WO2004088319A1

WO2004088319A1 - 物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体

Info

Publication number: WO2004088319A1
Application number: PCT/JP2004/004510
Authority: WO
Inventors: Yoshihiro Ito; Hirokazu Hasuda; Tomohiro Konno; Kazuhiko Ishihara; Tetsuya Yamauchi
Original assignee: Kanagawa Academy Of Science And Technology; Taiko-Denki Co., Ltd.
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2004-03-30
Publication date: 2004-10-14
Also published as: JPWO2004088319A1; JP4630817B2; EP1615034A1; EP1615034A4; US20060160089A1

Abstract

基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤が開示されている。一分子内に、ホスホリルコリン基と、光反応性基を複数含むポリマーを用いることにより、該ポリマーは、光反応性基を介して基体及び固定化すべき物質に結合し、これによって、固定化すべき物質は該ポリマーを介して基体上に共有結合され、さらに、ホスホリルコリン基により非特異吸着が有効に防止される。また、基体上に所望の物質を固定化するために用いられる物質固定化剤であって、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子から成る物質固定化剤も提供された。

Description

明細書

物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体技術分野

本発明は、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を基体上に固定化するための物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体に関する。

背景技術

従来より、抗体又は抗原をプレー卜上に固定化した、免疫測定のためのィムノプレー卜や、核酸をチップ上に固定化した D N Aチップ等が広く用いられている。従来、基体上にタンパク質や核酸を固定化する方法の 1つとして、物理吸着が広く用いられている。すなわち、例えばポリスチレンのような疎水性の基体と、基体上に固定化すべきタンパク質や核酸の水溶液とを接触させて放置することによリ、物理吸着によってタンパク質や核酸が基体上に固定化される。

しかしな力ら、物理吸着を用いる方法では、基体と固定化物質との結合が弱く、物質を固定化した基体の安定性が不十分であるという問題がある。また、目的のタンパク質や核酸で被覆されなかった領域への非特異吸着を防止するために、ゥシ血清アルブミン（BSA)、カゼイン、スキムミルク等のタンパク質（タンパク質を固定化する場合）や、サケ精子 D N A等の D N A ( D N Aを固定化する場合）でブロッキングすることが行われているが、ブロッキングによる非特異吸着の防止効果も必ずしも満足できるものではない。

また、基体上の官能基と、固定化すべきタンパク質や核酸の官能基とを共有結合させることによリ基体上にタンパク質や核酸を固定化することも行われている。しかしながら、この方法では、用いる官能基が物質の活性部位の中又はその近傍にある場合には、固定化により物質の活性が失われてしまう。また、適当な官能基が存在しない場合には、この方法により固定化することができない。また、物理吸着の場合と同様、ブロッキングにより非特異吸着が防止されているが、その防止効果は必ずしも満足できるものではない。

以上の従来技術を記載した文献として次のものを挙げることができる。特開平 1 1—337551号公報

特開 2001— 337089号公報

一方、光反応性基を利用して物質を基板に固定化することも知られている（Y. Ito and M. Nogawa, "Preparation of a protein micro-array using a photo - reactive polymer for a eel I adhesion assay, Biomater ials, 24、 3021-3026 (2003))。しかしながら、この方法では、非特異吸着を防止するための配慮は特にされてはいない。

発明の開示

従って、本発明の目的は、基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体を提供することでめる。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、分子全体として電気的に中性な水溶性のポリマ一を物質固定化剤に利用することにより、非特異吸着を有効に防止できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、基体上に所望の物質を固定化するために用いられる水溶性のポリマーであって、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有し、かつ、前記水溶性ポリマーが分子全体として電気的に中性なポリマーから成る、物質固定化剤を提供する。

また、本発明は、基体に固定化すべき物質と、上記本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により前記物質が固定化された基体を提供する。

本願発明によリ、基体上に固定化すべき物質を共有結合によリ固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体が提供された。本発明によれば、固定化すべき物質を、その種類に関係なく共有結合によリ固定化することができ、安定な固定化基板を得ることができる。また、本発明の物質固定化剤を用いて物 4004510

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質を固定化すると、非特異吸着が効果的に防止される。さらに、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化する場合、選択露光を行うことにより、固定化物質のパターニングも可能であり、容易にマイクロアレイ等の任意のパターンに物質を固定化することができる。

発明を実施するための最良の形態

上記の通り、本発明の物質固定化剤は、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有し、かつ、前分子全体として電気的に中性なポリマーから成る。ここで、「分子全体として電気的に中性」とは、中性付近の pH (pH6~8)の水溶液中で電離してイオンになる基を有さないか、又は有していても陽イオンになるものと陰イオンになるものを有していて、その電荷の合計が実質的に 0になることを意味する。ここで「実質的に」とは、電荷の合計が 0になるか、又は 0にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に小さいことを意味する。

本発明の物質固定化剤は、水溶性であり、水に対する溶解度（水 1 OO gに溶解するグラム数）は、好ましくは 5以上である。

水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式 [I]で表される構造を有する単位と、下記一般式 [II]で示される構造を有する単位を含むポリマーを挙げることができる。

—— Y [Π]

R¹

(ただし、一般式 [I]及び [II]中、 X及び Yは、互いに独立して、重合した状態の重合性原子団を表し、 R¹は光反応性基を有する原子団を表し、一般式 [I]及び [II]で表される単位は、それぞれ 2個以上であり、かつ、一般式 [I]で表される単位の数は、一般式 [I I]で表される単位の数よリも大きい）。

(上記一般式 [I]で表される構造を有する単位を以下、便宜的に「単位 [ι]」と言うことがある。また、上記一般式 [ I I ]で示される構造を有する単位を、以下、便宜的に「単位 [ 1 1 ]」と言うことがある。）

