JP3124018B2 - 結合アッセイ用固相の調製方法 - Google Patents

結合アッセイ用固相の調製方法

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、特異的結合成分を固相支持体に共有結合的
に結合させる方法および試薬に関する。さらに詳しく
は、本発明は、診断アッセイおよび分離法に使用するた
めの特異的結合成分の固相支持体への固定化に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 結合アッセイ法は、生物学的および非生物学的流体の
両方において、薬物、ホルモン、タンパク質、ペプチ
ド、代謝産物、微生物および他の目的物質（一般に分析
対象物と称されている）の検出および／または測定のた
めの臨床診断の分野において広範囲の応用が見出されて
いる。結合アッセイには、抗体および抗原免疫反応物を
代表的なものとする特異的結合成分を用い、特異的結合
成分のうち一方の成分はシグナル生成化合物（たとえ
ば、酵素で標識した抗体、蛍光化合物、化学発光化合
物、放射性標識、直接視覚標識など）で標識する。たと
えば、結合アッセイにおいて、分析対象物を含んでいる
と思われる試料を標識抗分析対象物抗体とともに混合
し、インキュベートして免疫反応を起こさせる。この反
応混合物を引き続き分析して抗体／分析対象物複合体に
結合した標識（結合標識）かまたは分析対象物と複合体
を生成しなかった標識抗体（有利標識）を検出し、試料
中の分析対象物の検出または測定を可能ならしめる。
結合アッセイは、均一アッセイと不均一アッセイとし
て知られる２つの一般的なカテゴリーに分けることがで
きる。均一アッセイにおいては、結合標識により生成す
るシグナルは遊離標識により生成するシグナルとは異な
る。その結果、個々の反応物を反応混合物から物理的に
分離することなく結合標識と遊離標識とを識別すること
ができる。
よく知られた均一結合アッセイ法は、米国特許第3,81
7,837号明細書に開示されている酵素多重（enzyme−mul
tiplied）イムノアッセイ法（EMIT）である。EMITアッ
セイでは、患者試料中に存在する分析対象物と酵素標識
分析対象物とが、限られた量の抗分析対象物抗体に対し
て競合する。分析対象物−酵素結合体に抗体が特異的に
結合することにより、該結合体の酵素活性が修飾され、
酵素活性は試料中の分析対象物の量に比例するようにな
る。均一結合アッセイは、迅速であること、容易に実施
できること、および自動化に容易に対応できることなど
の利点を有する。均一結合アッセイの不利な点として
は、試料中の非分析対象物により妨害されやすいこと、
一般に低分子量の分析対象物のアッセイに制限されるこ
と、および感度が限られていることなどが挙げられる。
不均一結合アッセイでは、結合標識により生成するシ
グナルを遊離標識により生成するシグナルと識別するこ
とができない。それゆえ、それぞれのシグナルを識別す
るために遊離標識と結合標識とを互いに分離しなければ
ならない。ある場合においては、結合標識の結合してい
る複合体は遊離の標識反応物とは分子量が実質的に異な
るため、一層重い複合体を分離するのに遠心分離を用い
ることができる。
遠心分離に代わる方法としては、結合アッセイの反応
物の少なくとも一方を固体支持体に結合させることが挙
げられる。ついで、この固体支持体を試料および残留す
るアッセイ試薬から分離して遊離標識と結合標識とを分
離することができる。固体支持体と反応混合物との分離
は、残留する反応混合物を吸引する（drawing−off）か
または反応混合物から固相を物理的に除去することによ
り行うことができる。この固体支持体はまた、固相に結
合した標識を検出または測定する前に処理または洗浄し
て妨害物質を除くことができる。
不均一アッセイでは一層長いインキュベート時間が必
要である。このことは、固相に結合した特異的結合成分
とその相補的結合成分との間の反応の動力学は、両結合
成分がともに溶液中にあるときの同じ反応の動力学に比
べて遅い傾向があるからである。しかしながら、不均一
アッセイは一般に均一アッセイに比べて感度が高く、ま
た妨害物質も洗浄工程により除くことができるので妨害
も受けにくい。
この一般的な固相分離法の変法が開発されているが、
それらは一般に固相に結合した特異的結合成分への分析
対象物の結合を含んでいる。一般に、特異的結合成分は
固相に吸着または共有結合により結合または固足化され
る。吸着は、固相が特異的結合成分を誘引し保持する作
用による。共有結合では、特異的結合成分と固相とは化
学的に反応し、その結果として生成する結合が特異的結
合成分を固相上に固定化する。
固相と固定化特異的結合成分との間の結合は、該特異
的結合成分の分析対象物への結合に大きな影響を与え得
る。たとえば、抗体は極めて特異的な構造的、空間的お
よび極性的な立体配置を有しており、それによって特定
の分析対象物（たとえば抗原）を認識し結合することが
できる。抗原の検出のためのアッセイにおいて抗体を用
いるときは、該抗体は固定に結合した特異的結合成分で
あってよい。しかしながら、固相が抗体に近接している
と、抗原の結合する抗体上の部位が一部分または完全に
ブロックされ得る。加えて、抗体と固相との間の結合は
抗体のコンホメーションを変化させ、そのことにより分
析対象物への抗体の結合能に影響を与え得る。同じよう
な制限は、他の特異的結合成分の固相への結合にもあて
はまる。特異的結合成分は、結合部位の完全な立体妨害
から妨害のない接近に至る範囲の位置スペクトルで結合
することができ、および／または特異的結合成分のコン
ホメーションは固相への結合に伴って変化し、その相補
的結合成分がもはや認識または結合できなくなる。予想
されるように、アッセイの感度は、立体妨害度が増加し
反応性が失われるにつれて減少する。
タンパク質性の特異的結合成分をポリマー性の固相に
共有結合的に結合させる従来法には、カルボジイミドを
用いてタンパク質のアミン基と固相の表面上のカルボキ
シル基との間で架橋を生成させることが含まれる。別法
として、グルタールアルデヒドを用い、タンパク質のア
ミンと固相上の結合アミンとの間で架橋を生成させる。
しかしながら、これらの架橋法は制御するのが困難であ
り、タンパク質／タンパク質架橋反応やタンパク質の過
剰修飾のような非特異的反応を引き起こし、特異的結合
成分の結合能を減少させる結果となる。加えて、そのよ
うにして固定化したタンパク質は反応性が乏しく、その
ため適当なアッセイ感度を得るために大量のタンパク質
を固相に結合させる必要がある。
不均一アッセイに付随する架橋の問題を解決するため
に２つの主要な試みがなされている。一つは、新たに生
成した複合体を固相上に固定化する前に結合成分の反応
を完了させることである。他の方法は、特異的結合成分
と固相の間の結合の長さを延長させることである。結合
剤またはカップリング剤は、アッセイの化学的操作の間
および洗浄および分離工程の物理的操作の間に上記結合
を保持していなければならない。延長された長さのヘテ
ロ二官能性（heterobifunctional）カップリング剤はヨ
ーロッパ特極出願公開EP−Ａ−314,127号公報（アボッ
ト・ラボラトリーズ）に記載されており、特異的結合成
分の固相への結合は、固相上の化学基と反応性の少なく
とも１個の結合基および特異的結合成分上の化学基と反
応性の少なくとも１個の結合基を有する延長された長さ
の分子鎖を用いることにより行うことができる。
