DE60033648T2

DE60033648T2 - Auf einer Oberfläche befestigte polyfunktionelle Polymernetzwerke für Sensorchips

Info

Publication number: DE60033648T2
Application number: DE60033648T
Authority: DE
Inventors: Jürgen Rühe
Original assignee: TDK Micronas GmbH
Current assignee: TDK Micronas GmbH
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2020-07-28
Also published as: WO2002010758A2; EP1176423B1; DE60033648D1; ATE355525T1; WO2002010758A3; US7396561B2; AU2001289738A1; JP2004505170A; EP1176423A1; US20050202396A1

Description

Aufgrund der zunehmenden Bedeutung von Mikrotechniken bei einer großen Vielfalt wissenschaftlicher Anwendungen ist die Entwicklung von Systemen, welche die Wechselwirkung von Molekülen mit Oberflächen erlauben, nach wie vor von entscheidender Bedeutung. Solche Wechselwirkungen schließen die Möglichkeit der Abtrennung spezifischer Moleküle aus einer Probe, z.B. zur Erleichterung ihrer Analyse oder ihres Nachweises, aber auch die Möglichkeit der Präsentation von Molekülen auf einer Oberfläche ein, wodurch nachfolgende Reaktionen stattfinden können. Diese Grundsätze zur Immobilisierung von Molekülen können allgemein im Rahmen von chromatographischen oder Sensorsystemen oder zur Bereitstellung von modifizierten Oberflächen angewendet werden.
In den letzten Jahren hat es zahlreiche Ansätze gegeben, um Sensorchips auf der Grundlage von sich selbst organisierenden Monoschichten (engl. "self-assembled monolayers", "SAM's") aus bifunktionellen Molekülen herzustellen, welche Probenmoleküle direkt oder indirekt an die Sensoroberfläche koppeln. Typischerweise tragen diese bifunktionellen Moleküle eine Silan- oder Thiol-/Disulfidgruppe, um eine Bindung mit der anorganischen Oberfläche zu erzielen, und eine zusätzliche funktionelle Gruppe (z.B. Amino- oder Epoxidgruppen), die mit Probenmolekülen interagiert, welche in biologischen Proben häufig in Form eines Oligonukleotids, eines Proteins oder eines Polysaccharids etc. enthalten sind.
Während die Bildung einer direkten Bindung zwischen der bifunktionellen Verbindung und dem Probenmolekül möglich ist, müssen die Probenmoleküle nicht unbedingt direkt mit den Monolayer-bildenden Kopplungsgruppen interagieren. Alternativ können in geeigneter Weise immobilisierte Biomoleküle selbst als Sonden für den Nachweis von Probenmolekülen wirken. Solche Sondenmoleküle können ebenso durch eine Reaktion mit den freien funktionellen Gruppen des Monolayers immobilisiert werden. Insbesondere im Falle der Verwendung von Biomolekülen als Sondenmoleküle kann die Spezifität der Wechselwirkung zwischen den Probenmolekülen und der modifizierten Oberfläche durch deren Anwesenheit signifikant verstärkt werden. Zum Beispiel können die Monolayer aus bifunktionellen Molekülen in Fällen, bei denen die schnelle Analyse einer Probe mit DNA-Fragmenten oder -Molekülen erforderlich ist, zuerst mit synthetischen Oligonukleotiden in Kontakt gebracht werden, welche auf diese Weise immobilisiert werden. Anschließend erfolgt der Nachweis einer Hybridisierung spezifischer Moleküle, wie beispielsweise kompatibler Stränge einer Probe, z.B. mittels Fluoreszenzmikroskopie, sofern farbmarkierte Probenmoleküle verwendet werden.