を挙げることができる。

上記ホスホリルコリン含有ポリマーは、生体膜が種々の物質と接触するにもかかわらず、非特異吸着がほとんど起きないことに着目し、生体膜の構成成分であるホスホリルコリンを含む高分子を利用して、所望の物質を基体に固定化することにより非特異吸着を有効に防止できるのではないかという着想に基づいて発明されたものである。

単位 [ I ]は、ホスホリルコリン基を含む単位であり、 Xは重合した状態の重合性原子団を表す。 Xとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位 [ I ]としては、下記一般式 [V]に示されるものが好ましい。 [V]

(ただし、式中、 X ' は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルォキシ基、メタクリルアミド基、アクリルォキシ基、アクリルアミド基、スチリルォキシ基又はスチリルアミド基を表し、 R ¹は単結合又は炭素数 1 〜 1 0のアルキレン基（ただし 1個叉は 2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）を表す

)。

このような単位の好ましい具体例として、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン、 2—ァクリロイルォキシェチルホスホリルコリン、 N— ( 2— メタクリルアミド）ェチルホスホリルコリン、 4ーメタクリロイルォキシブチルホスホリルコリン、 6—メタクリロイルォキシへキシルホスホリルコリン、 10- メタクリロイルォキシデシルシルホスホリルコリン、 ω—メタクリロイルジォキシエチレンホスホリルコリン又は 4—スチリルォキシブチルホスホリルコリンに由来する（すなわち、これらの単位を重合させた）単位を挙げることができる。これらの中でも 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンに由来する単位が特に好ましい。 2004/004510

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一方、単位 [I I]中の光反応性基の好ましい例としてアジド基 (- M₃)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。また、一般式 [II]の Yとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位 [II]の好ましい例として、下記一般式 [V

I]で示されるものを挙げることができる。

一 Y-一

R² [VI]

I

3

(ただし、 Y' は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルォキシ基、メタクリルアミド基、アクリルォキシ基、アクリルアミド基、スチリルォキシ基又はスチリルアミド基を表し、 R²は単結合、炭素数 1〜10のアルキレン基 ( ただし 1個又は 2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フヱニレン基 (ただし、 1〜3個の炭素数 1〜4のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい。）

単位 [I]の数は単位 [II]の数よりも大きく、その比率は、特に限定されないが、 100 ： 2〜 1 00 ： 50程度が好ましく、特に 100 ： 5〜 1 00 ： 20程度が好ましい。このように、ポリマーは、ホスホリルコリン基を有する単位 [I]力、ら主として成ることにより、非特異吸着が効果的に防止される。また、水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、 1,000〜 1,000, 000程度であり、好ましくは、 5,000〜100,000程度である。

上記水溶性ポリマーは、単位 [ I〗と単位 [ 11 ]のみから成るものが好ましいが、本発明の効果に悪影響を与えない範囲で他の重合性モノマー由来の単位を含んでいてもよい。このような他の単位の割合は、本発明の効果に悪影響を与えない範囲であれば特に限定されないが、通常、通常、ポリマ一中の全単位中の 30モル %以下、好ましくは 1 0モル％以下である。

上記水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式 [ 11 で表すものを挙げることができる。 0

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(ただし、式中、 X' 、 Υ' 、 R R²は上記定義と同じ意味を表し、 n及び mは、互いに独立して 2以上の整数であり、かつ、 nは mよりも大きく、 X' を含む単位と Y' を含む単位はランダムな順序で結合している。）

上記一般式 [III]で示される化合物の中でも、特に下記式 [IV]で示されるポリマーが好ましい。

(ただし、 n'は 50ないし 200の整数、 m'は 5ないし 40の整数を表し、ホスホリルコリン含有単位と、アジドフエニル基含有単位はランダムな順序で結合している）。

上記水溶性ポリマーは、上記した単位 [I]及び単位 [II]を単に重合させることにより製造することができる。あるいは、側鎖（ホスホリルコリン基含有基及び光反応性基含有基）を含まない主鎖のポリマーを先に合成し、後から側鎖を結合してもよい。また、ホルホリルコリン基含有基を有する単位 [ と、光反応性基を有さない単位 [II]とを先ず重合し、後から光反応性基含有基を結合させてもよし、。下記の実施例ではこの方法を採用している。なお、モノマーの重合や、側鎖の結合は、当業者の技術常識に従って容易に実施することができるし、下記の実施例にもその一例が具体的に記載されている。 2004/004510 フ

また、本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては、 1分子中に少なくとも 2 個の光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子（ポリマー）を好ましい例として挙げることができる。ノニオン性水溶性高分子は、上記したホスホリルコリン含有ポリマーと同等の非特異吸着防止効果を有し、それでいてホスホリルコリン含有ポリマーよりも安価に製造又は入手可能であるという利点を有する。

ここで、 Γノニオン性」とは、中性付近の pH (pH6〜8〉の水溶液中で電離してイオンになる基を実質的に有さないことを意味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全く含まないか、又は含んでいるとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微量（例えば、このような基の数が炭素数の 1 %以下）であることを意味する。