（課題を解決するための手段） 本発明は、式:B−Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｒ′−Ｍ （式中、Ｂはアミノ基、カルボキシル基およびチオール
基よりなる群から選ばれた反応性の基を有する固相、Ｍ
はアミノ化特異的結合成分、ＲおよびＲ′はヘテロ二官
能性試薬およびホモ二官能性試薬よりなる群から選ばれ
たカップリング剤、Ｓ−Ｘ−ＳはチオエーテルによりＲ
およびＲ′に結合したジチオ化合物である）で示される
固定化特異的結合成分； （ａ）アミノ基、カルボキシル基およびチオール基より
なる群から選ばれた反応性の基を有する固相を、ヘテロ
二官能性試薬およびホモ二官能性試薬よりなる群から選
ばれた第一のカップリング剤と反応させて固相／カップ
リング剤複合体を生成させ、 （ｂ）アミノ化特異的結合成分を第二のカップリング剤
と反応させて特異的結合成分／カップリング剤複合体を
生成させ、 （ｃ）該固相／カップリング剤複合体をジチオール化合
物と反応させてチオール化固相／カップリング剤複合体
を生成させ、ついで （ｄ）該チオール化固相／カップリング剤複合体を該特
異的結合成分／カップリング剤複合体と反応させてジチ
オエーテルで架橋された固相／特異的結合成分複合体を
生成させる ことを特徴とする、固定化特異的結合成分の製造方法； 式:B−Ｒ−Ｓ−Ｘ−SH （式中、Ｂはアミノ基、カルボキシル基およびチオール
基よりなる群から選ばれた反応性の基を有する固相、Ｒ
はヘテロ二官能性試薬およびホモ二官能性試薬よりなる
群から選ばれたカップリング剤、Ｓ−Ｘ−SHはチオエー
テルによりＲに結合したジチオ化合物である）で示され
るチオール化固相； （ａ）アミノ基、カルボキシル基およびチオール基より
なる群から選ばれた反応性の基を有する固相を、ヘテロ
二官能性試薬およびホモ二官能性試薬よりなる群から選
ばれたカップリング剤と反応させて固相／カップリング
剤複合体を生成させ、ついで （ｂ）該固相／カップリング剤複合体をジチオール化合
物と反応させてチオール化固相／カップリング剤複合体
を生成させる ことを特徴とする、チオール化固相の製造方法； 式:B−Ｑ−Ｓ−Ｒ−Ｍ （式中、Ｂはアミノ基、カルボキシル基およびチオール
基よりなる群から選ばれた反応性の基を有する固相、Ｍ
はアミノ化特異的結合成分、Ｒはヘテロ二官能性カップ
リング剤、Ｑ−Ｓはチオール導入剤である）で示される
固定化特異的結合成分； （ａ）アミノ基、カルボキシル基およびチオール基より
なる群から選ばれた反応性の基を有する固相をチオール
導入剤と反応させてチオール化固相を生成させ、 （ｂ）アミノ化特異的結合成分をヘテロ二官能性カップ
リング剤と反応させて特異的結合成分／カップリング剤
複合体を生成させ、ついで （ｃ）該チオール化固相を該特異的結合成分／カップリ
ング剤複合体と反応させて架橋された固相／特異的結合
成分複合体を生成させる ことを特徴とする、固定化特異的結合成分の製造方法； （ａ）アミノ基、カルボキシル基およびチオール基より
なる群から選ばれた反応性の基を有する固相をジスルフ
ィド化合物と反応させて固相／ジスルフィド化合物複合
体を生成させ、ついで （ｂ）該固相／ジスルフィド化合物複合体を還元剤と反
応させて該ジスルフィド化合物を還元させてチオール化
固相を生成させる ことにより調製したチオール化固相；および （ａ）アミノ基、カルボキシル基およびチオール基より
なる群から選ばれた反応性の基を有する固相をジスルフ
ィド化合物と反応させて固相／ジスルフィド化合物複合
体を生成させ、 （ｂ）該固相／ジスルフィド化合物複合体を還元剤と反
応させて該ジスルフィド化合物を還元させてチオール化
固相を生成させ、ついで （ｃ）該チオール化固相を、アミノ化特異的結合成分が
ヘテロ二官能性カップリング剤と複合体を生成した特異
的結合成分／カップリング剤複合体と反応させる ことにより調製した固定化特異的結合成分 を提供するものである。
本発明は、チオール化固相物質および固定化特異的結
合成分の製造方法を提供する。
本発明により製造される固定化特異的結合成分の一つ
の態様は、式:B−Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｒ′−Ｍ （式中、Ｂはアミノ基、カルボキシル基またはチオール
基を有する固相である）で示されるものである。この固
相は、同じかまたは異なるカップリング剤（ヘテロ二官
能性かまたはホモ二官能性）であるＲおよびＲ′により
アミノ化特異的結合成分であるＭに結合している。
この固定化特異的結合成分は、まず上記固相を第一の
カップリング剤と反応させて固相／カップリング剤複合
体を生成させることにより調製する。上記アミノ化特異
的結合成分を第二のカップリング剤と反応させて特異的
結合成分／カップリング剤複合体を生成させる。上記固
相／カップリング剤複合体をついでジチオール化合物と
反応させてチオール化固相／カップリング剤複合体を生
成させる。ついで、このチオール化固相／カップリング
剤複合体を上記特異的結合成分／カップリング剤複合体
と反応させてジチオールエーテルで架橋された固相／特
異的結合成分複合体を生成させる。別法として、上記特
異的結合成分／カップリング剤複合体をジチオール化合
物を反応させてチオール化特異的結合成分／カップリン
グ剤複合体を生成させ、ついでこれを上記固相／カップ
リング剤複合体と反応させて固定化特異的結合成分を生
成させる。
固定化特異的結合成分の他の態様は、式： Ｂ−Ｑ−Ｓ−Ｒ−Ｍ （式中、Ｂはアミノ基またはカルボキシル基を有する固
相であり、該固相は特異的結合成分／ヘテロ二官能性カ
ップリング剤複合体であるＲ−Ｍにチオール導入剤であ
るＱ−Ｓにより結合している）で示されるものである。
チオール導入剤としては、チオラン、スクシンイミジル
チオアセテートおよび還元によりチオールになるジスル
フィド化合物が挙げられる。この固定化特異的結合成分
は、上記固相をチオール導入剤と反応させてチオール化
固相を生成させ、アミノ化特異的結合成分をヘテロ二官
能性カップリング剤と反応させて特異的結合成分／カッ
プリング剤複合体を生成させ、ついで上記チオール化固
相を上記特異的結合成分／カップリング剤複合体と反応
させて架橋された固相／特異的結合成分複合体を生成さ
せることにより製造する。
本発明はまた、式:B−Ｒ−Ｓ−Ｘ−SH （式中、Ｂはアミノ基、カルボキシル基またはチオール
基を有する固相、Ｒはヘテロ二官能性カップリング剤、
Ｓ−Ｘ−SHはチオエーテルによりＲに結合したジチオ化
合物である）で示されるチオール化固相を製造するのに
有用である。このチオール化固相は、上記固相をヘテロ
二官能性カップリング剤と反応させて固相／カップリン
グ剤複合体を生成させ、ついでこの複合体をジチオール
化合物と反応させてチオール化固相／カップリング剤複
合体を生成させることにより製造する。
上記チオール化固相はまた、固相をジスルフィド化合
物と反応させて固相／ジスルフィド化合物複合体を生成
させ、ついでこれを還元剤と反応させて該ジスルフィド
を還元してチオール化固相を生成させることによっても
調製することができる。
上記のようにして得た固定化特異的結合成分は、診断
結合アッセイに用いることができる。この固定化結合成
分はまた、場合により支持媒体中、または支持媒体上に
導入することができる。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、イムノアッセイに使用するためのタンパク
質の固相上への固定化のような、特異的結合成分と固相
とを共有結合させるための方法を提供する。本発明の方