Obwohl diese Techniken für diesen Zweck gut etabliert sind, ist die Anwendung standardisierter Nachweisverfahren problematisch, insbesondere in Fällen, in denen der für den Nachweis eines spezifischen Typs von Probenmolekülen verfügbare Oberflächenbereich beschränkt ist, z.B. bei paralleler Analyse einer Vielzahl von Molekülen, weil die Monolayer in ihrer Pfropfdichte beschränkt sind. Beispielsweise müssen geeignete Detektoren hohe Anforderungen in Bezug auf ihre Sensitivität erfüllen, da die Anzahl an hybridisierten Doppelsträngen pro Oberflächeneinheit eines Sensors nicht einfach erhöht werden kann. Daher kann zum Nachweis eines Oligonukleotidtyps notwendige minimale Oberflächenbereich auf einem Sensor, der nicht einfach reduziert werden. Ferner kann die maximale Dichte, d.h. ein Proben- oder Sondenmolekül pro funktionelle Gruppe der Kopplungsgruppen, nur sehr schwer erreicht werden, da aufgrund sterischer Behinderung im zweidimensional ausgestalteten Monolayer lediglich ein Teil der funktionellen Gruppen in der Lage sein wird, mit Proben- oder Sondenmolekülen zu reagieren. Somit ist die gesamte Pfropfdichte gering und normalerweise nicht gut definiert.
Ähnliche Probleme bezüglich der beschränkten Anzahl an Reaktionsstellen pro Oberflächeneinheit können in anderen Anwendungen auftreten, bei denen es wünschenswert ist, eine erhöhte Anzahl an Molekülen auf einer Oberfläche zu immobilisieren.
Zahlreiche Versuche sind unternommen worden, um die oben beschriebenen Probleme zu überwinden. In Bezug auf die Analyse von Oligonukleotiden ist versucht worden, die Pfropfdichte auf der Oberfläche zu erhöhen durch Verwendung von Oligomeren oder Polymeren, die einen Oligonukleotidstrang (oder eine funktionelle Gruppe für seine Anheftung) zusammen mit einer geeigneten Gruppe tragen, welche die Bindung dieser Oligomere oder Polymere an die Oberfläche des Sensorchips erlaubt. Aufgrund der erhöhten Flexibilität der oligomeren oder polymeren Ketten ist ein größerer Teil der an der Oberfläche gekoppelten bifunktionellen Oligomer- oder Polymermolekülen in der Lage, Oligonukleotid-Sondenmoleküle zu immobilisieren.
Die gesamte Oligonukleotid-Pfropfdichte ist jedoch nicht signifikant erhöht, weil die Pfropfdichte der bifunktionellen oligomeren oder polymeren Moleküle auf der Oberfläche beschränkt ist. Dies ist eine Folge der Tatsache, dass die eigenständige Zusammenlagerung der Oligomere oder Polymere aus kinetischen Gründen gestört ist, denn sobald die Sensoroberfläche mit solchen Molekülen beschichtet ist, müssen weitere Polymere gegen einen Konzentrationsgradienten diffundieren, um die Oberfläche zu erreichen.
Ein anderer Ansatz zu den oben genannten, sich selbst organisierenden Monolayern aus bifunktionellen Molekülen zur Immobilisierung besteht in der Verwendung von Netzwerken zur DNA-Analyse. Ein Nachteil besteht darin, dass diese Netzwerke nicht an die Sensoroberfläche gekoppelt werden und nicht strukturiert sind, d.h. sie bilden keine gerasterten Arrays aus. Da die Netzwerke ferner in dem verwendeten Hybridisierungsmedium quellfähig sein müssen, besteht ferner das Risiko, dass das Netzwerk von der Oberfläche abgelöst wird.
Die Schrift US 5,695,925 offenbart eine Sensoroberfläche, die mit einem polyfunktionalen Netzwerk beschichtet ist, welches vernetzte Polymer-Subketten umfasst. Verschiedene Sonden-/Probenmoleküle sind durch Seitengruppen an das Polymernetzwerk gekoppelt. Aufgrund der Anwesenheit eines verknüpften Netzwerkes ist die Anzahl an interagierenden Molekülen pro Oberfläche im Vergleich zu konventionellen Monolayern, deutlich erhöht. Die US 5,695,925 offenbart nicht die Beschichtung einer Sensoroberfläche mit einem Monolayer eines Polymerisationsinitiators, welcher eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfasst, die für eine kovalente Kopplung an die Oberfläche geeignet sind, und das Kontaktieren des Polymerisationsinitiators entweder mit einer Lösung umfassend Polymerisationsinitiatoren, Vernetzern, und eine polymerisierbare Mischung von Monomeren und Comonomeren, die funktionelle Gruppen tragen, welche eine Wechselwirkung mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben, nach Anspruch 1 oder 8, oder mit einem Polymernetzwerk nach Anspruch 2 oder 9.
