JPH06186232A

JPH06186232A - 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット

Info

Publication number: JPH06186232A
Application number: JP8272392A
Authority: JP
Inventors: Makoto Kunichika; 誠國近
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 1992-03-03
Filing date: 1992-03-03
Publication date: 1994-07-08
Anticipated expiration: 2011-06-26
Also published as: JP2509840B2

Abstract

(57)【要約】【目的】より高感度で、正確な測定が可能な免疫測定
法を提供する。【構成】測定しようとする物質に、１重鎖のＤＮＡも
しくはＲＮＡを結合した水不溶性坦体、この１重鎖遺伝
子に対して相補的な塩基配列を持つ１重鎖のＤＮＡもし
くはＲＮＡと、測定物質に対する結合性物質の複合体、
及び結合性物質に標識剤を結合させた物質を反応させて
生成する免疫複合体中の標識剤の量を測定する免疫測定
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定法および免疫
測定用試薬キットに関する。更に詳しくは、ヘテロジニ
アスな免疫測定法および免疫測定用試薬キットに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、ヘテロジニアスな免疫測定法にお
いては、サンドイッチ法を例にして述べると次のような
方法が行われている。測定しようとする物質（以下「測定物質」という。）
に、「測定物質」に対する抗体あるいは抗原を直接水不
溶性坦体に結合したもの、及び標識された、「測定物
質」に対する抗体もしくは抗原を反応させて免疫複合体
を生成する方法を用いていた。さらに「測定物質」
に、抗Ｆｃ抗体を水不溶性坦体に結合した物、Ｆｃ部分
を有する、「測定物質」に対する抗体、及び標識され、
かつＦｃ部分を持たない、「測定物質」に対する抗体を
反応させて免疫複合体を生成する方法（特開昭５９−４
３３６０号公報など）；「測定物質」に、抗ハプテン
抗体を水不溶性坦体に結合した物、ハプテンと「測定物
質」に対する抗体との結合体、及び標識された、「測定
物質」に対する抗体を反応させて免疫複合体を生成する
方法（特開昭５９−２３２５１号公報など）；「測定
物質」に、アビジンを水不溶性坦体に結合した物、ビオ
チンを結合した、測定物質に対する抗体、及び標識され
た、測定物質に対する抗体を反応させて免疫複合体を生
成する方法（特開昭５９−２２４５６２号公報など）な
どが知られている。上記何れの方法も、標識される物質
を、「測定物質」と同じ免疫反応特性を有する物質とす
ることで、免疫競合法として使用される。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】近年、免疫測定法にお
いては、更に測定感度を向上させる要求が高まっている
が、上記の方法では、水不溶性坦体に結合する抗体量
を増すことは難しく、より高感度な測定法を実現できな
い。また、「測定物質」と抗体の反応が、液相と固相の
反応となるため、反応速度の点で不利である。また、上
記の方法では、血清検体中に存在する抗体の影響を受
け、正確な測定ができない場合がある。また、標識され
る抗体のＦｃ部分を完全に除去しなければならないとい
う技術的な問題もある。更にの方法と同様に水不溶性
坦体に結合した抗体量により性能が規制されてしまう。
上記の方法では、ハプテン結合抗体の非特異的な吸着
が大きく、測定感度が大きく向上しない。また、力価の
高い抗ハプテン抗体を得ることは難しいという問題もあ
る。更にの方法と同様に水不溶性坦体に結合した抗体
量により性能が規制されてしまう。上記の方法は、免
疫複合体中の標識量が多くなる点で有利であるが、血清
検体に含まれる干渉物質の影響をうけ、正確な測定値と
ならない場合がある。また、非特異的な吸着も比較的大
きく、測定感度は余り向上しない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果、塩基配列が相補的な関
係にある２種類の核酸を用い、１種類は水不溶性坦体に
結合させる方法を応用した免疫測定法を用いれば従来よ
り測定感度が向上することを見いだし、本発明に到達し
た。すなわち本発明は、下記の測定法およびの測定
用試薬キットにより構成される。測定しようとする物質（以下「測定物質」という。）
に、下記「固定化第１核酸」、下記「第２核酸結合物
質」及び下記「標識結合物質」を反応させて生成する免
疫複合体（Ａ）中あるいは未反応の「標識結合物質」中
の標識量を測定することを特徴とする免疫測定法。固定化第１核酸：１重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ（以下
「第１核酸」という。）と水不溶性坦体との結合体。第２核酸結合物質：「測定物質」と特異的な結合性を有
する物質（以下「結合性物質」という。）と、「第１核
酸」と相補的な塩基配列を有する、１重鎖のＤＮＡもし
くはＲＮＡ（以下「第２核酸」という。）との結合体。標識結合物質：「結合性物質」、あるいは「測定物質」
と同じ免疫反応特性を有する物質に、標識剤を結合させ
た物質。上記項記載の「固定化第１核酸」、「第２核酸結合
物質」および「標識結合物質」を構成品として含む免疫
測定用試薬キット。

