JP2006322708A - 物質固定化方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】基体上に被固定化物質を固定化する方法。被固定化物質および/または被固定化物質と特異的に反応する物質の基体表面への非特異吸着を防止する効果を有するポリマーを含む塗布液を基体上に塗布し、前記基体表面の少なくとも一部にポリマー層を形成し、次いで、前記ポリマー層を有する基体上に、被固定化物質と1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤との混合物を塗布し、光照射することを含む。
【選択図】なし
Description
[1] 基体上に被固定化物質を固定化する方法であって、
被固定化物質および/または被固定化物質と特異的に反応する物質の基体表面への非特異吸着を防止する効果を有するポリマーを含む塗布液を基体上に塗布し、前記基体表面の少なくとも一部にポリマー層を形成し、次いで、
前記ポリマー層を有する基体上に、被固定化物質と1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤との混合物を塗布し、光照射することを含む、物質固定化方法。
[2] 前記塗布液は、1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤を含む[1]に記載の物質固定化方法。
[3] 前記ポリマーは、光反応性基および/または基体表面と共有結合もしくは配位結合可能な基を有する[1]または[2]に記載の物質固定化方法。
[4] 前記光反応性基は、アジド基である[1]〜[3]のいずれかに記載の物質固定化方法。
[5] 前記ポリマーは、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーである[1]〜[4]のいずれかに記載の物質固定化方法。
[6] 前記ポリマーは、両極性またはノニオン性ポリマーである[5]に記載の物質固定化方法。
[7] 前記ノニオン性ポリマーは、ポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのビニル重合体である[6]に記載の物質固定化方法。
[8] 前記被固定化物質が、ポリペプチド、核酸、脂質、細胞およびその構成要素からなる群から選ばれる少なくとも一種である[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法。
本発明の物質固定化方法は、
基体上に被固定化物質を固定化する方法であって、
被固定化物質および/または被固定化物質と特異的に反応する物質の基体表面への非特異吸着を防止する効果を有するポリマーを含む塗布液を基体上に塗布し、前記基体表面の少なくとも一部にポリマー層を形成し(以下、「第一工程」という)、次いで、
前記ポリマー層を有する基体上に、被固定化物質と1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤との混合物を塗布し、光照射すること(以下、「第二工程」という)を含む、物質固定化方法。
である。
第一工程では、非特異吸着防止効果を有するポリマーを含む塗布液を基体上に塗布し、前記基体表面の少なくとも一部にポリマー層を形成する。
第一工程において使用されるポリマーは、被固定化物質および/または被固定化物質と特異的に反応する物質の基体表面への非特異吸着を防止する効果を有するものである。ここで、「非特異吸着」とは、基板表面の被固定化物質が固定化されていない領域へ、被固定化物質および/または被固定化物質と特異的に反応する物質が吸着することをいう。被固定化物質と特異的に反応する物質とは、例えば、被固定化物質が抗原である場合には抗体を、被固定化物質が抗体である場合には抗原であることができる。かかるポリマー層を介して基体上に物質を固定化することにより、非特異吸着を防止し、検出感度を高めることができる。更に、本発明の方法によれば、ポリマー、被固定化物質および光架橋剤を混合して基体上に塗布する方法に比べ、最表層に露出する被固定化物質量が多いため、S/N比および検出感度の優れた物質固定化基体を得ることができる。
前記光架橋剤は、光照射により光反応性基がラジカルを生じることにより、アミノ基やカルボキシル基、有機化合物を構成する炭素原子等と共有結合を形成することができる。これにより、前記光架橋剤を含む塗布液を基体上に塗布した後に光を照射することによって、基体とポリマーを光架橋剤を介して結合させることができ、基体上に非特異吸着防止効果を有するポリマー層を形成することができる。なお、本発明では、前記光架橋剤を使用せずに、または、前記光架橋剤とともに、前記ポリマーに光反応性基および/または基体表面と共有結合もしくは配位結合可能な基を導入することにより、該ポリマーが有する基を利用して、基体とポリマーを結合することも可能である。
また、前述の光反応性基によってポリマー層と基体とを結合する場合には、少なくともその表面が、光反応性基と結合し得る物質からなるものであれば特に限定されず、マイクロプレート等で広く用いられているポリスチレンをはじめ、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートやポリプロピレン等の有機物から成るものを例示することができる。ガラス板にシランカップリング剤をコーティングしたもの等も用いることができ、金表面をチオール処理したSPRやQCM用の基体も好ましく用いられ得る。また、基体の形態は何ら限定されるものではなく、マイクロアレイ用基板のような板状のものや、ビーズ状、繊維状のもの等を用いることができる。さらに、板に設けられた穴や溝、例えば、マイクロプレートのウェル等も用いることができる。本発明は、これらのうち、特にマイクロアレイ、SPRおよびQCM用に適している。
