JP4993081B2 - 蛋白質固定化磁性粒子およびその製造方法 - Google Patents
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
2,3−ジヒドロキシプロピル基を有し、かつ、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている。
2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有し、かつ、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている。
2,3−ジヒドロキシプロピル基をトシル化して得られた活性基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記活性基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、上記磁性粒子の製造方法である。
2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記カルボキシル基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、上記磁性粒子の製造方法である。
2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびエポキシ基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記エポキシ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、上記磁性粒子の製造方法である。
2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびアミノ基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記アミノ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、上記磁性粒子の製造方法である。
1.1.蛋白質固定化磁性粒子の構成
本発明の一実施形態に係る磁性粒子(本明細書において「蛋白質固定化磁性粒子」ともいう。)は、2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有し、かつ、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質(本明細書において「IgG Fc領域特異的結合蛋白質」ともいう。)が固定化されている。すなわち、本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子では、2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有する磁性粒子(M)に、IgG Fc領域特異的結合蛋白質が固定化されている。好ましくは、本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子は、2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する。
本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子は、例えば、以下の第1〜第4の製造方法によって、IgG Fc領域特異的結合蛋白質を磁性粒子(M)に化学結合することにより得ることができる。
第1の製造方法は、2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基を有する磁性粒子(M)に、IgG Fc領域特異的結合蛋白質を固定化する工程を含み、この固定化する工程は、前記カルボキシル基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む。すなわち、第1の製造方法においては、2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基の両方を有する磁性粒子(M)を用いることが必要である。
第2の製造方法は、2,3−ジヒドロキシプロピル基をトシル化して得られた活性基を有する磁性粒子(M)に、IgG Fc領域特異的結合蛋白質を固定化する工程を含み、この固定化する工程は、前記活性基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む。
第3の製造方法は、2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびエポキシ基を有する磁性粒子(M)に、IgG Fc領域特異的結合蛋白質を固定化する工程を含み、この固定化する工程は、前記エポキシ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む。
第4の製造方法は、2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびアミノ基を有する磁性粒子(M)に、IgG Fc領域特異的結合蛋白質を固定化する工程を含み、この固定化する工程は、前記アミノ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む。
本実施形態に係る蛋白質固定化磁性粒子はIgGなどの免疫グロブリン類を捕捉し、適当な条件で脱離させることができるので、免疫グロブリン類のアフィニティー精製における担体として利用できる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、各実施例および比較例において、評価は以下の方法で行った。
3.1.1.粒子径
レーザ回折式粒度分布測定装置((株)島津製作所製)SALD−200Vにより、粒子の数平均粒子径を測定し、これを粒子の粒子径とした。
プロテインG固定化磁性粒子について、非特異吸着および感度の評価を下記に示す方法にしたがって行った。
75%ジ(3,5,5−トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド溶液(日本油脂製「パーロイル355−75(S)」2質量部を1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液20質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径0.77μmのポリスチレン粒子13質量部および水41質量部の入ったリアクターに入れ、25℃で12時間攪拌した。別の容器にて、スチレン96質量部およびジビニルベンゼン4質量部を0.1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液400質量部で乳化させた液を前記リアクターに入れ、40℃で2時間攪拌した後、75℃に昇温して8時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥および粉砕して核粒子を得た。核粒子の数平均粒径は1.5μmであった。
合成例1のA−1粒子を凍結乾燥して得られた乾燥粒子1.0gを8mlのピリジンに分散させた後、p−トシルクロライド0.2gを加えて室温で2時間撹拌した。反応後、磁気を用いて粒子を分離し、アセトンで4回、続いて蒸留水で4回洗浄して、2,3−ジヒドロキシプロピル基をトシル化して得られた活性基を有する磁性粒子(以下、「B−2粒子」とする。)を得た。この磁性粒子(B−2粒子)の平均数粒子径は2.9μmであった。
