JP2007163240A - バイオチップおよびその使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 低分子化合物、蛋白質間の相互作用の検出に用いられる際に、検出対象物質の非特異的な吸着を抑制し、検出精度の高いバイオチップ用基板を提供すること。
【解決手段】固相基板の表面に低分子化合物を固定化したバイオチップであって、基板表面にアルキレングリコール残基を有する単量体を重合してなる高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ、及び該バイオチップに生物由来物質を反応させることを特徴とするバイオチップの使用方法。

Description

本発明は、たんぱく質と特異的選択性を有する低分子化合物をスクリーニングするためのバイオチップに関する。

細胞内の特定のたんぱく質に特異的に結合してその機能を調整するような低分子化合物をスクリーニングし、その低分子化合物が示す表現型からたんぱく質の機能を探る手法が注目を集めている。特定のたんぱく質と総合作用する低分子リガンドを得るためにさまざまなスクリーニング手法が確立されているが、この中でも注目に値するのは、１９９９年に米国ハーバード大学のMacbeathとSchreiberらにより開発された低分子マイクロアレイである。（非特許文献１）この手法では、合成された化合物を、ひとつのスライドガラス基板上に数千〜数万の単位で固定化し、このアレイを蛍光標識化たんぱく質で処理することでたんぱく質と低分子間相互作用を多検体同時に検出することができる。
このようなバイオチップのシグナル検出において、基板への検出対象物質の非特異的な吸着は信号対雑音比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる。
このためたんぱく質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。
J. Am. Chem. Soc., 121 7967-7968(1999)

本発明は、検出対象物質の非特異的な吸着を抑制し、検出精度の高いバイオチップ用基板を提供することを目的とする。

本発明は、
（１） 固相基板の表面に低分子化合物を固定化したバイオチップであって、基板表面にアルキレングリコール残基を有する単量体を重合してなる高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ、
（２）前記アルキレングリコール残基を有する単量体が下記の一般式［１］で表されるモノマーである（１）記載のバイオチップ、

（式中Ｒ₁は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ₂は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
（３）前記アルキレングリコール残基を有する単量体がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである（１）または（２）のバイオチップ。
（４）前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である（３）記載のバイオチップ、
（５）前記高分子物質が更に架橋可能な官能基を含む単量体との共重合体である（１）〜（４）いずれか記載のバイオチップ、
（６）前記架橋可能な官能基を有する単量体が下記の一般式［２］（式中Ｒ₃は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。ただし、Ｚはなくても構わない。Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃の内、少なくとも１個は加水分解可能基であり、その他はアルキル基を示す。）で表されるものである（５）記載のバイオチップ、

（７）一般式［２］中において、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃の内、少なくとも１つはアルコキシル基である（６）記載のバイオチップ、
（８）前記高分子物質が活性エステル基を含む単量体との共重合体であって、活性エステル基を介して低分子化合物を固定化することを特徴とする（１）〜（７）いずれか記載のバイオチップ、
（９）活性エステル基を有する単量体が下記の一般式［３］（式中R₂は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、または異なるアルキレンオキシ基の連鎖であってもよい。）で表されるものである（８）記載のバイオチップ、

（１０）活性エステル基を有する単量体がｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４．５−エチレングリコールメタクリレートまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド−４．５−エチレングリコールメタクリレートである（９）記載のバイオチップ、
（１１）固相基板がプラスチック製である（１）〜（１０）いずれか記載のバイオチップ、
（１２）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（１１）記載のバイオチップ、
（１３）固相基板がガラス製である（１）〜（１０）いずれか記載のバイオチップ。
（１４）固相基板に流路が設けてあることを特徴とする（１）〜（１３）いずれか記載のバイオチップ、
（１５）（１）〜（１４）いずれか記載のバイオチップに生物由来物質を反応させることを特徴とするバイオチップの使用方法、
（１６）（８）〜（１０）いずれか記載のバイオチップをアルカリ処理した後、生物由来物質を反応させることを特徴とするバイオチップの使用方法、
である。

本発明のバイオチップによれば、検出対象物質の非特異的な吸着抑制し、検出精度の高いマイクロアレイを得ることができる。

本発明のバイオチップ用基板は、基板表面にアルキレングリコール残基を有する単量体を重合してなる高分子物質を有することを特徴とする。アルキレングリコール残基を有する単量体を重合してなる高分子物質は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を持つポリマーで、アルキレングリコール残基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たす。