【０００５】本発明の方法を用いることができる「測定
物質」としては、免疫測定法が利用できる物であればよ
く、特に限定は無い。例えば、ハプテン（ジゴキシン、
サイロキシン、トリヨードサイロニン、コルチゾールな
ど）、ホルモン（甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモ
ン、インスリン、成長ホルモンなど）、血清タンパク質
（免疫グロブリン、Ｃ−反応性蛋白など）、腫瘍関連抗
原（α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、胎児性フェ
リチンなど）、およびウイルスならびにウイルス関連抗
原（風疹ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＢｓ抗原、Ｈ
Ｂｃ抗原など）があげられる。

【０００６】「固定化第１核酸」における該水不溶性坦
体としては、従来蛋白質やＤＮＡの不溶化に用いられて
いる水不溶性坦体が使用できる。例えば、ケイ酸無機坦
体（ガラス、シリカゲルなど）、および有機坦体（プラ
スチック、ニトロセルロース、ナイロン、デキストラン
など）があげられる。この坦体は、表面にアミノ基、チ
オール基、カルボキシル基、アルデヒド基、活性エステ
ル基などの官能基をもつものが、「第１核酸」と結合さ
せ易いためより好ましい。また、その形状は、粒子状、
シート状、チューブ状などいずれの形もとりうるが、よ
り好ましい例としては、粒径０．１〜５０μｍ程度の微
粒子状である。

【０００７】ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、デオキシ
リボヌクレオチド単位から構成され、ＲＮＡ（リボ核
酸）は、リボヌクレオチド単位から構成される。１重鎖
のＤＮＡもしくはＲＮＡは、２本で結合し２重鎖を形成
する（「ハイブリダイズ」と表現される）ことができ
る。その場合、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌ
クレオチドの配列（以下、塩基配列という。）が、相補
的に対応した配列である必要がある。即ち、ハイブリダ
イズするためには、リボヌクレオチドまたはデオキシリ
ボヌクレオチドの有する塩基部分［アデニン（Ａ）、グ
アニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシ
ル（Ｕ）］が相補的に、ＡとＴまたはＵ、ＧとＣのよう
に対応結合する、塩基配列を、互いに持つ核酸で有るこ
とが必要である。

【０００８】本発明において用いられる、「第１核酸」
と「第２核酸」は、共に１重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ
であり、塩基配列が相補的な関係にある。従って、「第
１核酸」と「第２核酸」は、ハイブリダイズすることが
可能である。「第１核酸」と「第２核酸」は、塩基配列
が相補的な関係であればどの様な１重鎖のＤＮＡもしく
はＲＮＡも用いることが可能であるが、分子内でループ
構造の形成しない塩基配列が良い。好ましい例として
は、「第１核酸」を構成するリボヌクレオチドまたはデ
オキシリボヌクレオチドの単位の種類が、１種類である
配列があげられる。この単位としては、アデニル酸、ウ
リジル酸、グアニル酸、シチジル酸、デオキシチミジル
酸、デオキシアデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキ
シシチジル酸があげられ、従って、これらから１種類が
選ばれたものが好ましい。なお、「第２核酸」の塩基配
列は、「第１核酸」の塩基配列に対応して相補的に決ま
る。また、「第１核酸」が、１種類のヌクレオチド単位
から構成された核酸の場合、「第２核酸」は、「第１核
酸」の任意の部分で対応結合できるというメリットがあ
る。

【０００９】「第１核酸」、「第２核酸」を各々構成す
るデオキシリボヌクレオチド単位もしくはリボヌクレオ
チド単位の個数は、１０から１０,０００の範囲が良
い。１０より少ないと、ハイブリダイズの結合力が低
く、１０,０００を越えると、分子量が大きすぎるた
め、相互の反応性が低下する。