Dementsprechend liegt eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer Oberfläche, die mit einer Polymerschicht modifiziert ist, welche funktionelle Gruppen zur Wechselwirkung mit Proben- oder Sondenmolekülen umfasst, wobei die Anzahl der pro Oberflächeneinheit wechselwirkenden Moleküle im Vergleich zu konventionellen Monolayern aus bifunktionellen Molekülen merklich erhöht ist. Außerdem sollte die Dichte an verfügbaren Wechselwirkungsstellen höher sein als die aus der Reaktion bifunktioneller Polymere oder Oligomere mit der Oberfläche erhaltene.
In dem spezifischen Fall des Nachweises von DNA-Molekülen, wie z.B. von Oligonukleotiden, kann die Aufgabe ausgedrückt werden als die Bereitstellung einer Oberfläche mit einer Pfropfdichte an synthetischen Oligonukleotidsträngen, die höher ist als die durch Kopplung der entsprechenden Oligonukleotide an einen funktionalisierten Monolayer aus niedermolekularen Verknüpfern erzeugte. Außerdem sollte die Pfropfdichte höher sein als die, welche aus der Reaktion von Polymeren oder Oligomeren, die mit einem synthetischen Oligonukleotid-Einzelstrang modifiziert sind, mit der Oberfläche resultiert.
Diese Aufgabe ist gelöst worden mit einer Oberfläche, wie sie in den beigefügten Ansprüchen beschrieben ist, der ein polyfunktionales Polymernetzwerk anhaftet, das eine Anordnung vernetzter Polymer-Subketten umfasst (welche die „Maschen" des Netzwerks ausbilden) (nachstehend auch lediglich als „Netzwerk" bezeichnet), wobei diese Polymer-Subketten jeweils eine Vielzahl identischer oder unterschiedlicher sich wiederholender Einheiten umfassen können, welche eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen, die eine Wechselwirkung des Polymers mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben. Die Anzahl von „Ankergruppen", die das Netzwerk an die Oberfläche anheften oder koppeln, bestimmt die Adhäsionsstärke des Netzwerkes an die Oberfläche und die mechanische Festigkeit des gesamten Systems. Die Anzahl dieser Ankerpunkte wird (wie weiter unten erläutert) durch die Oberflächendichte an verwendeten immobilisierten Initiatoren gesteuert. Sofern beispielsweise solch ein polyfunktionales Polymernetzwerk verwendet wird, um eine oder mehrere synthetische Oligonukleotidsonden zu immobilisieren, können nach einer Hybridi sierungsreaktion komplementäre Nukleinsäuren in einer Mischung von Probenmolekülen nachgewiesen werden. Überraschenderweise ist gefunden worden, dass ein solches oberflächengebundenes polyfunktionales Polymernetzwerk nicht an den Problemen der herkömmlichen Nachweismethoden leidet, wonach eine hohe Dichte an funktionellen Gruppen an der Oberfläche nicht erzielt werden konnte. Da die Flexibilität des polyfunktionalen Polymernetzwerks eine vollständige Beschichtung der Sensoroberfläche erlaubt, können ferner Oberflächeneffekte verhindert werden, wie sie z.B. während des Laserscannens auftreten. Ferner sind die oberflächengebundenen polyfunktionalen Netzwerke stabil, können leicht strukturiert werden, d.h. sie können rasterartige Arrays ausbilden, und bieten eine Verbesserung der Sensitivität des Sensors.
Der Begriff „Wechselwirkung", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, schließt die Bildung kovalenter Bindungen sowie anziehender ionischer und van-der-Waals'scher Kräfte und von Wasserstoffbindungen ein. Die jeweilige funktionelle Gruppe innerhalb des polyfunktionalen Polymernetzwerkes oder der Sondenmoleküle, welche die Art der Wechselwirkung bestimmt, wird entsprechend der gewünschten Anwendung der erfindungsgemäßen Oberfläche ausgewählt.