法は、２つのアミノ基含有成分を共有結合的に架橋させ
るのに用いることができる。これらの成分としては、抗
体、酵素、ペプチド、細胞、ハプテン、小さな分子、固
相、リポソームおよびポリマーなどが挙げられるが、こ
れらに限られるものではない。本発明の一般的方法に
は、特異的結合成分および／または固相を修飾してチオ
ール反応性の官能基を導入することが含まれる。ついで
活性化特異的結合成分を上記チオール化固相と反応させ
て共有結合を生成させる。本発明の特別の方法は、固相
にチオール基を導入するのに用いる手段が異なる。本発
明の他の態様においては、固相および特異的結合成分の
両方を個々に修飾して延長された長さのヘテロ二官能性
カップリング剤が含まれるようにし、これらをジチオー
ル化合物により架橋させることができる。
本発明によれば、誘導体化固相支持体および固定化特
異的結合成分の両方の産生のための化学に対して一層大
きな制御を加えることができる。本発明によれば、使用
する特異的結合成分は一層少量ですみながら、感度、特
異性および安定性の増大した固定化特異的結合成分を製
造することが可能となる。加えて、本発明は固相の表面
電荷を変化させることができ、このことにより、ある場
合に結合アッセイにおいて起こり得る電荷の関連する非
特異的相互反応を除くことができる。本発明の共有結合
特異的結合成分／固相複合体は、前進（forward）アッ
セイ法および逆アッセイ法のいずれにおいてもサンドイ
ッチおよび競合不均一結合アッセイ法の両方に用いるこ
とができる。
定義 本明細書において「特異的結合成分」とは、特異的結
合ペアの成分、すなわち２つの異なる分子において一方
の分子が化学的または物理的手段によって第二の分子に
特異的に結合するものをいう。抗原および抗体特異的結
合ペアに加えて、他の特異的結合ペアとしては、ビオチ
ンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチ
ド配列（標的核酸配列を検出するためのDNAハイブリダ
イゼーションアッセイに用いるプローブおよび捕捉核酸
配列を含む）、組換え法により製造したものを含む相補
的ペプチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、
酵素補助因子と酵素、酵素インヒブターと酵素などが挙
げられる。さらに、特異的結合ペアには、上記特異的結
合成分の類似体である成分も含まれる。たとえば、分析
対象物の断片の誘導体、すなわち分析対象物類似体も、
それが分析対象物と共通するエピトープを少なくとも１
個有する限り用いることができる。免疫反応性の特異的
結合成分としては、抗原、ハプテン、抗体およびそれら
の複合体が挙げられる。こえらは組換えDNA法またはペ
プチド合成により製造したものが含まれる。
本明細書において「分析対象物」とは、本発明を用い
て試料中に検出すべきまたは試料から分離すべき物質を
いう。分析対象物は、それに対して特異的結合成分が天
然に存在するかまたは特異的結合成分を調製することの
できるものであればいかなるものであってもよい。加え
て、分析対象物は２個以上の特異的結合成分と結合して
もよい。「分析対象物」にはまた、抗原性物質、ハプテ
ン、抗体およびそれらの組合わせも含まれる。分析対象
物には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、
ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的に投与されるも
のおよび不法目的で投与されるものを含む）、細菌、ウ
イルム、および上記物質のいずれかの代謝産物または上
記物質のいずれかに対する抗体が含まれる。
本明細書において「固相」とは、診断アッセイ、アフ
ィニティークロマトグラフィーおよび分離法に使用する
ために特異的結合成分をその上に固定化することのでき
る物質をいう。下記実施例においてはポリマー性物質で
できた微細粒子固相を用いて一般的に記載したが、特異
的結合成分の固定化を可能にする必要な連結基を含む
か、生成させることができるか、または受け入れるよう
に誘導体化することができる限り他の固相態様を使用す
ることができる。
本発明の固相としては、ポリマービーズ、ガラスビー
ズ、微細粒子、管、シート、プレート、スライド、ウエ
ル、テープ、試験管などが挙げられるがこれらに限られ
るものではない。天然の物質、合成物質または合成的に
修飾した天然に存在する物質を固相として用いることが
でき、多糖類、たとえばセルロース物質（紙および酢酸
セルロースやニトロセルロースなどのセルロース誘導体
など）；シリカ；シリコン粒子；不活化アルミナまたは
細かく粉砕し多孔質ポリマーマトリックス中に均一に分
散させた他の無機物質などの無機物質（ポリマーとして
は塩化ビニル、プロピレンとの塩化ビニルポリマー、酢
酸ビニルとの塩化ビニルポリマーなど）；ポリエチレ
ン；天然に存在する布（たとえば綿）および合成した布
（たとえばナイロン）；シリカゲルなどの多孔質ゲル；
ポリアクリレートなどのポリマー性フィルムなどが挙げ
られる。種々の固相物質を本発明に従って使用すること
ができることは当業者には容易に理解されるであろう。
加えて、本発明に従って調製した固相は、別の支持媒
体中または支持媒体上に導入することができる。支持媒
体としては、適当な吸収性物質、クロマトグラフィー物
質、吸湿性物質、多孔質物質または毛管作用を有する物
質のいずれも用いることができる。たとえば、本発明の
支持媒体には、ヨーロッパ特許出願公開217,403号明細
書（1987年４月８日公開）に記載されているようなフロ
ースルー（flow−through）アッセイ装置に用いるため
のファイバーグラス、セルロースまたはナイロンパッド
が含まれる。該公報に開示された装置は、繊維の多孔質
マトリックスを有する物質の実質的に平面の層と、その
上に固体化され固体化した特異的結合成分を有する実質
的に球形の微細粒子からなる。同様に、ディップ・アン
ド・リード（dip and read）アッセイのためのディップ
スティック（dipstick）またはクロマトグラフィーアッ
セイのための試験ストリップ（たとえば紙またはガラス
ファイバー）または薄層クロマトグラフィーアッセイの
ための試験ストリップ（たとえばニトロセルロース）を
用いることができる。
本明細書において「試料」とは、目的の分析対象物を
含有すると思われる、天然に存在するまたは人工的に生
成させた液体試験媒体をいう。診断アッセイにおいて
は、試料は一般に生物学的流体またはその希釈液であ
る。分析対象物を決定する生物学的流体としては、血
清、全血、血漿、尿、唾液、羊水、脳脊髄液などが挙げ
られる。本発明の試薬および方法はまた、食品製品およ
び環境分析対象物を決定すべく設計することもできる。
本明細書において「カップリング剤」とは、二官能性
の架橋またはカップリング剤、すなわち２個の反応性の
基または「末端」（これらはスペーサーによりつながれ
ていてもよい）を含む分子をいう。反応性末端は種々の
官能基のいずれかであってもよく、たとえば、ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド（NHS）活性エステル、イミドエ
ステル、アルデヒド、エポキシド、スルホニルハライ
ド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびニトロ
アリールハライドなどのアミノ反応性末端；およびピリ
ジルスルフィド、マレイミド、チオフタールイミドおよ
