JP2007285835A - バイオプレート用プレート及びその製造方法並びにバイオプレート - Google Patents

Abstract

【課題】 吸着防止剤をコーティングすることなしに、生理活性物質を基体表面の任意の位置に固定化し、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオプレート用プレート及びその製造方法並びにバイオプレートを提供すること。
【解決手段】 固相基体の表面に生理活性物質を固定化するためのプレートであって、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有するプレート、及びその製造方法、並びに該プレートに生理活性物質を固定化したバイオプレート。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体試料中の多数の蛋白質、核酸等の並列検出および分析に用いられるバイオプレート用プレート及びその製造方法並びにバイオプレートに関する技術であり、さらに詳しくは、プロテオミクス、ならびに遺伝子活性の細胞内蛋白質レベルでの測定に用いられるバイオプレート用プレート及びその製造方法並びにバイオプレートに関するものである。

遺伝子活性の評価や、薬物効果の分子レベルでの生理的プロセスを解読するための試みは、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。

「生命の設計図」であるゲノムの構造が明らかにされ、膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます盛んになっており、それに伴って生理活性物質検出の迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとして、ＤＮＡチップが開発され、実用化されつつある。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関してはプロテインチップが提唱され、近年研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基体）表面に固定化したものを総称する。

一方で、同じ目的で、チップではなく９６ウェルプレートなど免疫分析で用いられる容器のウェル底部に蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化したものも現在開発が進められ、市場に出つつある。プレートの形であれば、チップを読み取るスキャナ等の測定装置や器具を新規に購入したりすることなく、広く普及している免疫分析用の測定装置や器具をそのまま使うことができるので、多くの人にとって利用しやすいといった利点がある。

蛋白質、またはそれを捕捉する分子をプレート等の基体表面に固定化した後、該表面上で他の蛋白質（例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはその抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質）と反応させて検出機等で検出する場合、蛋白質、またはそれを捕捉する分子が固定されていない部分に該分子以外の夾雑物が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば非特許文献１参照）。

そこで通常は、ブロッキングという夾雑物の吸着を防止する作業が必要となる。ブロッキングとは、固定化後の表面に、吸着し易く系に影響を及ぼさない蛋白を選定し、これを接触させて固定化されていない部分をマスキングする作業である。ところが、たとえ基体表面をブロッキング蛋白で完全に覆ったとしても、一般的に蛋白質は吸着によりその高次構造が崩れる（変成）ことで二次的な吸着を誘引する為、ブロッキング蛋白上への非特異吸着が発生してしまい、充分な効果は得られない場合が多い。更に、ブロッキング蛋白は生体由来物質であるため、品質の安定性の面でも問題があり、測定日が異なると再現性が得られないケースも多い。さらには、蛋白の選定も系ごとに行わなければならず、その検討に手間がかかることがある。また、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーを使用した人工的なブロッキング剤も市販されているが、それら親水性ポリマーは疎水性の容器基材との相互作用が弱く、非特異的な吸着で基材表面に導入することは非常に困難で、洗浄により容易に剥離するため充分な効果を得る事は難しかった。このため、固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ蛋白質、またはそれを捕捉する分子が固定されていない部分での非特異吸着量の少ない基材表面が求められている。
「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57

本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制する、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオプレート用プレート及びその製造方法並びにバイオプレートを提供することを目的とする。

すなわち本発明は、
（１） 固相基体の表面に生理活性物質を固定化するためのプレートであって、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有するプレート、
（２） 前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである（１）記載のプレート、
（３） 前記基体は、前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むものである（１）又は（２）記載のプレート、
（４） ホスホリルコリン基を有する単量体が、更にメタクリル基又はアクリル基を有するものである（１）〜（３）いずれか記載のプレート、
（５） ホスホリルコリン基を有する単量体が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである（４）記載のプレート、
（６） 前記カルボン酸誘導基を有する単量体が、更にメタクリル基又はアクリル基を有するものである（１）〜（５）いずれか記載のプレート、
（７） 前記カルボン酸誘導基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシイミドエステル基である（１）〜（６）いずれか記載のプレート、
（８） 固相基体の材質がプラスチックである（１）〜（７）いずれか記載のプレート、
（９） プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１種である（８）記載のプレート、
（１０） 固相基体の材質がガラスである（１）〜（７）いずれか記載のプレート、
（１１） 固相基体が標準９６-ウェルマイクロタイタープレートのフットプリントを有し、かつ、マイクロタイターウェルを有するマイクロタイタープレートである、（１）〜（１０）いずれか記載のプレート、
（１２） 固相基体がサンプルからのシグナルを検出するためのマルチウェルプレートである（１）〜（１０）いずれか記載のプレート、
（１３） 前記マルチウェルプレートが96〜3,456のウェルを有する、
（１２）記載のプレート、
（１４） （１）〜（１３）いずれか記載のプレートの製造方法であって、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に塗布することを特徴とするプレートの製造方法、
（１５） （１）〜（１３）いずれか記載のプレートに生理活性物質を固定化したバイオプレート、
（１６） 吸着により生理活性物質が固定化されている（１５）記載のバイオプレート、
（１７） 生理活性物質が基体表面にスポット状に固定化されている
（１５）〜（１６）いずれか記載のバイオプレート、
（１８） 複数種の生理活性物質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している（１７）記載のバイオプレート、
である。

