JP4347212B2 - バイオチップ用基板の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生理活性物質と親和性を有する物質を固相表面に配置・固定したバイオチップ用基板の製造方法に関する。

一般的に生理活性物質と親和性を有する物質を固相表面に固定化したバイオチップでは、基板表面内で前記物質の固定化量にバラツキがある。バラツキの原因としてはいくつか考えられ、前記物質の固定化反応時の問題などが挙げられるが、基板表面に前記物質を固定化するために必要な官能基を導入する際の問題が大きい。
基板表面に官能基を導入する際の基板面内の反応性バラツキを解消する方法として、あらかじめ官能基を有した高分子物質を基板表面に塗布する方法がある。しかし、高分子物質の塗布が均一に行われない限り、バラツキの問題が解消できないことに変わりはなかった。

本発明の目的は、生理活性物質と親和性を有する物質を固相表面に配置・固定する際に使用するバイオチップ用基板の製造方法において、生理活性物質と親和性を有する物質を基板表面上に均一に形成させることができ、固定化量のバラツキの低減が可能となるバイオチップ用基板の製造方法を提供することである。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）生理活性物質と親和性を有する物質を固定化し、生理活性物質を検出する際に用いられるバイオチップ用基板の製造方法であって、基板表面に２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を含む単量体、活性エステル基を含む単量体、及びブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体である高分子物質を塗布する工程、及び前記高分子物質に対しての良溶媒である炭素数が１〜４のアルコール溶媒単独あるいはそれらの混合溶媒、又はそれらアルコールと水との混合溶媒中に浸漬させる工程を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
（２）基板の材質がプラスチックである（１）記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（３）前記プラスチックが環状ポリオレフィン又は環状ポリオレフィンを含む混合物である（２）記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（４）前記活性エステル基がｐ-ニトロフェニルエステル基又はＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するものである（１）〜（３）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（５）前記アルコールがエチルアルコールである（４）記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（６）生理活性物質と親和性を有する物質が、核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質の何れか又はこれらの複合物である（１）〜（５）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
（７）生理活性物質と親和性を有する物質および捕獲される生理活性物質が核酸である（１）〜（６）いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。

本発明のバイオチップ用基板の製造方法によれば、生理活性物質と親和性を有する物質を固定化するために必要な官能基を有する高分子物質を均一に基板表面に形成させたバイオチップ用基板が得られ、生理活性物質と親和性を有する物質を基板表面上に均一に形成させることができ、固定化量のバラツキの低減が可能となる。

（基板の素材）
本発明に使用するバイオチップ用基板の材質は、プラスチックであることが好ましい。プラスチックとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂を用いることができるが、熱可塑性樹脂の方が製造効率の観点から好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等が挙げられる。耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα―オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。

前者の例としては、例えばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、および、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。

後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピル、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα―オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。
これら樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、樹脂成分以外に繊維状、球状その他の形状を有する無機物あるいは有機物充填材、または各種添加剤成分を含んでもよい。

（基板の形状）
本発明に使用する基板の形状としては、特に限定しないが、平板状基板あるいは微細流路形状を有した基板等が挙げられる。

（高分子物質）
本発明のバイオチップ用基板は、基板表面に生理活性物質と親和性を有する物質を固定化するための高分子物質を有する。高分子物質としては、ホスホリルコリン基を有する高分子物質であることが好ましく、ホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質であることが更に好ましい。ホスホリルコリン基は生理活性物質や蛍光物質の非特異的吸着を抑制するのに効果があり、活性エステルは生理活性物質を固定化するのに効果がある。

ホスホリルコリン基としては、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンがより好ましい。

本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
このような活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基が好ましい。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基又は活性エステル基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。

（高分子物質の塗布）
本発明において、基板上に高分子物質を塗布し積層させた後、高分子物質に対して良溶媒である溶媒で洗浄、浸漬等により処理することにより表層部が除去され、基板表面に均一な膜厚の高分子膜を形成させることができる。
基板上に高分子物質を塗布し積層させる方法としては、高分子物質を溶解又は分散させた液体中に基板を浸漬する方法等が挙げられる。

（高分子物質に対する良溶媒）
高分子物質に対する良溶媒としては、使用する高分子物質にもよるが、炭素数が１〜４のアルコール溶媒を用いることが好ましい。また、前記アルコール溶媒を混合したもの、あるいは、前記アルコール溶媒と水との混合溶媒でも良い。その際の混合比率は、高分子物質に対して良溶媒になる混合比率であれば、任意の混合比率で良い。沸点などを考慮した溶媒の扱い易さ、また、水との混合し易さの点から、アルコール溶媒はエチルアルコールを用いることが好ましい。

（生理活性物質と親和性を有する物質の固定化）
本発明において使用する生理活性物質を基板表面上に固定化する際には、前記物質を溶解又は分散した液体を点着する方法が好ましい。
本発明において使用する生理活性物質と親和性を有する物質は、核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質の何れか又はこれらの複合物が挙げられ、捕獲される生理活性物質としては、核酸であることが好ましい。