び活性ハロゲンなどのチオール反応性末端が挙げられる
がこれらに限られるものではない。
本発明に使用することのできる市販のヘテロ二官能性
試薬としては、マレイミド−NHS−活性エステルカップ
リング剤、たとえばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシ−スクシンイミドエステル（MBS）；スクシン
イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（SMCC）；スクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）およ
びそれらの誘導体、たとえば、スルホスクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート（スルホ−SMCC）;m−マレイミドベン
ゾイル−スルホスクシンイミジルエステル（スルホ−MB
S）およびスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチレート（スルホ−SMPB）などのスルホ
スクシンイミジル誘導体が挙げられるがこれに限られる
ものではない。
他のヘテロ二官能性試薬としては、市販の活性ハロゲ
ン−NHS活性エステル、たとえば、Ｎ−スクシンイミジ
ルブロモアセテートおよびＮ−スクシンイミジル（４−
ヨードアセチル）アミノベンゾエート（SIAB）およびス
ルホスクシンイミジル誘導体、たとえば、スルホスクシ
ンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート
（スルホ−SIAB）などが挙げらられる。
他のカップリング剤の例は、Ｎ−スクシンイミジル３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）など
のヘテロ二官能性でチオール開裂性の試薬である。N,
N′−ジダンシル−Ｌ−シスチンおよびＬ−シスチンジ
メチルエステル二塩酸塩などのチオール開裂性試薬も用
いることができる。
カップリング剤のさらに他の例としては、ヨーロッパ
特許出願公開314,127号公報に記載された延長された長
さのヘテロ二官能性カップリング剤が挙げられる。この
延長された長さのヘテロ二官能性カップリング剤にはマ
レイミド−NHS活性エステル試薬が含まれ、ここでスペ
ーサーは式：−（Xn）−CO−Ｒ− （式中、Ｘは炭素数が３〜10個の直鎖からなる置換また
は非置換アミノ酸、ｎは０〜10、Ｒはアルキル基、シク
ロアルキル基、アルキルシクロアルキル基または芳香族
カルボン酸基である）で示される。ここでアルキルシク
ロアルキル基とは、シクロアルキル環構造にアルキル基
が結合したものをいい、その際、該アルキル基は該シク
ロアルキル基をマレイミド基またはカルボニル基に結合
させる。ここでアルキル基とは、直鎖または分枝鎖アル
キル基を意味し、好ましくは炭素数１〜６個の低級アル
キル基を意味する。
スペーサーが存在してカップリング剤の２個の反応性
の基をつないでいるときは、このスペーサーは、それと
ともに用いる分析対象物または他の特異的結合成分とは
非反応性で安定で非結合性の分子鎖である。このスペー
サーの長さは変化させることができ、単一の原子から上
記ヨーロッパ特許出願公開314,127号公報に開示された
大きさまたはそれ以上の大きさの範囲であってよい。
本明細書において「チオール導入剤」としては、チオ
ラン（２−イミノチオラン）、スクシンイミジルチオア
セテート（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオア
セテートなど）、および還元によりチオールになるジス
ルフィド化合物などが含まれるが、これらに限られるも
のではない。このチオール導入剤は、チオール反応性の
基と引き続き反応させるために特異的結合成分および固
相物質を活性化するために用いることができる。
カップリング剤またはチオール導入剤の選択は、診断
アッセイに用いた特定の固相および特異的結合成分との
許容し得る性能に依存する。それゆえ、所定のアッセイ
に用いるカップリング剤またはチオール導入剤は経験的
に決定されることが当業者には明らかであろう。加え
て、特異的結合成分は１個またはそれ以上のアミノ基、
カルボキシル基またはチオール基を含有しているか、ア
ミノ基、カルボキシル基またはチオール基を導入するよ
うに誘導体化して、該特異的結合成分がカップリング剤
またはチオール導入剤と反応することができるようにす
る。「活性種」とは、カップリング剤を導入することに
よって反応性の基を含むようになった（たとえばスルホ
−MBSによるタンパク質の活性化）特異的結合成分およ
び固相をいう。タンパク質活性部位にシステイン残基を
有するタンパク質性の特異的結合成分は、カップリング
剤を加えることによってその活性が減少するので、該タ
ンパク質をカップリング剤と反応させる前に公知に方法
により該活性部位におけるシステイン残基を保護してお
かなければならない。
活性化または誘導体化固相および固定化特異的結合成分
の調製 本発明の一般的方法には、チオール基を導入すること
により固相を修飾することが含まれる。特異的結合成分
（たとえばタンパク質抗原）もまた、修飾してチオール
反応性の官能残基（マレイミドまたは活性ハロゲンな
ど）を含むようにする。ついで、上記誘導体化特異的結
合成分を上記チオール化固相に加え、反応させて共有結
合を生成させる。
アミノ基を有する特異的結合成分を修飾してチオール
反応性の官能基を含むようにすることのできる２つの方
法を、下記に反応式１および２として図示する。
反応式1:マレイミド−NHS活性エステルヘテロ二官能性
試薬を用いた特異的結合成分の活性化 反応式2:活性ハロゲン−NHS活性エステルヘテロ二官能
性試薬を用いた特異的結合成分の活性化 特に反応式１は、マレイミド−NHS活性エステルヘテ
ロ二官能性試薬を用いることにより、タンパク質性特異
的結合成分を活性化して該タンパク質上にチオール反応
性の基を導入する方法を示す。カップリング剤中のＲ
は、すでに述べたようにアルキル基、シクロアルキル
基、アルキルシクロアルキル基または芳香族カルボン酸
環を示す。カップリング剤中のＺは、一般に水素原子を
表し、場合によりSO3 -のような該カップリング剤に水溶
性の性質を付与する不活性な極性基を表す。第二の工程
において、上記活性化特異的結合成分をついでチオール
化固相と反応させて該固相に結合させる。
反応式２では、上記特異的結合成分を活性ハロゲン−
NHS活性エステルヘテロ二官能性試薬（式中、Ｒおよび
Ｚは前記と同じ）と反応させる。第二の工程において、
得られた特異的結合成分／カップリング剤複合体をつい
でチオール化固相と反応させて該固相に結合させる。
下記反応式３〜６には、アミノ化またはカルボキシル
化ポリスチレンラテックス粒子のような固相にチオール
基を導入するための方法を図式してある。
反応式3:2−イミノチオランを用いたチオール化固相の
調製 反応式4:チオール化固相のジチオール調製 反応式5:アミノ化固相の修飾およびジスルフィド基の還
元 反応式6:カルボキシル化固相の修飾およびジスルフィド
基の還元 反応式３は、チオール導入剤（たとえば２−イミノチ
オラン）を用い、これをアミノ化固相と反応させてチオ
ール化固相を生成させる方法を示す。
反応式４は、アミノ化固相と活性ハロゲン−NHS活性
エステルヘテロ二官能性試薬（式中、ＲおよびＺは前記
と同じ、Ｉは試料ハロゲンである）との反応を示す。得