本発明のバイオプレート用プレートとその製造方法およびバイオプレートによれば、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制する、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオプレートを得ることが可能となる。

本発明のバイオプレート用プレートは、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有することを特徴とする。ホスホリルコリン基を有する高分子物質は、生体膜（リン脂質二重層膜）類似の構造を有している高分子物質であって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する（例えばIshihara K, Tsuji T, Kurosaki T, Nakabayashi N, Journal of Biomedical Materials Research, 28(2), pp.225-232, (1994)４など）。また、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基は生理活性物質を固定化する役割を果たす。

ホスホリルコリン基は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。

本発明に使用する、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基は、酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するカルボン酸誘導基、すなわち反応活性の高いカルボン酸誘導基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等が、アルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基として知られている。

このような、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等で活性化されたものが挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル基で活性化されたp−ニトロフェニルカルボニルオキシ基が好ましく用いられる。

本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基及び電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。

基体表面と高分子物質との結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であっても良いが、表面処理の簡易性等の観点から、基体表面と高分子物質との疎水効果によって結合していることが好ましい。

（基体の素材）
基体の素材は、通常ガラス、金属その他を用いることができるが、本発明に使用する基体の素材としては、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックを使用し、特に熱可塑性樹脂であることが好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリペンテン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、飽和環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体等を指す。

（基体の形状）
本発明に使用する基体の形状は、特に限定しないが、96、384、又は3456のウェルを有するマルチウェルプレートが好適に用いられる。

（生理活性物質の固定化）
本発明のプレートを使用して、各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質として核酸を用いる場合、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基との反応性を高めるため、アミノ基を有することが好ましく、アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。生理活性物質が蛋白質、オリゴペプチド、糖鎖、糖蛋白質の場合もアミノ基を有することが好ましい。

生理活性物質が基体表面にスポット状に固定化される場合、複数種の生理活性物質のスポットを基体表面の同一区画中に存在させることが可能である。例えばマルチウェルプレートであれば、同一ウェル内に複数種の生理活性物質のスポットを存在させることが可能である。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を９６ウェルを有するマルチウェルプレートに加工して固相基体を作成した。ウェル内に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体（各モノマーは、モル比で２５：７４：１）の０．３重量％エタノール溶液を入れて、乾燥させることにより、ウェル表面にホスホリルコリン基と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する高分子物質を導入した。
次に、自動スポッターを用いて、希釈倍率２倍（抗体濃度：３．３μｍｏｌ／Ｌ）、及び８倍（抗体濃度：０．８３μｍｏｌ／Ｌ）で、抗マウスＩｇＧ２ａ抗体をｐＨが９．５に調整された炭酸バッファーに溶解した溶液を該プレートのウェル底面にスポットし、温度２５℃、湿度３０％の環境下に１６時間静置して固定化させた。固定化後、ｐＨ９．０に調整した０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール水溶液をウェルに分注して、上記抗体の固定化工程で使用されなかった、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基の不活性化処理を行い、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。その後、抗原であるマウスＩｇＧ２ａおよびウシ胎児血清蛋白の混合物をＣｙ３標識したもの（マウスＩｇＧ２ａ濃度：１９ｎｍｏｌ／Ｌ）、または血清蛋白の混合物のみ（抗原なし）をＣｙ３標識したものを反応させ、各スポットおよびスポット部以外の部分（バックグラウンド）について蛍光量測定を行い、その際の抗原あり／抗原なしのシグナル比、およびＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。