合成例1で、GMA13.5gおよびTMP1.5gの代わりに、シクロヘキシルメタクリレート13.5gおよびメタクリル酸1.5gを用いた以外は合成例1と同様の手順を行うことにより、2,3−ジヒドロキシプロピル基は有さず、カルボキシル基を有する磁性粒子(以下、「B−3粒子」とする。)を得た。この磁性粒子(B−3粒子)の平均数粒子径は2.9μmであった。
B−1粒子の1wt%水分散液500μlをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。100mM MES−NaOH バッファー(pH5.0)にて3回洗浄後、500μlの100mM MES−NaOH バッファー(pH5.0)に分散し、EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)0.25mgを添加し、さらにrプロテインG(BioVision社製)0.15mgを加え撹拌した後、室温下2時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、tris−HClバッファー(pH7.4)500μlを加え、室温で2時間撹拌を行った。さらに、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで前記粒子を分散させて、粒子の表面にrプロテインGを固定化した磁性粒子(プロテインG固定化磁性粒子)を調製した。次に、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去しCitrate−Phosphateバッファー(pH8.0)にて2回洗浄後、200μlのCitrate−Phosphateバッファー(pH8.0)に分散し、これに標的物質(標的蛋白質)である20Sプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなる蛋白質(抗20Sプロテアソームα6・マウスIgG抗体)0.10mgを添加し、室温下40分撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。ついで、100μlの0.2Mトリエタノールアミンに分散し、ジメチルピメルイミデート二塩酸塩(dimethyl pimelimidate dihydrochloride(DMP))0.54mgを添加し、室温下30分間攪拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次に、tris−HClバッファー(pH7.4)500μlを加え、室温で15分間撹拌を行った。さらに、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで前記粒子を分散させることにより、プローブ(抗体)結合磁性粒子の分散液を得た。
B−1粒子10mgをpH9.5のホウ酸バッファーに分散し、これにrプロテインG(BioVision社製)0.3mgを溶解させた溶液0.1mLを添加し、37℃で16時間回転攪拌した後、トリスバッファーで3回洗浄して、粒子の表面にrプロテインGが固定化された磁性粒子(プロテインG固定化磁性粒子)を調製した。次に、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去し、Citrate−Phosphateバッファー(pH8.0)にて2回洗浄後、200μlのCitrate−Phosphateバッファー(pH8.0)に分散し、これに標的物質(標的蛋白質)である20Sプロテアソームを特異的に捕捉するためのプローブとなる蛋白質(抗20Sプロテアソームα6・マウスIgG抗体)0.10mgを添加し、室温下40分撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。ついで、100μlの0.2Mトリエタノールアミンに分散し、ジメチルピメルイミデート二塩酸塩(dimethyl pimelimidate dihydrochloride(DMP))0.54mgを添加し、室温下30分間攪拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次に、tris−HClバッファー(pH7.4)500μlを加え、室温で15分間撹拌を行った。さらに、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで前記粒子を分散させることにより、プローブ(抗体)結合磁性粒子の分散液を得た。
B−3粒子を用いた以外は、実施例1と同様の手順を行うことにより、2,3−ヒドロキシプロピル基を有さない比較例1のプローブ(抗体)結合磁性粒子の分散液を得た。
電気泳動の染色ゲルの画像を図1に示す。図1に示すように、本比較例で得られたプローブ結合磁性粒子においては、非特異吸着が「不良」であり、感度は非特異吸着が多いため判別できなかった。
Claims (8)
- 2,3−ジヒドロキシプロピル基を有し、かつ、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている磁性粒子。
- 2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基を有し、かつ、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質が固定化されている磁性粒子。
- 前記蛋白質がプロテインA,プロテインG,または少なくとも一方の誘導体である、請求項1または2に記載の磁性粒子。
- 2,3−ジヒドロキシプロピル基をトシル化して得られた活性基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記活性基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、請求項1または2に記載の磁性粒子の製造方法。 - 2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびカルボキシル基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記カルボキシル基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、請求項1または2に記載の磁性粒子の製造方法。 - 2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびエポキシ基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記エポキシ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、請求項1または2に記載の磁性粒子の製造方法。 - 2,3−ジヒドロキシプロピル基に由来する水酸基およびアミノ基を有する磁性粒子に、免疫グロブリンGのFc領域に特異的に結合する蛋白質を固定化する工程を含み、
前記固定化する工程は、前記アミノ基と前記蛋白質とを反応させる工程を含む、請求項1または2に記載の磁性粒子の製造方法。 - 前記蛋白質がプロテインA、プロテインG、または少なくとも一方の誘導体である、請求項4ないし7のいずれかに記載の磁性粒子の製造方法。
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