活性エステル基を有する高分子物質を用いた場合、生理活性物質の点着後は、生理活性物質を固定化した以外の基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ−２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、水酸化ナトリウム、アミノエタノール、グリシンがより好ましい。

活性エステル基を有する高分子物質を用いた場合で、固定化する生理活性物質として核酸、アプタマーを用いる場合、活性エステル基との反応性を高めるためアミノ基を導入することが好ましい。タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質もアミノ基を有することが好ましい。アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。

≪実施例１≫
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ、１ｍｍ）に加工してプラスチック基板を作成した。プラスチック基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
その後、エチルアルコールと水との混合溶媒（エチルアルコールと水の混合体積比が３対１）に３分間浸漬させることにより、基板上に高分子物質を膜厚が均一になるように形成した。

（ＤＮＡ溶液の調整）
ＤＮＡ溶液１： ５’末端にアミノ基を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ(配列番号１)シグマジェノシス社製）を０．１μｇ／μＬとなるように所定の緩衝液で溶解した。
ＤＮＡ溶液２： ５’末端にＣｙ３標識を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡ（配列番号２）シグマジェノシス社製）を０．００２μｇ／μＬとなるように所定の緩衝液で溶解した。

（スポット）
ＤＮＡ溶液１を９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて実施例１の基板上にスポットした。スポット終了後、８０℃のオーブン中で静置した。
その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に５分間浸漬することによって活性エステルを不活性化させ、ブロッキング処理を行なった。

（ハイブリダイゼーション）
次にこの基板上にＤＮＡ溶液２を展開しカバーガラスで覆い、さらに６５℃の多湿容器内で３時間静置することで、固定化されたオリゴＤＮＡとＣｙ３標識オリゴＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行なった。その後、０．５重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、２×ＳＳＣ中、０．２×ＳＳＣ中、０．０２×ＳＳＣ中の順で洗浄することにより、ＤＮＡハイブリダイゼーション後の基板を作成した。

（高分子物質膜厚評価）
実施例１の手法で基板表面上に形成された高分子物質膜の膜厚測定には、自動エリプソメータ「ＤＨＡ−ＸＡ」（溝尻光学工業所社製）を用いた。使用レーザーはＨｅ−Ｎｅレーザー（波長は６３２．８ｎｍ）、入射角度は７０°である。基板表面内で概ね等間隔となるように１２箇所を選び膜厚測定し、膜厚のバラツキを評価した。

高分子物質の膜厚および膜厚バラツキを表１に示す。

（ハイブリダイゼーション評価）
ＤＮＡハイブリダイゼーション後の蛍光カウント値の測定には、マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いてスポットの蛍光を検出した。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度４０％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍである。スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いてスポットの蛍光量を数値化した。

スポットの蛍光量および蛍光量のバラツキを表２に示す。

≪実施例２≫
実施例１記載のプラスチック基板を、実施例１記載の共重合体の０．０５重量％エタノール溶液に浸漬させ、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
その後、実施例１記載のエチルアルコールと水の混合溶媒に３分間浸漬させた。

≪比較例１≫
実施例１と同様に、スライドガラス形状に加工した飽和環状ポリオレフィン樹脂基板を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．３重量％エタノール溶液に浸漬させ、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。この基板を用いて実施例１と同様に評価した。結果を表１および表２に示す。

≪比較例２≫
比較例１と同様の手法で、比較例１記載の共重合体の０．０５重量％エタノール溶液に浸漬させ、プラスチック基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入し、比較例１と同様の手法で評価した。結果を表１および表２に示す。

実施例１および２では、比較例１および２と比較して、膜厚のバラツキが低減される結果となった。この結果は、本発明の効果を支持するものであった。

実施例１および２では、比較例１および２と比較して、スポット蛍光量のバラツキが低減される結果となった。この結果は、実施例の場合の方が基板上に核酸が均一に固定化されていたことを意味し、膜厚バラツキの場合と同様、本発明の効果を支持するものであった。

Claims (7)

1. 生理活性物質と親和性を有する物質を固定化し、生理活性物質を検出する際に用いられるバイオチップ用基板の製造方法であって、基板表面に２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を含む単量体、活性エステル基を含む単量体、及びブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体である高分子物質を塗布する工程、及び前記高分子物質に対しての良溶媒である炭素数が１〜４のアルコール溶媒単独あるいはそれらの混合溶媒、又はそれらアルコールと水との混合溶媒中に浸漬させる工程を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
2. 基板の材質がプラスチックである請求項１記載のバイオチップ用基板の製造方法。
3. 前記プラスチックが環状ポリオレフィン又は環状ポリオレフィンを含む混合物である請求項２記載のバイオチップ用基板の製造方法。
4. 前記活性エステル基がｐ-ニトロフェニルエステル基又はＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するものである請求項１〜３いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
5. 前記アルコールがエチルアルコールである請求項４記載のバイオチップ用基板の製造方法。
6. 生理活性物質と親和性を有する物質が、核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質の何れか又はこれらの複合物である請求項１〜５いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。
7. 生理活性物質と親和性を有する物質および捕獲される生理活性物質が核酸である請求項１〜６いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。