本発明に使用するアルキレングリコール残基を有する単量体は、特に構造を限定しないが、一般式［１］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖からなる化合物であることが好ましい。

式［１］中のアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｘの繰り返し数ｐは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Xの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
このような単量体としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール （メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。

本発明に使用する架橋可能な官能基を有する単量体は、架橋可能な官能基の反応が高分子化合物合成中に進行しないものであれば特に制限されるものではないが、一般式［２］で表される単量体であることが好ましい。
架橋可能な官能基としては、例えば加水分解によりシラノール基を生成する官能基やグリシジル基などが用いられるが、より低温で架橋できることから加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。

加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有する単量体は、（メタ）アクリル基と加水分解によりシラノール基を生成する官能基が炭素数１〜２０のアルキル鎖を介して、または直接結合した化合物である。加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。なかでもアルコキシシリル基がシラノール基を生成し易い点から好ましい。アルコキシシリル基を含有する単量体としては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。なかでも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがホスホリルコリン基を有する単量体との共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有する単量体は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。

本発明に使用する活性エステル基を有する単量体は、特に構造を限定しないが、一般式［３］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基の連鎖またはアルキル基を介して結合した化合物であることが好ましい。アルキレンオキシ基Ｙの繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
このような活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル基、等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより低いｐＨにて生理活性物質を固定化できるため好ましい。

本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、アルキレングリコール残基を有する単量体、活性エステル基を有する単量体および架橋可能基を有する単量体を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。

溶媒としてはそれぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基材を変性させないため好ましい。

重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，
２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。

本発明の高分子化合物の化学構造は、アルキレングリコール残基、活性エステル基及び架橋可能な官能基を有する各単量体が共重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。

本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。

本発明の高分子化合物は、基材表面を該高分子化合物で被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制し低分子化合物を固定化する性質を容易に付与することが可能である。

基材表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。

有機溶剤としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール又はメタノールがプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。

本発明の高分子化合物を固相基板に塗布することで容易に基材に生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を与えることができる。これらのことより、該高分子化合物を塗布した基材はバイオチップ用基板に好適に用いることができる。

本発明に用いる固相基板としては、プラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などがあげられる。プラスチック製基板の具体例としては、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレンポ、ポリサロフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルペタクリレートなどがあげられる。
固相基板はマイクロフルイディスクとして用いられる流路を有していても良い。

本発明に用いる低分子化合物は合成化合物、天然由来化合物などあげられるが特に限定されるものではない。あらゆる低分子化合物を基板上に固定化し、たんぱく質と特異的に相互作用を及ぼす低分子化合物を探索する。これまでたんぱく質と相互作用が確認されている低分子化合物としては、ビオチン、ラパマイシン、ジゴキシン、ジギトキシン、シクロスポリンＡ、ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６、レプトマイシン、ラクタシスチン、トラポキシン、フマギリン、ラディシコール、エポネマイシン、ミリオシン、パルセノライド、ドキソルビシンなどがあげられる。

本発明のバイオチップ用基板を使用して低分子化合物を固定化することにより、たんぱく質と特異的選択性を有する低分子化合物をスクリーニングするためのバイオチップとなる。

本発明の使用方法としては、活性エステルを有しない場合は、細胞抽出タンパク、血液抽出タンパク、アビジン、ＦＫＢＰ、ｍＴＯＲなどの特定のタンパク質を反応させることにより特定の低分子化合物とタンパク質との相互作用を検出するという使用方法がある。

活性エステルを有する場合は、アミノ化された低分子化合物を固定化した後、アルカリ化合物や一級アミノ基を有する化合物で表面を処理し、低分子化合物を固定化した部分以外の活性エステルを不活性化する。その後前記のようにタンパク質と反応させる特定の低分子化合物とタンパク質との相互作用を検出するという使用方法がある。

アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。

一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。

以下に本発明に使用する高分子化合物の合成例を示す。

（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成）
０．０１molのポリエチレングリコールモノメタクリレート（Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００（ｎ＝４） 日本油脂(株)製）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作成しておいた０．０１molのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Aldrich製）と０．０１molのトリエチルアミン（和光純薬(株)製）及びクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１ｈ反応させた後、室温でさらに２ｈ溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。

