JP4581673B2

JP4581673B2 - 固相担体およびその使用方法

Info

Publication number: JP4581673B2
Application number: JP2004370434A
Authority: JP
Inventors: 健太郎藤本
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2024-12-22
Also published as: JP2006177745A

Description

本発明は、核酸を固相表面に配置・固定した担体およびその使用方法に関する。

核酸を固相表面に固定化する担体としては、平板状基板、マイクロビーズあるいは微細流路形状を有した基板などが考えられる。核酸が貴重または高価であること、また、核酸を固相表面に固定化する過程で手間がかかることから、再利用可能な担体に対するニーズが高まっている。
核酸を固定化した担体を再利用するためには、検出目的となる核酸を捕獲および検出後に洗浄し、検出目的の核酸のみを完全に脱離させ、固定化した核酸は固相に固定化した状態を保持させ、かつその活性を落とさないことが必要となる。

核酸を固定化した担体の一つに、基板上にＤＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）を固定したＤＮＡマイクロアレイがある。一般的にＤＮＡは塩基数が増えるにしたがって高価になるため、高塩基数のＤＮＡを高密度に固定化したＤＮＡマイクロアレイでは、再利用可能なＤＮＡマイクロアレイへのニーズは高いと考えられる。特開２００３−１２１４３７号公報では、ＤＮＡマイクロアレイを８０℃の蒸留水で２０分間浸すことにより再利用を可能にしている。しかし高温で長時間処理した場合、固定化されたＤＮＡが変質する問題がある。
また、１つのＤＮＡマイクロアレイを再利用し解析する場合と、毎回新しいＤＮＡマイクロアレイを用いて解析する場合を比較すると、アレイ間のバラツキを考慮しなくて良いことから、再利用した場合の方がより精度の高いデータベースを構築することが可能となる。

特開２００２−１１６２０５号公報特開２００３−１２１４３７号公報

本発明の目的は、簡便な条件で再利用可能な固相担体及び固相担体の使用方法を提供することである。

本発明は、
（１）固相表面に第１の核酸を固定化し、第１の核酸と親和性を有する第２の核酸を捕獲して検出する際に用いられる固相担体であって、固相材質がプラスチックからなり、該固相表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基及びｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する高分子物質を有しており、検出目的となる第２の核酸を捕獲した後、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、水溶液中に接触させることにより捕獲された第２の核酸を取り除くことができ、再度第２の核酸を捕獲することが可能であることを特徴とする固相担体、
（２）固相の形態が、平板状基板、微細流路を有する基板、又はマイクロビーズである請求項（１）記載の固相担体、
（３）前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体である（１）記載の固相担体、
（４）前記プラスチックが環状ポリオレフィン又は環状ポリオレフィンを含む混合物である（１）〜（３）いずれか記載の固相担体、
（５）（１）〜（４）いずれか記載の固相担体に第１の核酸を固定化した固相担体、
（６）（１）〜（５）いずれか記載の固相担体の使用方法であって、第１の核酸を固定化する工程、第１の核酸と親和性を有する第２の核酸を捕獲する工程、第２の核酸を捕獲した後、脱イオン処理した水に室温で接触させる工程を含む固相担体の使用方法、
（７）脱イオン処理した水が、イオン交換膜あるいはイオン交換樹脂、活性炭、メンブレンフィルター、蒸留、紫外線照射の何れか又はこれらを複合して使用して得られたものである（６）記載の固相担体の使用方法、
である。

本発明の固相担体によれば、検出目的となる核酸を結合した後、容易に捕獲された核酸を取り除くことができ、再度、担体が核酸を捕獲できる状態になるという利点があり、ＤＮＡマイクロアレイの再利用が可能である。

本発明の固相担体は、担体の固層材質がプラスチックであり、固相表面に検出目的となる核酸を結合した後、界面活性剤、酸処理、アルカリ処理、加熱処理することなく、水溶液中に接触させることにより捕獲された生理活性物質を取り除くことができ、再度担体が核酸を捕獲できる状態になる。
本発明の担体は、固相表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有することが好ましい。ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質は、核酸や蛍光物質の非特異的吸着を抑制する性質と核酸を固定化する性質とを併せ持つポリマーで、ホスホリルコリン基は核酸や蛍光物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、活性エステルは核酸を固定化する役割を果たす。

