JPH04286957A - 遺伝子検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の目的］

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、試料中に存在する、
特定の塩基配列を有する遺伝子を特異的に検出するため
の遺伝子検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子（ＤＮＡ）にコ−ドされた遺伝情
報はメッセンジャ−ＲＮＡを介して酵素等のタンパク質
として表現され、これらのタンパク質の働きにより生成
した様々な化合物の集合体として生物が存在する。この
ような遺伝子の総数はヒトで　５〜１０万といわれてい
るが、その中に何らかの異常や変化（例えば、欠損、重
複等）が生じることがある。その場合には、生成するタ
ンパク質の特性、種類、量などが変化し、その結果、生
体系のバランスが崩れて疾病を引き起こす。したがって
、逆に、病因となっている遺伝子を検出することにより
、疾病の同定や予防が可能となる。近年の遺伝子工学の
進歩に伴い、このような遺伝子そのものに基づく診断（
遺伝子診断と呼ばれている）が可能になってきた。

【０００３】従来の診断法と比較して遺伝子診断にはい
くつかの特色がある。まず、遺伝子発現の機構を考える
と、生化学的レベルでのほとんどの変化に先行して遺伝
子上での変化が生じていることが推定される。したがっ
て、遺伝子診断により、病気という表現型での変化に先
立つ（すなわち、発症前や病気の潜伏期あるいは極めて
初期の）診断や予測が可能となる。また、生体内の細胞
の遺伝子は全て同一であるので、遺伝性の疾患に関して
は分析の対象となる臓器や組織は特定されない。特に、
胎児に関しては、妊婦から羊水を採取して羊水中に浮遊
している胎児の細胞を調べるだけで診断することができ
、非常に重要な診断方法である。一般に、遺伝子の検出
は次のように行なわれる。

【０００４】まず、試料から遺伝子を抽出し、必要があ
れば適当な制限酵素で切断する。次に、この遺伝子を電
気泳動にかけ、その後サザンブロットを行なう。次いで
、目的とする遺伝子に対応する遺伝子プロ−ブ（通常は
、放射性同位元素で標識されている）をハイブリダイズ
させた後、低温でオ−トラジオグラフィ−にかけてＸ線
フィルム上で目的とする遺伝子の有無を確認する。

【０００５】このような方法では、通常、プロ−ブの標
識は放射性同位元素を用いて行われている。しかし、放
射性同位元素を用いた場合には検出場所が限定され、試
薬の取扱いにも十分な注意を必要とする。このため、放
射性同位元素に代わる安全な標識剤の開発が試みられて
おり、既に、アビジン−　ビオチン結合を利用するもの
、酵素や蛍光物質を利用するものなどが開発されている
。 しかしながら、これらの方法は、いずれも感度の点で放
射性同位体を凌駕するまでには至っていない。また、遺
伝子の検出までに少なくとも　２〜３　日を要し、測定
操作もかなり複雑である。

【０００６】一方、試料中に存在する特定の抗原または
抗体の定量分析には、一般にラジオイムノアッセイ（以
下、ＲＩＡと略記する）が用いられている。しかしなが
ら、ＲＩＡでは前記の遺伝子診断方法と同様に放射性同
位体を用いるため、専用の機器を設置し、その操作も資
格を有するオペレ−タが行なわなければならない。これ
に加えて廃棄物の処理等にも注意を必要とする。また、
その他の分析方法として、例えば免疫電気泳動法が知ら
れているが、この方法は測定に長時間を要するうえ感度
が低く、被検物質がごく微量にしか含まれていない場合
には適用することができない。

【０００７】ところで、近年、大腸菌などの微生物から
多数の制限酵素が分離・精製されている。制限酵素とは
、特定の遺伝子配列を認識して特異的に遺伝子を切断す
る酵素（タンパク質）である。すなわち、タンパク質が
核酸における特定の塩基配列を認識することができるの
である。しかしながら、制限酵素は適当な微生物から見
つけてこなければならず、必ずしも目的とする遺伝子の
塩基配列を認識できる酵素が見出せるとは限らない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、高感度で
あり、結果を短時間で得ることができ、さらに安全かつ
簡便である遺伝子検出方法を提供することを目的とする
。 ［発明の構成］

