JP2007205753A - バイオチップの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制する、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップおよびその製造方法を提供する。
【解決手段】基体表面に蛋白質を固定化してなるバイオチップの製造方法であって、（１）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、（２）基体表面に蛋白質を溶媒に溶解又は分散した液体を点着又は塗布する工程、（３）２０℃以上の温度下で蛋白質を固定化する工程、を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体試料中の多数の蛋白質の検出および分析に用いられるバイオチップの製造方法に関する技術であり、さらに詳しくは、プロテオミクス、ならびに遺伝子活性の細胞内蛋白質レベルでの測定に用いられるバイオチップの製造方法に関するものである。

遺伝子活性の評価や、薬物効果の分子レベルでの生理的プロセスを解読するための試みは、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。

「生命の設計図」であるゲノムの構造が明らかにされ、膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます盛んになっており、それに伴って生理活性物質検出の迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとして、ＤＮＡチップが開発され、実用化されつつある。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関してはプロテインチップが提唱され、近年研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基体）表面に固定化したものを総称する。

しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。

蛋白質、またはそれを捕捉する分子を基板上に固定化した後、該表面上で他の蛋白質（例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはその抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質）と反応させて検出機等で検出する場合、蛋白質、またはそれを捕捉する分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば非特許文献１参照）。

このため通常は、蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化した後に、これらの分子が固定されていない部分で他の蛋白質が非特異的に吸着するのを防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われるが、これらの非特異吸着防止能は十分でない。また、蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質、またはそれを捕捉する分子の上に吸着防止剤がコーティングされてしまう場合があり、続く反応、即ち他の蛋白質（例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはその抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質）との反応において、反応性が低下するという問題があった。このため、一次抗体固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ蛋白質、またはそれを捕捉する分子が固定されていない部分での非特異吸着量の少ないバイオチップが求められている。

また、すべての蛋白質（プロテオーム）の変動をプロファイリングする技術面では、超微量の蛋白質や数ナノリットルというような超微量の溶液の操作を可能とするマイクロフルイディクスの技術や、チップ上での前処理、分離、検出を目標とする「ラボ・オン・チップ」の概念が重要となってくる。この技術においては、サンプルである蛋白質などの生理活性物質が、流路内に固定化されたキャプチャーと特異的に反応し、かつキャプチャー部以外の流路の内壁への非特異吸着を抑制することが必要となる。
特開２００１−１１６７５０号公報 「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57

本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制する、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供することを目的とする。

すなわち本発明は、
（１） 基体表面に蛋白質を固定化してなるバイオチップの製造方法であって、
（1）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、
（2）基体表面に蛋白質を溶媒に溶解又は分散した液体を点着又は塗布する工程、
（3）２０℃以上の温度下で蛋白質を固定化する工程、
を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法、
（２） 前記（3）の工程において、湿度６０％以下の乾燥状態におく（１）記載のバイオチップの製造方法、
（３） 蛋白質を溶解又は分散する溶媒のｐＨが８〜１０である（１）又は（２）記載のバイオチップの製造方法、
（４） 前記（3）の工程において、蛋白質の固定化温度が３７〜７０℃である（１）〜（３）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（５） 吸着により蛋白質が固定化されている（１）〜（４）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（６） ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項１〜５いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（７） 前記ポリマーがホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体との共重合体である（１）〜（６）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（８） 蛋白質が基体表面にスポット状に固定化されている（１）〜（７）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（９） 複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している（８）記載のバイオチップの製造方法、
（１０） 基体の形状がスライドガラス状である（１）〜（９）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（１１） 基体が流路を有しており、流路内に蛋白質が固定化されている（１）〜（１０）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（１２） 基体の材質がプラスチックである（１）〜（１１）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（１３） プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１種である（１２）記載のバイオチップの製造方法、
である。

本発明のバイオチップの製造方法によれば、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制する、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップを製造することが可能となる。

本発明のバイオチップの製造方法は、基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーをコートする工程を含むことを特徴とする。ホスホリルコリン基を有するポリマーは、生体膜（リン脂質二重層膜）類似の構造を有しているポリマーであって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する（例えばIshihara K, Tsuji T, Kurosaki T, Nakabayashi N, Journal of Biomedical Materials Research, 28(2), pp.225-232, (1994)４など）。

ホスホリルコリン基は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。

基体表面とポリマーとの結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であっても良いが、表面処理の簡易性等の観点から、基体表面とポリマーとの疎水効果によって結合していることが好ましい。

また、本発明に使用するポリマーは、ホスホリルコリン基以外に他の基を含んでもよく、ホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体との二元共重合体が好ましい。

（基体の素材）
基体の素材は、通常ガラス、金属その他を用いることができるが、本発明に使用する基体の素材としては、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックを使用し、特に熱可塑性樹脂であることが好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリペンテン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、飽和環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体等を指す。

（基体の形状）
本発明に使用する基体の形状は、特に限定しないが、スライドガラス状の基板、ビーズ状の球体等が挙げられる。これらの基体表面に微細な流路を有していてもよく、流路内に抗体を固定化させることも可能である。

