KR101268553B1 - 의료 재료용 폴리머 화합물 및 상기 폴리머 화합물을사용한 바이오칩 기판 - Google Patents

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마이클 패트릭 콜먼
도미니크 지치
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소마로직, 인크.
스미토모 베이클라이트 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 단백질, 핵산 등의 검출 및 분석에 사용되는 경우, 검출 대상 물질의 비특이적인 흡착 또는 결합을 억제하여, 검출 정밀도가 높은 바이오칩 기판을 제공한다. 본 발명의 바이오칩 기판은, 고상 기판의 표면에 생리 활성 물질을 고정화하기 위한 것으로서, 상기 기판의 표면에, 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머, 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머 및 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머를 공중합함으로써 얻어지는 폴리머 화합물을 포함하는 층을 가지는 것을 특징으로 한다.
의료 재료, 바이오칩 기판, 에틸렌계 불포화 중합성 모노머, 비특이적 흡착, 생리 활성 물질

Description

의료 재료용 폴리머 화합물 및 상기 폴리머 화합물을 사용한 바이오칩 기판 {POLYMER COMPOUND FOR BIOMEDICAL USE AND BIOCHIP SUBSTRATE USING SUCH A POLYMER COMPOUND}
본 발명은, 생리 활성 물질을 고정화하는 기능을 가지는 의료 재료용 폴리머 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 폴리머 화합물을 포함하는 표면 코팅 재료, 및 상기 폴리머 화합물을 사용한 바이오칩 기판에 관한 것이다.
전통적으로, 유전자 활성의 평가나, 질환 프로세스 또는 약리학적 효과의 생물학적 프로세스를 포함하는 생물학적 프로세스의 해독을 위한 다양한 시도는 게노믹스(genomics)에 초점을 맞추어 왔다. 그러나, 프로테오믹스(proteomics)는 세포의 생물학적 기능에 대해서 보다 상세한 정보를 제공한다. 프로테오믹스는, 유전자 수준보다 오히려 단백질 수준에서의 발현을 검출하고, 정량함으로써, 유전자 활성의 정성적 및 정량적 측정을 포함한다. 또한, 프로테오믹스는 단백질 번역 후의 수정과 단백질 간의 상호 작용 등과 같은, 유전자를 코딩하지 않는 분야의 연구를 포함한다.
최근에는 방대한 게놈 정보의 입수가 가능해졌다. 이에 따라, 프로테오믹스 연구에 있어서 신속 고효율화(high throughput)가 요구되고 있다. 이를 위한 분자 어레이로서 DNA 칩이 실용화되어 왔다. 한편, 생체 기능에 있어서 가장 복잡하고 다양한 단백질을 검출하기 위해서 단백질 칩이 제안되어, 최근에도 연구가 진행되고 있다. 단백질 칩이란, 단백질, 또는 이러한 단백질을 포착하는 분자를 칩(미세 기판 또는 입자) 표면에 고정화한 것을 총칭한다.
그러나, 현재의 단백질 칩은 일반적으로 DNA 칩의 연장선으로서 개발된다. 이에 따라, 유리 기판이나 입자와 같은 칩의 표면에, 단백질 또는 단백질을 포착하는 분자를 고정하기 위한 시도가 있었다 (예를 들면, 일본특개 2001-116750호 공보 참조).
단백질 칩의 신호 검출에 있어서 S/N 비를 저하시키는 한 가지 원인으로서는, 기판에 대한 검출 대상 물질의 비특이적 흡착(예를 들면, Hayashizaki, Y. 및 Okazaki, K., 2000, "Sure to Get data: Practical Manual of DNA Microarray", pp.57, Yodosha, Tokyo 참조)을 들 수 있다.
단백질 등을 고정화하는 방법으로서는 현재 2가지 방법이 실시되고 있다. 그 중 한 가지 방법은 단백질의 물리적 흡착에 의한 고정화 방법이다. 이 방법에서는 단백질을 고정화한 후, 2차 항체의 비특이적 흡착을 방지하기 위해, 흡착방지제로 코팅한다. 그러나, 이들 흡착방지제는 비특이적 흡착을 방지하기에 충분하지 않다. 또한, 1차 항체를 고정화한 후에 상기 흡착방지제를 코팅하기 때문에, 고정화된 단백질에 흡착방지제가 코팅되어, 상기 바이오칩과 2차 항체 간의 반응이 억제된다는 문제가 있었다. 이에 따라, 1차 항체를 고정화한 다음, 흡착방지제를 코팅하지 않은 상태에서, 생리 활성 물질의 비특이적 흡착량이 적은 바이오칩이 필요 한 실정이다.
전술한 문제점을 해결하기 위해, 생리 활성 물질의 비특이적 흡착을 억제할 수 있는 바이오칩이 요구되고 있다. 이러한 바이오칩을 사용하는 경우에는 단백질이 포착된 이후의 세정 공정에서 기판에 고정화된 단백질 또는 그것을 포착하는 분자가 유출됨으로써, 신호가 저하된다는 문제가 있었다. 이 문제를 해결하기 위한 하나의 접근 방법에 따르면, 작용기, 스페이서기(spacer group) 및 결합기(bonding group)를 포함하는 활성 성분, 가교용 성분, 및 매트릭스 형성 성분을 지지체 상에 피복하여, 경화시킴으로써, 상기 지지체 상에 견고하게 결합된 기능성 표면을 형성할 수 있다고 공개되어 있다 (예를 들면, 일본특허출원 제2004-531390호 공보(PCT 특허출원 국제 단계에서 공개)). 그러나, 전술한 방법에서는 상기 지지체 상에서 저분자량 성분의 경화가 진행된다. 그러므로, 상기 지지체가 플라스틱 기판인 경우에는 휨(warp)이나 변형이 생길 수 있다. 또한, 네트워크형으로 서로 얽힌 매트릭스가 형성되기 때문에, 생리 활성 물질을 고정화하기 위한 작용기의 반응이 억제되거나, 고정화된 생리 활성 물질의 기능 발현의 재현성이 양호하지 않다는 등의 문제가 있다. 뿐만 아니라, 상기 매트릭스 내부로 침입한 단백질을 세정하기 어렵기 때문에 비특이적 흡착을 충분히 억제할 수 없다는 문제가 있다.
(본 발명이 해결하고자 하는 과제)
본 발명은, 생리 활성 물질의 고정화 능력이 우수하고, 단백질에 대한 비특이적 흡착이 적고, 세정 공정에서도 용해나 열화되지 않는 화학적 및 물리적 안정성을 가지며, 플라스틱 기판 표면에도 적절하게 코팅 가능한 의료용 폴리머 화합물을 제공하는 것, 아울러, 상기 폴리머 화합물을 사용하여, S/N 비가 높은 바이오칩 기판을 제공하는 것을 목적으로 한다.
(과제를 해결하기 위한 수단)
본 발명자들은, 생리 활성 물질의 고정화 능력이 우수하며, 단백질에 대한 비특이적 흡착을 억제할 수 있는 의료 재료용 폴리머 화합물을 개발하기 위해 면밀히 연구하였다. 그 결과, 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a), 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b) 및 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)를 공중합하여 얻어지는 의료 재료용 폴리머 화합물이, 생리 활성 물질의 고정화 능력이 우수하고, 비특이적 흡착이 적으며, 휨이나 파동 등의 문제가 발생하지 않으면서 플라스틱 기판에 균일하게 코팅될 수 있으므로, 바이오칩에 바람직하게 이용될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이러한 발견을 토대로 본 발명을 달성하였다.
