JP2021060403A - 免疫測定用磁性粒子およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 耐酸性に優れ酸性水溶液で処理しても鉄の溶出が少なく、さらに水への分散性が良好であり、また、非特異吸着が少なく、並びに、粒子の比表面積が大きく生理活性物質の担持量が多い、免疫測定の高感度化が可能な磁性粒子を提供する。【解決手段】 コア粒子と、前記コア粒子表面に形成された第１の被覆層と、前記第１の被覆層の表面に形成された第２の被覆層を有する磁性粒子であって、前記第１の被覆層は、ナノ磁性体を含有する架橋無機物層であり、前記第２の被覆層は、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する重合体層であり、カルボキシル基含有構造単位を有することを特徴とする、抗体結合用磁性粒子。【選択図】 図１

Description

本発明は、免疫測定に用いられる免疫測定用磁性粒子およびその製造方法に関する。

磁性粒子は、その磁気的特性を利用し、免疫測定用の生理活性物質担持用担体として使用されている。しかし、抗体等の生理活性物質を磁性粒子の表面に結合する際、酸性水溶液中で反応させるため、磁性体の脱離や鉄イオン溶出など、磁性体成分に由来する物質が流出するという問題があった。鉄は免疫反応の干渉物質として働くため、免疫測定の感度の低下や感作可能な生理活性物質が限定されるという問題があり、このような磁性体成分の流出が少ない磁性粒子が望まれている。また、免疫測定用担体としての磁性粒子には、免疫反応に無関係な成分が非特異吸着することを抑制した低ノイズ化や、多くの生理活性物質を担持可能とする高シグナル化等、免疫測定の高感度化が可能な磁性粒子が求められている。さらに、免疫測定では磁性粒子を水溶液に分散させて使用することから、水への分散性が良好な磁性粒子が求められている。

これらの課題を解決するため、コア粒子表面にフェライト被覆層を有する磁性粒子の表面をアミノ基等の官能基を有する有機シランカップリング剤で被覆し、さらにカルボキシル基を導入した免疫測定用粒子が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。また、疎水性の有機シランカップリング剤で被覆したナノ磁性体をコア粒子に吸着させた後、ナノ磁性体が埋没するように疎水性重合体で被覆し、さらにその表面に官能基を導入した免疫測定用粒子が提案されている（例えば、特許文献２参照。）。

特許第２９７９４１４号公報 特許第３７３８８４７号公報

特許文献１では、有機シランカップリング剤で表面を処理することによって鉄の溶出を抑制できるものの、抑制が不十分であるという問題があった。

特許文献２では、疎水性の有機シランカップリング剤で処理した磁性体をコア粒子表面に被覆せしめた後、疎水性重合体層を形成することで鉄の溶出を抑制しているものの、疎水性重合体層は磁性粒子の水への分散性を悪化させるという問題があった。また、疎水性重合体層で被覆することでナノ磁性体が重合体で埋没するため、磁性粒子の比表面積が小さく、抗体等の生理活性物質を目的量担持させるためには多量の磁性粒子が必要であるという問題があった。

本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、耐酸性に優れ酸性水溶液で処理しても鉄の溶出が少なく、さらに水への分散性が良好であり、また、非特異吸着が少なく、並びに、粒子の比表面積が大きく生理活性物質の担持量が多い、免疫測定の高感度化が可能な磁性粒子を提供することにある。

本発明者らは、以上の点を鑑み鋭意研究を重ねた結果、以下の磁性粒子並びに磁性粒子の製造方法によって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の各態様は以下に示す［１］〜［１５］である。
［１］コア粒子と、前記コア粒子表面に形成された第１の被覆層と、前記第１の被覆層の表面に形成された第２の被覆層を有する磁性粒子であって、
前記第１の被覆層は、ナノ磁性体を含有する架橋無機物層であり、
前記第２の被覆層は、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する重合体層であり、カルボキシル基含有構造単位を有することを特徴とする、抗体結合用磁性粒子。
［２］ 前記ポリエチレングリコール基含有構造単位が、ポリエチレングリコール基を側鎖にもつ単量体単位であり、前記重合体が、前記第１の被覆層と共有結合していることを特徴とする、［１］に記載の免疫測定用磁性粒子。
［３］ 前記重合体が、カルボキシル基を側鎖にもつ単量体単位を有することを特徴とする、［１］又は［２］に記載の免疫測定用磁性粒子。
［４］ 前記第１の被覆層の表面が、前記重合体層で被覆されていない領域を有し、
第１の被覆層の表面に存在する水酸基とカルボン酸無水物との反応に由来するカルボキシル基を有することを特徴とする、［２］又は［３］に記載の免疫測定用磁性粒子。
［５］ 前記ポリエチレングリコール基含有構造単位が、ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤であり、前記重合体が、カルボキシル基を側鎖にもつ単量体単位を有することを特徴とする、［１］に記載の免疫測定用磁性粒子。
［６］ 前記重合体が、疎水性基を側鎖にもつ単量体単位を有することを特徴とする、［５］に記載の免疫測定用磁性粒子。
［７］ 前記ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤が、重合体と共有結合していることを特徴とする、［５］又は［６］に記載の免疫測定用磁性粒子。
［８］ 前記第１の被覆層の架橋無機物層がシリカを含有することを特徴とする、［１］
〜［７］のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子。
［９］ 比表面積が２〜１００ｍ^２／ｇであることを特徴とする、［１］〜［８］のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子。
［１０］ 下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含むことを特徴とする、［１］〜［９］に記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
（ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
（ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
（ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でカルボキシル基含有構造単位を有する単量体と、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に共重合体層を形成する工程
［１１］ 下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含むことを特徴とする、［１］〜［９］に記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
（ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
（ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
（ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に重合体層を形成する工程
（ｉｖ）重合体層を形成した粒子にカルボン酸無水物を反応させ、カルボキシル基を導入する工程
［１２］下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含むことを特徴とする、［１］〜［９］に記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
（ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
（ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
（ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でポリエチレングリコール基を有する界面活性剤の存在下、カルボキシル基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に重合体層を形成する工程
［１３］工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間に、（ｖ）架橋無機物層の表面に重合性官能基を有するシランカップリング剤を結合させる工程をさらに含むことを特徴とする、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
［１４］工程（ｉ）が、水溶液中でコア粒子にナノ磁性体を静電吸着させた後、乾燥させる工程を含むことを特徴とする、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
［１５］工程（ｉ）が、高速気流中に磁性粒子を分散させながら、粒子同士の衝撃力によって乾式で表面改質する工程を含むことを特徴とする、［１４］に記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。

本発明の一態様にかかる免疫測定用磁性粒子は、鉄の溶出抑制と粒子の水への分散性を有するものであり、また、抗体等の生理活性物質の担持量が多く、免疫測定の高感度化が可能となる。

本発明の一態様にかかる免疫測定用磁性粒子の構成を示す模式図である。

以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。

本発明において、「免疫測定」とは、抗原抗体反応を利用した生理活性物質（タンパク質など）の濃度測定法を示す。抗体や抗原等の生理活性物質を担持させた担体を使用し、容器内で抗原抗体反応を進行させ、最終的に酵素反応により可視化させる。濃度既知の抗原を測定することにより得られる検量線から逆算することで、濃度未知の試料中に含まれる抗原濃度を測定することができる。免疫測定方法として、第１抗体と第２抗体を用いて抗原をはさむサンドイッチ法や競合法などがある。

