＭ　トリス−１４ＣＩ（＋））Ｉ ７．４）と共に１６時間４°Ｃでインキュベートした。チューブを３回洗浄し、 次いでシンチレーション計数管で、ｆｆ２ｐの「セレンコツ（Ｃｅｒｅｎｃｏｖ ）　Ｊの計測により、結合ＤＮＡの量を測定した。

結論 本発明者等は以下の内容を明らかにした。すなわち、ポリマー表面、例えばポリ スチレン表面を、Ｃｅ（ＩＶ）塩、例えば硝酸セリウムアンモニウムの硝酸溶液 による処理および電磁放射、例えば長波の紫外線放射は、それが７０％だけ吸着 によるタンパク質の結合能力を減少させ更に同時に非処理ポリマー表面について 観測された非共有結合の吸着の約１０％に相当する効率をもって、タンパク質の 明白な共育結合の付着ならしめるように表面を改質した。

更に以下の内容も見出された。すなわち、本発明の活性化方法は、低分子量アミ ンおよびメルカプタンに結合させるための処理表面の能力を劇的に（４０倍以上 ）増加させる。

このタイプの表面改変は、固体支持体の「化学」、例えは免疫溶剤分析、アフィ ニティ　カラム　りロマトグラフィー、酵素固定化（例えば発酵における）、治 療器具（例えば透析）等に基づく多様の技術に対して有用なものである。