られた固相／カップリング剤複合体をついでチオール導
入剤（たとえばHS−Ｘ−SHで示されるジチオール化合
物）と反応させることにより活性化させ、チオール化固
相を生成させる。反応式１における特異的結合成分／カ
ップリング剤の調製の場合と同様、チオール化固相／カ
ップリング剤複合体はマレイミド−NHS活性エステルヘ
テロ二官能性試薬を用いることによっても調製すること
ができる。
反応式５および６は、アミノ化またはカルボキシル化
固相を修飾するためにジスルフィド化合物を使用する方
法を示す。式中、ＲおよびＺは前記と同じである。該ジ
スルフィド化合物と該固相との反応のあと、還元剤を加
えて該ジスルフィド化合物を還元してチオール化固相を
生成させる。このジスルフィド化合物は、−Ｒ−Ｓ−Ｓ
−Ｒ′の構造で表される。この方法に用いる還元剤とし
ては、上記ジスルフィド基をチオールに還元することの
できる物質であればいかなるものであってもよい。その
ような還元剤としては、チオール、水素化ホウ素、水素
化金属および触媒とともに用いる水素ガスなどが挙げら
れるがこれらに限られるものではない。反応式６に示し
たカルボキシル化固相とアミノ基含有ジスルフィド化合
物との反応の代わりに、固相がアミノ基を含むかまたは
アミノ基を含むように活性化させ、ジスルフィド化合物
がカルボキシル基を含んでいてよい。
固相および特異的結合成分の両方をカップリング剤を
含むように修飾することができ、該カップリング剤は必
要なアミノ基、チオール基またはカルボキシル基を提供
する。修飾成分の一つ、たとえば固相／カップリング剤
複合体をついてジチオール化合物で処理して該成分にス
ルフヒドリル基を導入してチオール化固相／カップリン
グ剤複合体を生成させる。最後に、この特異的結合成分
／カップリング剤複合体を上記チオール化固相／カップ
リング剤複合体に加えて架橋生成物を生成させる。
特異的結合成分／カップリング剤複合体と固相／カッ
プリング剤複合体とのスルフヒドリル結合の一例を下記
反応式７に示す。
反応式7:チオール化固相の調製および特異的結合成分の
共有固定化 アミノ化微細粒子を上記反応式７の左上に示してあ
る。固相微細粒子としては、アミノ基を有する市販のラ
テックス微細粒子、およびアミノ基を含むように修飾ま
たは活性化した微細粒子が挙げられる。この微細粒子を
ヘテロ二官能性カップリング剤（たとえばスルホ−MB
S）と混合して微細粒子／カップリング剤複合体を生成
させる。この微細粒子／カップリング剤複合体をついで
ジチオール化合物（たとえば、ジチオトレイルトール
（DTT））と反応させてチオール化微細粒子／カップリ
ング剤複合体を生成させる。アミノ化タンパク質（アミ
ノ基を有する抗原など）を上記反応式の右上に示してあ
る。このタンパク質もまたヘテロ二官能性カップリング
剤に結合させてタンパク質／カップリング剤複合体を生
成させる。最後に、上記チオール化微細粒子／カップリ
ング剤複合体および上記タンパク質／カップリング剤複
合体を反応させてジチオエーテルで華僑された微細粒子
およびタンパク質（たとえば固定化特異的結合成分）を
生成させる。
下記に掲げる実施例は、本発明による活性化固相生成
物（すなわち、チオール化固相／カップリング剤複合
体）および固定化特異的結合成分生成物の合成法を示す
ものであるが、本発明はこれらに限られるものではな
い。
I.ジチオエーテル結合によるタンパク質の固定化： 実施例１ 組換えHIV−１ gp−41誘導体化微細粒子の調製： （ａ）チオール化微細粒子の調製： アミノ−微細粒子（３μｍ直径、2.5％固形分、ポリ
サイエンシズ（Polysciences,Inc.,）、ワシントン、P
A）の懸濁液（3.0ml）を15mlポリプロピレン遠心管中に
入れ、3000rpmで10分間遠心分離した。上清をデカント
し廃棄した。この微細粒子ペレットを10mMリン酸バッフ
ァー食塩水、pH7.2（PBS）（3.0ml）中に均一になるま
で再懸濁した。Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ
キシスルホ−スクシンイミドエステル（スルホ−MBS、
ピアス・ケミカル（Pierce Chemical Co.,）、ロックフ
ォード、IL）（PBS1ml当たり10mg）の溶液（0.3ml）を
上記微細粒子懸濁液に加え、この混合物を室温（20〜25
℃）にて１時間、転倒回転（end−over−end rotatio
n）により混合させながら反応させた。この混合物を遠
心分離にかけ、上清をデカントし廃棄した。このマレイ
ミド−微細粒子ペレットをPBS（10ml）中に再懸濁し、
撹拌し、遠心分離にかけ、ついで上清をデカントするこ
とにより洗浄した。この洗浄工程を３回繰り返した。こ
の微細粒子ペレットをついでPBS中の0.1Mジチオスレイ
トールの溶液（10ml）中に再懸濁した。この微細粒子懸
濁液を室温にて転倒回転により１時間混合した。この懸
濁液を遠心分離にかけ、上清をデカントし廃棄した。こ
のチオール化微細粒子をPBS中のツイーン−20の0.1％
（v/v）溶液（10ml）中に撹拌により再懸濁して均一な
懸濁液を得た。この混合物をついで遠心分離にかけ、上
清を廃棄した。0.1％ツイーン−20/PBS中への再懸濁、
遠心分離および上清の廃棄の工程をさらに３回繰り返し
た。このチオール化微細粒子ペレットをついでPBSを用
いて再懸濁して最終容量を3.0mlとした。このチオール
化微細粒子は、ジチオスレイトールの除去３時間以内に
使用したときに最適に反応した。
（ｂ）組換えHIV−Ｉ gp−41のスルホMBSによる活性
化： 1.8％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS/PBS（w/v）中の
タンパク質（0.3mg）の溶液（1.2ml）を反応容器中に入
れた。タンパク質特異的結合成分はHIV抗原であった。
典型的なHIVタンパク質は、当該技術分野で知られてい
るようにp24配列やgp41配列などの組換えタンパク質構
築物を含んでいる。PBS中の30％ツイーン−20の溶液（v
/v;1.0ml）を加え、この溶液を混合し、ついでPBS（0.8
ml）中のスルホ−MBS（20μｇ）を加えて特異的結合成
分／カップリング剤複合体を生成させた。この溶液を再
び混合し、室温にて１時間放置した。
（ｃ）マレイミドベンゾイル活性化HIV−１ gp−41の
チオール化微細粒子への共有結合： 上記活性化タンパク質（3.0ml、実施例１（ｂ）から
のもの）をチオール化微細粒子の懸濁液（3.0ml、実施
例１（ａ）からのもの）と混合した。この混合物を転倒
回転させながら室温にて一夜（14〜18時間）反応させ
た。このタンパク質コーティング微細粒子懸濁液を実施
例１（ａ）に記載のようにして遠心分離にかけ、上清を
デカントし廃棄した。ペレットを10mM 2−メルカプトエ
タノール（10ml）中に撹拌することにより再懸濁し、こ
の混合物をついで１時間転倒回転により混合した。この
懸濁液を遠心分離にかけ、上清を廃棄した。この微細粒
子ペレットを、PBS中の0.1％ツイーン−20（v/v）（10m
l）中への再懸濁、ついで上清をデカントする工程を４
回繰り返すことにより洗浄した。この粒子をついで0.1
％（w/v）アジ化ナトリウムを加えたPBS中に再懸濁して
0.75％固形分の懸濁液（10ml）とした。この固定化特異
的結合成分調製物を４〜８℃で保存した。
実施例２ 組換えHIV−1 p24コーティング微細粒子の調製： （ａ）組換えHIV−1 p24のスルホ−MBSによる活性化： 0.5％SDS/PBS（w/v）（0.5ml）中のp24（375μｇ）の