本発明の一態様にかかる免疫測定用磁性粒子は、コア粒子と、前記コア粒子表面に形成された第１の被覆層と、前記第１の被覆層の表面に形成された第２の被覆層を有する磁性粒子であって、前記磁性粒子は、カルボキシル基含有構造単位を有し、前記第１の被覆層は、ナノ磁性体を含有する架橋無機物層であり、前記第２の被覆層は、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する重合体層である。

免疫測定用磁性粒子に用いられるコア粒子は、磁性粒子の最も中心に位置する粒子であり、コア粒子の形状や材質に特に限定はない。コア粒子の形状は適宜選択可能であり、真球に近い球状、楕円体や立方体、円柱、多角柱等の非球状、多孔質状や突起を有するもの等の比表面積の大きな凹凸を有する粒子等を挙げることができる。コア粒子の表面に多くのナノ磁性体を被覆させるのに好適のため、多孔質状や突起を有するもの等の比表面積の大きな凹凸を有する粒子が好ましい。

磁気応答性が良好な磁性粒子とするため、コア粒子の粒径としては０．１μｍ以上が好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましく、１μｍ以上が特に好ましく、２μｍ以上が最も好ましい。また、水への再分散性が良好な磁性粒子とするために、コア粒子の粒径は１００μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がさらに好ましく、５μｍ以下が特に好ましく、３μｍ以下が最も好ましい。

コア粒子の材質としては、例えば重合体等の有機化合物、無機化合物等を挙げることができる。これらから適宜選択できるが、例えばスチレン系単量体単位、アクリレート系単量体単位若しくはメタクリレート系単量体単位を含む重合体粒子、又はシリカ粒子を挙げることができる。

前記のスチレン系単量体としては、スチレン、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、ｐ−メチルスチレン、２−メチルスチレン、３−メチルスチレン、４−メチルスチレン、４−エチルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、３，４−ジメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−エトキシスチレン、２−クロロスチレン、３−クロロスチレン、４−クロロスチレン、２，４−ジクロロスチレン、２，６−ジクロロスチレン、４−クロロ−３−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができる。

前記のアクリレート系単量体若しくはメタアクリレート系単量体としては、（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−へキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート等の（シクロ）アルキル（メタ）アクリレート類； ２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、ｐ−メトキシシクロヘキシル（メタ）アクリレート等のアルコキシ（シクロ）アルキル（メタ）アクリレート類；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート等の多価（メタ）アクレート類；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、バーサチック酸ビニル等のビニルエステル類；２−シアノエチル（メタ）アクリレート、２−シアノプロピル（メタ）アクリレート、３−シアノプロピル（メタ）アクリレート等のシアノアクリレート類；ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、６−ヒドロキシヘキシル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシシクロヘキシル（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールモノ（メタ）アクリレート、 ３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等の置換ヒドロキシ（メタ）アクリレート類；グリシジル（メタ）アクリレート、メチルグリシジルメチルアクリレート、エポキシ化シクロヘキシル（メタ）アクリレート等のグリシジル基含有アクリレート類；トリメチロールプロパンエトキシトリアクリレート、ペンタエリスリトールエトキシテトラアクリレート、トリメチロールプロパンプロポキシトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリプロピレングリコールジアクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレート、エトキシ化フェニルアクリレート等の多官能（メタ）アクリレート類等の（メタ）アクリレートを単量体単位とする重合体粒子が挙げられる。また、前記（メタ）アクリレートは架橋したものであってもよい。

必要に応じて、コア粒子はナノ磁性体を含有してもよい。また、コア粒子の表面に常磁性の薄膜の被覆層を設けてもよい。常磁性の被覆層を設ける場合、粒子への残留磁化を低減し、粒子同士の凝集を抑制するのに好適のため、厚み０．００１〜１μｍが好ましく、０．００１〜０．１μｍがさらに好ましく、０．００１〜０．０１μｍが特に好ましく、０．００１〜０．００５μｍが最も好ましい。

また、第１の被覆層を設けるための前処理として、コア粒子の表面に正電荷又は負電荷を有する物質を被覆してもよい。コア粒子の表面に正電荷又は負電荷を有する物質を被覆する方法としては特に限定はないが、側鎖に電荷を有する単量体を用いてコア粒子の表面に重合体層を形成する方法、電荷を有する重合体を交互積層法（Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ法）によりコア粒子表面に被覆する方法等を挙げることができる。

コア粒子表面に形成された第１の被覆層は、ナノ磁性体を含有する架橋無機物層である。ナノ磁性体は、前記コア粒子よりも粒径の小さな粒子であり、さらに磁気応答性を有するものである。超常磁性を有するものであることが好ましいことから、ナノ磁性体の粒径は０．００１〜１μｍが好ましく、０．００１〜０．５μｍがさらに好ましく、０．００１〜０．１μｍが特に好ましく、０．００１〜０．０５μｍが最も好ましい。材質としては例えば、酸化鉄を挙げることができる。

ナノ磁性体は表面に脂質やシランカップリング剤等の無機表面改質剤を含んでいてもよい。前記シランカップリング剤としては、例えば、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、トリス−（トリメトキシシリルプロピル）イソシアヌレート、３−ウレイドプロピルトリアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィド、３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。

ナノ磁性体は架橋無機物層中に分散した状態にあることが好ましい。ナノ磁性体が架橋無機物層中に分散した状態にあることで、全てのナノ磁性体の表面を架橋無機物層で均一に被覆することができ、磁性粒子の耐酸性を高めることができる。

ナノ磁性体の含有量としては、磁気応答性の良好な磁性粒子とするのに好適のため、磁性粒子１ｇ当たりのナノ磁性体の含有量として、０．１ｇ／ｇ以上が好ましく、０．２ｇ／ｇ以上がさらに好ましく、０．５ｇ／ｇ以上が特に好ましく、０．７ｇ／ｇ以上が最も好ましい。また、磁性粒子の水への分散性を高めるのに好適であることから、磁性粒子１ｇ当たりのナノ磁性体の含有量として、０．９ｇ／ｇ以下が好ましく、０．８ｇ／ｇ以下がさらに好ましく、０．７ｇ／ｇ以下が特に好ましく、０．６ｇ／ｇ以下が最も好ましい。

また、免疫測定用粒子の比重を制御し、粒子の沈降速度を調整する目的から、磁性粒子に含まれるナノ磁性体の重量割合として、５〜７０ｗｔ％が好ましく、１０〜６０ｗｔ％がさらに好ましく、１５〜５０ｗｔ％が特に好ましく、２０〜４０ｗｔ％が最も好ましい。

架橋無機物層はコア粒子表面に架橋無機物を被覆することにより形成される。架橋無機物としては、シリカやガラス、酸化マグネシウム、酸化アルミナ等の酸化物、ジルコニアやヒドロキシアパタイト等のセラミックスを挙げることができる。これらの中で耐酸性を高めるのに特に好適のため、シリカが好ましい。架橋無機物層を設けることで、親水性でありながら耐酸性を高めることが可能であることから、鉄の溶出抑制と粒子の水への分散性という、相反する特性を付与することができる。また、架橋無機物層は粒子表面の磁性体の形状に沿って被覆され、磁性体を完全に埋没させないため、比表面積の大きな磁性粒子を得ることができ、抗体等の生理活性物質の担持量を増やすことができる。架橋無機物層の厚みとしては、耐酸性を高めるのに好適であることから、０．００１μｍ以上が好ましく、０．００５μｍ以上がさらに好ましく、０．０１μｍ以上が特に好ましく、０．０５μｍ以上が最も好ましい。また、比表面積の大きな磁性粒子とするのに好適のため、架橋無機物層の厚みは０．１μｍ以下が好ましく、０．０５μｍ以下がさらに好ましく、０．０２μｍ以下が特に好ましく、０．０１μｍ以下が最も好ましい。