ノニオン性水溶性高分子の分子量は、特に限定されないが、通常、 3 5 0〜5 0 0万程度であり、好ましくは、 5 0 0〜数 1 0万程度である。

このようなノ二オン性水溶性高分子の好ましい例として、ポリエチレングリコ —ル（PEG)やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール；ビニルアルコール、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルォキサゾリドン、ビニルメチルォキサゾリドン、 2-ビニルピリジン、 4-ビニルピリジン、 N- ビニルサクシンイミド、 N-ビニルホルムアミド、 N-ビニル -N-メチルホルムアミド、 N-ビニルァセ卜アミド、 N-ビニルメチルァセトアミド、 2—ヒドロキシェチルメタクリレート、ァクリルアミド、メタクリルアミド、 -ジメチルァクリルアミド、 N—i so-プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロ —ルアクリルアミド、ァクリロイルモルホリン、ァクリロイルピロリジン、ァクリロイルビペリジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、ブチルァク.リレー卜、メチルシアノアクリレート、ェチルシアノアクリレー卜、 n -プロピルシアノアクリレー卜、 i so -プロピルシアノアクリレー卜、 n-プチルシアノアクリレート、 i so -ブチルシアノアクリレー卜、 tert -プチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレー卜、ェチルビ二ルェ一テル、 n-プロピルビニルエーテル、 i so-プロピルビニルエーテル、 n -プチルビ二ルェ一テル、 i so-ブチルビニルエーテル、 tert -ブチルビ二ルェ一亍ルなどのモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノニオン性のビニル系高分子；ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グァーガム、プルラン、ぺクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体、カラギーナン、澱粉類（カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン）、デキストリン、サイクロデキストリン等の天然高分子、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシェチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セル口一ス誘導体等の天然高分子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特に好ましいものはポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド（本明細書及び特許請求の範囲において、「（メタ）アクリル」は、「メタクリル」又は「アクリル」を意味する）及びポリ（グリシジル（メタ）ァクリレート）であり、これらの中で特に好ましくは、ポリェチレングリコールである。

上記したノ二オン性水溶性高分子は、 1分子当り少なくとも 2個の光反応性基を有する。ノニオン性水溶性高分子 1分子当りの光反応性基の数は、 2個以上であれば、特に限定されるものではないが、あまりに多すぎると、非特異吸着が増大する恐れがあるので、高分子を構成する炭素数（側鎖の炭素を含まない）の 1 θ ο/ο以下が好ましく、さらに好ましくは 5 <½以下である。光反応性基の好ましい例としてアジド基 (-N₃)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。光反応性基の具体例としてフ Iニルアジド基、ァセチル基、ベンゾィル基が挙げられるが、特に好ましくはフエニルアジド基である。アジド基等の光反応性基は、ノ二オン性水溶性高分子に直接結合していてもよいが、任意のスぺーサ一構造を介してノニオン性水溶性高分子に結合されていてもよく、通常、後者の方が製造が容易であり好ましい。後者の場合、スぺーサー構造は、何ら限定されるものではなく、例えば炭素数 1〜 1 0のアルキレン基（ただし 1個又は 2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フヱニレン基（ただし、 1〜3個の炭素数1 〜 4のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい）等を挙げることができる。ノ二オン性水溶性高分子への光反応性基の導入は、常法に基づき容易に行うことができる。例えば、官能基を有するノニオン性水溶性高分子と、該官能基と反応する官能基を有するアジド化合物を反応させて、ノ二オン性水溶性高分子にァジド基を結合させることができる。好ましいノニオン性水溶性高分子であるポリエチレングリコールを用いる場合、両末端にアミノ基ゃカルボキシル基を有するポリエチレングリコールが市販されているので、このような市販の官能基含有ポリエチレングリコールの官能基に、アジド基含有化合物を反応させてポリエチレングリコールにアジド基を結合させることができる。下記実施例にも、複数のこのような方法が具体的に記載されている。あるいは、ノニオン性水溶性高分子が水溶性ビニル系高分子のように、モノマーの重合により形成されるものである場合には、水溶性ビニル系高分子の主な構成単位となるビニル系モノマーと、光反応性ビニル系モノマーとを共重合させることによリ光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子を製造することもできる。この方法により得られる光反応性水溶性ビニル系高分子の好ましい例として、ポリ（（メタ）アクリルアミドー光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体及びポリ（グリシジル（メタ）ァクリレ一トー光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体、ポリ（エチレングリコールモノ（メタ）ァクリレート一光反応性アクリル酸アミド）共重合体等を挙げることができ、これらを製造する方法は、下記実施例に具体的に記載されている。本発明の物質固定化剤を用いて固定化される物質は、特に限定されないが、ポリペプチド（糖タンパク質及びリポタンパク質を包含する）、核酸、脂質並びに細胞（動物細胞、植物細胞、微生物細胞等)及びその構成要素（核、ミトコンドリア等の細胞内小器官、細胞膜や単位膜等の膜等を包含する）を例示することができる。本発明の物質固定化剤に光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基ゃカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。

基体としては、少なくともその表面が、上記光反応性基と結合し得る物質から成るものであれば特に限定されず、マイクロプレー卜等で広く用いられているポリスチレンをはじめ、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートやポリプロピレン等の有機物から成るものを例示することができる。ガラス板にシラン力ップリング剤をコ一ティングしたもの等も用いることができる。また、基体の形態は何ら限定されるものではなく、マイクロアレイ用基板のような板状のものや、ビーズ状、繊維状のもの等を用いることができる。さらに、板に設けられた穴や溝、例えば、マイクロプレートのゥエル等も用いることができる。本発明の物質固定化剤は、これらのうち、特にマイクロアレイ用に適している。

本発明の物質固定化剤を用いて、基体上に所望の物質を固定化することは、次のようにして行うことができる。先ず、基体に固定化すべき物質と、本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布する。この場合、水溶液中の物質固定化剤の濃度（重量基準）は、特に限定されないが、通常、 0. 005 %〜10%程度であり、好ましくは 0. 04〜1 %程度である。また、固定化すべき物質の濃度（重量基準）は、通常、用いる物質固定化剤の 1 0倍ないし 2 0 0倍程度であり、好ましくは 2 0倍ないし 1 0 0倍程度である。