즉, 본 발명은,
(1) 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a), 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b) 및 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)를 공중합하여 얻어지는, 의료 재료용 폴리머 화합물,
(2) 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a), 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b), 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c) 및 알킬기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(d)를 공중합함에 의해 얻어지는 의료 재료용 폴리머 화합물,
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a)가 하기 일반식 [1]로 표시되는 모노머인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물:
일반식 [1]
Figure 112007063018863-pct00001
(상기 일반식에서, R1은 수소 원자 또는 메틸기이고, R2는 수소 원자, 또는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; X는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 알킬렌 글리콜 잔기이고, p는 1 내지 100의 정수이며; p가 2 이상, 100 이하의 정수인 경우, 상기 반복되는 X는 서로 동일하거나, 상이할 수 있음),
(4) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a)가, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 아크릴레이트 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물,
(5) (4)에 있어서, 상기 메톡시폴리에틸렌 글리콜 아크릴레이트 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트의 에틸렌 글리콜 잔기의 평균 반복수가 3 내지 100인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물,
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b)의 작용기가, 알데히드기, 활성 에스테르, 에폭시기, 비닐 설폰기 및 비오틴(biotin) 중에서 선택되는 하나 이상의 작용기인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물,
(7) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b)가, 하기 일반식 [2]로 표시되는 활성 에스테르를 가지는 모노머인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물:
일반식 [2]
Figure 112007063018863-pct00002
(상기 일반식에서, R3는 수소 원자 또는 메틸기이고, Y는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 알킬렌 글리콜 잔기 또는 알킬기이고; W는 활성 에스테르기이고; q는 1 내지 20의 정수이고; q가 2 이상, 20 이하의 정수인 경우, 상기 반복되는 Y는 서로 동일하거나, 상이할 수 있음),
(8) (6) 또는 (7)에 있어서, 상기 활성 에스테르가 p-니트로페닐 에스테르 또는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물,
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)의 가교 가능한 작용기가, 알콕시실릴, 에폭시, 아크릴 및 메타크릴 중에서 선택되는 하나 이상의 작용기인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물,
(10) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)가, 하기 일반식 [3]으로 표시되는 알콕시실릴을 가지는 모노머인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물:
화학식 [3]
Figure 112007063018863-pct00003
(상기 일반식에서, R4는 수소 원자 또는 메틸기이고, Z는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; A1, A2 및 A3 중 적어도 하나는 가수분해 가능한 알콕시기이며, 그 나머지는 알킬기임),
(11) (2) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 알킬기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(d)가, n-부틸 메타크릴레이트, n-도데실 메타크릴레이트, n-옥틸 메타크릴레이트 및 사이클로헥실 메타크릴레이트 중에서 선택되는 하나 이상의 모노머인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물,
(12) (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 의료 재료용 폴리머 화합물을 포함하는 의료 재료용 표면 코팅 재료,
(13) (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 의료 재료용 폴리머 화합물을 포함하는 층이 지지 기판의 표면에 형성된 바이오칩 기판,
(14) (13)에 있어서, 상기 지지 기판이 플라스틱으로 제조된 것을 특징으로 하는 바이오칩 기판,
(15) (14)에 있어서, 상기 플라스틱이 포화 환형 폴리올레핀인 것을 특징으로 하는 바이오칩 기판,
(16) (13) 내지 (15) 중 어느 하나의 바이오칩 기판의 제조 방법으로서, (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 의료 재료용 폴리머 화합물을 포함하는 용액을 지지 기판의 표면에 도포하는 단계, 및 도포 후, 상기 폴리머 화합물을 가교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법,
(17) (13) 내지 (15) 중 어느 하나의 바이오칩 기판에 생리 활성 물질을 고정화한 바이오칩,
(18) (17)에 있어서, 상기 생리 활성 물질이, 핵산, 앱타머(aptamer), 단백질, 올리고펩타이드, 당사슬(sugar chain) 및 당단백질 중에서 선택되는 하나 이상의 생리 활성 물질인 것을 특징으로 하는 바이오칩.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면, 생리 활성 물질의 고정화 능력이 우수하고, 단백질에 대한 비특이적 흡착이 적고, 세정 공정에서도 용해나 열화되지 않는 화학적 및 물리적 안정성을 가지며, 플라스틱 기판 표면에도 적절하게 코팅 가능한 의료용 폴리머 화합물을 제공하는 것, 아울러, 상기 폴리머 화합물을 사용하여, S/N 비가 높은 바이오칩 기판을 제공할 수 있다.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
본 발명의 폴리머 화합물은, 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a), 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b) 및 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)를 공중합하여 얻어지는 것을 특징으로 한다. 이 폴리머 화합물은, 생리 활성 물질의 비특이적 흡착을 억제하는 성질, 생리 활성 물질을 고정화하는 성질 및 폴리머 사슬을 가교시키는 성질을 겸비한 폴리머이다. 상기 폴리머 화합물에서, 상기 알킬렌 글리콜 잔기는 생리 활성 물질의 비특이적 흡착을 억제하는 역할을 하고, 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기는 생리 활성 물질을 고정화하는 역할을 한다.
본 발명에 사용되는 상기 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a)의 구조는 특별히 한정되지는 않지만, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 알킬렌 글리콜 잔기 X와 (메타)아크릴기의 사슬을 포함하고, 하기 일반식 (1)로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다. 본 명세서에서 "알킬렌 글리콜 잔기"란, 알킬렌 글리콜(HO-R-OH, 여기서, R은 알킬렌기임)의 하나 또는 2개의 말단 하이드록시기와 기타 화합물 간의 축합 반응 후에 잔류하는 "알킬렌옥시기"(-R-O-, 여기서, R은 알킬렌기임)를 의미한다. 예를 들면, 메틸렌 글리콜(HO-CH2-OH)의 "알킬렌 글리콜 잔기"는 메틸렌옥시기(-CH2-O-)이고, 에틸렌 글리콜(HO-CH2-CH2-OH)의 "알킬렌 글리콜 잔기"는 에틸렌옥시기(-CH2-CH2-O-)이다.
일반식 (1)
Figure 112007063018863-pct00004
일반식 (1)에서, 상기 알킬렌 글리콜 잔기 X의 탄소 개수는 1 내지 10개이고, 바람직하게는 1 내지 6개이고, 더욱 바람직하게는 2 내지 4개이고, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 3개이며, 가장 바람직하게는 2개이다. 상기 알킬렌 글리콜 잔기 X의 반복수 p는 1 내지 100의 정수이고, 바람직하게는 2 내지 100의 정수이고, 더욱 바람직하게는 2 내지 95의 정수이며, 가장 바람직하게는 20 내지 90의 정수이다. 상기 반복수 p가 2 이상, 100 이하인 경우, 상기 반복되는 알킬렌 글리콜 잔기 X의 탄소수는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a)를 예시하면, 메톡시폴리에틸렌글리콜(메타)아크릴레이트; 2-하이드록시에틸(메타)아크릴레이트, 2-하이드록시프로필(메타)아크릴레이트 및 2-하이드록시부틸(메타)아크릴레이트 등과 같은, 하나의 하이드록시기로 치환된 에스테르의 (메타)아크릴레이트; 글리세롤모노(메타)아크릴레이트; 폴리프로필렌글리콜을 측쇄를 가지는 (메타)아크릴레이트; 2-메톡시에틸(메타)아크릴레이트; 2-에톡시에틸(메타)아크릴레이트; 메톡시디에틸렌글리콜(메타)아크릴레이트; 에톡시디에틸렌글리콜(메타)아크릴레이트; 에톡시폴리에틸렌글리콜(메타)아크릴레이트 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 입수 관점에서 볼 때, 메톡시폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트가 바람직하다. 본 발명에서 "(메타)아크릴레이트"란, 메타크릴레이트 또는 아크릴레이트를 칭한다.
본 발명에서 "생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b)"의 작용기를 예시하면, 화학적 활성을 가지는 기, 수용체기(receptor group), 리간드기 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 상기 작용기의 구체적인 예를 들면, 알데히드기, 활성 에스테르, 에폭시기, 비닐 설폰기, 비오틴, 티올기(thiol group), 아미노기, 이소시아네이트기, 하이드록시기, 아크릴레이트기, 말레이미드기, 하이드라지드기, 아지드기(azide group), 아미도기(amido group), 설포네이트기, 스트렙토아비딘(streptoavidin), 금속 킬레이트 등이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 이들 중에서도, 생리 활성 물질에 많이 포함된 아미노기와의 반응성을 고려할 때에는 알데히드기, 활성 에스테르, 에폭시기, 비닐 설폰기가 바람직하고, 생리 활성 물질과의 결합 상수가 높다는 점을 고려할 때에는 비오틴이 바람직하다. 특히, 상기 모노머의 보존 안정성을 고려할 때, 활성 에스테르가 가장 바람직하다.