Der Ausdruck „immobilisieren" wird vorliegend für eine Wechselwirkung von Molekülen mit dem polyfunktionalen Polymernetzwerk verwendet, was zur Bildung einer Bindung führt, die unter den gewählten Bedingungen dauerhaft ist. Beispielsweise werden Sondenmoleküle durch das polyfunktionale Netzwerk während ihrer Aufbringung auf eine Sensoroberfläche immobilisiert. Allerdings kann eine Immobilisierung durch Veränderung der Bedingungen (z.B. pH-Wert, Zugabe spezifischer Spaltungsagenzien) manchmal rückgängig gemacht werden. Der Begriff „Probenmolekül" wird hier für Moleküle verwendet, die in einer Probe vorhanden sind und die vorübergehend oder dauerhaft an das erfindungsgemäße polyfunktionale Netzwerk koppeln. Die vorliegende Erfindung schließt zwei allgemeine Prinzipien für eine Wechselwirkung des erfinderischen polyfunktionalen Netzwerks mit den Probenmolekülen ein. Nach einer ersten Ausführungsform sind die innerhalb des polyfunktionalen Netzwerks umfassten funktionellen Gruppen so ausgewählt, dass sie eine direkte Wechselwirkung der Ketten mit den Probenmolekülen erlauben. Nach einer zweiten Ausführungsform werden Sondenmoleküle an den funktionellen Gruppen des polyfunktionalen Netzwerks immobilisiert, und eine Wechselwirkung erfolgt zwischen diesen Sondenmolekülen und den Probenmolekülen.
Geeignete Sondenmoleküle sind Moleküle, die mindestens bifunktionell sind, so dass nach ihrer Kopplung an das polyfunktionale Polymernetzwerk neue Wechselwirkungsstellen in dem erfindungsgemäßen oberflächengebundenen polyfunktionalen Netzwerk vorhanden sind, die eine Wechselwirkung mit Probenmolekülen erlauben. Vorzugsweise stellen die Sondenmoleküle hochspezifische Wechselwirkungsstellen für die Probenmoleküle bereit. Sie können von natürlichen oder nicht-natürlichen Quellen abgeleitet sein. Besonders bevorzugte Sondenmoleküle sind Biomoleküle wie Nukleinsäuren, einschließlich DNA, RNA oder PNA (Peptid-Nukleinsäure), am meisten bevorzugt Oligonukleotide oder Aptamere, Polysaccharide, Proteine einschließlich glykosidisch modifizierte Proteine oder Antikörper, Enzyme, Zytokine, Chemokine, Peptidhormone oder Antibiotika, und Peptide. Um eine ausreichende Stabilität sicherzustellen, z.B. während einer Sensoranwendung, sind die Sondenmoleküle vorzugsweise kovalent an das polyfunktionale Polymernetzwerk gebunden.
In Abhängigkeit von der Verwendung kann eine Vielzahl von identischen Sondenmolekülen oder eine Mischung aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Sonden immobilisiert werden. Beispielsweise ist für die Verwendung des polyfunktionalen Polymernetzwerkes als Affinitätsmatrix ein Satz identischer Sondenmoleküle bevorzugt.
Das erfindungsgemäße polyfunktionale Polymernetzwerk umfasst eine Anordnung vernetzter Polymer-Subketten, die an eine Oberfläche gekoppelt sind. Vorzugsweise sind die Bindungen zwischen dem polyfunktionalen Polymernetzwerk und der Oberfläche kovalent. Gewünschtenfalls ist das Einführen von verzweigten Polymeren möglich. In einigen Fällen ist eine Zugabe von Comonomeren zweckmäßig, mit denen die physikalischen Eigenschaften des Netzwerks an die gewünschte Anwendung angepasst werden können.
Die Mindestkomponenten des Netzwerks sind die funktionalisierten sich wiederholenden Einheiten und die vernetzenden Einheiten. Für die funktionalisierten sich wiederholenden Einheiten enthalten die Subketten des Polymernetzwerks sich wiederholende Einheiten, die mindestens eine der funktionellen Gruppen tragen, welche mit Proben- oder Sondenmoleküle wechselwirken können. Um dem polyfunktionalen Polymernetzwerk jedoch bestimmte vorteilhafte Eigenschaften zu verleihen, kann ein aus diesen Monomeren mit spezifischen funktionellen Gruppen für die Wechselwirkung mit Proben- oder Sondenmolekülen gebildetes Copolymer (nachfolgend bezeichnet als „funktionalisierte Monomere") zusammen mit anderen Comonomeren verwendet werden.