【００１０】また、「第２核酸」は「第１核酸」の１部
分のみに対応する１重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡでも良
い、すなわち「第１核酸」より短い核酸を使用すること
ができる。この場合、１分子の「第１核酸」に複数の
「第２核酸」が結合することができる利点がある。特
に、「第１核酸」が、１種類のヌクレオチド単位から構
成された核酸である場合、短い「第２核酸」は、「第１
核酸」の任意の部分に対応結合でき、より多くの分子が
結合できる。即ち、「固定化第１核酸」上に「第２核酸
結合物質」を多く結合した形で用いることができるた
め、測定感度を向上することになる。

【００１１】「第１核酸」及び「第２核酸」は、いずれ
も従来既知の方法で合成あるいは生体より抽出して使用
できる。好ましいものは、合成法により作成された核酸
で、その末端にアミノ基などの官能基が導入されたもの
である。導入された官能基は、「水不溶性坦体」および
「結合性物質」との結合に便利である。

【００１２】「固定化第１核酸」は、従来既知の方法で
作成することができる。例えば、ニトロセルロースフィ
ルターに１重鎖ＤＮＡを物理吸着する方法、水不溶性坦
体の表面の官能基と「第１核酸」の末端に導入されたア
ミノ基などの官能基とを共有結合する方法などがある。
結合の後、坦体の表面及び表面の未反応官能基を適当な
タンパク質、核酸、界面活性剤などで、ブロッキングす
ることも通常行われる。

【００１３】「結合性物質」としては、「測定物質」に
対し特異的な結合性を有するものであり、抗体、抗原、
レクチン、プロテインＡなどがあげられるが、「測定物
質」に対応できる範囲で自由に選択することが可能であ
る。さらに「第２核酸結合物質」と「標識結合物質」に
用いられる、「結合性物質」は、必ずしもおなじ物質で
ある必要はない。「結合性物質」の好ましい例として
は、「測定物質」に対するモノクローナル抗体があげら
れる。この場合、「第２核酸結合物質」と「標識結合物
質」に各々用いられるモノクローナル抗体は、「測定物
質」に対する認識部位が各々異なる抗体であればさらに
良い。

【００１４】「測定物質」と同じ免疫反応特性を有する
物質として、「測定物質」と同一の物質、「測定物質」
の断片で、「測定物質」の免疫反応特性を有するもの、
「測定物質」と「結合性物質」との反応に関与しない物
質と、「測定物質」との複合体などがあげられる。

【００１５】「第２核酸結合物質」である、「結合性物
質」あるいは「測定物質」と同じ免疫反応特性を有する
物質」と、「第２核酸」の結合体は、従来知られている
蛋白分子の架橋結合法を使用して作成できる。例えば、
「結合性物質」にチオール基を導入し、「第２核酸」の
末端に導入されたアミノ基との間を２架橋性試薬で結合
することにより、「第２核酸結合物質」を得ることがで
きる。

【００１６】「標識結合物質」に用いられる標識する物
質（標識剤）としては、例えば、アイソトープ、酵素、
蛍光体および発光体があげられる。これらはいずれも公
知のものを使用することができる。例えば、アイソトー
プとしては、¹²⁵Ｉなど、酵素としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼなど、蛍光体としてはユーロピウム誘導体な
ど、発光体としては、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体な
どがあげられる。

【００１７】「標識結合物質」が、「結合性物質」と標
識剤を結合させた物質である場合、本発明の方法は、サ
ンドイッチ免疫測定法の原理にもとづく方法である。ま
た、「標識結合物質」が、「測定物質」と同じ免疫反応
特性を有する物質と標識剤を結合させた物質である場
合、本発明の方法は、競合免疫測定にもとづく方法であ
る。

【００１８】「標識結合物質」は、上記の何れのタイプ
の場合も従来公知の標識方法で作成することができる。
例えば、酵素により標識する方法としては過ヨウ素酸酸
化法（ナカネ等、ジェー．ヒストケム．サイトケム．，
２２；１０８４，１９７４）があげられる。蛍光体によ
り標識する方法としては、アイ．ヘミラ，エス．ダブ
ク，エトール．；アナル．バイオケム．，１３７：３３
５，１９８４に記載の方法などがあげられる。発光体に
より標識する方法としては、エイ．ウッドヘッド，ア
イ．ウイークス；クリン．ケム．，２９：１４８０，１
９８３に記載の方法などがあげられる。