본 발명에서, 상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b)의 구조는 특별히 한정되지는 않지만, 하기 일반식 (2)로 표시되며, (메타)아크릴기와 활성 에스테르기가, 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 알킬렌 글리콜 잔기의 연쇄, 또는 알킬기에 의해 결합된 화합물인 것이 바람직하다:
일반식 (2)
Figure 112007063018863-pct00005
일반식 (2)에서, 상기 알킬렌 글리콜 잔기 Y의 탄소 개수는 1 내지 10개이고, 바람직하게는 1 내지 6개이고, 더욱 바람직하게는 2 내지 4개이고, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 3개이며, 가장 바람직하게는 2개이다. 상기 알킬렌 글리콜 잔기 Y의 반복수 q는 1 내지 20의 정수이고, 바람직하게는 2 내지 18의 정수이고, 더욱 바람직하게는 3 내지 16의 정수이며, 가장 바람직하게는 4 내지 14의 정수이다. 상기 반복수 q가 2 이상, 20 이하인 경우, 상기 반복되는 알킬렌 글리콜 잔기의 탄소수는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명에서 "활성 에스테르기"란, 상기 에스테르기의 하나의 치환체로서 고산성도의 전자 유인성 기(electron attracting group)를 가짐으로 인해, 친핵성 반응에 대하여 활성화된 에스테르기, 즉, 반응 활성이 높은 에스테르기를 의미하며, 각종 화학 합성, 예컨대, 폴리머 화학 분야 또는 펩타이드 합성 분야 등에서 관용되고 있다. 실제로, 페놀 에스테르, 티오페놀 에스테르, N-하이드록시아민 에스테르, 또는 헤테로사이클릭 하이드록시 화합물의 에스테르 등은 알킬 에스테르 등에 비해 훨씬 높은 활성을 가지는 활성 에스테르기로서 알려져 있다.
이러한 활성 에스테르를 예시하면, p-니트로페닐 활성 에스테르기, N-하이드록시숙신이미드 활성 에스테르기, 숙신이미드 활성 에스테르기, 프탈산 이미드 활성 에스테르기, 5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드 활성 에스테르기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, p-니트로페닐 활성 에스테르기 또는 N-하이드록시숙신이미드 활성 에스테르기가 바람직하며, p-니트로페닐 활성 에스테르기가 가장 바람직하다.
상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b)의 바람직한 조성비는 1 내지 50 몰%이고, 바람직하게는 1 내지 30 몰%, 가장 바람직하게는 1 내지 20 몰%이다.
본 발명에서 상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)로서는, 상기 폴리머 화합물을 합성하는 동안 상기 가교 가능한 작용기의 반응이 진행되지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 가교 가능한 작용기를 예시하면, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 작용기 또는 에폭시기, (메타)아크릴기, 글리시딜기 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 가교 공정이 용이하다는 점을 고려할 때, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 작용기 또는 에폭시기, 및 글리시딜기가 바람직하다. 또한, 보다 낮은 온도 환경에서의 가교 가능성을 고려할 때, 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 작용기가 더욱 바람직하다.
상기 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 작용기는, 물과 접촉하면, 용이하게 가수분해되어, 실라놀기를 생성하는 기를 의미한다. 이러한 작용기를 예시하면, 실릴 할라이드기, 알콕시 실릴기, 페녹시 실릴기, 아세톡시 실릴기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 할로겐을 포함하지 않는다는 점을 고려할 때, 알콕시 실릴기, 페녹시 실릴기 및 아세톡시 실릴기가 바람직하다. 특히, 실라놀기의 생성이 용이하다는 점을 고려할 때, 알콕시 실릴기가 가장 바람직하다.
상기 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머는, 하기 일반식 (3)으로 표시되며, (메타)아크릴기와 알콕시 실릴기가 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 알킬 사슬에 의해, 또는 서로 직접 결합한 에틸렌계 불포화 중합성 모노머인 것이 바람직하다:
일반식 (3)
Figure 112007063018863-pct00006
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알콕시 실릴기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머를 예시하면, 3-(메타)아크릴옥시 프로페닐 트리메톡시실란, 3-(메타)아크릴옥시 프로필 비스(트리메틸 실록시)메틸 실란, 3-(메타)아크릴옥시 프로필 디메틸 메톡시 실란, 3-(메타)아크릴옥시 프로필 디메틸 에톡시 실란, 3-(메타)아크릴옥시 프로필 메틸 디메톡시 실란, 3-(메타)아크릴옥시 프로필 메틸 디에톡시실란, 3-(메타)아크릴옥시 프로필 트리메톡시실란, 3-(메타)아크릴옥시 프로필 트리에톡시 실란, 3-(메타)아크릴옥시 프로필 트리스(메톡시에톡시)실란, 8-(메타)아크릴옥시 옥타닐 트리메톡시 실란, 11-(메타)아크릴옥시 운데닐 트리메톡시 실란 등과 같은 (메타)아크릴옥시 알킬 실란 화합물을 들 수 있다. 그 중에서도, 3-메타크릴옥시 프로필 트리메톡시 실란, 3-메타크릴옥시 프로필 트리에톡시실란, 3-메타크릴옥시 프로필 디메틸메톡시 실란, 및 3-메타크릴옥시 프로필 디메틸 에톡시실란은, 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머와의 공중합성이 우수하다는 점, 및 입수가 용이하다는 점 등에서 바람직하다. 본 발명에서는 상기 알콕시 실릴기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머를 단독으로, 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.
상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)의 바람직한 조성비는 1∼20 몰%이고, 더욱 바람직하게는 2∼15 몰%, 가장 바람직하게는 2∼10 몰%이다.
본 발명에 사용되는 폴리머 화합물은, 상기 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머, 상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머 및 상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머 이외에, 전술한 기 이외의 다른 기를 가지는 다른 에틸렌계 불포화 중합성 모노머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 알킬기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(d)를 공중합시킬 수 있다. 이러한 알킬기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(d)로서는 n-부틸 메타크릴레이트, n-도데실 메타크릴레이트 또는 n-옥틸 메타크릴레이트가 바람직하다.
본 발명의 폴리머 화합물의 합성 방법은 특별히 한정되지는 않는다. 그러나, 합성이 용이하다는 점을 고려할 때, 적어도, 상기 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a), 상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b) 및 상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)를 포함하는 혼합물을, 중합 개시제의 존재 하에 용매중에서 라디칼 중합하는 것이 바람직하다.
상기 용매로서는 각각의 에틸렌계 불포화 중합성 모노머가 용해되는 것이면 특별히 제한되지는 않으며, 본 발명에 사용 가능한 용매를 예시하면, 메탄올, 에탄올, t-부틸 알코올, 벤젠, 톨루엔, 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디옥산, 디클로로메탄, 클로로포름 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 이들 용매를 단독으로, 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 상기 폴리머 화합물을 플라스틱 기판에 도포하는 경우에는, 기재를 변성시키지 않는다는 점에 있어서 에탄올 또는 메탄올이 용매로서 바람직하다.
상기 중합 개시제로서는 통상적인 라디칼 개시제(radical initiator)를 사용할 수 있고, 사용 가능한 중합 개시제를 예시하면, 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(이하, "AIBN"이라 칭함) 및 1,1'-아조비스(사이클로헥산-1-카르보니트릴) 등과 같은 아조 화합물; 및 벤조일 퍼옥사이드(benzoyl peroxide) 및 라우릴 퍼옥사이드 등과 같은 유기 과산화물 등을 들 수 있다.