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記事情に
鑑み、鋭意研究の結果、制限酵素の代わりに特定の塩基
配列を認識できる抗体を作成し、この抗体を用いて遺伝
子を検出する方法を見出した。

【００１０】すなわち、この発明の遺伝子検出方法は、
検出しようとする特定の塩基配列を有する一本鎖オリゴ
ヌクレオチドに対する抗体を試料と反応させ、その際の
抗原抗体反応の有無を測定することを特徴とする。

【００１１】この発明の遺伝子検出方法において用いら
れる、一本鎖オリゴヌクレオチドに対する抗体は、検出
しようとする特定の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌク
レオチドを抗原として、常法により調製することができ
る。

【００１２】この抗体を調製する際に抗原として用いら
れる一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ
であれば、特にその塩基配列が限定されることはない。 また、このオリゴヌクレオチドの塩基数は、一般的には
　８ないし２０程度であることが望ましい。塩基数が少
なすぎると、得られる抗体が試料遺伝子上において認識
する部位の数が多くなり、プロ−ブとしての機能が低下
する。逆に、塩基数があまり多すぎても、抗体がそれに
対応することができない。

【００１３】この一本鎖オリゴヌクレオチドは、他のタ
ンパク質と混合されているか、もしくは結合しているこ
とが好ましい。この際用いられるタンパク質は、特に限
定されるものではないが、適当な抗原性を得るに十分な
分子量を有していることが望ましい。このようなタンパ
ク質としては、例えばアルブミンを挙げることができる
。さらに、このタンパク質は変性されていることが好ま
しいが、その変性方法は特に限定されるものではなく、
例えば、メチル化、熱変性、尿素変性等を挙げることが
できる。抗体とタンパク質が結合している場合には、そ
の結合は共有結合、イオン結合等が適当である。

【００１４】この発明の遺伝子検出方法において用いら
れる、一本鎖オリゴヌクレオチドに対する抗体は、好ま
しくはモノクロ−ナル抗体である。その調製の際に用い
られる作成動物細胞は特に限定されるものではないが、
一般的には、マウスやラットなどの小動物の細胞が用い
られる。

【００１５】この発明の遺伝子検出方法において用いら
れる、一本鎖オリゴヌクレオチドに対する抗体は、遊離
したものであっても、リポソ−ムや磁性微粒子などの固
相に固定化されているものであってもよい。抗体を固定
化するための固相は、特に限定されるものではないが、
反応後の分離、検出が容易なものであることが好ましい
。また、この抗体は、酵素や蛍光体などの標識物質で標
識されていてもよく、特に、検出しようとする試料遺伝
子がフィルタ−などに固定化されている場合には標識さ
れていることが好ましい。

【００１６】

【作用】この発明の遺伝子検出方法において用いられる
抗体は、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを
抗原として調製される。したがって、試料遺伝子上にお
いて、抗原として用いたオリゴヌクレオチドと同じ塩基
配列を有する部位に特異的に結合する。この反応は特異
性が非常に高い上に、高感度であり、かつ短時間に完了
する。

【００１７】

【実施例】以下、この発明を実施例を用いて詳細に説明
する。 実施例１　　モノクロ−ナル抗−　オリゴヌクレオチド
抗体の作成

【００１８】オリゴヌクレオチドとしてＧＧＡＡＣＣＴ
Ｔの配列を有するオクタマ−を選択し、ＤＮＡシンセサ
イザ−（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて
自動合成した。

【００１９】これとは別に、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）をメタノ−ルに懸濁し、この懸濁液に塩酸を加えて
ＢＳＡをメチル化した（Ｊ．Ｐｌｅｓｃｉａ　ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　、５２、　２７
９（１９６４））。

【００２０】上で得られたオリゴヌクレオチドおよびメ
チル化ＢＳＡを、モル比　１：１００　程度になるよう
に　１０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．４；以下、Ｐ
ＢＳと略記する）に溶解し、抗原溶液とした。

