JP2006071309A - 再利用が可能なバイオチップ用基板 - Google Patents

Abstract

【課題】生理活性物質との親和性を失活することなく再利用できるバイオチップを提供すること。
【解決手段】
表面に生理活性物質と親和性を有する物質を固定化し、生理活性物質を捕獲する工程を含む生理活性物質の検出に用いられるバイオチップ用基板であって、検出目的となる生理活性物質を結合した後、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、水溶液中に接触させることにより捕獲された生理活性物質を取り除くことができ、再度生理活性物質を捕獲できるバイオチップ用基板。

Description

本発明は、核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質、その他の生体由来物又は生体由来物と親和性を有する物質などを固相基板表面に配置・固定したデバイスに用いるバイオチップ用基板に関する。

一般的にバイオチップは、固相基板表面に生体由来物又は生体由来物と親和性を有する物質いわゆる生理活性物質などを固定化して作成するが、生理活性物質が貴重または高価であることから、再利用可能なバイオチップに対するニーズが高まっている。
バイオチップを再利用するためには、検出目的となる物質を捕獲および検出後に洗浄し、検出目的物質のみを完全に脱離させ、生理活性物質は固相に固定化した状態を保持させ、かつその活性を落とさないことが必要となる。

バイオチップの一つに、基板上にＤＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）を固定したＤＮＡマイクロアレイがある。一般的にＤＮＡは塩基数が増えるにしたがって高価になるため、高塩基数のＤＮＡを高密度に固定化したＤＮＡマイクロアレイでは、特許文献１のように固定化するＤＮＡ量を微量にする工夫を行なったり、又は、再利用することが可能なＤＮＡチップ開発へのニーズは高いと考えられる。特許文献２は、ＤＮＡマイクロアレイを８０℃の蒸留水で２０分間浸すことにより再利用を可能にしている。しかし高温で長時間処理した場合、固定化されたＤＮＡが変質する問題がある。
また、１つのＤＮＡマイクロアレイを再利用し解析する場合と、毎回新しいＤＮＡマイクロアレイを用いて解析する場合を比較すると、アレイ間のバラツキを考慮しなくて良いことから、再利用した場合の方がより精度の高いデータベースを構築することが可能となり、より簡便な条件で再利用が可能な基板が要求されている。
特開２００２−１１６２０５号公報 特開２００３−１２１４３７号公報

本発明の目的は、簡便な条件で再利用可能なバイオチップ用基板、及びバイオチップ用基板の使用方法を提供することである。

本発明は、
（１）基板表面に生理活性物質と親和性を有する物質を固定化し、該生理活性物質を捕獲して該生理活性物質を検出する際に用いられるバイオチップ用基板であって、基板材質がプラスチックからなり、検出目的となる該生理活性物質を捕獲した後、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、水溶液中に接触させることにより捕獲された該生理活性物質を取り除くことができ、再度該生理活性物質を捕獲することが可能であることを特徴とするバイオチップ用基板、
（２）基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有する（１）記載のバイオチップ用基板、
（３）前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（２）記載のバイオチップ用基板、
（４）前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である（２）または（３）記載のバイオチップ用基板、
（５）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である（２）〜（４）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（６）前記プラスチックが環状ポリオレフィン又は環状ポリオレフィンを含む混合物である（１）〜（５）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（７）（１）〜（６）いずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法であって、生理活性物質と親和性を有する物質を固定化する工程、該生理活性物質を捕獲する工程、該生理活性物質を捕獲した後、脱イオン処理した水に接触させる工程を含むバイオチップ用基板の使用方法、
（８）生理活性物質と親和性を有する物質が核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質の何れか又はこれらの複合物である（７）記載のバイオチップ用基板の使用方法、
（９）生理活性物質と親和性を有する物質および捕獲される生理活性物質が核酸である（７）記載のバイオチップ用基板の使用方法、
（１０）脱イオン処理した水が、イオン交換膜あるいはイオン交換樹脂、活性炭、メンブレンフィルター、蒸留、紫外線照射の何れか又はこれらを複合して使用して得られたものである（７）〜（９）いずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法、
である。