次に、塗布した液を好ましくは乾燥した後、光を照射する。光は、用いる光反応性基がラジカルを生じさせることができる光であり、光反応性基としてアジド基を用いる場合には、紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、 1 cm²当たり 1 mW~ 100mW程度である。

光を照射することにより、ポリマー中の光反応性基がラジカルを生じ、ポリマ一が基体及び固定化すべき物質の双方と共有結合する。その結果、固定化すべき物質がポリマ一を介して基体に固定化される。光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基ゃカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。なお、本発明の方法では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、固定化すべき物質の特定の部位と結合するのではなく、ランダムな部位と結合する。従って、活性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も当然出てくると考えられるが、活性部位に影響を与えない部位で結合する分子も当然存在するので、本発明の方法によれば、従来、適当な置換基が活性部位又はその近傍にあるために、共有結合で固定化することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させることなく、共有結合により基体に固定化することができる。

光が照射されなかった部分では、光反応性基が基体及び物質に結合しないので、洗浄すればポリマーも物質も除去される。従って、フォトマスク等を介して選択露光を行うことにより、任意のパターンで物質を固定化することができる。従つて、選択露光により、マイクロアレイ等の任意の種々の形状に物質を固定化することができるので、非常に有利である。

あるいは、本発明の物質固定化剤と、固定化すべき物質の混合物を基体上にマイクロスポッティングし、基体の全面を光照射してもよい。マイクロスポッティングは、液を基体上に非常に狭い領域に塗布する手法であり、 DNAチップ等の作製に常用されており、そのための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことができる。あるいは、先ず、基体上に本発明の物質固定化剤を全面にコ一ティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合、固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。さらに、基体上に本発明の物質固定化剤をマイクロスポッティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合にも固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層（それぞれ分離したスポット）の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。本発明の方法は、抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原を固定化した免疫測定用プレー卜の作製、 D N Aや R N Aを基板上に固定化した核酸チップ、マイクロアレイ等の作製に好適に用いることができるがこれらに限定されるものではなく、例えば、細胞全体やその構成要素の固定化等にも適用することができる。以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1 物質固定化剤の製造（その 1 )

下記の合成スキームにより光反応性メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン ( PC)ポリマーを合成した。

2mLの PMAG水溶液（5vrt%=50mg/mL) (PMAcは 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン（90%)とメタクリル酸 (10%)のランダム共重合体で上記反応式中の化合物 1 )に 1 2. 44mgの 4一アジドア二リンと、 1 7. 47m の水溶性カルボジィミド (WSG)を混合し，最終的に純水で 1 00mLにメスアップした。 pH7で 24時間撹拌 (冷蔵庫中 4 °C) し、反応終了後，透析カセット（P I ERCE社製）で、外液からァジドアニリンの UV吸収がなくなるまで透析。最後に凍結乾燥し光反応性 MPGポリマーを得た。

試験例 1 光反応性 M P Cポリマーの非特異吸着性

実施例 1で製造した光反応性 M P Cポリマ一の非特異吸着性を、以下のように F I TC化タンパク質又は細胞と接触させることにより調査した。

(1 ) MPGポリマーの基板上への結合

実施例 1で製造した光反応性 MPGポリマ一を、純水に 10 mg/m lの濃度で溶解し、ポリスチレン基板（直径 2cm)上に 25 I塗布して風乾した。次に、幅 1 0 O mのス卜ライプパターンを有するフォ卜マスクを介して紫外線（波長 2 60n m) を選択照射した（照射量 16mW/cm²)。次いで、水洗し、ポリスチレン基板上に光反応性 MPGポリマーをストライプ状に固定化した。

(2) F G (フルォレツセインイソチオシァネート）化タンパク質の吸着

FITC-BSA (シグマ社より市販）水溶液 (濃度 10 mg/ml), FITG-lgG (シグマ社より市販）水溶液 (濃度 2 mg/ml)又は TC-フイブリノ一ゲン水溶液（濃度 3.7 mg/370^ I )を、上記パターンが形成された基板上に 50 I載せ、 37°Cで 1 0分間反応させた。 P BSで洗浄後、乾燥させ、蛍光顕微鏡で観察した。

その結果、光反応性 MPCポリマーが固定化されていない領域にのみ蛍光が見られ、極めて明瞭なストライプパターンが観察された。これにより、 MPCポリマーがタンパク質を非特異吸着しないことが確認された。

なお、上記試験に用いた F G -フイブリノ一ゲンは、次のようにして調製した c すなわち、フイブリノ一ゲン 2 Omgに F G- 1 0.1 mgを加えて 50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（PH 8.5) 7 mlに溶解し、 4 °Cで一夜反応させ、排除分子量 30 00のフィルタ一で遠心濃縮した。脱塩のため、 MilliQ水（商品名）で 3回遠心分離した。その後、凍結乾燥して 3.7 mgの FITG-フイブリノ一ゲンを得た。

(3) 細胞の吸着

実施例 1で調製した光反応性 MPCポリマ一を、上記と同様にポリスチレン基板上にパターンをつけて固定化し、水洗後、 70%エタノールを用いて滅菌し、滅菌水で洗浄した。得られた基板をそのままで、又は 1% BSA/PBS溶液若しくは 1% フイブリノ一ゲン/ PBS溶液 250 I を基板に載せて 3フ °Cで 1 0分間反応させ、水洗後、細胞の吸着試験に供した。用いた細胞は、 Cos 7細胞（理化学研究所細胞バンクより市販）及び Raw 246細胞（理化学研究所細胞バンク社より市販）であった。細胞を基板上に播き、 1時間後及び 4時間後に顕微鏡で観察した。