【００２１】この抗原溶液　０．５ｍｌおよびフロイン
ド完全アジュバント　０．５ｍｌをよく混合して２匹の
ＢＡＬＢ／ｃマウスにそれぞれ　０．５ｍｌずつ腹腔内
投与して免疫した。投与の　２週間後および　４週間後
に、それぞれ初回と同様にして追加免疫を行ない、最終
免疫から　３日後に脾臓を摘出した。この脾臓から得ら
れた脾臓細胞と、予め培養したＢＡＬＢ／ｃマウス由来
のミエロ−マ細胞（ＮＳ−１）とを、常法（岩崎辰夫ほ
か著、「単クロ−ン抗体　−ハイブリド−マとＥＬＩＳ
Ａ−　」、第５０頁、講談社サイエンティフィック（１
９８３））に従って、細胞数　１：１０の割合で融合さ
せた。

【００２２】得られた融合細胞を培養し、培地上清の抗
体価を上記オリゴヌクレオチドを抗原とした固相酵素免
疫分析法（ＥＬＩＳＡ）で測定することにより、抗体の
スクリ−ニングを行なった。この際、第２抗体としては
β−　ガラクトシダ−ゼ標識ヤギ抗　−マウスＩｇＧ抗
体（Ｚｙｍｅｄ　社製）を使用し、　４１５ｎｍにおけ
る吸光度（ＯＤ４１５　）を測定した。その結果、５種
のモノクロ−ナル抗体ＡないしＥを得た。

【００２３】次いで、得られた５種の抗体のそれぞれに
対して、抗原として上記オリゴヌクレオチド、これとは
異なる塩基配列を有する他の７種のオリゴヌクレオチド
、および上記オリゴヌクレオチドにさらに２塩基付加し
たオリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザ−で合成し
、同様にＥＬＩＳＡを行なうことによりそれぞれの抗原
に対する特異性を検討した。その結果を以下の表にまと
める。

【００２４】

【表１】

【００２５】

【表２】 上記表１および表２におけるシンボルは、ＯＤ４１５　
の値に従って次のように分類した。 ＋＋：　０．３以上 ＋：　０．１〜　０．３ −：　０．１以下

【００２６】上記表より明らかなように、この実施例に
おいては、Ｄで示すモノクロ−ナル抗体が、元のオリゴ
ヌクレオチドＧＧＡＡＣＣＴＴに対して最も特異性が高
かった。 実施例２　　塩基配列特異的核酸抗体を用いたオリゴヌ
クレオチドの検出方法。

【００２７】実施例１において調製したモノクロ−ナル
抗体Ｄを用いて、モデルオリゴヌクレオチド試料の検出
を試みた。この実施例においては、モデルオリゴヌクレ
オチド（試料核酸）として、ＧＧＡＡＣＣＴＴの塩基配
列を２か所含む１５０塩基対の核酸をＤＮＡシンセサイ
ザ−で合成して使用した。

【００２８】まず、核酸固定用フィルタ−付の９６穴マ
イクロタイタ−プレ−ト（日本ポ−ル社製）の各ウェル
に、所定量の試料核酸を吸着固定化した。次に、非特異
的な抗体の吸着を防ぐために各ウェルを　１％ＢＳＡ溶
液で処理し、その後、前述のモノクロ−ナル抗体Ｄ（培
養上清を緩衝液で１０倍に希釈したもの）およびβ−　
ガラクトシダ−ゼ標識ヤギ抗−　マウスＩｇＧ抗体を添
加した。 これを３７℃で３０分間反応させ、反応終了後に各ウェ
ルを緩衝液で十分洗浄した。なお、この実施例において
は、緩衝液として、全て　０．０１　Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ．７．４）を使用した。最後に発色用の酵素基質を
加え、基質添加の３０分後に各ウェルのＯＤ４１５　を
測定した。その結果を下記表３に示す。

【００２９】

【表３】

【００３０】上記表３より明らかなように、この実施例
においては、約　１ｐｇからの核酸の検出が可能である
。 これは、放射性同位元素を使用する従来の遺伝子プロ−
ブ法とほぼ同等の感度であり、この結果を得るまでの所
用時間は約　２時間と非常に短いものであった。 実施例３　　塩基配列特異的核酸抗体固定化リポソ−ム
を用いたモデルオリゴヌクレオチドの検出