本発明のバイオチップ用基板によれば、検出目的となる生理活性物質を結合した後、容易に捕獲された生理活性物質を取り除くことができ、再度バイオチップ用基板が生理活性物質を捕獲できる状態になるという利点がある。

本発明のバイオチップ用基板は、基板材質がプラスチックであり、基板表面に検出目的となる生理活性物質を結合した後、界面活性剤、酸処理、アルカリ処理、加熱処理することなく、水溶液中に接触させることにより捕獲された生理活性物質を取り除くことができ、再度バイオチップ用基板が生理活性物質を捕獲できる状態になる。
本発明のバイオチップ用基板は、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有することが好ましい。ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質は、生理活性物質や蛍光物質の非特異的吸着を抑制する性質と生理活性物質を固定化する性質とを併せ持つポリマーで、ホスホリルコリン基は生理活性物質や蛍光物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、活性エステル基は生理活性物質を固定化する役割を果たす。

ホスホリルコリン基としては、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンがより好ましい。

活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基、等が好ましく、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより好ましい。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基及び活性エステル基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む共重合体が好ましい。

（基板の素材）
本発明のバイオチップ用基板は、基板材質がプラスチックであることを特徴とする。
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂を用いることができるが、熱可塑性樹脂の方が製造効率の観点から好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等が挙げられる。耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα―オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。

前者の例としては、例えばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、および、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。

後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピル、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα―オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。
これら樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、樹脂成分以外に繊維状、球状その他の形状を有する無機物あるいは有機物充填材、または各種添加剤成分を含んでもよい。

（基板の形状）
基板の形状としては、平板状のもの又は平板状表面に微細な流路を形成したもの等が挙げられる。

（生理活性物質と親和性を有する物質の固定化）
本発明において生理活性物質と親和性を有する物質をバイオチップ用基板上に固定化する際には、検出する生理活性物質と親和性を有する物質である生理活性物質を溶解又は分散した液体を点着する方法が好ましい。
点着後は、生理活性物質を固定化した以外の基板表面の活性エステル基の不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ−２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、水酸化ナトリウム、アミノエタノール、グリシンがより好ましい。

固定化する生理活性物質と親和性を有する物質として核酸、アプタマーを用いる場合、活性エステル基との反応性を高めるためアミノ基を導入することが好ましい。タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質もアミノ基を有することが好ましい。アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。

（検出目的となる生理活性物質の捕獲）
基板表面に固定化した物質と親和性を有する検出目的の生理活性物質を含む水溶液を基板表面上に展開することにより生理活性物質を捕獲することができる。このとき必要に応じて、水溶液中に界面活性剤、塩などを入れても良い。
展開後は水溶液をカバーガラス等で覆い、水溶液の蒸発を防ぐことが好ましい。さらには併せて、捕獲率を上げるために適度に加熱することがより好ましい。

（生理活性物質の洗浄除去）
生理活性物質を捕獲した後、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、脱イオン処理した水に接触させることにより、該生理活性物質を取り除くことができる。より具体的には、基板を脱イオン処理した中に数分間浸漬させることによって
該生理活性物質を取り除くことができる。
脱イオン処理した水とは、イオン交換膜あるいはイオン交換樹脂、活性炭、メンブレンフィルター、蒸留、紫外線照射の何れか又はこれらを複合して使用して得られたものであり、２５℃における比抵抗値が１０ＭΩ・ｃｍ以上であることが好ましく、前記温度における比抵抗値が１８．２ＭΩ・ｃｍである超純水がより好ましい。

≪実施例１≫
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ、１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。

（ＤＮＡ溶液の調整）
ＤＮＡ溶液１： ５’末端にアミノ基を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ（配列番号１）シグマジェノシス社製）を０．１μｇ／μＬとなるように所定の緩衝液で溶解した。
ＤＮＡ溶液２： ５’末端にＣｙ３標識を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡ（配列番号２）シグマジェノシス社製）を０．００２μｇ／μＬとなるように所定の緩衝液で溶解した。