【００１９】本発明の方法では、「測定物質」と、「第
２核酸結合性物質」および「標識結合性物質」を液相で
個別に或は同時に反応することが可能である。従って、
本発明の方法は、固相と液相の反応である従来の方法よ
り反応速度が速く、短時間に高感度な測定が可能とな
る。また、「第１核酸」と「第２核酸」が形成するハイ
ブリダイズは、検体中の物質に干渉されることが少ない
ので、ブランクが低くより正確な測定が期待できるとと
もに、異常な測定値を示さない。

【００２０】
反応の順序としては、種々の順がとりう
るが、好ましい例としては、「測定物質」に「第２核
酸結合物質」及び「標識結合物質」を逐次あるいは同時
に反応させた後、更に「固定化第１核酸」と反応させる
ことにより該免疫複合体（Ａ）を得る；「測定物質」
に「第２核酸結合物質」及び「固定化第１核酸」を逐次
あるいは同時に反応させた後、更に「標識結合物質」を
反応させることにより該免疫複合体（Ａ）を得る；
「測定物質」に、「固定化第１核酸」と「第２核酸結合
物質」を反応させた複合体、及び「標識結合物質」を逐
次あるいは同時に反応させることにより該免疫複合体
（Ａ）を得る；「測定物質」に「固定化第１核酸」、
「第２核酸結合物質」及び「標識結合物質」を同時に反
応させることにより該免疫複合体（Ａ）を得る；などが
ある。各反応に用いる成分の投入順序、未反応物の除去
などは、適宜行うことができる。

【００２１】各反応を行う温度、各反応を行う溶液の組
成、ｐＨなどは、通常免疫測定および核酸のハイブリダ
イゼイションで行われる条件で可能である。例えば、温
度としては、５〜６０℃、ｐＨとしては５〜９が好まし
く、反応を行う溶液は、適当な緩衝液に塩類、タンパク
質、界面活性剤などを必要により添加した物が好まし
い。

【００２２】反応の結果、生成する免疫複合体（Ａ）中
に、「測定物質」の量に応じて標識剤が存在することに
なる。未反応物を除去した後、該免疫複合体中の標識剤
の量を測定すること、または未反応物中の標識剤の量を
測定することで、「測定物質」の量を決定することが可
能である。標識剤の量の測定は、標識剤の種類に応じ
て、種々の方法をとりうるが、当業者により自由に選択
できるものである。測定された標識量を、既知量の「測
定物質」を測定した場合の標識量と比較することによ
り、検体中の「測定物質」の量を決定できる。

【００２３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。

【００２４】実施例１この実施例は、本発明によるα−フェトプロテイン（Ａ
ＦＰ）の測定を、長さの異なる合成ＤＮＡを用いて行っ
たものである。

【００２５】１）ポリデオキシアデニル酸の合成自動ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズジャパ
ン（株）製、モデル３９２）を用いて、装置添付の使用
法にもとづき、ヌクレオチド数１０、５０、１００のポ
リデオキシアデニル酸を各々合成し、更に５´末端にア
ミノヘキシルリンカー［アプライドバイオシステムズジ
ャパン（株）製、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ２］によりアミノ
基を導入した。合成した各々の鎖長のアミノ基導入ポリ
デオキシアデニル酸は、カラムで精製した後、蒸留水に
溶解し次の操作に用いた。

【００２６】２）ポリデオキシアデニル酸結合微粒子の
作成表面に活性エステル基を有するコポリマー粒子［国産化
学（株）製、ＡＳＵコポリマー；平均粒子径１μｍ］１
０ｍｇを２ｍｌのリン酸緩衝液（０．０２モル、ｐＨ
７．２）で２回洗浄遠心し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液
に懸濁した。上記１）で作成した各々の鎖長のアミノ基
導入ポリデオキシアデニル酸溶液（核酸量１ｍｇ）を微
粒子懸濁液に加え、室温で８時間反応した。０．１％牛
血清アルブミン含有リン酸緩衝液で２回洗浄したのち、
０．１％牛血清アルブミン、１ｍＭＥＤＴＡ含有トリス
塩酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、使用するまで４℃で保存し
た。