본 발명의 폴리머 화합물의 화학 구조는, 상기 폴리머 화합물이 적어도, 각각의 알킬렌 글리콜 잔기, 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기 및 가교 가능한 작용기를 가지는 각각의 에틸렌계 불포화 중합성 모노머를 공중합하여 얻어진 것이라면, 랜덤 코폴리머, 블록 코폴리머 및 그래프트 코폴리머 형태와 같은 코폴리머 형태에 상관없이, 특별한 구조로 제한되지는 않는다.
본 발명의 폴리머 화합물의 분자량은, 폴리머 화합물과 미반응된 에틸렌계 불포화 중합성 모노머의 분리 정제가 용이하는 점에서, 수평균 분자량이 5,000 이상인 것이 바람직하고, 10,000 이상인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 폴리머 화합물을 사용하여, 지지 기판의 표면을 상기 폴리머 화합물로 코팅함으로써, 생리 활성 물질의 비특이적 흡착을 억제하는 성질, 소정의 생리 활성 물질을 고정화하는 성질을 용이하게 부여할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리머 화합물은 복수의 폴리머 주쇄를 가교하는 성질을 가지기 때문에, 상기 지지 기판의 표면을 코팅한 후에 가교시키는 것이 가능하다. 이에 따라, 상기 기판 상의 폴리머의 화합물은 불용성을 가질 수 있고, 이로써, 상기 지지 기판의 세정으로 인한 신호의 저하를 저감시킬 수 있다.
상기 지지 기판 표면에 상기 폴리머 화합물을 코팅시키는 것은, (i) 유기 용매에 폴리머 화합물을, 0.05∼10 중량% 농도가 되도록 용해한 폴리머 화합물 용액을 제조하는 단계, (ii) 침지 또는 블로잉(blowing) 등과 같은 공지된 방법에 의해 상기 지지 기판의 표면에 상기 폴리머 화합물 용액을 도포하는 단계, 및 (iii) 도포된 용액을 실온 환경 또는 가온 환경에서 건조시키는 단계를 포함하는 단계에 의해 달성될 수 있다. 상기 폴리머 화합물을 코팅한 다음에는, 가교 가능한 작용기에 따라서 적절한 방법을 사용하여, 복수의 폴리머 주쇄를 가교시킨다. 상기 가교 가능한 작용기가 가수분해에 의해 실라놀기를 생성하는 작용기인 경우, 상기 폴리머 화합물의 코팅 시, 유기 용매 중에 물을 함유시킨 혼합 용액을 사용할 수도 있다. 함유된 물에 의해 가수분해가 일어나고, 이로써, 상기 합성된 폴리머에 실라놀기가 생성된다. 아울러, 합성된 폴리머를 가열함으로써, 복수의 주쇄가 결합되어, 상기 폴리머 화합물이 불용성을 가지게 된다. 용액 제조의 용이성을 고려할 때, 함수량(water content)은 약 0.01 내지 15 중량%일 수 있다.
상기 유기 용매로서는, 에탄올, 메탄올, t-부틸 알코올, 벤젠, 톨루엔, 테트라하이드로퓨란, 디옥산, 디클로로메탄, 클로로포름, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 용매를 단독으로, 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있다. 특히, 에탄올 및 메탄올은 플라스틱 기판을 변성시키지 않고, 건조가 용이하기 때문에 바람직하다. 또한, 에탄올 및 메탄올은, 상기 용액 중에서 상기 폴리머 화합물을 가수분해시키는 경우에도 물과 적절한 비율로 혼합될 수 있기 때문에 바람직하게 사용된다.
본 발명의 폴리머 화합물을 용해한 용액을 지지 기판의 표면에 도포한 다음, 건조시키는 공정에서, 상기 폴리머 화합물 중의 실라놀기는, 다른 폴리머 화합물 중의 실라놀기, 하이드록시기, 아미노기 등과 탈수 축합됨으로써, 가교 결합을 형성한다. 또한, 상기 지지 기판의 표면 상에 하이드록시기, 카르보닐기, 아미노기 등이 존재하는 경우 역시, 마찬가지로 탈수 축합되어, 상기 지지 기판의 표면과 화학적 결합을 형성할 수 있다. 실라놀기의 탈수 축합에 의해 형성되는 공유 결합은 가수분해되기 어렵기 때문에, 상기 지지 기판의 표면에 코팅된 폴리머 화합물은 용이하게 용해된다거나, 기재로부터 이탈한다거나 하는 일이 거의 없다. 상기 실라놀기의 탈수 축합은 가열 처리에 의해 촉진된다. 상기 가열 처리는, 상기 폴리머 화합물이 열에 의해 변성되지 않는 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 가열 처리는 60 내지 120℃ 범위의 온도에서 5분 내지 24시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 바이오칩 기판의 소재로서는, 유리, 플라스틱, 금속 및 기타 재료를 사용할 수 있으나, 표면 처리의 용이성 및 양산성을 고려할 때, 플라스틱을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하기로는, 열가소성 수지를 사용한다.
상기 열가소성 수지로서는, 형광 발생량이 적은 열가소성 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 등의 직쇄형 폴리올레핀; 환형 폴리올레핀; 플루오르 함유 수지 등을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 포화 환형 폴리올레핀은 내열성, 내약품성, 저형광성 및 성형성이 특히 우수하기 때문에, 더욱 바람직하기로는, 포화 환형 폴리올레핀을 사용한다. 여기서, 포화 환형 폴리올레핀이란, 환형 올레핀 구조를 가지는 단독의 중합체를 수소 첨가하거나, 환형 올레핀과 α-올레핀의 코폴리머를 수소 첨가하여 얻어진 포화 중합체를 일컫는다.
상기 지지 기판의 표면과 상기 표면에 코팅되는 폴리머 화합물 간의 밀착성을 향상시키기 위해서, 상기 지지 기판의 표면을 활성화하는 것이 바람직하다. 상기 표면의 활성화 방법을 예시하면, 산소 분위기, 아르곤 분위기, 질소 분위기 또는 공기 분위기 등의 조건 하에 플라즈마 처리하는 방법, 또는 ArF 또는 KrF 등의 엑시머 레이저로 처리하는 방법을 들 수 있다. 특히, 본 발명에서는 산소 분위기 하에 플라즈마 처리하는 방법이 바람직하다.
본 발명의 폴리머 화합물을 상기 지지 기판에 도포함에 의해, 기판에 생리 활성 물질의 비특이적 흡착을 억제할 수 있는 바이오칩 기판을 제조할 수 있다. 또한, 상기 폴리머 화합물을 가교함으로써, 상기 지지 기판 상의 폴리머 화합물에 불용성을 부여할 수 있다. 그러므로, 상기 폴리머 화합물이 도포된 지지 기판은 바이오칩용으로서 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 바이오칩 기판을 사용하여, 각종 생리 활성 물질을 고정화할 수 있다. 고정화되는 생리 활성 물질을 예시하면, 핵산, 앱타머(aptamer), 단백질, 올리고펩타이드, 당사슬(sugar chain), 당단백질 등을 들 수 있다. 예컨대, 핵산을 고정화하는 경우에는, 활성 에스테르기와의 반응성을 향상시키기 위해서 아미노기를 도입하는 것이 바람직하다. 아미노기의 도입 위치는 분자쇄 말단 또는 측쇄("분지(branch)"라고도 칭함)일 수 있다. 그러나, 분자쇄 말단에 아미노기가 도입되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에서 생리 활성 물질을 바이오칩 기판 상에 고정화하기 위해서는 상기 생리 활성 물질의 용액 또는 분산액의 액적(droplet)을 점착하는 방법을 적용하는 것이 바람직하다.
액적을 점착한 후, 상기 바이오칩 기판을 방치함으로써, 상기 생리 활성 물질이 표면에 고정화된다. 예를 들면, 아미노화된 핵산을 이용하는 경우, 바이오칩 기판을 실온 내지 80℃ 범위의 온도에서 1시간 동안 방치함으로써, 상기 물질의 고정화가 가능하다. 처리 온도는 고온인 것이 바람직하다. 상기 생리 활성 물질이 용해 또는 분산되는 액체는 알카리성인 것이 바람직하다.