また、免疫測定用粒子の比重を制御し、粒子の沈降速度を調整する目的から、磁性粒子に含まれる架橋無機物の含有割合として、０．１〜１０ｗｔ％が好ましく、０．５〜５ｗｔ％がさらに好ましく、１〜５ｗｔ％が特に好ましく、１〜３ｗｔ％が最も好ましい。

ナノ磁性体を含有する架橋無機物層の形成方法としては特に限定はないが、コア粒子表面にナノ磁性体を吸着させ集積せしめた後、ナノ磁性体間の隙間を埋めるように架橋無機物層を形成する方法、架橋無機物層を形成する際にナノ磁性体を添加する方法等を挙げることができる。反応の制御が容易であることから、コア粒子表面にナノ磁性体を吸着させ集積せしめた後、ナノ磁性体間の隙間を埋めるように架橋無機物層を形成する方法が好ましい。

前記コア粒子表面にナノ磁性体を吸着させる方法としては、コア粒子と、コア粒子と反対の表面電荷を有するナノ磁性体とを水溶液中で混合することにより、静電相互作用によりコア粒子表面に自発的にナノ磁性体を吸着させる方法、コア粒子表面の官能基とナノ磁性体との化学的反応によりナノ磁性体をコア粒子表面に結合させる方法、機械的なエネルギーを与えることによりコア粒子とナノ磁性体とを複合化する方法等を挙げることができる。前記コア粒子表面にナノ磁性体を吸着させる方法は、複数の方法を組み合わせてもよく、例えば、静電相互作用によりコア粒子表面に自発的にナノ磁性体を吸着させた後、乾燥させた粒子を用い、さらに機械的なエネルギーを与えることにより強固にナノ磁性体をコア粒子に吸着させてもよい。

前記静電相互作用によりコア粒子表面に自発的にナノ磁性体を吸着させる方法としては、コア粒子へのナノ磁性体の吸着量を増大させるのに好適のため、水溶液中でコア粒子とナノ磁性体を混合することが好ましく、塩化ナトリウム等の電解質を含有する水溶液がさらに好ましい。電解質を含有する水溶液の場合、ナノ磁性体が互いに凝集しない電解質濃度が好ましく、例えば、０．０１〜０．５Ｍ程度の濃度を好適に用いることができる。また、吸着させたナノ磁性体をコア粒子表面に強固に固定化させるため、水溶液中での複合化の後に粒子を乾燥させることが好ましい。

前記機械的なエネルギーを与えることによりコア粒子とナノ磁性体とを複合化する方法としては、高速気流中で旋回力により複合化を行う装置、自転公転混合器やボールミル等で混合攪拌を行う装置、スプレードライヤー等で表面被覆を行う装置等、乾式で粒子を処理できる方法が好ましい。前記装置としては例えば、ハイブリダイゼーションシステムＮＨＳシリーズ（（株）奈良機械製作所製）、ノビルタＮＯＢ（ホソカワミクロン（株）製）、高速撹拌型粉体球状化装置ＮＳＭシリーズ（（株）セイシン企業製）、ミニスプレードライヤー Ｂ−２９０型（（株）柴田科学）等を挙げることができる。

前記高速気流中で旋回力により複合化を行う場合、磁性体を強固にコア粒子に固定化するのに好適であることから、回転速度８０００ｍｉｎ^−１以上が好ましく、９０００ｍｉｎ^−１以上がさらに好ましく、１００００ｍｉｎ^−１以上が特に好ましく、１１０００ｍｉｎ^−１以上が最も好ましい。また、粒子形状を球状に整形するのに好適であることから、回転速度１５０００ｍｉｎ^−１以下が好ましく、１４０００ｍｉｎ^−１以下がさらに好ましく、１３０００ｍｉｎ^−１以下が特に好ましく、１２０００ｍｉｎ^−１以下が最も好ましい。また、粒子形状を球状に整形するのに好適であることから、処理時間は１〜６０分が好ましく、１〜２０分がさらに好ましく、１〜１０分が特に好ましく、３〜１０分が最も好ましい。また、粒子の融着を抑制するのに好適であることから、処理温度は２５〜８０℃が好ましく、２５〜６０℃がさらに好ましく、２５〜５０℃が特に好ましく、２５〜４０℃が最も好ましい。

架橋無機物としてシリカを形成する場合、粒子を溶媒中に分散させた後、オルトケイ酸テトラエチル及びアンモニア水を添加する方法を好適に用いることができる。反応時に添加するオルトケイ酸テトラエチルの量としては、粒子表面に十分な量のシリカを形成するために好適であることから、粒子１ｇに対して０．０５ｇ以上が好ましく、０．１ｇ以上がさらに好ましく、０．２ｇ以上が好ましく、０．５ｇ以上が最も好ましい。また、反応中の粒子の凝集を抑制するのに好適であることから、粒子１ｇに対して５ｇ以下が好ましく、２ｇ以下がさらに好ましく、１ｇ以下が特に好ましく、０．５ｇ以下が最も好ましい。さらに、反応時に添加するアンモニア水の量としては、粒子表面に十分な量のシリカを形成するために好適であることから、溶媒１Ｌに対して２０ｍＬ以上が好ましく、３０ｍＬ以上がさらに好ましく、４０ｍＬ以上が特に好ましく、５０ｍＬ以上が最も好ましい。また、反応中の粒子の凝集を抑制するのに好適であることから、溶媒１Ｌに対して１００ｍＬ以下が好ましく、８０ｍＬ以下がさらに好ましく、７０ｍＬ以下が特に好ましく、６０ｍＬ以下が最も好ましい。

架橋無機物としてシリカを形成する際の反応溶媒としては、粒子の凝集を抑制しつつ均一にシリカを被覆するのに好適であることから、エタノール、２−プロパノール、ブタノールが好ましく、エタノール又は２−プロパノールがさらに好ましく、２−プロパノールが特に好ましい。

第１の被覆層の表面に形成された第２の被覆層は、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する重合体層であり、カルボキシル基含有構造単位を有する。

コア粒子表面に第１の被覆層を形成した粒子は、抗体等の生理活性物質を粒子に結合するための官能基を有していないことから、生理活性物質を担持することができないため、架橋無機物層を設けた粒子の表面に第２の被覆層を設けることにより、非特異吸着を抑制しつつ抗体を担持させることができるようになり、免疫測定の高感度化が可能となる。カルボキシル基含有構造単位だけでは非特異吸着が高く、免疫測定の高感度化はできない。カルボキシル基含有構造単位及びポリエチレングリコール基含有構造単位の２つを有することにより、免疫測定の高感度化が可能となる。