【００２７】３）ポリチミジル酸結合抗ＡＦＰ抗体の作
成ヌクレオチド数１０、５０、１００のアミノ基導入ポリ
チミジル酸を各々１）と同様に合成した。抗ＡＦＰ免疫
グロブリン抗体（ダコ社製）から、イー．イシカワ，エ
ム．イマガワ，エトール．，ジェー．イムノアッセイ，
４；２０９，１９８３に記載の方法でＦａｂ´抗体を作
成した。各々の鎖長のアミノ基導入ポリチミジル酸溶液
（核酸量１ｍｇ）とＦａｂ´抗体（１０ｍｇ）をリン酸
緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０、１ｍＭＥＤＴＡ含
有）２ｍｌ中で混合融解し、１０μｌのジメチルホルム
アミドに溶解した２架橋性試薬Ｎ−（γ−マレイミドブ
チリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ；同仁化学
製）０．２ｍｇを添加し、３０℃で２時間反応した。リ
ン酸緩衝液で透析し、未反応ＧＭＢＳを除去し、ポリチ
ミジル酸結合抗ＡＦＰ抗体とした。４℃で保存し、使用
時、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で希釈
して用いた。

【００２８】４）ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体の
作成抗ＡＦＰ免疫グロブリン抗体（ダコ社製）を、エス．ヨ
シタケ，エム．イマガワ，イー．イシカワ，エトー
ル．，ジェー．バイオケム．，９２；１４１３，１９８
２記載の方法で、ペルオキシダーゼＩ−Ｃ（東洋紡
（株）製）と結合した。この試薬は、１％ウシ血清アル
ブミン含有燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈して使用し
た。

【００２９】５）測定操作血清検体５０μｌと希釈した各々のポリチミジル酸結合
抗ＡＦＰ抗体５０μｌ及び各鎖長のポリデオキシアデニ
ル酸結合微粒子懸濁液５μｌを試験管中で３７℃、１５
分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心し
た。上清をすて、希釈したペルオキシダーゼ標識抗ＡＦ
Ｐ抗体溶液１００μｌを加え、粒子を再懸濁し３７℃、
１５分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠
心した。上清をすて、基質液（過酸化水素含有ο−フェ
ニレンジアミン溶液）０．５ｍｌをくわえ粒子を再懸濁
し３７℃、１５分反応した。遠心し上清の吸光度を４９
２ｎｍで測定した。既知濃度のＡＦＰを含む標準溶液を
同様に測定し作成した検量線から、検体中のＡＦＰ濃度
を読み取った。標準溶液は市販ＡＦＰ測定キット「グラ
ザイムＡＦＰ−ＥＩＡＴＥＳＴ」（和光純薬より発
売）のものを使用した。

【００３０】６）測定結果ヌクレオチド数の異なる、ポリデオキシアデニル酸結合
微粒子とポリチミジル酸結合抗ＡＦＰ抗体を各々組み合
わせて標準ＡＦＰを測定した結果を下記表１に示した。
固相のヌクレオチド数が少ない場合やや感度の低下が認
められる。固相のヌクレオチド数に対して抗体側のヌク
レオチド数が少ない場合、感度の上昇が認められる。

【００３１】

【表１】

【００３２】正常人及び肝癌患者の血清検体をヌクレオ
チド数５０の組合せで測定した結果を下記表２に示し
た。

【００３３】

【表２】

【００３４】実施例２この実施例は、生体より分離した遺伝子を利用した本発
明によるフェリチン測定の例である。

【００３５】１）ファージＤＮＡの精製Ｍ１３クローニングキット（東洋紡社製）を用い、キッ
ト添付の説明書にしたがい、ファージＤＮＡを精製し
た。菌体からは、２重鎖ＤＮＡが分離でき、培養上清か
らは、１重鎖ＤＮＡがえられた。Ｍ１３ファージは約
７,０００のヌクレオチド（７Ｋｂ）より構成されてい
る。

【００３６】２）ファージＤＮＡ結合フィルターの作成Ｍ１３ファージの２重鎖ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
（東洋紡社製）で切断し、直鎖ＤＮＡとした後、アルカ
リ処理をおこない１重鎖ＤＮＡとした。ナイロンメンブ
レンフィルター（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ；ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ社製）に１重鎖ＤＮＡ溶
液を塗布したのち、紫外線を照射してフィルターにＤＮ
Ａを固定した。０．１％ＢＳＡ含有トリス塩酸緩衝液中
で４℃で使用まで保存した。