（高分子化合物の合成例１）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１８８ Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．４ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（高分子化合物の合成例２）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約３００ Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．１０ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．０１ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬（株）製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で２時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３８ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（高分子化合物の合成例３）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約４７５ Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１．５時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１５ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（高分子化合物の合成例４）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１１００ Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．１０ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１６ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（高分子化合物の合成例５）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１８８ Aldrich製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．４ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．４および８．２９ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（高分子化合物の合成例６）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約３００ Aldrich製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．０１ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬（株）製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で２時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３８ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．４および８．３ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（高分子化合物の合成例７）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約４７５ Aldrich製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１．５時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１５ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（高分子化合物の合成例８）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１１００ Aldrich製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１６ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（基板１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成し、酸素プラズマ処理を行った。

（基板２）
マツナミ社製スライドガラス（品番：ＳＤ９００１１）

（高分子化合物の塗布及びバイチップ用基板の作製）
合成例１−８にて得られた高分子化合物をエタノールに溶解し、０．３重量％とした。合成例１−８の０．３ｗｔ％エタノール溶液に基板１、２を浸漬し、風乾して、それぞれバイチップ用基板１−１６を作製した。
コーティングなしの基板１、２をそれぞれバイオチップ用基板１７，１８とした。

（実施例１−４、実施例９−１２、比較例１）
バイオチップ用基板１−４、９−１２、１７にビオチン（和光純薬製：０２３−０８７１１）をスポットしバイオチップを得た。

（実施例５−８、実施例１３−１６、比較例２）
バイオチップ用基板５−８、１３−１６、１８にＥＺ−Ｌｉｎｋ（ＴＭ）ビオチンＰＥＯアミン（和光純薬製：５００−４５４３１）をスポットし、６５℃で１時間処理した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で室温１０分間処理をし、乾燥することによりバイオチップを得た。

（評価）
得られたバイオチップの表面に、Ｃｙ３標識されたストレプトアビジンを１ｕｇ／ｍｌの割合でＣｙ３標識された１０％血清溶液に混合した溶液を適用し、ビオチン―ストレプトアビジン反応を行った。０．１％ドデシル硫酸ナトリウムのＰＢＳ溶液で５分間洗浄した。各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表２に示す。

実施例および比較例における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
実施例は、固定化したビオチンと後から反応させたアビジンが特異的に反応することによりシグナルが得られ、かつバックグランドが低いバイオチップとなった。比較例も同様にビオチンとアビジンの特異的な相互作用によるシグナルが確認できているがバックグランドが高いという結果になった。

Claims (16)

1. 固相基板の表面に低分子化合物を固定化したバイオチップであって、基板表面にアルキレングリコール残基を有する単量体を重合してなる高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ。
2. 前記アルキレングリコール残基を有する単量体が下記の一般式［１］で表されるモノマーである請求項１記載のバイオチップ。
   

   

   （式中Ｒ₁は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ₂は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
3. 前記アルキレングリコール残基を有する単量体がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである請求項２記載のバイオチップ。
4. 前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である請求項３記載のバイオチップ。
5. 前記高分子物質が更に架橋可能な官能基を含む単量体との共重合体である請求項１〜４いずれか記載のバイオチップ。
6. 前記架橋可能な官能基を有する単量体が下記の一般式［２］（式中Ｒ₃は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。ただし、Ｚはなくても構わない。Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃の内、少なくとも１個は加水分解可能基であり、その他はアルキル基を示す。）で表されるものである請求項５記載のバイオチップ。
   

   
7. 一般式［２］中において、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃の内、少なくとも１つはアルコキシル基である請求項６記載のバイオチップ。
8. 前記高分子物質が更に活性エステル基を含む単量体との共重合体であって、前記活性エステル基を介して低分子化合物を固定化することを特徴とする請求項１〜７いずれか記載のバイオチップ。
9. 活性エステル基を有する単量体が下記の一般式［３］（式中R₂は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、または異なるアルキレンオキシ基の連鎖であってもよい。）で表されるものである請求項８記載のバイオチップ。
   

   
10. 活性エステル基を有する単量体がｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４．５−エチレングリコールメタクリレートまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド−４．５−エチレングリコールメタクリレートである請求項９記載のバイオチップ。
11. 固相基板がプラスチック製である請求項１〜１０いずれか記載のバイオチップ。
12. プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項１１記載のバイオチップ。
13. 固相基板がガラス製である請求項１〜１０いずれか記載のバイオチップ。
14. 固相基板に流路が設けてあることを特徴とする請求項１〜１３いずれか記載のバイオチップ
15. 請求項１〜１４いずれか記載のバイオチップに生物由来物質を反応させることを特徴とするバイオチップの使用方法
16. 請求項８〜１０いずれか記載のバイオチップをアルカリ処理した後、生物由来物質を反応させることを特徴とするバイオチップの使用方法。