第二工程では、前記ポリマーを含む塗布液を基体上へ塗布し、好ましくは乾燥して、基体表面の少なくとも一部にポリマー層を形成した後に、該ポリマー層を有する基体上に、被固定化物質と1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤との混合物を塗布し、光照射する。前記混合物は、基体上のポリマー層上に塗布することが好ましい。この光照射により、光架橋剤に含まれる光反応性基のラジカル化が起こり、ポリマー層と被固定化物質とを、光架橋剤を介して結合させることができ、結果的に、被固定化物質を基体上に固定化することができる。また、前述のように光反応性基によって基体とポリマーとを結合する場合には、第一工程において塗布液を塗布し、好ましくは乾燥した後に光照射を行い、次いで、第二工程において、被固定化物質と架橋剤との混合物を塗布してもよく、または、第一工程では光照射を行わず、第二工程における光照射によって、前記塗布液に含まれる光架橋剤およびポリマーが有する光反応性基のラジカル化を行ってもよい。第二工程において使用される光架橋剤の詳細については、前述の通りである。
なお、本発明では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、光架橋剤は、固定化すべき物質の特定の部位と結合するのではなく、ランダムな部位と結合する。従って、活性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も出てくる可能性はあるが、活性部位に影響を与えない部位で結合する分子も多数存在するので、全体として、その影響は少ないと考えられる。本発明によれば、従来、適当な置換基が活性部位またはその近傍にあるために、共有結合で固定化することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させることなく、共有結合により基体に固定化することができる。
[実施例1]
1.水溶性ポリマーの調製
ポリエチレングリコールモノメタクリレート(ポリエチレングリコール部分子量350)4.5gを50mlの酢酸エチルに溶解し、AIBNを開始剤として14.03mg加え、60℃で6時間反応させた。反応液はエバポレーターにて溶媒を取り除いた後、水で溶解し、限外ろ過を行い未反応のモノマーを取り除いた。ゲル濾過クロマトグラフィー(GPC)にてポリマー生成を確認した。
4,4'−ジアジドスチルベン−2,2'−ジスルホン酸ナトリウム(市販品)を光架橋剤として用いた。光架橋剤の濃度が0.0125質量%、上記水溶性ポリマーの濃度が0.25質量%となるように水に混合した。得られた塗布液を、アクリル樹脂基板上に、10×10mm2の面積に10μL塗布し、乾燥した(膜厚約0.2μm)。次いで、BSA0.125質量%および光架橋剤0.00156質量%になるように混合した水溶液を0.5μLスポットした。乾燥後、UV照射(ブラックライト(波長300〜400nm)で7分間)によりBSAを固定化した。
PBS(0.1質量% Tween20(登録商標))で洗浄後、抗BSAウサギIgG(市販品)(100ng/mL)と室温で20分間反応させた。PBS(0.1質量% Tween20(登録商標))で洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体(市販品)と室温で20分間反応させた。PBS(0.1質量% Tween20(登録商標))で洗浄後、化学発光試薬を添加し、発光強度を測定した。
測定した発光強度を下記表1に示す。また、表1の下段には比較例として、BSAのみをスポットした結果を示す。
1.水溶性ポリマーの調製
実施例1と同様に処理した。
4,4'−ジアジドスチルベン−2,2'−ジスルホン酸ナトリウム(市販品)を光架橋剤として用いた。光架橋剤の濃度が0.003125質量%、上記水溶性ポリマーの濃度が0.0625質量%となるように混合した。得られた塗布液を、ビアコア社製SPR用金基板をメルカプトエタノールで処理した後、その上に7×7mm2の面積に20μL塗布し、乾燥した(膜厚約0.2μm)。次いで、BSA0.125質量%および光架橋剤を表2記載の濃度になるように混合した水溶液を3μLスポットした。乾燥後、UV照射(ブラックライトで7分間)によりBSAを固定化した。
PBS(0.1質量% Tween20(登録商標))で洗浄後、抗BSAウサギIgG(市販品)(20μg/mL)を使用して、SPR測定を実施した。
測定した結果を下記表2に示す。また、表2の下段には比較例として、BSAのみをスポットした結果および実施例2で使用した塗布液とBSAを1:1に混合してスポットした結果を示す。
Claims (8)
- 基体上に被固定化物質を固定化する方法であって、
被固定化物質および/または被固定化物質と特異的に反応する物質の基体表面への非特異吸着を防止する効果を有するポリマーを含む塗布液を基体上に塗布し、前記基体表面の少なくとも一部にポリマー層を形成し、次いで、
前記ポリマー層を有する基体上に、被固定化物質と1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤との混合物を塗布し、光照射することを含む、物質固定化方法。 - 前記塗布液は、1分子中に少なくとも2個の光反応性基を有する光架橋剤を含む請求項1に記載の物質固定化方法。
- 前記ポリマーは、光反応性基および/または基体表面と共有結合もしくは配位結合可能な基を有する請求項1または2に記載の物質固定化方法。
- 前記光反応性基は、アジド基である請求項1〜3のいずれか1項に記載の物質固定化方法。
- 前記ポリマーは、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーである請求項1〜4のいずれか1項に記載の物質固定化方法。
- 前記ポリマーは、両極性またはノニオン性ポリマーである請求項5に記載の物質固定化方法。
- 前記ノニオン性ポリマーは、ポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのビニル重合体である請求項6に記載の物質固定化方法。
- 前記被固定化物質が、ポリペプチド、核酸、脂質、細胞およびその構成要素からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
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