その結果、光反応性 MPGポリマーを固定化した領域には、細胞がほとんど吸着されず、細胞がストライプ状に吸着された。とりわけ、光反応性 MPGポリマー単独の場合及び光反応性 MPGポリマーにフィプリノ一ゲンを塗布した基板で明瞭なス卜ライプパターンが観察された。

実施例 2 免疫測定

以下に記載する方法により、本発明の方法により作製した、コラーゲン固定化基板を用いて、コラーゲンを検出する免疫測定を行った。

方法

(ί) 0.1%光反応性 MP Cポリマ一（実施例 1で製造したもの)水溶液と 0.5%コラ一ゲン水溶液を 1 :10で混合。

(i i) 35圆ポリスチレンディッシュに 3 1の MPG /コラーゲン水溶液をスポット: (i i i) 乾燥後、 UV照射（波長 260nm、照射量 16mW/Gm²、 10秒間）により固定化。

(iv) PBSで 3回洗浄。

(V) —次抗体として抗コラーゲン抗体（モノサン社より市販）（5 g/ml) 又は抗ヒト GD3抗体（ファーミンジェン社より市販）（5 ig/ml) をスポット上に 10 Ομ I添加、室温で 4時間ィンキュベ一シヨン。

(vi) PBSで 3回洗浄後、 FITG標識二次抗体（抗ラビット IgG あるいはマウス IgG抗体）（アマ一シャム社より市販）（5000倍希釈） 100 1添加、室温で 1時間インキュベーション。

(vii) PBSで 3回洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察。

(viii) コントロールとして MPGポリマーのみをスポットしたもの、またタカラ社製 Hubbleスライドガラスにポリマ一無しでコラーゲン溶液のみをスポッ卜したもので同様の操作を行つお。さらに、コントロールとして、負電荷のみを有するアジドフエニル基導入ポリアクリル酸（PAAc) とコラーゲンの水溶液、又は正電荷のみを有するアジドフエ二ル基導入ポリアリルアミン（PAAm) とコラ一ゲンの水溶液を同様にポリスチレン基板上にスポッ卜したものを用いて同様の操作を行った。

結果と考察

抗コラーゲン抗体による免疫染色後、蛍光顕微鏡により MPGポリマーコラー 0

1 5

ゲンスポットに蛍光が観察され、抗 GD3抗体では染色されず、コラーゲンが特異的に染色されることが確認された。コントロールとして行った MPGポリマーのみのスポットではほとんど蛍光は無く、負電荷のみを有するアジドフエ二ル基導入ポリアクリル酸（PAA c ) とコラーゲンでも、蛍光はなかった。正電荷のみを有するアジドフ: cニル基導入ポリアリルアミン（PAAm) では、抗体の種類によらず非特異的な染色が起こった。以上のことから、 MPGポリマーの非特異的吸着が少ない特性を実証することが出来た。コントロールとしてタカラ社製の Hubb l e スライドガラスへコラーゲンの固定化を行ったが、スポット上に蛍光は観察されなず、この場合にはコラーゲンは固定化できなかったと考えられる。以上より M PCポリマ一を用いてタンパク質の共有固定化が可能となリ、非特異的吸着を抑制し、有効であることが明らかになった。なお、結果を下記表 1にまとめて示す。表 1

抗コラーゲン抗体 ~~抗 GD3抗体 ~

MPCポリマ一コラ一ゲン蛍光有

MPGポリマ一 4B 4m-

PAAc コラ一ゲン

PAAmノコラ一ゲン有有実施例 3 物質固定化剤の製造（その 2 )

(1 ) M- (4-アジドベンゾイロキシ）スクシンイミドの合成

4 -アジド安息香酸（東京化成 (株）より市販） 600mgと N-ヒドロキシスクシンィミド（和光純薬 (株）より市販） 420mgを 1 , 4-ジォキサン 40m lに溶解し、 N, N' - ジシクロへキシルカルポジイミド（和光純薬 (株)より市販） 760mgを加えて室温で攪拌しながら反応を開始した。 24時間後、副生成物をろ紙でろ去し、ろ液は減圧下で溶媒を留去した。得られた生成物は、 1 , 4-ジォキサンとジェチルェ一テルを用いて 2回再結晶して精製した。その結果、 675mgの N- (4 -アジドベンゾィ口キシ）スクシンイミドを得た（収率 70· 6%)。

(2) ポリエチレングリコールへのアジド基の導入

100mgのポリ（エチレングリコール）ビス（3 -ァミノプロピル）末端（A l dr i ch 社より市販、平均分子量 1500、以下、便宜的に「PEG - NH2」と言うことがある）と 68. 6mgの（1 )で製造した N- (4-アジドベンジロキシ）スクシンィミドをジメチルホルムアミド（和光純薬（株）より市販） 10m lに溶解し、 pH6で 4°Cで 24時間攪拌した。反応終了後、エバポレータにより減圧下で DMFを留去し、純水を入れ、未反応物を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により、沈降させ上清を回収し、凍結乾燥により光反応性 PEG-NH2 (NH2基は、アジド化合物との結合に消費されてもはや存在しないが便宜的にこのように記載する）を得た。

実施例 4 物質固定化剤の製造（その 3 )

100mgのポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル（A I dr i ch社より市販、平均分子量 600、以下、便宜的に「PEG - G00H」と言うことがある））と 1 13. 3mgの 4-アジドア二リンと 127mgの水溶性カルポジィミドを純水 10m lに溶解し、 pH6で 4°Cで 24時間攪拌した。反応終了後、水酸化ナトリウムにより pH1 2 にし、未反応物を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により沈降させ、上清を回収し、分液ロートにてクロ口ホルムで脱塩した（pHが中性になるまで繰り返した）。そして凍結乾燥により光反応性 PEG - C00Hを得た（G00H基は、ァジド化合物との結合に消費されてもはや存在しないが便宜的にこのように記載す 4004510 る）。