−−−十　＋　＋　ＣＡＮ／ＵＶＡ −−＋−−＋　ベロール ー　“　−−“　−エタノールアミン ト工Ｇ、１ Ｆ工Ｇ、４ 一−−＋＋ＣＡＭ活性化 一一十一　十　ビオチン−アミン −＋＋＋　＋　ツイーン Ｆ工Ｇ、５ −一＋−−十　エタノールアミン抑制 −“　−−＋　−ベロール抑郡１ ＋　＋　＋　＋　十　＋ＣＡＮ ＦＩＣ，８ アビジン（ＮＧ／ＭＬ） Ｆ工Ｇ、９ Ｆ工Ｇ、１０ スペルミン（μＧ／ＭＬ） Ｆｒｃ、　１１ Ｆｘａ、　１２ ＋＋＋＋＋＋ＣＡＮ −−＋＋−−ビオチンアミン −−−−十　＋　ビオチンチオール −＋−＋　＋　＋　クエンチング溶液 ＋＋　＋＋　＋　＋　アビジン Ｆ工０．１３ Ｆｘｃ、１４ Ｆｘｃ、１５ Ｆｘｃ、１６ 国際調査報告 国際調査報告 ρＣＴ／ＤＫ　９１１００１０７ フロントページの続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリマー表面を改質する方法であって、ａ）ポリマー表面にＣｅ（ＩＶ）塩 の溶液を適用し、これにより表面を溶液で被覆し、 ｂ）溶液で被覆された表面に電磁線を照射し、これにより表面を活性化し、 ｃ）活性化された表面を一回又はくり返し洗浄することを含んでなる、前記方法 。 ２．更にｄ）活性化ポリマー表面の化学的改質を含んでなるし請求の範囲第１項 記載の方法。 ３．更に、ｅ）ポリマー表面をリンカー分子と共にインキュベートし次いでｆ） 表面を１回又はくり返し洗浄する、請求の範囲第１又は第２項記載の方法。 ４．前記工程（ｄ）が、次の反応： ｉ）アルコールに至る加水分解反応、 ｉｉ）アルケンをもたらす脱離反応、 ｉｉｉ）エポキシド、アルデヒド、およびカルボン酸に到る酸化反応、および ｉｖ）例えばハロゲン化物に至る付加反応の任意のいずれかを含んでなる、請求 の範囲第２又は第３項記載の方法。 ５．ポリマーが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン 、ポリエチレンテトラフタレート　グリコール、ポリビニル　アセテート、ポリ ビニルクロリド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメ タクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチル　ゴム、スチレンブタジエ ン　ゴム、天然ゴム、ポリ−４−メチルベンチレン、およびポリエステルから成 る群から選ばれる、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６．塩を、水、ジメチルスルホキシド（ＤＨＳＯ）、水性アセトニトリル溶液、 又は水性酸性溶液に溶解する、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。 ７．塩がニトレートである、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。 ８．塩を、窒素含有酸、好ましくはＨＮＯ３に溶解する、請求の範囲第７項記載 の方法。 ９．用いる電磁線が紫外光、好ましくはほぼ可視ＵＶ光である、請求の範囲第１ 〜８項のいずれかに記載の方法。 １０．前記リンカーがホモ官能性である、請求の範囲第３〜９項のいずれかに記 載の方法。 １１．前記リンカーが、ヘテロ官能性である、請求の範囲第３〜９項のいずれか に記載の方法。 １２．前記リンカーが、二官能性である、請求の範囲第１０又は第１１項記載の 方法。 １３．前記リンカーが、多官能性である、請求の範囲第１０又は第１１項記載の 方法。 １４．前記リンカーが、ジビニル　スルホン、Ｏ−フェニレンジマレイミド、ジ メチル　アジピイミデート、グルタコンアルデヒド、グルタールアルデヒド、カ ルボジイミド、トリレン−２，４−ジイソシアネート、およびジスシンイミジル 　スベレートを含んで成る群から選ばれ、好ましくはジビニル　スルホンである 、請求の範囲第１０および１１項記載の方法。 １５．前記リンカーが、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エーテルを含んで成る群から選ばれる、請求の範囲第１１および第１２項記載の 方法。 １６．蛋白質又は他のリガンドをポリマー表面に固定化する方法であって、 ａ）ポリマー表面にＣｅ（ＩＶ）塩の溶液を適用し、これにより表面を溶液で被 覆し、 ｂ）溶液で被覆された表面に電磁線を照射し、これにより表面を活性化し、 ｃ）活性化された表面を一回又はくり返し洗浄することを含んでなる、前記方法 。 ｇ）蛋白質、低分子ペプチド、又は他のリガンドを、照射され、活性化され更に 洗浄された表面に適用し、次いでｈ）表面を洗浄する、 ことを含んでなる、前記方法。 １７．工程（ｃ）と工程（ｇ）の間に、更にｄ）活性化ポリマー表面の化学的改 質を含んでなる、請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．工程（ｃ）と工程（ｇ）の間に、更に、ｅ）ポリマー表面をリンカー分子 と共にインキュベートし次いでｆ）表面を１回又はくり返し洗浄する、請求の範 囲第１６又は第１７項記載の方法。 １９．前記工程（ｄ）が、次の反応： ｉ）アルコールに至る加水分解反応、 ｉｉ）アルケンをもたらす脱離反応、 ｉｉｉ）エポキシド、アルデヒド、およびカルボン酸に到る酸化反応、および ｉｖ）例えばハロゲン化物に至る付加反応の任意のいずれかを含んでなる、請求 の範囲第１７又は第１８項記載の方法。 ２０．ポリマーが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタ ン、ポリエチレンテトラフタレート　グリコール、ポリビニル　アセテート、ポ リビニルクロリド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチル メタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチル　ゴム、スチレンブタジ エン　ゴム、天然ゴム、ポリ−４−メチルベンチレン、およびポリエステルから 成る群から選ばれる、請求の範囲第１６〜１９項のいずれかに記載の方法。 ２１．塩を、水、ジメチルスルホキシド（ＤＨＳＯ）、水性アセトニトリル溶液 、又は水性酸性溶液に溶解する、請求の範囲第１６〜２０項のいずれかに記載の 方法。 ２２．塩がニトレートである、請求の範囲第１６〜２１項のいずれかに記載の方 法。 ２３．塩を、窒素含有酸、好ましくはＨＮＯ３に溶解する、請求の範囲第２２項 記載の方法。 ２４．用いる電磁線が紫外光、好ましくはほぼ可視ＵＶ光である、請求の範囲第 １６〜２３項のいずれかに記載の方法。 ２５．前記リンカーがホモ官能性である、請求の範囲第１８〜２４項のいずれか に記載の方法。 ２６．前記リンカーが、ヘテロ官能性である、請求の範囲第１８〜２４項のいず れかに記載の方法。 ２７．前記リンカーが、二官能性である、請求の範囲第２５又は第２６項記載の 方法。 ２８．前記リンカーが、多官能性である、請求の範囲第２５又は第２６項記載の 方法。 ２９．前記リンカーが、ジビニル　スルホン、Ｏ−フェニレンジマレイミド、ジ メチル　アジピイミデート、グルタコンアルデヒド、グルタールアルデヒド、カ ルボジイミド、トリレン−２，４−ジイソシアネート、およびジスシンイミジル 　スベレートを含んで成る群から選ばれ、好ましくはジビニル　スルホンである 、請求の範囲第２５および第２７項記載の方法。 ３０．前記リンカーが、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エーテルを含んで成る群から選ばれる、請求の範囲第２６および第２７項記載の 方法。 ３１．用いる物質が、分子、例えば蛋白質（酵素、抗体、抗原）、ペプチド、核 酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、炭水化物、脂質、アミノ酸、ヌクレオシド、アミン、 アルコール、又は触媒のカップリング、螢光化合物、および／又は無機部分、可 能ならキレート剤を介して、ポリマー表面に固定化させることが望まれるものは 何でもよいものである、請求の範囲第１６〜３０項のいずれかに記載の方法。 ３２．用いる物質が、細胞、ウィルス、微生物等である、請求の範囲第１６〜３ ０項のいずれかに記載の方法。 ３３．適当な形態、例えばマイクロ滴定プレート又はチューブの形態に造られて いる、請求の範囲第３４項記載の方法。 ３５．蛋白質又は他のリガンドの固定化に対し、それを調製するため、ポリマー 表面の改質に適した化学試剤のセットと組合せて特定の所望の目的用途に対して 所望の配置の形態にある朱改質ポリマーを含んでなるキット。