ホスホリルコリン基としては、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンがより好ましい。

活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基、等が好ましく、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより好ましい。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基及び活性エステル基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。

（固相担体の素材）
本発明の担体は、固相材質がプラスチックであることを特徴とする。
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂を用いることができるが、熱可塑性樹脂の方が製造効率の観点から好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等が挙げられる。耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα―オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。

前者の例としては、例えばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、および、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。

後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピル、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα―オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。
これら樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、樹脂成分以外に繊維状、球状その他の形状を有する無機物あるいは有機物充填材、または各種添加剤成分を含んでもよい。

（固相担体の形状）
固相担体の形状としては、平板状基板、マイクロビーズ、微細流路形状を有した基板等が挙げられる。
マイクロビーズ表面に核酸を固定化させた担体の場合、基板に固定化させた場合に比べ核酸を固定化できる表面積が大幅に増加するため、結果的に多くの検出目的となる核酸を捕獲でき、ＳＮ比の増加が可能となる。
また微細流路内に核酸を固定化した場合、核酸が検出目的となる核酸を捕獲できる頻度が相対的に増加するため、反応時間の短縮ができる。
さらには、核酸を固定化したマイクロビーズを微細流路内に封入した場合、前記の利点の両方が達成できる。

（核酸の固定化）
本発明において第１の核酸を固相上に固定化する際には、核酸を溶解又は分散した液体を点着する方法が好ましい。
点着後は、核酸を固定化した以外の固相表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行なうことが好ましい。
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ−２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、水酸化ナトリウム、アミノエタノール、グリシンがより好ましい。

活性エステル基との反応性を高めるため、固定化する核酸にアミノ基を導入することが好ましい。アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。

（検出目的となる核酸の捕獲）
固相表面に固定化した核酸と親和性を有する検出目的の第２の核酸を含む水溶液を固相表面に接触させることにより該核酸を捕獲することができる。このとき必要に応じて、水溶液中に界面活性剤、塩などを入れても良い。

（核酸の洗浄除去）
第２の核酸を捕獲した後、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、脱イオン処理した水に接触させることにより、第２の核酸を取り除くことができる。より具体的には、担体を脱イオン処理した水に数分間浸漬させることによって該核酸を取り除くことができる。
脱イオン処理した水とは、イオン交換膜あるいはイオン交換樹脂、活性炭、メンブレンフィルター、蒸留、紫外線照射の何れか又はこれらを複合して得られたものであり、２５℃における比抵抗値が１０ＭΩ・ｃｍ以上であることが好ましく、前記温度における比抵抗値が１８．２ＭΩ・ｃｍである超純水がより好ましい。
脱イオン処理した水に浸漬する際の温度は、室温であることが好ましい。

≪実施例１≫
射出成形により、飽和環状ポリオレフィン樹脂を用いて、スライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ、１ｍｍ）で幅１５０μｍ、深さ１００μｍの溝および、溝の末端に直径１ｍｍの貫通孔を有する基板と、この基板と同じ大きさの溝を有さない平板基板を成形した。
溝を有する基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、溝を含む基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。その後、溝以外の基板表面をわずかに研磨することにより、前記高分子物質を除去し、溝部のみに前記高分子物質を導入した。

（ＤＮＡ溶液の調整）
ＤＮＡ溶液１：５’末端にアミノ基を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ(配列番号１)シグマジェノシス社製）を０．１μｇ／μＬとなるように所定の緩衝液で溶解した。
ＤＮＡ溶液２：５’末端にＣｙ３標識を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡ（配列番号２）シグマジェノシス社製）を０．００２μｇ／μＬとなるように所定の緩衝液で溶解した。

（スポット、基板貼り合わせ）
直径が１００μｍのマイクロアレイ用スポットピンを用いてＤＮＡ溶液１を溝の底面部にスポットした。スポット終了後、８０℃のオーブン中で１時間静置した。
その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に５分間浸漬することによって活性エステルを不活性化させ、ブロッキング処理を行なった。
さらに平面基板と溝側を合わせ、熱融着により基板同士を張り合わせ、溝の末端に設けられた孔から液体を注入することにより溝を流通できる基板を作成した。