Beispielsweise ist die Reaktion der Proben- oder Sondenmoleküle mit dem polyfunktionalen Polymernetzwerk signifikant erleichtert, wenn das polyfunktionale Polymernetzwerk in dem diese Moleküle enthaltenden Lösungsmittel quellbar ist, so dass bevorzugt Comonomere ausgewählt werden sollten, die eine starke Wechselwirkung mit dem fraglichen Lösungsmittel zeigen. Dies kann durch Verwendung von Comonomeren erzielt werden, welche die Quellfähigkeit des Netzwerks verbessern. Da nach einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Biomoleküle, die normalerweise in wässrigen Lösungen vorhanden sind, mit dem polyfunktionalen Polymernetzwerk wechselwirken, ist das polyfunktionale Polymernetzwerk bevorzugt in Wasser quellbar.
Demnach können beispielsweise ein oder mehrere Comonomere verwendet werden, die polar oder sogar in Wasser löslich sind, sofern ein Homopolymer aus funktionalisierten Monomeren keine ausreichende Wechselwirkung mit Wasser zeigt, um eine schnelle Reaktion der nachzuweisenden Moleküle mit den funktionellen Gruppen zu ermöglichen. Beide Arten von Monomeren, sowohl funktionalisierte als auch Comonomere, enthalten vorzugsweise eine C-C Doppelbindung, die in einer radikalischen Polymerisationsreaktion reagieren kann. Beispiele für geeignete Comonomere, die ein wasserquellbares Polymer erzeugen, sind Acrylsäure, Methacrylsäure und Derivate davon, z.B. Ester und Amide dieser Säuren mit Alkoholen oder Aminen, die vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatome umfassen.
Übliche Beispiele aus dieser Gruppe von Monomeren sind Hydroxyethylmethacrylat, Acrylamid und Dimethylacrylamid. Ein weiteres geeignetes Monomer ist Vinylpyrrolidon. Es ist auch möglich, Monomere zu verwenden, die zuerst wasserunlösliche Polymere erzeugen, welche dann in wasserlösliche Derivate überführt werden können. Ein geeignetes Beispiel aus dieser Gruppe von Polymeren ist Polyvinylalkohol, das beispielsweise durch Esterspaltung von Polyvinylacetat erhältlich ist.
Sofern ein Copolymer verwendet wird, wird das Verhältnis zwischen Comonomeren und funktionalisierten Monomeren vor dem Polymerisationsprozess festgelegt, um die Zusammensetzung der resultierenden Polymerketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks zu definieren. Vorzugsweise liegt das Verhältnis zwischen Comonomeren und funktionalisierten Monomeren in einem Bereich von 50/1 bis 1/1, besonders bevorzugt von 20/1 bis 2/1.
Die funktionellen Gruppen, die notwendig sind, um eine Wechselwirkung des polyfunktionalen Polymernetzwerks mit den Proben- oder Sondenmolekülen zu erlauben, sind bevorzugt in Seitenketten der Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks vorhanden. Eine „Vielzahl" von in Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks der vorliegenden Erfindung umfassten funktionellen Gruppen bedeutet mindestens zwei, vorzugsweise aber mehr als zwei Gruppen pro Polymer-Subkette. Da die betreffenden funktionellen Gruppen vorzugsweise in sich wiederholenden Einheiten umfasst sind, welche die Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks bilden, kann ihre Anzahl bis zu mehreren Tausend betragen, z.B. können bis zu 10.000 dieser Gruppen in einer einzelnen Subkette vorhanden sein, abhängig von der Größe des zu immobilisierenden Sonden- oder Probenmoleküls. Vorzugsweise umfasst jede Kette 20 bis 1.000 dieser funktionellen Gruppen.
Geeignete funktionalisierte sich wiederholende Einheiten, die in den Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks vorhanden sind, sind solche sich wiederholende Einheiten, die eine polymerisierbare C-C Doppelbindung sowie eine weitere funktionelle Gruppe umfassen, die nicht in dem Polymerisationsprozess beteiligt ist. Vorzugsweise ist diese funktionelle Gruppe mit den Hauptpolymer-Subketten des polyfunktio nalen Polymernetzwerks verknüpft durch eine C₂-C₁₀-, besonders bevorzugt durch eine C₃-C₇-Alkylkette als Spacer.