本発明の一態様としては、ポリエチレングリコール基含有構造単位は、ポリエチレングリコール基を有する成分であり、ポリエチレングリコール基を側鎖にもつ単量体単位であることが好ましい。ポリエチレングリコール基を側鎖にもつ単量体単位であることにより、粒子表面の重合体層に高密度のポリエチレングリコール基を導入することができ、粒子への生理活性物質の非特異吸着を抑制することができる。ポリエチレングリコール基を有する単量体としては、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、ポリプロピレングリコールモノアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノメタクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルメタクリレート、ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート、ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート等を挙げることができる。

また、粒子の長期保存安定性の点から、第２の被覆層である重合体が第１の被覆層と共有結合していることが好ましい。重合体と第１の被覆層を共有結合させる方法としては特に限定はないが、例えば、第１の被覆層の表面にシランカップリング剤を用いて重合開始剤又は単量体を化学結合させた後、重合を行う方法が挙げられる。

第２の被覆層である重合体は、カルボキシル基を側鎖にもつ単量体単位を有することが好ましい。カルボキシル基を側鎖にもつ単量体単位を有することにより、カルボキシル基を介して生理活性物質を粒子表面に固定化することができ、免疫測定の高感度化が可能となる。前記カルボキシル基含有構造単位を有する単量体としては、カルボキシル基を含有すること以外に特に限定はないが、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸等を挙げることができる。

本発明の別の態様として、前記ポリエチレングリコール基含有構造単位が、ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤であることが好ましい。ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤であることにより、ポリエチレングリコール基を粒子表面に均一かつ一定量導入することが可能であり、粒子の製造安定性に優れる。ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールアルキルエステル、ポリオキシアルキレングリコールロジン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリエチレングリコール等を挙げることができ、炭素数１〜２０の長鎖アルキルを有するポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。また、非特異吸着を抑制するのに好適であることから、前記ポリオキシエチレンの分子量は５００以上が好ましく、１０００以上が好ましく、１５００以上がさらに好ましく、２０００以上が特に好ましい。さらに、生理活性物質の担持を阻害しないために、前記ポリオキシエチレンの分子量は２００００以下が好ましく、１００００以下がさらに好ましく、５０００以下が特に好ましく、３０００以下が最も好ましい。

ポリエチレングリコール基含有構造単位としてポリエチレングリコール基を有する界面活性剤を用いる場合においても、前述と同様の理由から、重合体が、カルボキシル基を側鎖にもつ単量体単位を有することが好ましい。前記カルボキシル基含有構造単位を有する単量体としては、前述のカルボキシル基を有する単量体と同様のものを好適に用いることができる。

また、ポリエチレングリコール基含有構造単位としてポリエチレングリコール基を有する界面活性剤を用いる場合、前記重合体が、疎水性基を側鎖にもつ単量体単位を有することが好ましい。疎水性基を側鎖にもつ単量体単位を有することにより、抗体を粒子表面に吸着又は結合させるための疎水性を付与するために好適である。また、疎水性基を側鎖にもつ単量体を用いることで、ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤を粒子表面に均一に導入しやすくなる。疎水性基を側鎖にもつ単量体単位としては特に限定はないが、炭素数１〜２０の長鎖及び環状アルキル基を側鎖に有することが好ましく、炭素数１〜１０の長鎖及び環状アルキル基を側鎖に有することがさらに好ましく、炭素数１〜６の長鎖及び環状アルキル基を側鎖に有することが特に好ましく、炭素数６の長鎖及び環状アルキル基を側鎖に有することが最も好ましい。例えば、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、プロピルアクリレート、プロピルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｔ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−ペンタノイルアクリレート、ｎ−ペンタノイルメタクリレート、ｎ−ヘキシルチルアクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、シクロプロピルアクリレート、シクロプロピルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、フェニルアクリレート、フェニルメタクリレート、スチレン等を挙げることができる。

また、前記ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤が、重合体と共有結合していることが好ましい。ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤が重合体と共有結合していることにより、粒子の長期保存安定性に優れる。ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤を重合体と共有結合させる方法としては、ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤の存在下において、粒子表面で重合反応を行うことで、重合反応によって生じるラジカルを、ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤に連鎖移動させる方法を挙げることができる。

第２の被覆層は、ポリエチレングリコール基を側鎖にもつ単量体の存在下で、粒子表面で重合を行う方法、又はポリエチレングリコール基を有する界面活性剤を粒子表面に化学的又は物理的な相互作用により固定化する方法のいずれかにより形成される。前記ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤を粒子表面に化学的又は物理的な相互作用により固定化する方法としては、ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤の存在下で、粒子表面で重合を行う方法、ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤を粒子表面に物理的に吸着させる方法を挙げることができる。

また、第２の被覆層は、ポリエチレングリコール以外の親水性基としてヒドロキシル基含有構造単位を含んでいてもよく、単量体としては例えば、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド、２−ヒドロキシフェニルアクリレート、２−ヒドロキシフェニルメタクリレート、３−ヒドロキシフェニルアクリレート、３−ヒドロキシフェニルメタクリレート、４−ヒドロキシフェニルアクリレート、４−ヒドロキシフェニルメタクリレート等を挙げることができる。

カルボキシル基含有構造単位は、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体とカルボキシル基含有構造単位を有する単量体を共重合して重合体に導入することができる。また、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する重合体層を形成した粒子にカルボン酸無水物を反応させて、重合体層に導入（変性）しても良い。また、架橋無機物層の表面に存在する官能基との反応によってカルボキシル基含有構造単位が導入されていても良い。前記カルボン酸無水物としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水シュウ酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、無水安息香酸等を挙げることができる。

第２の被覆層形成に用いる重合開始剤としては特に限定はなく、所望の重合温度及び重合速度に応じて、アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物、ペルオキソ二硫酸カリウム等の過酸化物、パーヘキシルＰＶやパーブチルＯ（（株）日油製）等のパーオキシエステル類等を好適に用いることができる。

第２の被覆層である重合体層は、第１の被覆層と、直接又はリンカーを介して化学結合していることが好ましい。直接又はリンカーを介して化学結合していることで、耐酸性及び耐溶剤性を高めることができる。化学結合の存在は、重合体が溶解する溶剤で洗浄しても重合体が消失していないことにより確認できる。化学結合していない場合は、被覆した重合体がほぼ全て溶けてなくなる。

第２の被覆層を第１の被覆層と化学結合で固定化させることで、磁性粒子の耐酸性及び耐溶剤性を高めるのに好適であることから、架橋無機物層の表面に重合性官能基（及び残基）を有するシランカップリング剤を有していることが好ましい。前記シランカップリング剤としては、例えば、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン等を挙げることができる。