実施例 5 物質固定化剤の製造（その 4)

(1) N-アジドフエ二ルアクリル酸アミドの合成

4-アジドア二リン（Aldrich社より市販） 341.2 mgと N -ァクリロキシスクシンイミド（Aldn'Gh社より市販） 169. Imgを DMFIOmlに溶解し、 4°Cで攪拌しながら反応を開始した。 24時間後、再結晶により精製した。その結果、 N-アジドフェニルァクリル酸アミドを得た。

(2) 光反応性ポリ（ァクリルアミドー N-アジドフヱ二ルァクリル酸アミド）共重合体の合成

639.7mgのアクリルアミド（和光純薬市販）と 160mgの N-アジドフエ二ルァクリル酸アミドをエタノール 30ml に溶解し、重合開始剤として 2,2' -ァゾビスィソブリロ二トリル（和光純薬より市販）を 82.1mg添加し、攪拌しながら 60°C で反応を開始した。 5時間後、アセトンへの再沈殿により重合物を精製し、減圧乾燥によリ光反応性ポリ（ァクリルアミド一 N-アジドフエ二ルァクリル酸アミド ) 共重合体を得た。

実施例 6 物質固定化剤の製造（その 5)

光反応性ポリ（グリシジルメタクリレー卜一M -アジドフエ二ルァクリル酸アミド）共重合体の合成

1 . 28gのグリシジルメタクリレート（A l dr i ch社より市販）と 160mgの N-アジドフエ二ルアクリル酸アミドをメタノール 30m lに溶解し、重合開始剤として 2, 2' -ァゾビスイソプリロニ卜リルを〗 6. 42m g添加し、攪拌しながら 60°Cで反応を開始した。 5時間後、ジェチルエーテルへの再沈殿により重合物を精製し、減圧乾燥によリ光反応性ポリ（ダリシジルメタクリレート一 N-アジドフエ二ルァクリル酸アミド）共重合体を得た。水酸化ナトリウム（PH12) による処理によリエポキシ基をグリセロール化させ、水溶性とした。

比較例 1 光反応性ポリアクリル酸の製造

光反応性ポリアクリル酸は、次のように調整した。 720mgのポリアクリル酸（和光純薬社より市販、平均分子量 1 , 000, 000) と 1 70. 6mgの 4-アジドア二リンと 1 . 917gの水溶性カルボジィミドを純水 100m Iに溶解し、 p H7. 0、 4°Cで 24時間攪拌した。反応終了後、外液からアジドア二リンの UV吸収がなくなるまで透析を行った。最後に凍結乾燥し光反応性ポリアクリル酸ポリマ一を得た。

比較例 2 光反応性ポリァリルァミンの製造

比較例 1の方法において、ポリアクリル酸をポリアクリルァミンに代えた同様な方法により光反応性ポリァクリルァミンを製造した。

実施例 7 免疫測定 (1) コラーゲン固定化基体め作製及びそれを用いた抗コラーゲン抗体の免疫測定

以下の手順によリ、実施例 3ないし 6、又は実施例 1、比較例 1若しくは比較例 2で製造した物質固定化剤を用い、コラーゲンを固定化した基体（ポリスチレンディッシュ）を作製し、これを用いて抗コラーゲン抗体の免疫測定を行った。

(i) 上記作成した光反応性 PEG-NH₂ (実施例 3) 、光反応性 PEG- G00H (実施例 4) 、光反応性ポリ（アクリルアミドー N-アジドフエニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例 5) 又は光反応性ポリ（グリシジルメタクリレートー N -アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例 6) (0.125wt%) とコラーゲン（0. 25 t%) を〗： 1で混合。

(i i) 35睡ポリスチレンディッシュに 0.5 Iのポリマ一/コラーゲン水溶液をスポッ卜。

(i i i) 乾燥後、 UV照射（波長 260nm、照射量 40mW/cm ²、 10秒間）により固定化。

( i v) PBS (0, 1 %tween20)で 3回洗浄。

(V) —次抗体として抗コラーゲン抗体（モノサン社より市販） 10倍希釈溶液（1 %BSA/PBS) 又はマウス IgG抗体 (Santa cruz biotechnology社より市販） 40倍希釈溶液（1%BSA/PBS) をスポット状に 100 I添加、室温で 3時間インキュベーシヨン。

(vi) PBS(0.1%Tween20 (商品名））で 3回洗浄後、 FITG標識二次抗体（杭ラビット IgG抗体あるいはマウス IgG抗体）（アマシャム社より市販） 20倍希釈溶液

(1%BSA/PBS) を 100 I添加、室温で 1時間ィンキュベーシヨン。

(vi i) PBS(0.1%Tween20(商品名））で 3回洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察。

(vi i i)光反応性 MPGポリマー（実施例 1 ) 、比較として光反応性ポリアクリル酸 (比較例 1 ) 、光反応性ポリァリルァミン（比較例 2 ) およびコントロールとして各例において物質固定化剤のみをスポッ卜したもので同様の操作を行った。