溶液を45℃にて20〜30分間加熱した。加熱後、PBS中の3
0％ツイーン−20（v/v）（0.5ml）およびスルホ−MBS
（60μｇ）を含むPBS（0.5ml）を上記タンパク質溶液に
加えた。この反応混合物を撹拌し、室温にて１時間放置
して特異的結合成分／カップリング剤複合体を生成させ
た。
（ｂ）誘導体化p24のチオール化微細粒子への共有結
合： チオール化微細粒子（実施例１（ａ）に記載のように
して調製したもの）の懸濁液（3.0ml）を遠心分離にか
け、上清を廃棄した。このペレットを撹拌しながら活性
化p24溶液中に再懸濁し、20〜25℃にて14〜18時間転倒
回転により混合した。この懸濁液をついで遠心分離にか
け、上清を廃棄した。このp24コーティング微細粒子の
ペレットを10mM ２−メルカプトエタノール（10ml）中
に再懸濁し、20〜25℃にて１時間転倒回転により混合し
た。この懸濁液を再び遠心分離にかけ、上清を廃棄し
た。このペレットをついで、PBS中の0.1％ツイーン−20
（v/v）（10ml）中への再懸濁、遠心分離および上清の
廃棄の工程を４回繰り返すことにより洗浄した。このペ
レットを、0.1％アジ化ナトリウム（w/v）を含有するPB
S中に再懸濁して容量を10mlとし、この固定化特異的結
合成分を４〜８℃にて保存した。
実施例３ タンパク質の尿活性化による組換えHIVタンパク質−コ
ーティング微細粒子の調製： （ａ）組換えHIVタンパク質のスルホ−MBSでの活性化： 8M尿（55μ）中のHIVタンパク質（600μｇ）の溶液
を適当な容器中に入れた。これに8M尿（40μ）中のス
ルホ−MBS（40μｇ）を加えた。この溶液を充分に撹拌
し、室温にて１時間放置した。
（ｂ）組換えHIVタンパク質のチオール化微細粒子への
共有結合： 実施例３（ａ）で得た活性化タンパク質を実施例１
（ａ）で得たチオール化微細粒子の懸濁液（3.0ml）に
加えた。この懸濁液を転倒回転させながら20〜25℃にて
14〜18時間インキュベートした。このタンパク質コーテ
ィング微細粒子をついで遠心分離にかけ、２−メルカプ
トエタノールで処理し、洗浄し、再懸濁し、実質的に実
施例１（ｃ）に記載の手順に従って保存した。II.微細
粒子のチオール化において他のヘテロ二官能性試薬を用
いてジチオエーテル結合することによりタンパク質を固
定化すること： 実施例４ 微細粒子のチオール化においてスルホ−SMCCを用いた組
換えHIV−１ gp−41誘導体化微細粒子の調製： チオール化微細粒子の調製においてスルホ−MBSの代
わりにスルホ−SMCCカップリング剤（ピアス）を用いた
他は実質的に実施例１に記載の方法に従って固定化特異
的結合成分を調製した。
実施例５ 微細粒子のチオール化においてスルホ−SIABを用いた組
換えHIV−１ gp−41誘導体化微細粒子の調製： チオール化微細粒子の調製においてスルホ−MBSの代
わりにスルホ−SIABカップリング剤（ピアス）を用いた
他は実質的に実施例１に記載の方法に従って固定化特異
的結合成分を調製した。
実施例６ 微細粒子のチオール化においてSIABを用いた組換えHIV
−1 gp−41誘導体化微細粒子の調製： アミノ−微細粒子の懸濁液（3.0ml）を3000rpmにて10
分間遠心分離にかけた。上清を除き廃棄した。このペレ
ットをPBSとジメチルスルホキシド（DMSO）との1:1混合
物（3.0ml）中に撹拌により再懸濁した。この懸濁液にD
MSO中にSIAB（ピアス）（3.0mg）を含有する溶液（0.3m
l）を加え、ついでこれを20〜25℃にて転倒回転により
１時間混合した。この懸濁液を遠心分離にかけ、上清を
廃棄した。このヨードアセチル微細粒子を、PBS（10m
l）中への再懸濁、遠心分離および上清の廃棄の工程を
３回繰り返すことにより洗浄した。このペレットをつい
でPBS中の0.1Mジチオスレイトールの溶液（10ml）中に
再懸濁した。この懸濁液を20〜25℃にて１時間混合し、
ついで遠心分離にかけ、上清を廃棄した。このチオール
化微細粒子を上記のようにしてそれぞれPBS中の0.1％ツ
イーン−20（v/v）（10ml）を用いた工程を４回繰り返
すことにより洗浄した。この微細粒子をついでPBS（10m
l）中に再懸濁した。タンパク質／カップリング剤複合
体の調製およびチオール化微細粒子への架橋は、実質的
に実施例１（ｂ）および（ｃ）に記載の手順に従って行
った。
実施例７ 微細粒子のチオール化においてSMCCを用いた組換えHIV
−1 gp−41誘導体化微細粒子の調製： チオール化微細粒子の調製においてSIABの代わりにSM
CC（ピアス）を用いた他は実質的に実施例６に記載のプ
ロトコールに従って固定化特異的結合成分を調製した。
実施例８ 微細粒子のチオール化において16原子ヘテロ二官能性リ
ンカー基を用いた組換えHIV−1 gp−41誘導体化微細粒
子の調製： SIABの代わりにヨーロッパ特許出願公開314,127号公
報に記載の16原子マレイミド−ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジル活性エステル化合物を用いた他は実質的に実施
例６に記載のプロトコールに従って固定化特異的結合成
分を調製した。
実施例９ 微細粒子のチオール化において23原子ヘテロ二官能性リ
ンカー基を用いた組換えHIV−1 gp−41誘導体化微細粒
子の調製： SIABの代わりにヨーロッパ特許出願公開314,127号公
報に記載の23原子マレイミド−ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジル活性エステル化合物を用いた他は実質的に実施
例６に記載のプロトコールに従って固定化特異的結合成
分を調製した。
実施例10 微細粒子のチオール化において30原子ヘテロ二官能性リ
ンカー基を用いた組換えHIV−1 gp−41誘導体化微細粒
子の調製： SIABの代わりにヨーロッパ特許出願公開314,127号公
報に記載の30原子マレイミド−ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジル活性エステル化合物を用いた他は実質的に実施
例６に記載のプロトコールに従って固定化特異的結合成
分を調製した。
III.タンパク質の活性化において他のヘテロ二官能性試
薬を用いたジチオエーテル結合によるタンパク質の固定
化： 実施例11 スルホ−SMCC活性化gp41を用いた組換えHIV−1 gp−41
誘導体化微細粒子の調製： 実施例１（ｂ）に記載した組換えgp41の活性化におい
てスルホ−MBSの代わりにスルホ−SMCCを用いた他は実
質的に実施例１に記載のプロトコールに従って固定化特
異的結合成分を調製した。
実施例12 スルホ−SIAB活性化gp41を用いた組換えHIV−1 gp−41
誘導体化微細粒子の調製： 実施例１（ｂ）に記載した組換えgp41の活性化におい
てスルホ−MBSの代わりにスルホ−SIABを用いた他は実
質的に実施例１に記載のプロトコールに従って固定化特
異的結合成分を調製した。
実施例13 SMCC活性化gp41を用いた組換えHIV−1 gp−41誘導体化
微細粒子の調製： PBS中のタンパク質（0.3mg）の溶液（1.0ml）を、SMC
C（20μｇ）を含有するDMSO（2.0ml）と混合した。この
溶液を混合し、20〜25℃にて１時間放置して特異的結合
成分／カップリング剤複合体を調製した。チオール化微
細粒子の調製およびタンパク質の微細粒子へのカップリ