【００３７】３）１重鎖ＤＮＡ結合抗フェリチン抗体の作成１）で調製した１重鎖ＤＮＡを機械的に攪拌した後、シ
ョ糖密度勾配遠心法により、１Ｋｂ、４Ｋｂ、７Ｋｂの
長さの画分をえた。この各１重鎖ＤＮＡ１０μｇを１ｍ
ｌのリン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０）に溶解し
た液に、５μｇの２−イミノチオラン塩酸塩を添加し３
７℃、３０分反応し、チオール基を導入した。３倍量の
エタノールを加えＤＮＡを沈澱して回収し、再度１ｍＭ
のＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液に溶解し、チオール基導入
１重鎖ＤＮＡ溶液とした。

【００３８】抗フェリチン抗体（ダコ社製）１ｍｇを含
むリン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６．０）１ｍｌに、
ヂメチルホルムアミドで溶解したＧＭＢＳ０．５ｍｇを
添加し３０℃、９０分反応した。リン酸緩衝液に対して
透析し未反応ＧＭＢＳを除去したのち、チオール基導入
１重鎖ＤＮＡ溶液と混合し８時間反応し、１重鎖ＤＮＡ
結合抗フェリチン抗体溶液とした。

【００３９】４）ペルオキシダーゼ標識抗フェリチン抗体の作成抗フェリチン抗体（ダコ社製）を用い、実施例１の４）
に記載の方法により、ペルオキシダーゼ標識抗フェリチ
ン抗体を作成した。

【００４０】５）測定操作ファージＤＮＡ結合フィルターを直径８ｍｍの円形に切
抜いた。標準フェリチン溶液５０μｌと希釈した１重鎖
ＤＮＡ結合抗フェリチン抗体５０μｌ及び切り抜いたフ
ィルター１枚を試験管中で３７℃、３０分反応した後、
蒸留水２ｍｌでフィルターを３回洗浄した。上清をす
て、希釈したペルオキシダーゼ標識抗フェリチン抗体溶
液１００μｌを加え、３７℃、３０分反応した後、蒸留
水２ｍｌでフィルターを３回洗浄した。上清をすて、基
質液（過酸化水素含有ο−フェニレンジアミン溶液）
０．５ｍｌをくわえ３７℃、３０分反応した。上清の吸
光度を４９２ｎｍで測定した。標準溶液は市販フェリチ
ン測定キット「グラオザイムフェリチン」（和光純薬
より発売）のものを使用した。

【００４１】６）測定結果測定結果を下記表３に示した。１重鎖ＤＮＡ結合抗フェ
リチン抗体のＤＮＡ鎖長が長くなると反応性がやや低下
していることが判る。

【００４２】

【表３】

【００４３】比較例１この比較例は、従来行われている方法での測定を示した
ものである。

【００４４】１）アビジン結合微粒子の作成実施例１の２）記載の微粒子１０ｍｇにアビジン（シグ
マ社製）１ｍｇを実施例１の２）に記載の方法で結合し
た。

【００４５】２）ビオチン化抗ＡＦＰ抗体の作成抗ＡＦＰ抗体（ダコ社製）１ｍｇを含むリン酸緩衝液１
ｍｌに、ＮＨＳ−ビオチン（Ｎ−Ｈｙｄｏｒｏｘｙｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｏ−ｂｉｏｔｉｎ；ＰＩＥＲＣＥ社
製）０．５ｍｇを溶解したジメチルホルムアミド２０μ
ｌを添加し、３７℃、９０分反応した。ゲル濾過により
未反応物を除去し、抗体画分を得、ビオチン化抗体とし
た。１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液で希釈し用いた。

【００４６】３）測定操作血清検体５０μｌと希釈したビオチン化抗ＡＦＰ抗体５
０μｌ及びアビジン結合微粒子懸濁液５μｌを試験管中
で３７℃、１５分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を
３回洗浄遠心した。上清をすて、希釈したペルオキシダ
ーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液１００μｌを加え、粒子を再
懸濁し３７℃、１５分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒
子を３回洗浄遠心した。上清をすて、基質液（過酸化水
素含有ο−フェニレンジアミン溶液）０．５ｍｌをくわ
え粒子を再懸濁し３７℃、１５分反応した。遠心し上清
の吸光度を４９２ｎｍで測定した。既知濃度のＡＦＰを
含む標準溶液を同様に測定し作成した検量線から、検体
中のＡＦＰ濃度を読み取った。