(2) 結果

下記表 2に示すように、抗コラーゲン抗体による免疫染色後、 PEG- NH2 (実施例 3) ノコラーゲンスポット及び PEG- G00H (実施例 4) Zコラーゲンスポット、ポリ（アクリルアミドー N-アジドフニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例 5 ) Zコラーゲンスポット、ポリ（グリシジルメタクリレートー N -アジドフエ二ルアクリル酸アミド）共重合体（実施例 6 ) コラーゲンスポッ卜で蛍光が観察され、抗 I gG抗体スポットでは蛍光は観察されなかった。これによリコラーゲンが特異的に染色されたことが確認できた。 PEG- NH2 (実施例 3 ) 、 PEG-G00H (実施例 4 ) では蛍光強度も WIPGポリマー Zコラーゲンスポット（実施例 1 ) を抗コラ —ゲン抗体で染色した場合とほぼ同等であり、ポリ（アクリルアミド一 N-アジドフエニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例 5 ) 、ポリ（グリシジルメタクリレート一 N -アジドフエニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例 6 ) では約 1 /2 の蛍光強度を示した。それに対して、負電荷のみを有する光反応性ポリアクリル酸コラーゲンスポット（比較例 1 ) では、蛍光は無く、正電荷のみを有する光反応性ポリアリルアミンコラーゲン（比較例 2 ) では、抗体の種類によらず非特異的な染色が起こった。以上よリ光反応性ポリエチレングリコ一ルは MPGポリマーと同等にタンパク質を固定化することができ、また非特異的吸着を抑制することが明らかとなった。また、ポリ（アクリルアミドー N-アジドフエニルァクリル酸アミド）共重合体（実施例 5 ) 、ポリ（グリシジルメタクリレー卜一 -アジドフエニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例 6 ) においてもポリエチレングリコール（実施例 3、 4 ) よりはタンパク質の固定化量は低いが、固定化は可能であり、非特異的吸着も抑制することができる。

表 2

2004/004510

2

実施例 8 物質固定化剤の製造（その 6)

1. N-アジドフエ二ルアクリル酸アミドの合成

(反応式）

4-ァジドアニリン塩酸塩（Aldr ich社より市販） 300.02 mgを 97mlの純水に溶解し、その溶液に 2mol/lの NaOH水溶液を 3ml加えた。次にァクリル酸ク口リド (東京化成工業より市販） 200mgをジクロロメタンで希釈し、 13mlにしたものをゆつくりと攪拌しながら滴下し、滴下終了後、密栓し 1時間強攪拌した。析出した固体をろ過により回収、ジクロロメタン相はクロ口ホルム 80ml を加えて分液した。分液した有機層を乾燥させ、固体を回収した。その結果、 N -アジドフエ二ルァクリル酸アミドを得た。

2. 光反応性ポリ（エチレングリコールモノメタクリレ一トー N-アジドフエ二ルアクリル酸アミド）共重合体の合成

(反応式）

300m Iナス型フラスコに N-アジドフエ二ルァクリル酸アミド 49.90m _g、 PEG (重合度 n=8)モノメタクリレート 2225. 2m gを 43m Iの酢酸ェチルに溶解させァゾビスイソプチロニトリル (A I BN)を 6. 31 m g入れて窒素で満たし密栓し、湯浴で 60°C、 6時間攪拌した。加熱を止めてある程度溶媒を留去させた後ジェチルエーテルに移しソニケ一ターを 30分かけた。固体を回収し、減圧乾燥を 2時間行った。その結果、光反応性ポリ（エチレングリコールモノメタクリレート一 N- アジドフエニルアクリル酸アミド）共重合体を得た。

実施例 9 アレルゲン固定化基体の作製及びそれを用いたアレルゲン抗体の免疫測定

スギ及びダニアレルゲン（生化学工業 (株）より市販）を純水で 0. 25wt%に調整し、実施例 1又は実施例 8で製造した光反応性ポリマ一（0. 125wt%) と 1 _: 1 (V /V) で混合した。混合したアレルゲンポリマー溶液をポリスチレン基板上に 0. 5 μ Iスポッ卜して風乾した。次に紫外線（波長 260nm、照射量 15mWZcm ²) を照射してポリスチレン基板上にァレルゲンを固定化した。

次いで PBS (0. 1 %tween20)で洗浄し、一次抗体としてァレルゲン抗体（生化学工業 (株）より市販）をヒ卜血清で l OO z g/m lに調整したものをスポッ卜上に 10 I添加し、室温で 2時間反応させた。次に PBS (0. 1 %tween20)で洗浄し、 HRP標識二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社より市販）を 10%BSA/PBSで 100倍に希釈したものをスポット上に 10 i I添加し、室温で 1時間反応させた。 PBS (0. 1 %tween20)で洗浄後、化学発光試薬 EGL advance (アマシャムバイオサイエンス社より市販）を添加し、ゲル撮影装置により 30秒間露光した画像を得た。得られた画像を解析ソフ卜により数値化した。

以下の表 3に数値化した発光強度を纏めて示す。

抗体濃度 100ng/m lで最も高い発光強度を示したのは、 PEGと、実施例 8の共重合体であった。また、抗体濃度が 0の時の発光強度が低いのも実施例 8の共重合体であり、非特異的吸着が最も少ないことがわかった。

以上の結果より、アレルゲン固定化量が多く、非特異的吸着の少ない実施例 8 の共重合体がァレルゲンァレイに使用するマ卜リックスに最も適していることがわかった。表 3

産業上の利用可能性

本願発明は、基体上に固定化すべき物質を共有結合によリ固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体に係る。本発明によれば、固定化すべき物質を、その種類に関係なく共有結合により固定化することができ、安定な固定化基板を得ることができる。また、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化すると、非特異吸着が効果的に防止される。さらに、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化する場合、選択露光を行うことにより、固定化物質のパターニングも可能であり、容易にマイクロアレイ等の任意のパターンに物質を固定化することができる。従って、本願発明は、各種マイクロアレイの作製等に有用で