ング手順は、それぞれ実施例１（ａ）および（ｃ）に記
載の方法に従った。
実施例14 SIAB活性化gp41を用いた組換えHIV−1 gp−41誘導体化
微細粒子の調製： 組換えgp41の誘導体化においてSMCCの代わりにSIABを
用いた他は実質的に実施例13に記載のプロトコールに従
って固定化特異的結合成分を調製した。
実施例15 30原子ヘテロ二官能性リンカー修飾gp41を用いた組換え
HIV−1 gp−41誘導体化微細粒子の調製： 組換えgp41の誘導体においてSMCCの代わりにヨーロッ
パ特許出願公開314,127号公報に記載の30原子マレイミ
ド−ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル化合
物を用いた他は実質的に実施例13に記載のプロトコール
に従って固定化特異的結合成分を調製した。
IV.2−イミノチオランによりチオール化した微細粒子と
のタンパク質の固定化： 実施例16 ２−イミノチオランによりチオール化した微細粒子への
組換えHIV−1 gp−41の共有結合： （ａ）チオール化微細粒子の調製： アミノ−微細粒子（３μ直径、脱イオン化水中に2.5
％固形分；ポリサイエンシズ）の懸濁液（3.0ml）を50m
M N−メチルモルホリンの氷冷溶液（pH6.5、15ml）に加
えた。これに２−イミノチオラン（ピアス・ケミカル）
（90mg）を含有する氷冷0.1M重炭酸ナトリウム（9.0m
l）を加えた。この懸濁液を連続的に撹拌することによ
り室温（20〜25℃）にて混合し、4,500rpmにて10分間遠
心分離にかけ、上清を除き廃棄した。このペレットを、
PBS中の0.05％ツイーン−20（v/v）（30ml）中に撹拌し
ながら再懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄する工程を３
回繰り返すことにより洗浄した。このチオール化微細粒
子をペレットとして放置し、１時間以内に用いた。
（ｂ）組換えHIV−1 gp−41のスルホ−MBSによる活性： スルホ−MBS（20μｇ）を含有するPBSの溶液（2.0m
l）を、脱イオン化水中のgp41（250μｇ）の溶液（1.0m
l）に加えて特異的結合成分／カップリング剤複合体を
調製した。この混合物を撹拌し、室温にて１時間放置し
た。
（ｃ）誘導体化gp41のチオール化微細粒子への共有結
合： 実施例16（ｂ）の活性化タンパク質溶液およびPBS
（2.0ml）を、実施例16（ａ）のチオール化微細粒子の
ペレットに加えた。この粒子を撹拌しながら再懸濁し、
この懸濁液を20〜25℃にて14〜18時間転倒回転により混
合した。この懸濁液を実質的に実施例１（ｃ）に記載の
プロトコールに従って遠心分離にかけ、２−メルカプト
エタノールで処理し、洗浄し、再懸濁し、保存した。
実施例17 微細粒子のチオール化のために２−イミノチオランを用
いたペプチド誘導体化微細粒子の調製： 合成ペプチド（20〜30）アミノ酸残基を含むアミン
（430μｇ）のPBS（150μ）中の溶液を、実施例16
（ａ）に記載のようにして調製したチオール化微細粒子
（3.0ml）に加えた。この懸濁液にメタノール1ml当たり
SIAB（1mg）を含有する溶液（75μ）を加え、この混
合物を20〜25℃にて14〜18時間転倒回転により混合し
た。この誘導体化微細粒子をついで実質的に実施例１
（ｃ）に記載のプロトコールに従って遠心分離にかけ、
洗浄し、再懸濁し、保存した。V.ジスルフィドを用いて
チオール化した微細粒子へのタンパク質の固定化： 実施例18 微細粒子のチオール化においてSPDPを用いた組換えHIV
−1 gp−41誘導体化微細粒子の調製： チオール化微細粒子の調製においてSIABの代わりにSP
DP（ピアス）を用いた他は実質的に実施例６に記載のプ
ロトコールに従って固定化特異的結合成分を調製した。
実施例19 Ｎ−（５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニ
ル）−システイン（ダンシル−システイン）誘導体化微
細粒子への組換えHIV−1 gp−41の共有結合： 1:1のDMSO:5mM 2−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスル
ホン酸（MES、シクマ、セントルイス、MO）（pH5.0）中
のN,N′−ジダンシル−Ｌ−シスチン（シグマ）（10mg/
ml）の溶液（5.0ml）を、アミノ−微細粒子の懸濁液
（5.0ml）に加えた。脱イオン化水（0.5ml）中の１−エ
チル−３−（３−ジメチル−アミドプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩（EDC、ピアス）（5mg）を上記微細粒子懸
濁液に加えた。この混合物を20〜25℃にて２時間、転倒
回転により混合した。脱イオン化水（0.5ml）中のEDC
（5mg）の第二のアリコートを加え、この懸濁液をさら
に２時間回転混和した。この誘導体化微細粒子を遠心分
離にかけ、上清を廃棄した。このペレットをついで0.1M
ジチオスレイトール（15ml）中に再懸濁し、１時間転倒
回転した。この懸濁液を遠心分離にかけ、上清をデカン
トし廃棄した。このチオール化微細粒子を、PBS中の0.1
％ツイーン−20（15ml）中に再懸濁し、遠心分離にか
け、上清を廃棄する工程を４回繰り返して洗浄した。こ
のペレット化微細粒子をついでPBS中に再懸濁して容量
を5.0mlとした。gp41特異的結合成分／カップリング剤
複合体の調製およびチオール化微細粒子への架橋は、実
質的に実施例１（ｂ）および（ｃ）に記載のプロトコー
ルに従って行った。
実施例20 メルカプトエチルアミン誘導体化微細粒子への組換えHI
V−1 gp−41の共有結合： （ａ）メルカプトエチルアミン誘導体化微細粒子の調
製： カルボキシル化微細粒子（0.49μ直径、2.5％固形
分、ポリサイエンシズ）の懸濁液（0.6ml）を10,000×
ｇにて５分間遠心分離にかけた。この上清をアスピレー
トし廃棄した。このペレットを、0.1Mシスタミン（シグ
マ）、5mM MES（pH5.0）（1.0ml）中に再懸濁した。脱
イオン化水中にEDC（2mg）を含有する溶液（0.2ml）を
上記懸濁液に加え、これをついで20〜25℃にて14〜18時
間、転倒回転した。この懸濁液を遠心分離にかけ、上清
を廃棄した。このシスタミン誘導体化微細粒子をつい
で、PBS中の0.1％ツイーン−20（1.0ml）中に再懸濁
し、遠心分離にかけ、上清を廃棄する工程を３回繰り返
すことにより洗浄した。このペレットをついでPBS中の
0.1Mジチオスレイトール（1.0ml）中に再懸濁し、20〜2
5℃にて１時間、転倒回転した。この懸濁液を遠心分離
にかけ、上清を廃棄し、このメルカプトエチルアミン誘
導体化微細粒子を上記のようにして洗浄した。このペレ
ットをついでPBS（0.6ml）中に再懸濁した。
（ｂ）マレイミドベンゾイル活性化HIV−1 gp−41のチ
オール化微細粒子への共有結合： タンパク質を実質的に実施例１（ｂ）に記載のプロト
コールに従って活性化した。このgp41特異的結合成分／
カップリング剤複合体の0.3mlアリコートを、実施例20
（ａ）からのメルカプトエチルアミン誘導体化微細粒子
（0.3ml）に加えた。この懸濁液を撹拌により混合し、
ついで20〜25℃にて14〜18時間、転倒回転した。この懸
濁液を遠心分離にかけ、上清をアスピレートし廃棄し
た。このペレットを10mM 2−メルカプトエタノール（1.