【００４７】４）測定結果実施例１と同じ、標準溶液、正常人及び肝癌患者の血清
検体の測定結果を前記表２に示した。実施例１よりバッ
クグラウンド（標準０濃度の吸光度）が高く、測定吸光
度も低いため測定感度が劣ってる。従って、正常人血清
の測定値が不正確である。また、正常人血清であるにも
かかわらず異常に高値を示したり、患者血清でも低値を
示す検体があり臨床的に問題のある結果となった。

【００４８】実施例３本実施例は、本発明における各試薬の反応順を変えて測
定した場合について比較したものである。

【００４９】１）用いた試薬実施例１で作成したポリデオキシアデニル酸結合微粒子
およびポリチミジル酸結合抗ＡＦＰ抗体のうち、ヌクレ
オチド数５０の鎖長の物を用いた。ペルオキシダーゼ標
識抗体及び基質液は、同じものを用いた。

【００５０】２）測定操作Ａ標準ＡＦＰ溶液５０μｌと希釈したポリチミジル酸結合
抗ＡＦＰ抗体５０μｌ及びポリデオキシアデニル酸結合
微粒子懸濁液５μｌを試験管中で３７℃、１５分反応し
た後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清
をすて、希釈したペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶
液１００μｌを加え、粒子を再懸濁し３７℃、１５分反
応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。
上清をすて、基質液（過酸化水素含有ο−フェニレンジ
アミン溶液）０．５ｍｌをくわえ粒子を再懸濁し３７
℃、１５分反応した。遠心し上清の吸光度を４９２ｎｍ
で測定した。

【００５１】３）測定操作Ｂ標準ＡＦＰ溶液５０μｌと希釈したポリチミジル酸結合
抗ＡＦＰ抗体５０μｌ及び希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ＡＦＰ抗体溶液５０μｌを試験管中で３７℃、１５
分反応した後、更にポリデオキシアデニル酸結合微粒子
懸濁液５μｌを加え、３７℃、１５分反応した。反応の
後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清を
すて、基質液（過酸化水素含有ο−フェニレンジアミン
溶液）０．５ｍｌをくわえ粒子を再懸濁し３７℃、１５
分反応した。遠心し上清の吸光度を４９２ｎｍで測定し
た。

【００５２】４）測定操作Ｃポリデオキシアデニル酸結合微粒子懸濁液５μｌとポリ
チミジル酸結合抗ＡＦＰ抗体５０μｌを試験管中で３７
℃、１５分反応した後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗
浄遠心した。上清を除去し、１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝
液５０μｌ及び標準ＡＦＰ溶液５０μｌを加え３７℃、
１５分反応した後、更に希釈したペルオキシダーゼ標識
抗ＡＦＰ抗体溶液５０μｌをくわえ３７℃、１５分反応
した。反応後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心し
た。上清をすて、基質液（過酸化水素含有ο−フェニレ
ンジアミン溶液）０．５ｍｌをくわえ粒子を再懸濁し３
７℃、１５分反応した。遠心し上清の吸光度を４９２ｎ
ｍで測定した。

【００５３】５）測定結果結果を下記表４に示した。何れの反応順でも測定が可能
であった。

【００５４】

【表４】

【００５５】実施例４本実施例は、本発明によるサイロキシン（Ｔ４）の競合
免疫測定法の例である。

【００５６】１）ポリチミジル酸結合抗サイロキシン
（Ｔ４）抗体の作成抗Ｔ４抗体（ダコ社製）を用いて実施例１の３）に記載
の方法で、ポリチミジル酸結合抗Ｔ４抗体を作成した。

【００５７】２）酵素標識Ｔ４の作成ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）１０ｍｇをリン酸緩衝
液（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）２ｍｌに溶解し、これに
１．５％グルタルアルデヒド水溶液２００μｌを加え、
室温で２０時間反応させた。反応後、反応液をリン酸緩
衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）に対して透析し、未反
応物を除去し活性化ペルオキシダーゼをえた。

【００５８】Ｔ４（カルバイオケミストリー社製）１ｍ
ｇにジメチルホルムアミド１ｍｌを加え、溶解した。こ
の溶解液１ｍｌを先の活性化ペルオキシダーゼ溶液に加
え、室温で１２時間反応した。反応後、反応混合物をゲ
ル濾過カラムに通し、酵素活性および免疫活性を示す画
分を集め、酵素標識Ｔ４とした。