前記シランカップリング剤を架橋無機物層の表面に反応させる場合、粒子を溶媒中に分散させた後、シランカップリング剤及びアンモニア水を添加する方法を好適に用いることができる。反応時に添加するシランカップリング剤の量としては、粒子表面に十分な量のシランカップリング剤を反応させるために好適であることから、粒子１ｇに対して０．０５ｇ以上が好ましく、０．１ｇ以上がさらに好ましく、０．２ｇ以上が好ましく、０．５ｇ以上が最も好ましい。また、反応中の粒子の凝集を抑制するのに好適であることから、粒子１ｇに対して５ｇ以下が好ましく、２ｇ以下がさらに好ましく、１ｇ以下が特に好ましく、０．５ｇ以下が最も好ましい。さらに、反応時に添加するアンモニア水の量としては、粒子表面に十分な量のシランカップリング剤を反応させるために好適であることから、溶媒１Ｌに対して２０ｍＬ以上が好ましく、３０ｍＬ以上がさらに好ましく、４０ｍＬ以上が特に好ましく、５０ｍＬ以上が最も好ましい。また、反応中の粒子の凝集を抑制するのに好適であることから、溶媒１Ｌに対して１００ｍＬ以下が好ましく、８０ｍＬ以下がさらに好ましく、７０ｍＬ以下が特に好ましく、６０ｍＬ以下が最も好ましい。
シランカップリング剤を反応させる際の反応溶媒としては、粒子の凝集を抑制しつつ均一にシランカップリング剤を反応させるのに好適であることから、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール等のアルコール類が好ましく、メタノール、エタノール、２−プロパノールがさらに好ましく、メタノール又は２−プロパノールが特に好ましい。

第２の被覆層における重合体の被覆量としては特に限定はないが、比表面積の大きな磁性粒子を作製するのに好適のため、磁性粒子１ｇ当たりの重合体の被覆量として、１ｇ／ｇ以下が好ましく、０．５ｇ／ｇ以下がさらに好ましく、０．１ｇ／ｇ以下が特に好ましく、０．０５ｇ／ｇ以下が最も好ましい。また、耐酸性を高めるのに好適のため、磁性粒子１ｇ当たりの重合体の被覆量として、０．００１ｇ／ｇ以上が好ましく、０．０１ｇ／ｇ以上がさらに好ましく、０．１ｇ／ｇ以上が特に好ましく、０．５ｇ／ｇ以上が最も好ましい。重合体の被覆量は、重合体を被覆する前後の粒子のＴＧ−ＤＴＡを測定し、重合体被覆前後の熱重量減少の差分を求めることにより測定可能である。また、粒子断面の走査型電子顕微鏡像、又は粒子の透過型電子顕微鏡像により、重合体の厚みを求めることでも算出可能である。 磁性粒子のカルボキシル基量としては、多くの抗体を結合可能な磁性粒子とするのに好適のため、磁性粒子１ｇ当たりのカルボキシル基量として、５μｍｏｌ／ｇ以上が好ましく、１０μｍｏｌ／ｇ以上がさらに好ましく、２０μｍｏｌ／ｇ以上が特に好ましく、５０μｍｏｌ／ｇ以上が最も好ましい。また、磁性粒子への抗体以外の物質が非特異吸着し、免疫測定における測定ノイズが発生することを抑制するのに好適のため、磁性粒子１ｇ当たりのカルボキシル基量として、２００μｍｏｌ／ｇ以下が好ましく、１００μｍｏｌ／ｇ以下がさらに好ましく、５０μｍｏｌ／ｇ以下が特に好ましく、２０μｍｏｌ／ｇ以下が最も好ましい。カルボキシル基量の測定方法としては、ピレニルジアゾメタンと磁性粒子を混合し、反応により消失したピレニルジアゾメタンを定量する方法、又は電位差滴定により磁性粒子表面のカルボキシル基量を直接定量する方法を挙げることができる。

本発明の一態様にかかる免疫測定用磁性粒子は、比表面積が２ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。比表面積が２ｍ^２／ｇ以上であることで、単位重量当たりの磁性粒子の表面に結合可能な抗体の量を増やすことができ、免疫測定におけるシグナル強度を高めることができる。また、比表面積は３ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましく、５ｍ^２／ｇ以上が特に好ましく、１０ｍ^２／ｇ以上が最も好ましい。一方、磁性粒子の力学的強度を高めるのに好適であることから、比表面積は１００ｍ^２／ｇ以下が好ましく、５０ｍ^２／ｇ以下がさらに好ましく、３０ｍ^２／ｇ以下が特に好ましく、２０ｍ^２／ｇ以下が最も好ましい。

本発明の一態様にかかる免疫測定用磁性粒子は、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む製造方法により得られる。
（ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
（ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
（ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でカルボキシル基含有構造単位を有する単量体と、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面にランダム共重合体層を形成する工程
また、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む製造方法でも得ることができる。
（ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
（ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
（ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に共重合体層を形成する工程
（ｉｖ）共重合体層を形成した粒子にカルボン酸無水物を反応させ、カルボキシル基を導入する工程
また、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む製造方法でも得ることができる。
（ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
（ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
（ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でポリエチレングリコール基を有する界面活性剤の存在下、カルボキシル基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に重合体層を形成する工程
工程（ｉ）において、コア粒子の表面電荷と反対の電荷を有するナノ磁性体を接触させる方法、疎水性のコア粒子に疎水性のナノ磁性体を接触させる方法、常磁性を有するコア粒子にナノ磁性体を接触させる方法により、コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる。コア粒子とナノ磁性体を接触させる方法としては特に限定はなく、液相中、気相中で攪拌することで可能である。ナノ磁性体をコア粒子に均一に吸着させるために好適であることから、水溶液中でコア粒子にナノ磁性体を静電吸着させることが好ましい。また、前記静電吸着させたナノ磁性体を強固に固定させるため、静電吸着後に粒子を乾燥させることが好ましい。さらに、粒子の形状を真球化するのに好適であることから、高速気流中に磁性粒子を分散させながら、粒子同士の衝撃力によって乾式で表面改質することが好ましい。

工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）でナノ磁性体を吸着させた粒子表面に架橋無機物層を形成する。架橋無機物層を形成する方法に特に限定はないが、架橋無機物層の原料となる試薬と反応触媒を有する溶液中に粒子を分散させ、反応を進行させることで粒子表面に架橋無機物層を形成する方法、粒子表面に前記架橋無機物層又はその原料を被覆する方法等を挙げることができる。

工程（ｉｉｉ）において、工程（ｉｉ）で架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でカルボキシル基含有構造単位を有する単量体と、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に共重合体層を形成する。重合方法としては、粒子以外の成分が全て溶媒に溶解した状態で重合を行う分散重合法、溶媒に相溶しない単量体を使用し、粒子に単量体を吸着させた状態で重合を行うシード重合法等を挙げることができる。また、シード重合法としては、乳化剤を使用しないソープフリー重合、乳化剤を使用する乳化重合から適宜選択できる。また、ラジカル発生源としては過酸化物、アゾ化合物等を使用でき、溶媒又は単量体への溶解性については適宜選択可能である。

また、工程（ｉｉｉ）において、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合し、重合体層を形成した後、工程（ｉｖ）でカルボン酸無水物を反応させ、粒子表面にカルボキシル基を導入しても良い。粒子表面とカルボン酸無水物の反応方法は特に限定はなく、水を含まない溶媒中に粒子を分散させ、過剰量のカルボン酸無水物を加えることで可能である。

さらに、工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間に、（ｖ）架橋無機物層の表面に重合性官能基を有するシランカップリング剤を結合させる工程を有していても良い。架橋無機物層の表面にシランカップリング剤を結合させる方法としては特に限定はなく、溶媒中に粒子を分散させ、シランカップリング剤を加える方法、粒子表面にシランカップリング剤を被覆する方法から選択可能である。また、必要に応じて反応触媒となる酸性又は塩基性水溶液を併用してよい。