（ハイブリダイゼーション）
注入孔から、４０℃に保ったＤＮＡ溶液２を２μｌ／分のスピードで１０分間送液した後、０．５重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ水溶液を５μｌ／分のスピードで１分間、０．２×ＳＳＣ水溶液を５μｌ／分のスピードで１分間、さらには、０．０２×ＳＳＣ水溶液を５μｌ／分のスピードで１分間送液し、一連のハイブリダイゼーションを完結させた。

（評価）
ＤＮＡハイブリダイゼーション後の評価には、落射式蛍光顕微鏡（励起光波長５３２ｎｍ、測定光波長５６０ｎｍ）を用いた。ＣＣＤカメラで蛍光を撮影し、画像データより蛍光量を比較評価した。

（洗浄）
前記評価終了後、前記基板の注入孔から２５℃の超純水（２５℃における比抵抗値が１８．２ＭΩ・ｃｍ）を５μｍ／分のスピードで１分間送液し、その後、前記の手法でスポットの蛍光量を評価した。

（再ハイブリダイゼーション）
前記洗浄及び評価を行なった後、前記記載の方法でハイブリダイゼーションを行い、スポットの蛍光量を評価した。
その後、洗浄及びハイブリダイゼーションの工程をさらに１回繰り返し、評価した。

各段階でのスポットの蛍光量を表１に示す。この時、表面に高分子物質の塗布やＤＮＡ固定などの処理を行なわずに貼り合わせた飽和環状ポリオレフィン樹脂基板をリファレンスとし、この基板の蛍光量を１００としたときの相対量を示した。

≪比較例１≫
エッチングにより表面研磨ガラス基板表面に幅１５０μｍ、深さ１００μｍの溝および、溝の末端に直径１ｍｍの貫通孔を導入した。またこの基板と同じ大きさの表面研磨ガラス基板を用意した。
溝を有する基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、溝を含む基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。その後、溝以外の基板表面をわずかに研磨することにより、前記高分子物質を除去し、溝部のみに前記高分子物質を導入した。
前記の溝を有するガラス基板と平板ガラス基板を用いて、実施例１と同様に評価した。なお、基板貼り合わせの際には、シリコン系接着剤を使用した。評価結果を表１に示す。

実施例１では、比較例１と比較して、超純水洗浄後に蛍光量が大幅に減少する結果となった。この結果は、本発明の効果を支持するものであった。

本発明では、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、水溶液中に接触させることにより再利用できる核酸を固定化させた担体を提供することができた。
この担体を使用することで、貴重あるいは高価な核酸を再利用することができ、かつ、より高精度なデータベース構築が可能になる。
また、マイクロビーズ、微細流路基板にも適用できるなど、産業上の利用性は大きい。

Claims

固相表面に第１の核酸を固定化し、第１の核酸と親和性を有する第２の核酸を捕獲して検出する際に用いられる固相担体であって、固相材質がプラスチックからなり、該固相表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基及びｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する高分子物質を有しており、検出目的となる第２の核酸を捕獲した後、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理、加熱処理をすることなく、水溶液中に接触させることにより捕獲された第２の核酸を取り除くことができ、再度第２の核酸を捕獲することが可能であることを特徴とする固相担体。
固相の形態が、平板状基板、微細流路を有する基板、又はマイクロビーズである請求項１記載の固相担体。
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体である請求項1記載の固相担体。
前記プラスチックが環状ポリオレフィン又は環状ポリオレフィンを含む混合物である請求項１〜３いずれか記載の固相担体。
請求項１〜４いずれか記載の固相担体に第１の核酸を固定化した固相担体。
請求項１〜５いずれか記載の固相担体の使用方法であって、第１の核酸を固定化する工程、第１の核酸と親和性を有する第２の核酸を捕獲する工程、第２の核酸を捕獲した後、脱イオン処理した水に室温で接触させる工程を含む固相担体の使用方法。
脱イオン処理した水が、イオン交換膜あるいはイオン交換樹脂、活性炭、メンブレンフィルター、蒸留、紫外線照射の何れか又はこれらを複合して使用して得られたものである請求項６記載の固相担体の使用方法。