세정 후, 생리 활성 물질이 고정화된 부분을 제외하고, 상기 바이오칩 기판 표면의 작용기를 불활성화 처리한다. 활성 에스테르 또는 알데히드기의 경우, 알칼리 화합물, 또는 1차 아미노기를 가지는 화합물로 불활성화를 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 바람직하게 사용 가능한 알칼리 화합물을 예시하면, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 소듐 카르보네이트, 탄산수소나트륨, 인산수소이나트륨, 칼슘 하이드록사이드, 마그네슘 하이드록사이드, 소듐 보레이트, 리튬 하이드록사이드, 포타슘 포스페이트 등을 들 수 있다.
상기 1차 아미노기를 가지는 화합물로서 바람직한 것을 예시하면, 메틸아민, 에틸아민, 부틸아민, 글리신, 9-아미노아쿠아진(9-aminoaquagene), 아미노부탄올, 4-아미노부티르산, 아미노카프릴산, 아미노에탄올, 5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-펜타놀, 아미노에탄티올 하이드로클로라이드, 아미노에탄티올 황산, 2-(2-아미노에틸아미노)에탄올, 2-아미노에틸 디하이드로젼 포스페이트, 아미노에틸 하이드로젼설페이트(aminoethyl hydrogensulfate), 4-(2-아미노에틸)모르폴린, 5-아미노플루오레세인(5-aminofluorescein), 6-아미노헥산산, 아미노헥실 셀룰로스, p-아미노히푸르산(p-aminohippuric acid), 2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올, 5-아미노이소프탈산, 아미노메탄, 아미노페놀, 2-아미노옥탄, 2-아미노옥탄산, 1-아미노-2-프로판올, 3-아미노-1-프로판올, 3-아미노프로펜, 3-아미노프로피오니트릴, 아미노피리딘, 11-아미노운데칸산, 아미노살리실산, 아미노퀴놀린, 4-아미노프탈로니트릴, 3-아미노프탈이미드, p-아미노프로피오페논, 아미노페닐 아세트산, 아미노나프탈렌 등을 들 수 있다. 특히, 아미노 에탄올 및 글리신이 가장 바람직하다.
이와 같이 생리 활성 물질을 고정화함으로써 얻어진 바이오칩은 면역 진단 시스템, 유전자 마이크로어레이 시스템(gene microarray system), 단백질 마이크로 어레이 시스템 및 미세유체역학 소자(microfluidic device)를 포함하는 다양한 분석 시스템에 사용될 수 있다.
<p-니트로페닐옥시카르보닐-폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(MEONP)의 합성>
O.O1 몰의 폴리에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트(Blenmer PE 200 (n=4) NOF Corporation에서 제조)를 20 mL의 클로로포름에 용해시켰다. 그런 다음, 얻어진 용액을 -30℃로 냉각하였다. 상기 용액의 온도를 -30℃로 유지시키면서, 이 용액에, p-니트로페닐 클로로포르메이트(Aldrich에서 제조), O.O1 몰의 트리에틸아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 제조) 및 20 mL의 클로로포름으로부터 미리 제조해 둔 0.01 몰의 균일 용액을 천천히 적하하였다. -30℃에서 1 시간 반응시킨 후, 상기 용액을 2시간 더 교반하였다. 그 후, 상기 반응액으로부터 여과에 의해 염을 제거하고, 상기 용매를 증류에 의해 제거하여, p-니트로페닐옥시카르보닐-폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(MEONP)를 얻었다. 얻어진 모노머를 1H-NMR로 측정하였다(중클로로포름 용매 중에서). 그 결과, 에틸렌 글리콜 잔기가 4.5 단위 포함되어 있음을 확인하였다.
(폴리머 화합물의 합성예 1)
폴리에틸렌 글리콜 메틸에테르 메타크릴레이트(메톡시폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트라고도 칭함) (PEGMA, 수평균 분자량 Mn=약 188, Aldrich에서 제조), p-니트로페닐옥시카르보닐-폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(MEONP), 및 3-메타크 릴옥시프로필디메틸에톡시 실란(MPDES, GELEST, INC.에서 제조)을 각각, 차례로 O.90 몰/L, O.05 몰/L 및 O.05 몰/L의 농도가 되도록 탈수 에탄올에 용해시켜, 모노머 혼합 용액을 제조하였다. 또한, 상기 모노머 혼합 용액에, 0.002 몰/L의 2,2-아조비스이소부티로니트릴(AIBN, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 제조)을 첨가하여, 균일해질 때까지 상기 모노머 혼합 용액을 교반하였다. 그런 다음, 아르곤 가스 분위기 하에, 60℃에서 4시간 반응시킨 후, 상기 반응 용액을 디에틸에테르에 적하하고, 침전물을 수집하였다. 얻어진 폴리머 화합물을 1H-NMR로 측정(중클로로포름 용매 중에서)하였다. MPDES의 Si에 결합된 메틸기에 귀속되고, O.13 ppm 부근에 나타나는 피크, PEGMA의 말단 메톡시기에 귀속되고, 3.4 ppm 부근에 나타나는 피크, 및 MEONP의 벤젠 고리에 귀속되고, 7.4 ppm 및 8.29 ppm 부근에 나타나는 피크의 적분값으로부터, 상기 폴리머 화합물의 조성비를 산출하였다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.
(폴리머 화합물의 합성예 2)
폴리에틸렌 글리콜 메틸에테르 메타크릴레이트(메톡시폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트라고도 칭함) (PEGMA, 수평균 분자량 Mn=약 30O, Aldrich에서 제조), p-니트로페닐옥시카르보닐-폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(MEONP), 및 3-메타크릴옥시프로필디메틸에톡시 실란(MPDES, GELEST, INC.에서 제조)을 각각, 차례로 O.90 몰/L, O.05 몰/L 및 O.05 몰/L의 농도가 되도록 탈수 에탄올에 용해시켜, 모노머 혼합 용액을 제조하였다. 또한, 상기 모노머 혼합 용액에, O.O1 몰/L의 2,2-아조비스이소부티로니트릴(AIBN, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 제조) 을 첨가하여, 균일해질 때까지 상기 모노머 혼합 용액을 교반하였다. 그런 다음, 아르곤 가스 분위기 하에, 60℃에서 2시간 반응시킨 후, 상기 반응 용액을 디에틸에테르에 적하하고, 침전물을 수집하였다. 얻어진 폴리머 화합물을 1H-NMR로 측정(중클로로포름 용매 중에서)하였다. MPDES의 Si에 결합된 메틸기에 귀속되고, O.13 ppm 부근에 나타나는 피크, PEGMA의 말단 메톡시기에 귀속되고, 3.38 ppm 부근에 나타나는 피크, 및 MEONP의 벤젠 고리에 귀속되고, 7.4 ppm 및 8.3 ppm 부근에 나타나는 피크의 적분값으로부터, 상기 폴리머 화합물의 조성비를 산출하였다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.
(폴리머 화합물의 합성예 3)
폴리에틸렌 글리콜 메틸에테르 메타크릴레이트(메톡시폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트라고도 칭함) (PEGMA, 수평균 분자량 Mn=약 475, Aldrich에서 제조), p-니트로페닐옥시카르보닐-폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(MEONP), 및 3-메타크릴옥시프로필디메틸에톡시 실란(MPDES, GELEST, INC.에서 제조)을 각각, 차례로 O.90 몰/L, O.05 몰/L 및 O.05 몰/L의 농도가 되도록 탈수 에탄올에 용해시켜, 모노머 혼합 용액을 제조하였다. 또한, 상기 모노머 혼합 용액에, O.O02 몰/L의 2,2-아조비스이소부티로니트릴(AIBN, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 제조)을 첨가하여, 균일해질 때까지 상기 모노머 혼합 용액을 교반하였다. 그런 다음, 아르곤 가스 분위기 하에, 60℃에서 1.5시간 반응시킨 후, 상기 반응 용액을 디에틸에테르에 적하하고, 침전물을 수집하였다. 얻어진 폴리머 화합물을 1H-NMR로 측정(중클로로포름 용매 중에서)하였다. MPDES의 Si에 결합된 메틸기에 귀속되 고, O.15 ppm 부근에 나타나는 피크, PEGMA의 말단 메톡시기에 귀속되고, 3.35 ppm 부근에 나타나는 피크, 및 MEONP의 벤젠 고리에 귀속되고, 7.6 ppm 및 8.4 ppm 부근에 나타나는 피크의 적분값으로부터, 상기 폴리머 화합물의 조성비를 산출하였다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.