また、工程（ｉｉｉ）において、ポリエチレングリコール基有構造単位を有する単量体を用いる代わりに、ポリエチレングリコール基を含有する重合体を使用し、重合中のラジカル連鎖移動による粒子表面への化学結合による固定化、又は、粒子との疎水性相互作用又は静電相互作用、若しくは粒子表面の分子鎖との絡み合い効果のいずれかにより、粒子表面への物理吸着による固定化を利用し、ポリエチレングリコール基含有構造単位を粒子に導入してもよい。

本発明の一態様にかかる免疫測定用磁性粒子は、粒子の表面に抗体を固定化し、免疫測定用装置で使用することができる。抗体の結合方法としては、粒子表面のカルボキシル基を介して結合させることが好ましく、例えば、カルボキシル基にカルボジイミド等の縮合剤を反応させることで活性化させ、活性化させたカルボキシル基を抗体が有するアミノ基と反応させることで結合できる。

以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
［重合体被覆量の測定］
重合体被覆前後の粒子についてそれぞれＴＧ−ＤＴＡ測定を行い、１００℃から５６０℃までの熱重量減少を求めた。重合体被覆前の粒子における熱重量減少をΔＴＧ１、重合体被覆後の粒子における熱重量減少をΔＴＧ２としたとき、ΔＴＧ２−ΔＴＧ１を重合体被覆量とした。
［カルボキシル基量の測定］
磁性粒子１０ｍｇに酢酸エチル２ｍＬを加え、室温で２０分間攪拌。この粒子分散液にピレニルジアゾメタン０．１２ｍｇを溶解させた酢酸エチル２ｍＬを加え、室温で５０分間攪拌。粒子を除去した後、上澄み液をメタノールで１０倍希釈し、３９２ｎｍの吸光度を測定し、この吸光度をＡ１とし、粒子を使用せずに同様の操作を行った場合の溶液の吸光度をＡ０とした時、下記式からカルボキシル基量を求めた。

１３８×（Ａ０−Ａ１）μｍｏｌ／ｇ
［水分散性の評価］
乾燥させた粉末状の磁性粒子０．１ｇを１０ｇのイオン交換水に加え、手で振って攪拌して評価した。
○：水に均一分散可能
×：水に分散しない
［比表面積の測定］
Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ Ｃｏ．製の製品名ＱＵＡＤＲＡＳＯＲＢｅｖｏを使用し、吸着ガスとして窒素ガスを用いたＢＥＴ多点法により測定した。
［鉄イオン溶出の評価］
ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液１ｍＬに磁性粒子１０ｍｇを加え、３７℃で１７時間攪拌した。溶液から粒子を除いた溶液を測定試料とし、光の波長４６０ｎｍにおける溶液の吸光度を測定することで鉄イオンの溶出量を評価した。
［希釈固相懸濁液と検出用標識抗体溶液の調製］
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中に分散させた磁性粒子に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を過剰量加え、３７℃で１時間インキュベートした。クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で抗甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）抗体を加え、３７℃で３時間インキュベートして抗ＴＳＨ抗体を磁性粒子に結合させた。次にポリエチレングリコールから成る非特異吸着抑制剤を添加したトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１７時間インキュベートして磁性粒子にブロッキング処理を行い、抗ＴＳＨ抗体固定化磁性粒子とした（Ａ）。さらに（Ａ）を８％コラーゲンペプチドを含むＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、希釈固相懸濁液（Ｂ）を調製した。また抗ＴＳＨ抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）で希釈し、検出用標識抗体溶液（Ｃ）を調製した。
［非特異吸着（Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ：ＮＳＢ）及びポジカウント評価用サンプルの調製］
５％コラーゲンペプチドを含む０．０３ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、ＮＳＢ評価用サンプル（Ｄ）とした。また５％コラーゲンペプチドを含む０．０３ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にＴＳＨを添加して、ポジカウント評価用サンプル（Ｅ）とした。
［ＮＳＢ及びポジカウントの測定、感度の評価］
測定試薬（希釈固相懸濁液（Ｂ）と検出用標識抗体溶液（Ｃ）を含む凍結乾燥品）でＮＳＢ及びポジカウントの測定、感度の評価を行った。

ＮＳＢの測定は以下の手順で行った。

凍結乾燥した希釈固相懸濁液（Ｂ）を、トリトンＸ−１００を含む純水及びＮＳＢ評価用サンプル（Ｄ）で溶解した後、３７℃にて５分間免疫反応を行い、１回目のＢ／Ｆ分離を行った。次にトリトンＸ−１００を含む純水で溶解した検出用標識抗体溶液（Ｃ）を加えて３７℃にて３分間免疫反応を行い、２回目のＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（ＤＩＦＵＲＡＴ、３−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３，２，０］ヘプト−１−イル）フェニルリン酸エステル ジナトリウム塩）及びフルオレセインを含む化学発光補助試薬を加え、発光強度（ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ（ｃｐｓ））を測定しＮＳＢ値とした。

ポジカウントの測定は以下の手順で行った。

凍結乾燥した希釈固相懸濁液（Ｂ）を、トリトンＸ−１００を含む純水及びポジカウント評価用サンプル（Ｅ）で溶解した後、３７℃にて５分間免疫反応を行い、１回目のＢ／Ｆ分離を行った。次にトリトンＸ−１００を含む純水で溶解した検出用標識抗体溶液（Ｃ）を加えて３７℃にて３分間免疫反応を行い、２回目のＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（ＤＩＦＵＲＡＴ、３−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３，２，０］ヘプト−１−イル）フェニルリン酸エステル ジナトリウム塩）及びフルオレセインを含む化学発光補助試薬を加え、発光強度（ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ（ｃｐｓ））を測定しポジカウント値とした。

感度はポジカウント値／ＮＳＢ値の比を求めることによって評価した。
［実施例１］
工程（ｉ）（磁性化微粒子の作製）
ポリジビニルベンゼン粒子５．０ｇ（粒子径２．５μｍ）、ポリビニルピロリドン１．２ｇ、１Ｎ−塩酸水溶液６ｍＬを純水１６０ｍＬに回転数１８０ｒｐｍで分散させた。窒素雰囲気下、８０℃に昇温した後に、尿素６ｇ、塩化鉄（ＩＩ）四水和物２ｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物３ｇを添加し５時間反応させた。この粒子分散液をろ過にて粒子と反応液を分離した後に、再度粒子を純水２００ｍＬに回転数１８０ｒｐｍで分散させた。窒素雰囲気下、８０℃に昇温した後に、０．２Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を滴下し１５時間反応させた。純水にて洗浄し、酸化鉄被覆された粒子５．７５ｇを得た。

得られた酸化鉄被覆された粒子１ｇを純水５０ｍＬに室温にて回転数１００ｒｐｍで分散させた。この粒子分散液に、表面にカチオン系分散剤を有する磁性体（材質：マグネタイト、粒子径：１０ｎｍ、商品名：ＥＭＧ６０７、フェローテック社製）１．０ｇを添加し、室温にて回転数１００ｒｐｍで２時間反応させた。純水にて洗浄し、さらに５０℃で１５時間乾燥させることにより、磁性化された粒子を１．９３ｇ得た。

工程（ｉｉ）（磁性化粒子へのシリカ被覆）
前記磁性化された微粒子１ｇをエタノール４００ｍＬに分散させ、オルトけい酸テトラエチル３ｇを加え、室温にて回転数３００ｒｐｍで攪拌した。２５％アンモニア水２１ｇを加え、３５℃にて回転数３００ｒｐｍで４時間反応させた。純水及びエタノールにて洗浄し、減圧乾燥させた。透過型電子顕微鏡により確認したシリカ層の厚みは約２０ｎｍであった。