（蛋白質の固定化）
本発明において蛋白質を基体上に固定化する際には、蛋白質を溶媒で溶解又は分散した液体を点着する方法が好ましい。
蛋白質を溶解または分散する溶媒のｐＨは８〜１０であることが好ましく、ｐＨ９．０〜９．９がより好ましい。蛋白質固定化の工程における環境については、温度は２０℃以上が必要であり、好ましくは２５〜７０℃であり、湿度は０〜８０％が好ましい。特に温度３７〜７０℃、乾燥状態（湿度０〜６０％）の条件下ではスポットシグナル強度が高くなり、より好適である。固定化後は、固定化されなかった蛋白質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することが好ましい。

基体表面への蛋白質の固定化様式は、特に限定するものではなく、共有結合やイオン結合などの化学結合の他、共有結合によらず吸着による固定化も用いることができる。

蛋白質が基体表面にスポット状に固定化される場合、複数種の蛋白質のスポットを基体表面の同一区画中に存在させることが可能である。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを導入した。
次に、自動スポッターを用いて表１に示した希釈倍率（濃度）で、蛋白質であるラットアルブミンをｐＨが９．５に調整された炭酸バッファーに溶解した溶液を該基板にスポットし、温度５０℃、湿度３０％の環境下に２時間静置して固定化させた。固定化後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。その後、抗体である抗ラットアルブミン抗体およびウシ胎児血清蛋白の混合物をＣｙ３標識したもの（抗ラットアルブミン抗体濃度：２．１μｍｏｌ／Ｌ）、または血清蛋白の混合物のみ（抗体なし）をＣｙ３標識したものを反応させ、各スポットおよびスポット部以外の部分（バックグラウンド）について蛍光量測定を行い、その際の抗体あり／抗体なしのシグナル比、およびＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。

（比較例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍ）に加工した。基板表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２重量％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１重量％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
次に、自動スポッターを用いて表１に示した希釈倍率（濃度）で、蛋白質であるラットアルブミンをｐＨが９．５に調整された炭酸バッファーに溶解した溶液を該基板にスポットし、温度５０℃、湿度３０％の環境下に２時間静置して固定化させた。固定化後、非特異吸着防止の為に大日本製薬（株）製免疫実験用ブロッキング剤「ブロックエース」を純水で４倍希釈した溶液に該基板を浸し、室温で１時間静かに振とうした。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。抗体である抗ラットアルブミン抗体およびウシ胎児血清蛋白の混合物をＣｙ３標識したもの（抗ラットアルブミン抗体濃度：２．１μｍｏｌ／Ｌ）、または血清蛋白の混合物のみ（抗体なし）をＣｙ３標識したものを反応させ、各スポットおよびスポット部以外の部分（バックグラウンド）について蛍光量測定を行い、その際の抗体あり／抗体なしのシグナル比、およびＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。

実施例および比較例における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製バイオチップスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度４５％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍ、解像度１０μｍであった。
実施例は、抗体ありのスポットシグナル強度では比較例とほぼ同等かそれ以上であり、抗体なしのスポットシグナル強度値は比較例に比べて低く、抗体あり／抗体なしのシグナル比は比較例より大きい結果となった。さらに、スポット部以外の蛍光強度（バックグラウンド）は比較例よりも格段に低く、Ｓ／Ｎ比は実施例の方が非常に高い結果となった。すなわち、高感度な生理活性物質の検出ができたと言える。

本発明のバイオチップの製造方法によれば、固定化蛋白質の溶液のｐＨ、固定化の際の温度、湿度の少なくとも一つを制御することにより、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質、またはそれを捕捉する分子等の生理活性物質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制する、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップを提供することができるので、マイクロフルイディクスを含む各種バイオチップの製造に適用できる。

Claims (13)

1. 基体表面に蛋白質を固定化してなるバイオチップの製造方法であって、
   （１）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、
   （２）基体表面に蛋白質を溶媒に溶解又は分散した液体を点着又は塗布する工程、
   （３）２０℃以上の温度下で蛋白質を固定化する工程、
   を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
2. 前記（３）の工程において、湿度６０％以下の乾燥状態におく請求項１記載のバイオチップの製造方法。
3. 蛋白質を溶解又は分散する溶媒のｐＨが８〜１０である請求項１又は２記載のバイオチップの製造方法。
4. 前記（３）の工程において、蛋白質の固定化温度が３７〜７０℃である請求項１〜３いずれか記載のバイオチップの製造方法。
5. 吸着により蛋白質が固定化されている請求項１〜４いずれか記載のバイオチップの製造方法。
6. ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項１〜５いずれか記載のバイオチップの製造方法。
7. 前記ポリマーがホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体との共重合体である請求項１〜６いずれか記載のバイオチップの製造方法。
8. 蛋白質が基体表面にスポット状に固定化されている請求項１〜７いずれか記載のバイオチップの製造方法。
9. 複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している請求項８記載のバイオチップの製造方法。
10. 基体の形状がスライドガラス状である請求項１〜９いずれか記載のバイオチップの製造方法。
11. 基体が流路を有しており、流路内に蛋白質が固定化されている請求項１〜１０いずれか記載のバイオチップの製造方法。
12. 基体の材質がプラスチックである請求項１〜１１いずれか記載のバイオチップの製造方法。
13. プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１種である請求項１２記載のバイオチップの製造方法。