（比較例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を96ウェルを有するマルチウェルプレートに加工して固相基体を作成した。プレート表面に親水化処理を施したのち、ウェルにアミノ基含有アルキルシランの２重量％水溶液を分注し、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。続いてウェルに１重量％グルタルアルデヒド水溶液を分注することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
次に、自動スポッターを用いて希釈倍率２倍（抗体濃度：３．３μｍｏｌ／Ｌ）、及び８倍（抗体濃度：０．８３μｍｏｌ／Ｌ）で、抗マウスＩｇＧ２ａ抗体をｐＨが９．５に調整された炭酸バッファーに溶解した溶液を該プレートのウェル底面にスポットし、温度２５℃、湿度３０％の環境下に１６時間静置して固定化させた。固定化後、非特異吸着防止の為に大日本製薬（株）製免疫実験用ブロッキング剤「ブロックエース」を純水で４倍希釈した溶液をウェルに分注してブロッキングを行い、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。その後、抗原であるマウスＩｇＧ２ａおよびウシ胎児血清蛋白の混合物をＣｙ３標識したもの（マウスＩｇＧ２ａ濃度：１９ｎｍｏｌ／Ｌ）、または血清蛋白の混合物のみ（抗原なし）をＣｙ３標識したものを反応させ、各スポットおよびスポット部以外の部分（バックグラウンド）について蛍光量測定を行い、その際の抗原あり／抗原なしのシグナル比、およびＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。

実施例および比較例における蛍光量の測定には、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製バリアブルイメージアナライザー「Typhoon 9210」を用いた。測定条件は、励起波長５３２ｎｍ、解像度１０μｍであった。
実施例は、抗原ありのスポットシグナル強度では比較例とほぼ同等かそれ以上であり、抗原なしのスポットシグナル強度値は比較例に比べて低く、抗原あり／抗原なしのシグナル比は比較例より大きい結果となった。さらに、スポット部以外の蛍光強度（バックグラウンド）は比較例よりも格段に低く、Ｓ／Ｎ比は実施例の方が非常に高い結果となった。すなわち、高感度な生理活性物質の検出ができたと言える。

本発明のバイオプレート用プレート及びその製造方法並びにバイオプレートによれば、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質、またはそれを捕捉する分子等の生理活性物質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制する、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオプレートを提供することができるので、各種バイオプレートの製造に適用できる。

Claims (18)

1. 固相基体の表面に生理活性物質を固定化するためのプレートであって、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有するプレート。
2. 前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである請求項１記載のプレート。
3. 前記基体は、前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むものである請求項１又は２記載のプレート。
4. ホスホリルコリン基を有する単量体が、更にメタクリル基又はアクリル基を有するものである請求項１〜３いずれか記載のプレート。
5. ホスホリルコリン基を有する単量体が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである請求項４記載のプレート。
6. 前記カルボン酸誘導基を有する単量体が、更にメタクリル基又はアクリル基を有するものである請求項１〜５いずれか記載のプレート。
7. 前記カルボン酸誘導基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシイミドエステル基である請求項１〜６いずれか記載のプレート。
8. 固相基体の材質がプラスチックである請求項１〜７いずれか記載のプレート。
9. プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１種である請求項８記載のプレート。
10. 固相基体の材質がガラスである請求項１〜７いずれか記載のプレート。
11. 固相基体が標準９６-ウェルマイクロタイタープレートのフットプリントを有し、かつ、マイクロタイターウェルを有するマイクロタイタープレートである、請求項１〜１０いずれか記載のプレート。
12. 固相基体がサンプルからのシグナルを検出するためのマルチウェルプレートである請求項１〜１０いずれか記載のプレート。
13. 前記マルチウェルプレートが９６〜３４５６のウェルを有する請求項１２記載のプレート。
14. 請求項１〜１３いずれか記載のプレートの製造方法であって、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に塗布することを特徴とするプレートの製造方法。
15. 請求項１〜１３いずれか記載のプレートに生理活性物質を固定化したバイオプレート。
16. 吸着により生理活性物質が固定化されている請求項１５記載のバイオプレート。
17. 生理活性物質が基体表面にスポット状に固定化されている請求項１５又は１６記載のバイオプレート。
18. 複数種の生理活性物質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している請求項１７記載のバイオプレート。