工程（ｖ）（シリカ被覆粒子へのメタクリル基導入）
シリカ被覆された粒子１ｇをメタノール７５ｍＬに分散させ、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン０．５ｇ、２５％アンモニア水１５ｇを加え、６０℃にて回転数３００ｒｐｍで３時間反応させた。メタノール及び純水にて洗浄し、減圧乾燥させた。

工程（ｉｉｉ）（メタクリル基導入粒子への重合体被覆）
前記メタクリル基導入された粒子０．１ｇを純水１８ｍＬに分散させ、ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（Ｍｎ＝３００）０．０３８ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．００８ｇ、過硫酸カリウム０．０２ｇを加え、脱気を行った後、窒素雰囲気下にて６５℃で３時間反応させた。純水及びメタノールにて洗浄し、減圧乾燥させた。

工程（ｉｖ）（カルボキシル基導入）
前記重合体被覆された粒子０．１ｇを２ｍＬのテトラヒドロフランに分散させ、無水コハク酸０．１ｇ、ジメチルアミノピリジン０．０１ｇを加え、６５℃で２時間反応させた。
（評価結果）
重合体被覆量は０．００６ｇ／ｇであった。カルボキシル基量は４４μｍｏｌ／ｇであった。

作製された磁性粒子は水分散性に優れ、鉄イオンの溶出が少ないものであった。比表面積は３８ｍ^２／ｇで、比表面積が大きなものであった。また、ＮＳＢは７６、ポジカウントは１０６５８００、感度は１４０２４で、感度に優れるものであった。
［実施例２］
実施例１の工程（ｉｉｉ）の単量体としてポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（Ｍｎ＝３００）の代わりに、ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（Ｍｎ＝３００）とメタクリル酸の混合比が７５：２５の重量比の混合物を用い、その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（評価結果）
重合体被覆量は０．００８ｇ／ｇであった。カルボキシル基量は５８μｍｏｌ／ｇであった。

作製された磁性粒子は水分散性に優れ、鉄イオンの溶出が少ないものであった。また、ＮＳＢは３４、ポジカウントは４２２７００、感度は１２４３２で、感度に優れるものであった。
［実施例３］
実施例１の工程（ｉｉｉ）の単量体としてポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（Ｍｎ＝３００）の代わりに、ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（Ｍｎ＝３００）とアクリル酸の混合比が７５：２５の重量比の混合物を用い、また、重合体被覆後の工程（ｉｖ）を全て実施せず、その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（評価結果）
重合体被覆量は０．０１２ｇ／ｇであった。カルボキシル基量は５０μｍｏｌ／ｇであった。

作製された磁性粒子は水分散性に優れ、鉄イオンの溶出が少ないものであった。また、ＮＳＢは５６、ポジカウントは５９２３００、感度は１０５７７で、感度に優れるものであった。
［実施例４］
実施例１の工程（ｉｉｉ）の代わりに、以下の方法で重合体被覆を実施し、また、重合体被覆後の工程（ｉｖ）を全て実施せず、その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（メタクリル基導入粒子への重合体被覆）
実施例１の工程（ｖ）で得られたメタクリル基導入された粒子０．２ｇを純水６ｍＬに分散させ、ポリオキシエチレン（４７）ラウリルエーテル０．０３ｇ、メタクリル酸０．０１５ｇ、シクロヘキシルメタクリレート０．０４ｇ、日油（株）製の製品名「パーブチルＯ」０．００４ｇを加え、脱気を行った後、窒素雰囲気下にて８０℃で８時間反応させた。純水及びメタノールにて洗浄し、減圧乾燥させた。
（評価結果）
重合体被覆量は０．１６９ｇ／ｇであった。カルボキシル基量は３０μｍｏｌ／ｇであった。

作製された磁性粒子は水分散性に優れ、鉄イオンの溶出が少ないものであった。比表面積は６．３ｍ^２／ｇで、比表面積が大きなものであった。また、ＮＳＢは４１、ポジカウントは５５８８００、感度は１３６２９で、感度に優れるものであった。
［実施例５］
実施例４の工程（ｉｉｉ）（メタクリル基導入粒子への重合体被覆）において、シクロヘキシルメタクリレートを添加せず、その他は実施例４と同様にして行った。
（評価結果）
重合体被覆量は０．０２５ｇ／ｇであった。カルボキシル基量は６９μｍｏｌ／ｇであった。

作製された磁性粒子は水分散性に優れ、鉄イオンの溶出が少ないものであった。また、ＮＳＢは４８、ポジカウントは５２６３９７、感度は１０９６７で、感度に優れるものであった。
［実施例６］
工程（ｉ）（磁性化微粒子の作製）
ポリジビニルベンゼン粒子１ｇ（粒子径２．２μｍ）を０．１Ｍの塩化ナトリウム純水５０ｍＬに室温にて回転数１００ｒｐｍで分散させた。この粒子分散液に、表面にカチオン系分散剤を有する磁性体（材質：マグネタイト、粒子径：１０ｎｍ、商品名：ＥＭＧ６０７、フェローテック社製）１．２ｇを添加し、室温にて回転数１００ｒｐｍで２時間反応させた。純水にて洗浄し、さらに５０℃で１５時間乾燥させることにより、磁性化された粒子を２．１８ｇ得た。この磁性化粒子をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０（（株）奈良機械製作所製）に投入し、回転速度１１３００ｍｉｎ^−１、処理中の平均温度３５℃で５分間処理した。

工程（ｉｉ）（磁性化粒子へのシリカ被覆）
前記磁性化された微粒子１ｇを２−プロパノール１０ｍＬに分散させ、オルトけい酸テトラエチル０．５ｇを加え、室温にて回転数１８０ｒｐｍで攪拌した。２５％アンモニア水０．５ｍＬを加え、３５℃にて回転数１８０ｒｐｍで４時間反応させた。メタノールにて洗浄し、減圧乾燥させた。透過型電子顕微鏡により確認したシリカ層の厚みは約１０ｎｍであった。

工程（ｖ）（シリカ被覆粒子へのメタクリル基導入）
シリカ被覆された粒子１ｇをメタノール１０ｍＬに分散させ、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン０．５ｇ、２５％アンモニア水０．５ｍＬを加え、３５℃にて回転数１８０ｒｐｍで３時間反応させた。メタノール及び純水にて洗浄し、減圧乾燥させた。

工程（ｉｉｉ）（メタクリル基導入粒子への重合体被覆）
前記メタクリル基導入された粒子１ｇをポリオキシエチレン（４７）ラウリルエーテル０．３ｇを溶解させた純水１０ｍＬに分散させ、メタクリル酸０．０７ｇ、シクロヘキシルメタクリレート０．０５ｇ、日油（株）製の製品名「パーブチルＯ」０．００５ｇを加え、室温にて回転数１８０ｒｐｍで１時間攪拌後、脱気を行った後、窒素雰囲気下にて８０℃で２時間反応させた。純水及びメタノールにて洗浄し、減圧乾燥させた。
（評価結果）
重合体被覆量は０．０５ｇ／ｇであった。