Claims

請求の範囲

1 . 基体上に所望の物質を固定化するために用いられる水溶性のポリマーであつて、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有し、かつ、前記水溶性ポリマ

—が分子全体として電気的に中性なポリマ一から成る、物質固定化剤。

2 . 下記一般式 [I]で表される構造を有する単位と、下記一般式 [I I]で示される構造を有する単位を含む、請求項 1記載の物質固定化剤。

(ただし、一般式 [I]及び [II]中、 X及び Yは、互いに独立して、重合した状態の重合性原子団を表し、 R ¹は光反応性基を有する原子団を表し、一般式 [I]及び [II]で表される単位は、それぞれ 2個以上であり、かつ、一般式 [I]で表される単位の数は、一般式 [Π]で表される単位の数よりも大きい）。

3 . 前記光反応性基がアジド基である請求項 1又は 2記載の物質固定化剤。

4 . 一般式 [I]で表される単位の数と一般式 [Π]で表される単位の数の比が 1 0 0 ： 2〜 1 0 0 ： 5 0である請求項 2又は 3記載の物質固定化剤。

5 . 前記ポリマーの分子量が、 1 , 000〜1 , 000, 000である請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の物質固定化剤。

6 . X及び Yがビニル系モノマー由来である請求項 2ないし 5のいずれか 1項に記載の物質固定化剤。

7 . 前記物質固定化剤が、下記一般式 [I I I]で表される請求項 3ないし 6のいずれか 1項に記載の物質固定化剤。

(ただし、式中、 X ' 及び Y ' は、互いに独立して、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルォキシ基、メタクリルアミド基、アクリルォキシ基、ァクリルアミド基、スチリルォキシ基又はスチリルアミド基を表し、 R ¹は単結合又は炭素数 1 〜 1 0のアルキレン基（ただし 1個又は 2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）を表し、 R ²は単結合、炭素数 1〜 1 0のアルキレン基（ただし 1個又は 2個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フエ二レン基 ( ただし、 1 〜 3個の炭素数 1〜 4のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい）、 η及び mは、互いに独立して 2以上の整数であり、かつ、 ηは m よりも大きく、 X ' を含む単位と Y ' を含む単位はランダムな順序で結合している）を表す請求項 5記載の物質固定化剤。

8 . X ' を含む単位が、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン、 2—ァクリロイルォキシェチルホスホリルコリン、 N— ( 2—メタクリルアミド

) ェチルホスホリルコリン、 4—メタクリロイルォキシブチルホスホリルコリン、 6—メタクリロイル才キシへキシルホスホリルコリン、 10-メタクリロイルォキシデシルシルホスホリルコリン、 ω—メタクリロイルジォキシエチレンホスホリルコリン又は 4—スチリルォキシブチルホスホリルコリンに由来する請求項 7記載の物質固定化剤。

9 . 前記一般式 [ I ]で示される単位が、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンに由来する請求項 8記載の物質固定化剤。

1 0 . 下記式 [ I V]で表される請求項 9記載の物質固定化剤。

(ただし、 η'は 5 0ないし 2 0 0の整数、 m 'は 5ないし 4 0の整数を表し、ホスホリルコリン含有単位と、アジドフエニル基含有単位はランダムな順序で結合している）

1 1 . 基体に固定化する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項 1ないし 1 0のいずれか 1項に記載の物質固定化剤。

1 2 . 基体に固定化すべき物質と、請求項 1ないし 1 1のいずれか 1項に記載の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法。

1 3 . 基体に固定化する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項 1 2記載の方法。

1 4 . 前記光を選択照射することにより、物質を固定化する領域をパターニングすることを含む請求項 1 2又は 1 3記載の方法。

1 5 . 請求項 1 2ないし 1 4のいずれか 1項に記載の方法により前記物質が固定化された基体。

1 6 . 前記水溶性ポリマーが、 1分子中に少なくとも 2個の光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子から成る請求項 1記載の物質固定化剤。

1 フ. 前記ノニオン性水溶性高分子が、ポリアルキレングリコール、ポリビニル系高分子又は天然高分子である請求項 1 6記載の物質固定化剤。

1 8 . 前記ポリアルキレングリコ一ルがポリエチレングリコ一ルであり、ポリビニル系高分子がポリ（（メタ）アクリルアミドー光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体又はポリ（グリシジル（メタ）ァクリレートー光反応性（メタ ) アクリル酸アミド）共重合体である請求項 1 7記載の物質固定化剤。

1 9 . 前記ノニオン性水溶性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド一光反応性アクリル酸アミド）共重合体又はポリ（グリシジルメタクリレート一光反応性アクリル酸アミド）共重合体である請求項 1 8記載の物質固定化剤。

2 0 . 前記光反応性基がフ： Lニルアジド基である請求項 1 6ないし 1 9のいずれか 1項に記載の物質固定化剤。

2 1 . 前記ノ二オン性水溶性高分子の分子量が 5 0 0ないし 5 0 0万である請求項 1 6ないし 2 0のいずれか 1項に記載の物質固定化剤。

2 2 . 基体に固定化する物質が、ポリペプチド、多糖類、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項 1 6ないし 2 1のいずれか 1 項に記載の物質固定化剤。

2 3 . 基体に固定化すべき物質と、請求項 1 6ないし 2 2のいずれか 1項に記載の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法。

2 4 . 基体に固定化する物質が、ポリペプチド、多糖類、核酸、脂質並びに細胞及ぴその構成要素から成る群から選ばれる請求項 2 3記載の方法。

2 5 . 請求項 1 6ないし 2 4のいずれか 1項に記載の方法により前記物質が固定化された基体。