(폴리머 화합물의 합성예 4)
폴리에틸렌 글리콜 메틸에테르 메타크릴레이트(메톡시폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트라고도 칭함) (PEGMA, 수평균 분자량 Mn=약 1100, Aldrich에서 제조), p-니트로페닐옥시카르보닐-폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(MEONP), 및 3-메타크릴옥시프로필디메틸에톡시 실란(MPDES, GELEST, INC.에서 제조)을 각각, 차례로 O.45 몰/L, O.025 몰/L 및 O.025 몰/L의 농도가 되도록 탈수 에탄올에 용해시켜, 모노머 혼합 용액을 제조하였다. 또한, 상기 모노머 혼합 용액에, O.O02 몰/L의 2,2-아조비스이소부티로니트릴(AIBN, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 제조)을 첨가하여, 균일해질 때까지 상기 모노머 혼합 용액을 교반하였다. 그런 다음, 아르곤 가스 분위기 하에, 60℃에서 1시간 반응시킨 후, 상기 반응 용액을 디에틸에테르에 적하하고, 침전물을 수집하였다. 얻어진 폴리머 화합물을 1H-NMR로 측정(중클로로포름 용매 중에서)하였다. MPDES의 Si에 결합된 메틸기에 귀속되고, O.16 ppm 부근에 나타나는 피크, PEGMA의 말단 메톡시기에 귀속되고, 3.35 ppm 부근에 나타나는 피크, 및 MEONP의 벤젠 고리에 귀속되고, 7.6 ppm 및 8.4 ppm 부근에 나타나는 피크의 적분값으로부터, 상기 폴리머 화합물의 조성비를 산출하였다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.
표 1
Figure 112007063018863-pct00007
(실시예 1∼4)
5-메틸-2-노르보르넨을 개환 중합하고, 중합된 생성물에 수소 첨가함으로써 얻어진 포화 환형 폴리올레핀 수지 (MFR(Melt Flow Rate)은 21 g/10분이고, 수소 첨가비는 실질적으로 100%이고, 열 변형 온도는 123℃임)를, 사출 성형에 의해 슬라이드 글래스 형상(치수: 76 ㎜×26 ㎜×1 ㎜)으로 가공하여, 지지 기판으로서 고상 기판을 제조하였다. 산소 분위기 하의 플라즈마 처리에 의해 상기 기판의 표면을 산화 처리하였다. 이 고상 기판을, 합성예 1 내지 4에서 얻어진 각각의 폴리머 화합물의 O.3 중량% 에탄올 용액에 침지한 다음, 65℃에서 4시간 동안 가열 건조함으로써, 상기 고상 기판 표면에, 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머, 활성 에스테르기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머 및 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머를 포함하는 폴리머 화합물을 포함하는 층을 형성하였다.
(비교예 1)
(코팅되지 않은 기판)
5-메틸-2-노르보르넨을 개환 중합하고, 중합된 생성물에 수소 첨가함으로써 얻어진 포화 환형 폴리올레핀 수지(MFR은 21 g/10분이고, 수소 첨가비는 실질적으로 100%이고, 열 변형 온도는 123℃임)를, 사출 성형에 의해 슬라이드 글래스 형상(치수: 76 ㎜×26 ㎜×1 ㎜)으로 가공하여, 고상 기판을 제조하였다. 산소 분위기 하의 플라즈마 처리에 의해 상기 기판의 표면을 산화 처리하였다.
(비교예 2)
(알데히드 코팅된 기판)
5-메틸-2-노르보르넨을 개환 중합하고, 중합된 생성물에 수소 첨가함으로써 얻어진 포화 환형 폴리올레핀 수지(MFR은 21 g/10분이고, 수소 첨가비는 실질적으로 100%이고, 열 변형 온도는 123℃임)를, 사출 성형에 의해 슬라이드 글래스 형상(치수: 76 ㎜×26 ㎜×1 ㎜)으로 가공하여, 고상 기판을 제조하였다. 산소 분위기 하의 플라즈마 처리에 의해 상기 기판의 표면을 산화 처리하였다. 상기 고상 기판을 3-아미노프로필메톡시 실란의 2 부피% 에탄올 용액에 침지하였다. 그런 다음, 상기 기판을 순수로 세정한 후, 45℃에서 2시간 가열하여, 아미노기를 도입하였다. 또한, 상기 기판을 글루타르알데히드의 1 부피% 수성 용액에 침지한 후, 순수로 세정하여, 알데히드기를 도입하였다.
(비교예 3)
일본특허출원 제2004-531390호 공보(PCT 출원 국제 단계에서 공개)의 실시예 X에 따라, 아민 반응성 슬라이드 글래스 기판을 제조하였다.
실시예 1 내지 4에서 얻어진 기판 및 비교예 3의 기판을 대상으로, 하기 실험을 5회 반복 수행하여, 재현성을 평가하였다. 재현성의 평가는, 항원인 마우스 IgG2a를 첨가하지 않는 시스템 내에서 수행하였다.
(실험 1)
공정 1 (1차 항체의 고정화)
실시예 및 비교예에서 얻어진 기판 상에서 샌드위치법을 실시하였다. 이를 상세하게 설명하면, 먼저, 자동 스포터(spotter)를 사용하여 각각의 기판에, 탄산 완충액(Wako Pure Chemical Industreis, Ltd.에서 제조, pH 9.5)으로 3.3 μmol/L로 조제된 1차 항체인 항 마우스 IgG2a를 스포팅(spotting)하였다. 그런 다음, 각각의 기판을 실온 환경에서 24시간 방치함으로써, 1차 항체를 고정화하였다.
공정 2 (흡착 방지 처리)
1차 항체의 고정화 후, 실시예 1 내지 4의 각각의 기판을, 0.1 몰/L의 에탄올 아민(Wako Pure Chemical Industreis, Ltd.에서 제조, 초순수 등급)와 0.1 몰/L의 트리스 완충액(SIGMA에서 제조)의 수성 용액(pH 9.5)에 1시간 동안 침지하여, 나머지 활성 에스테르 부분을 비활성화시켰다. 한편, 비교예 1의 기판을, 흡착 방지제 시판품인 "block ace"(Dainippon Pharma Co., Ltd.에서 제조)를 4배 희석한 용액에 2시간 침지시켜 흡착 방지 처리를 실시하였으며, 여기서, 희석제로서는 PBS 완충액(Nissui Pharma Co., Ltd.에서 제조: 조직 배양용 Dulbecco PBS(-) 9.6 g을 1L의 순수에 용해하여 얻은 완충액)을 사용하였다. 또한, 흡착 방지 처리를 실시하지 않고서, 비교예 1의 다른 기판을 제조하였다. 그리고, 비교예 2의 기판을, 흡착 방지제 시판품인 "block ace"(Dainippon Pharma Co., Ltd.에서 제조)를 4배 희석한 용액에 2시간 침지시켜 흡착 방지 처리를 실시하였으며, 여기서, 희석제로서는 PBS 완충액(Nissui Pharma Co., Ltd.에서 제조: 조직 배양용 Dulbecco PBS(-) 9.6 g을 1L의 순수에 용해하여 얻은 완충액)을 사용하였다.