（スポット）
ＤＮＡ溶液１を９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて実施例１の基板上にスポットした。スポット終了後、８０℃のオーブン中で静置した。
その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に５分間浸漬することによって活性エステルを不活性化させ、ブロッキング処理を行なった。

（ハイブリダイゼーション）
次にこの基板上にＤＮＡ溶液２を展開しカバーガラスで覆い、さらに６５℃の多湿容器内で３時間静置することで、固定化されたオリゴＤＮＡとＣｙ３標識オリゴＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行なった。その後、０．５重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、２×ＳＳＣ中、０．２×ＳＳＣ中、０．０２×ＳＳＣ中の順で洗浄することにより、ＤＮＡハイブリダイゼーション後の基板を作成した。

（評価）
ＤＮＡハイブリダイゼーション後の蛍光カウント値の測定には、マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いてスポットの蛍光を検出した。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度４０％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍである。スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いてスポットの蛍光量を数値化した。

（洗浄）
前記評価終了後、ＤＮＡマイクロアレイを超純水（２５℃における比抵抗値が１８．２ＭΩ・ｃｍ）中で２分間浸漬洗浄し、その後、前記の手法でスポットの蛍光量を評価した。

（再ハイブリダイゼーション・評価）
前記洗浄及び評価を行なった後、前記記載の方法でハイブリダイゼーションを行い、スポットの蛍光量を評価した。
その後、洗浄及びハイブリダイゼーションの工程をさらに１回繰り返し、評価した。

各段階でのスポットの蛍光量を表１に示す。

≪比較例１≫
表面研磨スライドガラス（松浪ガラス社製）に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、ガラス基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。この基板を用いて実施例１と同様に評価した。結果を表１に示す。

実施例１では、比較例１と比較して、超純水洗浄後に蛍光量が大幅に減少する結果となった。この結果は、本発明の効果を支持するものであった。

本発明では、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、水溶液中に接触させることにより再利用できるバイオチップを提供することができた。
このバイオチップを使用することで、貴重あるいは高価な生理活性物質を再利用することができ、かつ、より高精度なデータベース構築が可能になる。

Claims (10)

1. 基板表面に生理活性物質と親和性を有する物質を固定化し、該生理活性物質を捕獲して該生理活性物質を検出する際に用いられるバイオチップ用基板であって、基板材質がプラスチックからなり、検出目的となる該生理活性物質を捕獲した後、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、水溶液中に接触させることにより捕獲された該生理活性物質を取り除くことができ、再度該生理活性物質を捕獲することが可能であることを特徴とするバイオチップ用基板。
2. 基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有する請求項１記載のバイオチップ用基板。
3. 前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項２記載のバイオチップ用基板。
4. 前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である請求項２または３記載のバイオチップ用基板。
5. 前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である請求項２〜４いずれか記載のバイオチップ用基板。
6. 前記プラスチックが環状ポリオレフィン又は環状ポリオレフィンを含む混合物である請求項１〜５いずれか記載のバイオチップ用基板。
7. 請求項１〜６いずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法であって、生理活性物質と親和性を有する物質を固定化する工程、該生理活性物質を捕獲する工程、該生理活性物質を捕獲した後、脱イオン処理した水に接触させる工程を含むバイオチップ用基板の使用方法。
8. 生理活性物質と親和性を有する物質が核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質の何れか又はこれらの複合物である請求項７記載のバイオチップ用基板の使用方法。
9. 生理活性物質と親和性を有する物質および捕獲される生理活性物質が核酸である請求項７記載のバイオチップ用基板の使用方法。
10. 脱イオン処理した水が、イオン交換膜あるいはイオン交換樹脂、活性炭、メンブレンフィルター、蒸留、紫外線照射の何れか又はこれらを複合して使用して得られたものである請求項７〜９いずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法。