0ml）中に再懸濁し、１時間転倒回転した。この懸濁液
を遠心分離にかけ、上清を廃棄し、このタンパク質コー
ティング微細粒子を、PBS中の0.1％ツイーン−20（1.0m
l）中に再懸濁し、遠心分離にかけ、上清を廃棄する工
程を４回繰り返すことにより洗浄した。この微細粒子を
PBS（1.0ml）中に再懸濁し、４〜８℃にて保存した。
実施例21 Ｌ−システイン−Ｏ−メチルエチル誘導体化微細粒子へ
の組換えHIV−1 gp−41の共有結合： シスタミンの代わりにＬ−シスチンジメチルエステル
二塩酸塩（シグマ）を用いた他は実質的に実施例20に記
載のプロトコールに従って固定化特異的結合成分を調製
した。
本発明の概念を他の多くの特異的結合成分、固相物質
およびカップリング剤の架橋にも同様に適用し得ること
は当業者には容易に理解されるであろう。上記の実施例
は本発明の例示に過ぎず、本発明を限定することを意図
するものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭54−158488（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−12178（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−132172（ＪＰ，Ａ) 米国特許4176006（ＵＳ，Ａ) 米国特許4529712（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/547

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： Ｂ−Ｒ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｒ′−Ｍ （式中、Ｂはアミノ基、カルボキシル基およびチオール
    基よりなる群から選ばれた反応性の基を有する固相、Ｍ
    はアミノ化特異的結合成分、ＲおよびＲ′はヘテロ二官
    能性試薬およびホモ二官能性試薬よりなる群から選ばれ
    たカップリング剤、Ｓ−Ｘ−ＳはチオエーテルによりＲ
    およびＲ′に結合したジチオ化合物である）で示される
    固定化特異的結合成分。
  2. 【請求項２】特異的結合成分が、組換えDNA法またはペ
    プチド合成により調製したものを含む抗原、ハプテン、
    抗体およびそれらの複合体よりなる群から選ばれた免疫
    反応性特異的結合ペアから選ばれた成分である請求項
    （１）に記載の固定化特異的結合成分。
  3. 【請求項３】固相がプラスチック微細粒子であり、特異
    的結合成分が抗原である請求項（２）に記載の固定化特
    異的結合成分。
  4. 【請求項４】カップリング剤がヘテロ二官能性試薬であ
    る請求項（１）に記載の固定化特異的結合成分。
  5. 【請求項５】カップリング剤が、マレイミド−Ｎ−ヒド
    ロキシスクシンイミド活性エステルおよび活性ハロゲン
    −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルよりなる
    群から選ばれたものである請求項（１）に記載の固定化
    特異的結合成分。
  6. 【請求項６】マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
    ド活性エステルが、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
    ドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４
    −（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
    ボキシレート、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド
    フェニル）ブチレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−ス
    ルホスクシンイミドエステルおよびスルホスクシンイミ
    ジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートよりな
    る群から選ばれたものである請求項（５）に記載の固定
    化特異的結合成分。
  7. 【請求項７】マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
    ド活性エステルが、式： −（Xn）−CO−Ｒ− （式中、Ｘは直鎖中炭素数３〜10個を有する置換または
    非置換アミノ酸、ｎは０〜10、Ｒはアルキル基、シクロ
    アルキル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族
    カルボン酸基である）で示されるスペーサーを有するカ
    ップリング剤よりなる群から選ばれたものである請求項
    （５）に記載の固定化特異的結合成分。
  8. 【請求項８】活性ハロゲン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
    ミド活性エステルカップリング剤が、Ｎ−スクシンイミ
    ジルブロモアセテート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨ
    ードアセチル）アミノベンゾエートおよびスルホスクシ
    ンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート
    よりなる群から選ばれたものである請求項（５）に記載
    の固定化特異的結合成分。
  9. 【請求項９】式： Ｂ−Ｒ−Ｓ−Ｘ−SH （式中、Ｂはアミノ基、カルボキシル基およびチオール
    基よりなる群から選ばれた反応性の基を有する固相、Ｒ
    はヘテロ二官能性試薬およびホモ二官能性試薬よりなる
    群から選ばれたカップリング剤、Ｓ−Ｘ−SHはチオエー
    テルによりＲに結合したジチオ化合物である）で示され
    るチオール化固相。
  10. 【請求項１０】カップリング剤がヘテロ二官能性試薬で
    ある請求項（９）に記載のチオール化固相。
  11. 【請求項１１】カップリング剤が、マレイミド−Ｎ−ヒ
    ドロキシスクシンイミド活性エステルおよび活性ハロゲ
    ン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルよりな
    る群から選ばれたものである請求項（９）に記載のチオ
    ール化固相。
  12. 【請求項１２】マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
    ミド活性エステルが、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
    ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル
    ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
    ルボキシレート、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミ
    ドフェニル）ブチレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−
    スルホスクシンイミドエステルおよびスルホスクシンイ
    ミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートより
    なる群から選ばれたものである請求項（11）に記載のチ
    オール化固相。
  13. 【請求項１３】マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
    ミド活性エステルが、式： −（Xn）−CO−Ｒ− （式中、Ｘは直鎖中炭素数３〜10個を有する置換または
    非置換アミノ酸、ｎは０〜10、Ｒはアルキル基、シクロ
    アルキル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族
    カルボン酸基である）で示されるスペーサーを有するカ
    ップリング剤よりなる群から選ばれたものである請求項
    （11）に記載のチオール化固相。
  14. 【請求項１４】活性ハロゲン−Ｎ−ヒドロキシスクシン
    イミド活性エステルカップリング剤が、Ｎ−スクシンイ
    ミジルブロモアセテート、Ｎ−スクシンイミジル（４−
    ヨードアセチル）アミノベンゾエートおよびスルホスク
    シンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエー
    トよりなる群から選ばれたものである請求項（11）に記
    載のチオール化固相。
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