공정 3 (항원-항체 반응 1)
흡착 방지 처리 후, PBS 완충액(Nissui Pharma Co., Ltd.에서 제조: 조직 배양용 Dulbecco PBS(-) 9.6 g을 1L의 순수에 용해하여 얻은 완충액)을 사용하여 10%로 희석시킨 FBS(fetal bovine serum) 용액을 제조하였다. 항원인 마우스 IgG2a를 상기 용액에 첨가하여, 20 nmol/L로 용액을 제조하였다. 이 용액을, PBS 완충액(Nissui Pharma Co., Ltd.에서 제조: 조직 배양용 Dulbecco PBS(-) 9.6 g을 1L의 용매에 용해하여 얻은 완충액)으로 10%로 희석한 FBS 용액으로 희석하여, 1배, 2배, 3배, 및 4배 희석 용액을 제조하였다. 이들 희석 용액, 및 항원인 마우스 IgG2a를 포함하지 않는 10% FBS 용액을 37℃에서 2시간 동안 각각의 기판과 접촉시켜, 항원-항체 반응을 실시하였다. 항원-항체 반응 후, O.05 중량%의 비(非)이온성 계면활성제 "Tween 20"(Roche Diagnostics K.K.에서 제조)이 첨가된 1×SSC 완충액(Zymed Laboratories, Inc.에서 제조, SSC20×완충액을 희석하여 사용)을 사용하여, 실온에서 5분간 세정하였다.
공정 4 (항원-항체 반응 2)
세정 후, 비오틴 표지화된 항 마우스 IgG2a를 2차 항체로서, PBS 완충액(Nissui Pharma Co., Ltd.에서 제조: 조직 배양용 Dulbecco PBS(-) 9.6 g을 1L의 순수에 용해하여 얻은 완충액)에 첨가하여, 20 nmol/L의 용액을 제조하였다. 이 용액과 각각의 기판을 37℃에서 2시간 동안 접촉시켜, 항원-항체 반응을 실시하였다. 항원-항체 반응 후, O.05 중량%의 비(非)이온성 계면활성제 "Tween 20"(Roche Diagnostics K.K.에서 제조)이 첨가된 1×SSC 완충액(Zymed Laboratories, Inc.에서 제조, SSC20×완충액을 희석하여 사용)을 사용하여, 실온에서 5분간 세정하였다.
공정 5 (표지화)
최종적으로, Cy5 표지화된 스트렙타비딘(streptavidin)을 PBS 완충액(Nissui Pharma Co., Ltd.에서 제조: 조직 배양용 Dulbecco PBS(-) 9.6 g을 1L의 순수에 용해하여 얻은 완충액)에 첨가하여, 20 nmol/L의 용액을 제조하였다. 이 용액과 각각의 기판을 37℃에서 30분간 접촉시켜, 반응을 실시하였다. 그런 다음, O.05 중량%의 비(非)이온성 계면활성제 "Tween 20"(Roche Diagnostics K.K.에서 제조)이 첨가된 1×SSC 완충액(Zymed Laboratories, Inc.에서 제조, SSC20×완충액을 희석하여 사용)을 사용하여, 실온에서 5분간 세정하여, 각각의 기판을 표지화하였다.
각각의 기판에 대해서 형광량 측정하여, 각각의 스폿 신호 강도값 및 배경값(background value)을 평가하였다. 표 2는 배경값 측정 결과를, 표 3은 스폿 신호 강도의 측정 결과를, 그리고 표 4는 재현성 시험 결과를 나타낸다.
실시예 및 비교예에서의 형광량의 측정에는 마이크로어레이 스캐너인 "ScanArray"(Packard BioChip Technologies에서 제조)를 이용하였다. 형광량의 측정 시, 레이저 출력 90%, PMT 감도 50%, 여기 파장 649 ㎚, 측정 파장 670 ㎚, 해 상도 50 ㎛의 측정 조건에서 측정하였다.
실시예 1 내지 4와 비교예 1(block ace로 처리하지 않은 경우)을 비교한 결과, 본 발명의 바이오칩 기판에서의 배경값이 저감되었음을 확인하였다.
또한, 실시예 1 내지 4와 비교예 2를 비교한 결과, 본 발명에 따른 바이오칩 기판은, 종래의 알데히드 기판을 흡착 처리제 시판품으로 처리한 경우에 비해, 낮은 배경값 및 높은 신호 강도값을 가진다는 것을 알 수 있다.
아울러, 실시예 1 내지 4와 및 비교예 3을 비교한 결과, 본 발명에 따른 바이오칩 기판은, 일본특허출원 제2004-531390호 공보(PCT 특허출원 국제 단계에서 공개)에 기재된 기판에 비해, 낮은 배경값을 가진다는 것을 알 수 있다. 이는, 본 발명에 따른 바이오칩 기판에는 혈청 중에 포함된 비특이적 단백질이 거의 흡착되지 않았음을 의미한다. 또한, 본 발명에 따른 바이오칩 기판은 항원이 없는 1차 항체 스폿부의 신호 강도값이 낮다는 것을 알 수 있다. 이는, 상기 기판에 고정화된 1차 항체가 기능하고 있다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에 따른 바이오칩 기판은 우수한 재현성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
(표 2) 배경값
Figure 112007063018863-pct00008
(표 3) 신호 강도값
Figure 112007063018863-pct00009
* 상기 표에서, ND는 "검출 불가"를 의미함
(표 4) 재현성 (항원이 없는 경우)
Figure 112007063018863-pct00010
실시예 4의 기판 및 비교예 3의 기판을 대상으로 하기 실험 2 내지 6을 수행하여, 평가하였다.
(실험 2)
공정 1 (앱타머의 고정화)
실시예 4 및 비교예 3에서 제조된 각각의 기판에, 0.1 M의 포스페이트 완충액(pH=9.5, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 제조)을 사용하여 10 μmol/L 용액으로 각각 제조된 각종 앱타머 용액을 스포팅하였다. 여기서, 상기 앱타머로서는, 엔도스타틴(endostatin), bFGF 및 VEGF를 검출하기 위한 앱타머를 사용하였다. 그런 다음, 상기 기판을 65℃에서 1시간 동안 방치하여, 상기 기판에 각각의 앱타머를 고정화하였다.
공정 2 (흡착 방지 처리)
앱타머를 고정화한 후, 상기 기판을 0.1 몰/L 에탄올 아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 제조, 초순수 등급)과 0.1 몰/L 트리스 완충액(SIGMA에서 제조한 "T5912")의 수성 용액(pH=9.5)에 1시간 동안 침지시켜, 나머지 활성 에스테르 부분을 비활성화시켰다.
공정 3 (앱타머와 단백질의 반응)
흡착 방지 처리 후, 40 mM의 HEPES 완충액(DOJINDO LABORATORIES에서 제조한 "GB60", pH=7.5), 111 mM의 소듐 클로라이드, 5 mM의 포타슘 클로라이드, 1 mM의 마그네슘 클로라이드 및 1 mM의 칼슘 클로라이드의 수성 용액을 사용하여, 엔도스타틴(Acris Antibody GmbH로부터 입수한 "SP5230CP")을 1 ㎍/mL로 희석시켜, 엔도스타틴 용액을 제조하였다. 이 용액을 37℃에서 2시간 동안 각각의 기판에 접촉시켜, 앱타머와 단백질을 반응시켰다. 상기 반응 후, 상기 각각의 기판을, 40 mM HEPES 완충액(pH=7.5), 111 mM의 소듐 클로라이드, 5 mM의 포타슘 클로라이드, 1 mM의 마그네슘 클로라이드, 1 mM의 칼슘 클로라이드 및 0.1%의 소듐 도데실 설페이트의 수성 용액을 사용하여, 37℃에서 30분간 세정하였다.
공정 4 (염색 공정)
세정 후, 0.1 M의 탄산 완충액(pH=9.0)에 3 ㎎/mL NHS-ALEXA 647(Molecular Probe로부터 입수)을 함유시켜 제조된 용액과 상기 각각의 기판을 실온에서 5분간 반응시켰다. 상기 반응 후, 0.1% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 SSPE 완충액(SIGMA에서 제조한 "S1027", pH=7.5)을 사용하여, 실온에서 5분간 상기 각각의 기판을 세정하였다.