【００３１】
実施例１で得られたモノクロ−ナル抗体Ｄを、二官能性
架橋剤　Ｎ−　サクシンイミジル　　３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオネ−ト（ＳＰＤＰ、ファルマシア社
製）を用いて、カルボキシフルオレセインを封入したリ
ポソ−ム表面に固定化した（Ｙ．Ｉｓｈｉｍｏｒｉら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　、７５、３５１
−３６０　（１９８４））。このリポソ−ム試薬をゼラ
チン−　ベロナ−ル緩衝液（ＧＶＢ）で１０倍に希釈し
、このうちの１０μｌを所定濃度の前記試料核酸を含む
溶液２５μｌに加え、３７℃で１５分間反応させた。次
いで、この反応液に、ＧＶＢで１０倍に希釈したウサギ
抗−　核酸抗体および１０倍希釈補体（モルモット血清
）を各々２５μｌずつ添加し、さらに３７℃で３０分間
インキュベ−トした。ここで、ウサギ抗−　核酸抗体は
、常法によりウサギを前記試料核酸で免疫して得られた
ものである。反応終了後、マイクロタイタ−プレ−ト用
蛍光分光光度計（コロナ電子社製）を用いて、各ウェル
の相対蛍光強度を測定した。その結果を表４に示す。

【００３２】

【表４】

【００３３】上記表４より明らかなように、この実施例
においては、約　１ｐｇ／ｍｌからの核酸の検出が可能
であることが示されている。これは、放射性同位元素を
使用する従来の遺伝子プロ−ブ法とほぼ同等の感度では
あるが、この実施例においては結果を得るまでの所用時
間は約　１時間と非常に短いものであり、その結果も洗
浄を必要としない簡便な操作で得ることができる。 実施例４　　塩基配列特異的核酸抗体固定化磁性微粒子
を用いたモデルヌクレオチドの検出

【００３４】実施例１において調製したモノクロ−ナル
抗体Ｄを、グルタルアルデヒドを用いて、アミノ基結合
磁性微粒子（川原油化社製）の表面に固定化した。これ
とは別に、ＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣという塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドに対して特異的に反応するモノク
ロ−ナル抗体Ｐを、実施例１と同様にして作成し、β−
　ガラクトシダ−ゼで標識した。また、モデルオリゴヌ
クレオチド（試料核酸）として、ＧＧＡＡＣＣＴＴおよ
びＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣという塩基配列を含む　１５０
塩基対からなる核酸をＤＮＡシンセサイザ−で合成した
。

【００３５】所定濃度の試料核酸を含む溶液に、モノク
ロ−ナル抗体Ｄ固定化磁性微粒子およびβ−　ガラクト
シダ−ゼ標識抗体Ｐの所定量を添加し、３７℃で３０分
間インキュベ−トした。反応終了後、磁石で磁性微粒子
を回収し、緩衝液でよく洗浄した後、発色用の酵素基質
を添加してさらに３７℃で３０分間反応させた。反応終
了後、磁石で磁性微粒子を回収し、上清のＯＤ４１５　
を分光光度計で測定した。その結果を表５に示す。

【００３６】

【表５】

【００３７】上記第５表から明らかなように、この実施
例においては、約　１ｐｇ／ｍｌからの核酸の検出が可
能である。これは、放射性同位元素を使用する従来の遺
伝子プロ−ブ法とほぼ同等の感度であり、この結果を得
るまでの所用時間は約　１時間と非常に短いものであっ
た。

【００３８】

【発明の効果】以上のように、この発明の遺伝子検出方
法は、放射性同位元素を使用する従来の遺伝子プロ−ブ
法とほぼ同等の高感度でありながら、放射性同位元素を
扱うことなく安全に遺伝子の検出を行なうことが可能で
ある。また、従来の方法においては必要不可欠であった
ハイブリダイゼ−ションを行なう必要がなく、簡便に、
かつ非常に短時間に遺伝子を検出することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　特定の塩基配列を有する一本鎖オリゴ
   ヌクレオチドに対する抗体を試料と反応させ、抗原抗体
   反応の有無を測定することを特徴とする遺伝子検出方法
   。