【００５９】３）測定方法標準Ｔ４溶液（Ｔ４をＴ４フリー血清に溶解したもの）
５０μｌと希釈した５０μｌの酵素標識Ｔ４および希釈
したポリチミジル酸結合抗Ｔ４抗体溶液５０μｌを試験
管内で３７℃、１５分反応した。反応後、ポリデオキシ
アデニル酸結合微粒子（実施例１に記載した物と同じ）
懸濁液５μｌを加え更に３７℃、１５分反応した。反応
の後、蒸留水２ｍｌで微粒子を３回洗浄遠心した。上清
をすて、基質液（過酸化水素含有ο−フェニレンジアミ
ン溶液）０．５ｍｌをくわえ粒子を再懸濁し３７℃、１
５分反応した。遠心し上清の吸光度を４９２ｎｍで測定
した。

【００６０】４）測定結果図１に本実施例による、Ｔ４測定の検量線を示した。

【００６１】

【発明の効果】本発明は、塩基配列が相補的な関係にあ
る２種類の核酸を用い、１種類は水不溶性坦体に結合さ
せる方法を応用した免疫測定法を用いることで、より高
感度で、より正確な測定を可能とする免疫測定法および
免疫測定用キットを提供できることを示したものであ
る。すなわち、塩基配列が相補的な関係にある２種類の
核酸を用い、１種類は水不溶性坦体に結合させる方法を
応用した免疫測定法を用いることで次のような効果があ
る。水不溶性坦体に結合する免疫複合体の量を増やすこと
が可能であり、そのため高感度な測定が可能となる。特
に、「第１核酸」の鎖長より短い鎖長の「第２核酸」を
用いた場合、著しく測定感度が向上する。従来の方法に比べて、測定のブランクが低いため、低
値の測定値の正確性が高い。検体中の、干渉物質の影響を受けることが少なく、誤
った測定値を示すことが無い。「測定物質」と、「第２核酸結合物質」及び「標識結
合物質」を液相で反応することができるため、短時間で
高感度な測定ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４において、標準Ｔ４溶液を測定したと
きの検量線である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定しようとする物質（以下「測定物
質」という。）に、下記「固定化第１核酸」、下記「第
２核酸結合物質」及び下記「標識結合物質」を反応させ
て生成する免疫複合体（Ａ）中あるいは未反応の「標識
結合物質」中の標識量を測定することを特徴とする免疫
測定法。固定化第１核酸：１重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ（以下
「第１核酸」という。）と水不溶性坦体との結合体。第２核酸結合物質：「測定物質」と特異的な結合性を有
する物質（以下「結合性物質」という。）と、「第１核
酸」と相補的な塩基配列を有する、１重鎖のＤＮＡもし
くはＲＮＡ（以下「第２核酸」という。）との結合体。標識結合物質：「結合性物質」、あるいは「測定物質」
と同じ免疫反応特性を有する物質に、標識剤を結合させ
た物質。
【請求項２】「第１核酸」を構成するすべてのリボヌ
クレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドから選ば
れる単位の種類数が、１種類である請求項１記載の方
法。
【請求項３】「結合性物質」が、「測定物質」に対す
る、抗体または抗原である請求項１または２記載の方
法。
【請求項４】「第１核酸」及び「第２核酸」を各々構
成するリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオ
チドから選ばれる単位の個数が１０〜１０,０００であ
る請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】該免疫複合体（Ａ）が、「測定物質」に
「第２核酸結合物質」及び「標識結合物質」を反応させ
て生成する複合体に、更に「固定化第１核酸」を反応さ
せて生成する複合体である請求項１〜４のいずれか記載
の方法。
【請求項６】該免疫複合体（Ａ）が、「測定物質」に
「第２核酸結合物質」及び「固定化第１核酸」を反応さ
せて生成する複合体に、更に「標識結合物質」を反応さ
せて生成する複合体である請求項１〜４のいずれか記載
の方法。
【請求項７】該免疫複合体（Ａ）が、「測定物質」
に、「固定化第１核酸」と「第２核酸結合物質」を反応
させて生成する複合体、及び「標識結合物質」を反応さ
せて生成する複合体である請求項１〜４のいずれか記載
の方法。
【請求項８】請求項１〜４のいずれか記載の、「固定
化第１核酸」、「第２核酸結合物質」および「標識結合
物質」を構成品として含む免疫測定用試薬キット。