(실험 3)
실험 2의 공정 3에서 사용한 엔도스타틴 대신, 염기성 FGF(Acris Antibody GmbH로부터 입수한 "PA055X")를 사용한 것을 제외하고는 실험 2와 동일하게 실시하였다.
(실험 4)
실험 2의 공정 3에서 사용한 엔도스타틴 대신, VEGF(R&D System Inc.로부터 입수한 "293-VE-010")를 사용한 것을 제외하고는 실험 2와 동일하게 실시하였다.
(실험 5)
실험 2의 공정 3에서 사용한 엔도스타틴 용액 대신, 10%로 희석된 AB형 인간 혈청(Dainippon Pharma Co., Ltd.로부터 입수한 "29319-49") 용액을 사용한 것을 제외하고는 실험 2와 동일하게 실시하였다.
(실험 6)
실험 2의 공정 3에서 사용한 엔도스타틴 용액 대신, 10%로 희석된 AB형 인간 혈청(Dainippon Pharma Co., Ltd.로부터 입수한 "29319-49") 용액 및 10 ㎍/mL로 희석된 VEGF(R&D System Inc.로부터 입수한 "293-VE-010")를 단독 용액으로서 사용한 것을 제외하고는 실험 2와 동일하게 실시하였다.
각각의 실험에 있어서 형광량을 측정하여, 스폿 신호 강도값 및 배경값을 평가하였다.
형광량의 측정에는 마이크로어레이 스캐너인 "ScanArray"(Packard BioChip Technologies에서 제조)를 이용하였다. 형광량의 측정 시, 레이저 출력 90%, PMT 감도 50%, 여기 파장 649 ㎚, 측정 파장 670 ㎚, 해상도 50 ㎛의 측정 조건에서 측정하였다.
표 5는, 실시예 4의 기판을 사용한 경우의 실험 2 내지 6에 대한 평가 결과를 나타내며, 표 6은, 비교예 3의 기판을 사용한 경우의 실험 2 내지 6에 대한 평가 결과를 나타낸다.
실시예 4의 기판을 사용한 경우, 실험 2 내지 4에서, 고정화된 앱타머와 반응한 단백질의 특이적 신호가 관찰되었다. 실험 5에서, 혈청 내 각각의 단백질이 검출되었으며, 낮은 배경값이 유지되었다.
비교예 3의 기판의 경우, 특이적 단백질 및 고정화된 앱타머가 검출되었지만, 실험 2 내지 4에서의 배경값이 높았다. 실험 5 및 6에서, 신호값은 높았지만, VEGF의 첨가로 인해 나타나는 신호가 검출되었다. 상기 앱타머는 특이적 단백질만이 아니라, 그 외 단백질 역시 비특이적으로 인식하기 때문에, 신호값이 높은 것이라고 생각된다. 또한, 혈청을 사용하였기 때문에, 상기 단백질이 상기 기판에 흡착되어, 배경값이 높아졌다.
(표 5) 실시예 4의 기판을 사용하여 수행한 실험 2∼6의 결과
Figure 112007063018863-pct00011
(표 6) 비교예 3의 기판을 사용하여 수행한 실험 2∼6의 결과
Figure 112007063018863-pct00012

Claims (18)

  1. 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a), 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b) 및 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)를 공중합하여 얻어지는, 의료 재료용 폴리머 화합물로서,
    상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b)의 작용기가, 알데히드기, 활성 에스테르, 에폭시기, 비닐 설폰기 및 비오틴(biotin) 중에서 선택되는 하나 이상의 작용기이고,
    상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)의 가교 가능한 작용기가, 알콕시실릴, 에폭시, 아크릴 및 메타크릴 중에서 선택되는 하나 이상의 작용기인 것을 특징으로 하는, 의료 재료용 폴리머 화합물.
  2. 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a), 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b), 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c) 및 탄소수가 12개 이하인 알킬기 또는 사이클로알킬기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(d)를 공중합하여 얻어지는 의료 재료용 폴리머 화합물로서,
    상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b)의 작용기가, 알데히드기, 활성 에스테르, 에폭시기, 비닐 설폰기 및 비오틴(biotin) 중에서 선택되는 하나 이상의 작용기이고,
    상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)의 가교 가능한 작용기가, 알콕시실릴, 에폭시, 아크릴 및 메타크릴 중에서 선택되는 하나 이상의 작용기인 것을 특징으로 하는, 의료 재료용 폴리머 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a)가 하기 일반식 (1)로 표시되는 모노머인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물:
    일반식 (1)
    Figure 112007063018863-pct00013
    (상기 일반식에서, R1은 수소 원자 또는 메틸기이고, R2는 수소 원자, 또는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; X는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 알킬렌 글리콜 잔기이고, p는 1 내지 100의 정수이며; p가 2 이상의 정수인 경우, 상기 반복되는 X는 서로 동일하거나, 상이할 수 있음).
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 알킬렌 글리콜 잔기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(a)가, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 아크릴레이트 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 메톡시폴리에틸렌 글리콜 아크릴레이트 및/또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트의 에틸렌 글리콜 잔기의 평균 반복수가 3 내지 100인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 생리 활성 물질을 고정화하는 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(b)가, 하기 일반식 (2)로 표시되는 활성 에스테르를 가지는 모노머인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물:
    일반식 (2)
    Figure 112012083624088-pct00014
    (상기 일반식에서, R3는 수소 원자 또는 메틸기이고, Y는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 알킬렌 글리콜 잔기 또는 알킬기이고; W는 활성 에스테르기이고; q는 1 내지 20의 정수이고; q가 2 이상, 20 이하의 정수인 경우, 상기 반복되는 Y는 서로 동일하거나, 상이할 수 있음).
  7. 제6항에 있어서,
    상기 활성 에스테르가 p-니트로페닐 에스테르 또는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 가교 가능한 작용기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(c)가, 하기 일반식 (3)으로 표시되는 알콕시실릴을 가지는 모노머인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물:
    화학식 (3)
    Figure 112012083624088-pct00015
    (상기 일반식에서, R4는 수소 원자 또는 메틸기이고, Z는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; A1, A2 및 A3 중 적어도 하나는 가수분해 가능한 알콕시기이며, 그 나머지는 메틸기임).
  9. 제2항에 있어서,
    상기 탄소수가 12개 이하인 알킬기 또는 사이클로알킬기를 가지는 에틸렌계 불포화 중합성 모노머(d)가, n-부틸 메타크릴레이트, n-도데실 메타크릴레이트, n-옥틸 메타크릴레이트 및 사이클로헥실 메타크릴레이트 중에서 선택되는 하나 이상의 모노머인 것을 특징으로 하는 의료 재료용 폴리머 화합물.
  10. 제1항 또는 제2항의 의료 재료용 폴리머 화합물을 포함하는 의료 재료용 표면 코팅 재료.
  11. 제1항 또는 제2항의 의료 재료용 폴리머 화합물을 포함하는 층이 지지 기판의 표면에 형성된 바이오칩 기판.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 지지 기판이 플라스틱으로 제조된 것을 특징으로 하는 바이오칩 기판.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 플라스틱이 포화 환형 폴리올레핀인 것을 특징으로 하는 바이오칩 기판.
  14. 제1항 또는 제2항의 의료 재료용 폴리머 화합물을 포함하는 층이 지지 기판의 표면에 형성된 바이오칩 기판의 제조 방법으로서,
    제1항 또는 제2항의 의료 재료용 폴리머 화합물을 포함하는 용액을 지지 기판의 표면에 도포하는 단계, 및
    도포 후, 상기 폴리머 화합물을 가교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  15. 제11항의 바이오칩 기판에 생리 활성 물질을 고정화한 바이오칩.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 생리 활성 물질이, 핵산, 앱타머(aptamer), 단백질, 올리고펩타이드, 당사슬(sugar chain) 및 당단백질 중에서 선택되는 하나 이상의 생리 활성 물질인 것을 특징으로 하는 바이오칩.
  17. 삭제
  18. 삭제
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