作製された磁性粒子は水分散性に優れ、鉄イオンの溶出が少ないものであった。また、ＮＳＢは３６、ポジカウントは８０３０８１、感度は２２３０８で、感度に優れるものであった。
［比較例１］
実施例１の工程（ｉｉ）、工程（ｖ）、工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）の全てを実施せず、その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（評価結果）
作製された磁性粒子は水分散性が乏しく、鉄イオンの溶出が多いものであった。
［比較例２］
実施例１の工程（ｉｉ）、工程（ｖ）、工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）の全てを実施せず、代わりに以下の方法で磁性化粒子への有機シランカップリング剤修飾を行った。その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（磁性化粒子への有機シランカップリング剤修飾）
実施例１の工程（ｉ）で得られた磁性化された微粒子１ｇをメタノール７５ｍＬに分散させた。３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン０．５ｇ、２５％アンモニア水１５ｇを加え、６０℃にて回転数３００ｒｐｍで３時間反応させた。メタノール及び純水にて洗浄し、減圧乾燥させた。
（評価結果）
作製された磁性粒子は水への分散性が乏しく、鉄イオンの溶出が多いものであった。
［比較例３］
実施例１の工程（ｉｉ）、工程（ｖ）、工程（ｉｖ）の全てを実施せず、代わりに以下の方法で磁性化粒子への重合体被覆を行った。その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（磁性化粒子への重合体被覆）
実施例１の工程（ｉ）で得られた磁性化された粒子０．１ｇを純水１８ｍＬに分散させ、メタクリル酸メチル４ｇ、過硫酸カリウム０．０２ｇを加え、脱気を行った後、窒素雰囲気下にて６５℃で３時間反応させた。純水及びメタノールにて洗浄し、減圧乾燥させた。
（評価結果）
作製された粒子は水への分散性に乏しいものであった。比表面積は１．８ｍ^２／ｇで、比表面積が小さなものであった。
［比較例４］
実施例１の工程（ｉｉ）、工程（ｖ）、工程（ｉｖ）を実施せず、その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（評価結果）
作製された粒子は鉄イオンの溶出が多いものであった。
［比較例５］
実施例１における工程（ｖ）、工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）を実施せず、その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（評価結果）
作製された磁性粒子のＮＳＢは７０、ポジカウントは１３９９８６、感度は２０００で、感度に劣るものであった。
［比較例６］
実施例１における工程（ｉｉｉ）を実施せず、その他は実施例１と同様にして粒子を作製した。
（評価結果）
作製された磁性粒子のＮＳＢは３６５、ポジカウントは９６２１２４、感度は２６３６で、感度に劣るものであった。
［比較例７］
実施例４の工程（ｉｉｉ）（メタクリル基導入粒子への重合体被覆）において、ポリオキシエチレン（４７）ラウリルエーテルを添加せず、その他は実施例４と同様にして行った。
（評価結果）
重合体被覆量は０．０５７ｇ／ｇであった。カルボキシル基量は６８μｍｏｌ／ｇであった。

作製された磁性粒子のＮＳＢは５２６、ポジカウントは９７１８０１、感度は１８４８で、感度に劣るものであった。
［比較例８］
実施例４の工程（ｉｉｉ）（メタクリル基導入粒子への重合体被覆）において、ポリオキシエチレン（４７）ラウリルエーテル及びシクロヘキシルメタクリレートを添加せず、その他は実施例４と同様にして行った。
（評価結果）
重合体被覆量は検出限界以下の微量であった。カルボキシル基量は６７μｍｏｌ／ｇであった。

作製された磁性粒子のＮＳＢは３９２、ポジカウントは８６３３８４、感度は２２０３で、感度に劣るものであった。
［比較例９］
実施例４の工程（ｉｉｉ）（メタクリル基導入粒子への重合体被覆）において、メタクリル酸を添加せず、その他は実施例４と同様にして行った。
（評価結果）
重合体被覆量は０．０６６ｇ／ｇであった。

作製された磁性粒子のＮＳＢは１２７、ポジカウントは７６９５７１、感度は６０６０で、感度に劣るものであった。

１ コア粒子
２ ナノ磁性体
３ 架橋無機物層
４ 親水性基含有構造単位を有する重合体層

Claims (15)

1. コア粒子と、前記コア粒子表面に形成された第１の被覆層と、前記第１の被覆層の表面に形成された第２の被覆層を有する磁性粒子であって、
   前記第１の被覆層は、ナノ磁性体を含有する架橋無機物層であり、
   前記第２の被覆層は、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する重合体層であり、カルボキシル基含有構造単位を有することを特徴とする、抗体結合用磁性粒子。
2. 前記ポリエチレングリコール基含有構造単位が、ポリエチレングリコール基を側鎖にもつ単量体単位であり、前記重合体が、前記第１の被覆層と共有結合していることを特徴とする、請求項１に記載の免疫測定用磁性粒子。
3. 前記重合体が、カルボキシル基を側鎖にもつ単量体単位を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の免疫測定用磁性粒子。
4. 前記第１の被覆層の表面が、前記重合体層で被覆されていない領域を有し、第１の被覆層の表面に存在する水酸基とカルボン酸無水物との反応に由来するカルボキシル基を有することを特徴とする、請求項２又は３に記載の免疫測定用磁性粒子。
5. 前記ポリエチレングリコール基含有構造単位が、ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤であり、前記重合体が、カルボキシル基を側鎖にもつ単量体単位を有することを特徴とする、請求項１に記載の免疫測定用磁性粒子。
6. 前記重合体が、疎水性基を側鎖にもつ単量体単位を有することを特徴とする、請求項５に記載の免疫測定用磁性粒子。
7. 前記ポリエチレングリコール基を有する界面活性剤が、重合体と共有結合していることを特徴とする、請求項５又は６に記載の免疫測定用磁性粒子。
8. 前記第１の被覆層の架橋無機物層がシリカを含有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子。
9. 比表面積が２〜１００ｍ^２／ｇであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子。
10. 下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜９に記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
    （ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
    （ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
    （ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でカルボキシル基含有構造単位を有する単量体と、ポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に共重合体層を形成する工程
11. 下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜９に記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
    （ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
    （ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
    （ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でポリエチレングリコール基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に重合体層を形成する工程
    （ｉｖ）重合体層を形成した粒子にカルボン酸無水物を反応させ、カルボキシル基を導入する工程
12. 下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜９に記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
    （ｉ）コア粒子の表面にナノ磁性体を物理吸着させる工程
    （ｉｉ）前記ナノ磁性体を吸着させた粒子の表面に架橋無機物層を形成する工程
    （ｉｉｉ）前記架橋無機物層を形成した粒子を水溶液に分散させ、水溶液中でポリエチレングリコール基を有する界面活性剤の存在下、カルボキシル基含有構造単位を有する単量体をフリーラジカル重合することにより粒子の表面に重合体層を形成する工程
13. 工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間に、（ｖ）架橋無機物層の表面に重合性官能基を有するシランカップリング剤を結合させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
14. 工程（ｉ）が、水溶液中でコア粒子にナノ磁性体を静電吸着させた後、乾燥させる工程を含むことを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。
15. 工程（ｉ）が、高速気流中に磁性粒子を分散させながら、粒子同士の衝撃力によって乾式で表面改質する工程を含むことを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の免疫測定用磁性粒子の製造方法。

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