Die Spacer-Moleküle können Teil der funktionalisierten Monomere sein. Für diesen Ansatz geeignete Monomere schließen Acryl- und Methacrylester oder Amide von C₂-C₁₀-Alkoholen oder C₂-C₁₀-Aminen ein. Um als Spacer zu dienen, tragen diese Alkohole oder Amine eine zusätzliche funktionelle Gruppe an dem Terminus, der demjenigen gegenüberliegt, an welchem sich die Ester- oder Amidbindung bildet. Diese funktionelle Gruppe stellt entweder diejenige dar, welche für die Wechselwirkung mit den Proben- oder Sondenmolekülen notwendig ist, oder sie kann in einem weiteren Schritt zu einer derartig geeigneten funktionellen Gruppe umgewandelt werden.
Wahlweise ist es auch möglich, diese Spacer-Moleküle an geeignete reaktive Bereiche innerhalb der Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks nach seiner Bildung zu koppeln. In diesem Fall müssen reaktiven Monomere, wie Acryl- oder Methacrylsäurechloride oder reaktive Ester davon, wie N-Hydroxysuccinimide oder andere Monomere, z.B. Maleinanhydrid, während der Polymerisation vorliegen. Diese bevorzugten reaktiven Monomere können kovalente Bindungen mit den bifunktionellen Alkoholen oder Aminen bilden, die als Spacer verwendet werden können.
Die die Spacer-Einheit tragenden Monomere können leicht aus dem jeweiligen Acryl- oder Methacrylsäurechlorid oder -anhydrid und der ω-Amino- oder Hydroxycarboxylsäure synthetisiert werden. Das resultierende Produkt kann unter Verwendung von z.B. N-Hydroxysuccinimid in das aktive Esterderivat umgewandelt werden. Ein detailliertes Verfahren zur Synthese verschiedener Beispiele derartiger Monomere ist in der Literatur zu finden, z.B. in H. -G. Batz, J. Koldehoff, Macromol. Chem. 177 (1976) 683. Wie zuvor beschrieben ist es möglich, reaktive Monomere zu verwenden, die direkt die Polymer-Subketten des erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerks erzeugen. Alternativ können Monomere ausgewählt werden, die einen Vorläufer der funktionellen Gruppe tragen, welche auf der endgültigen Oberfläche verwendet werden soll, z.B. ein Säurechlorid oder ein Säureanhydrid. Anschließend können sie zu reaktiven Gruppen umgewandelt werden, z.B. NHS-Ester oder Glycidylestergruppen, welche unter den gewünschten Bedingungen eine Wechselwirkung des polyfunktionalen Polymernetzwerks mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben.
Demnach sind alle polymerisierbaren Monomere für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet, solange sie mit funktionellen Gruppen kombiniert werden können oder diese umfassen, die notwendig sind, um eine Wechselwirkung des polyfunktionalen Polymernetzwerks mit den Proben- oder Sondenmolekülen zu erlauben.
Funktionelle Gruppen, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind bevorzugt ausgewählt entsprechend der Moleküle, mit denen eine Wechselwirkung erzielt werden soll. Die Wechselwirkung kann auf eine einzige Art von Probenmolekül oder auf eine Vielfalt von Probenmolekülen gerichtet sein. Da eine wichtige Anwendung der vorliegenden Erfindung der Nachweis spezifischer Moleküle in biologischen Proben ist, werden die innerhalb des polyfunktionalen Polymernetzwerks vorhandenen funktionellen Gruppen bevorzugt mit natürlichen oder synthetischen Biomolekülen wechselwirken, die zur spezifischen Wechselwirkung mit den Molekülen in biologischen Proben in der Lage sind, was zu ihrem Nachweis führt. Geeignete funktionelle Gruppen sind vorzugsweise in der Lage, mit Nukleinsäuren und Derivaten davon, wie DNA, RNA, oder PNA, z.B. Oligonukleotiden oder Aptameren, Polysacchariden, Proteinen einschließlich glykosidisch modifizierten Proteinen oder Antikörpern, Enzymen, Zytokinen, Chemokinen, Peptidhormonen oder Antibiotika oder Peptiden oder markierten Derivaten davon zu reagieren. Ferner ist es möglich, die Kopplungsreaktion zwischen den nachzuweisenden Molekülen oder den synthetischen Oligonukleotiden und dem polyfunktionalen Polymernetzwerk unter Bedingungen durchzuführen, die für die Proben- oder Sondenmoleküle nicht nachteilig sind. Folglich sollte die Reaktion bei einer Nukleinsäure/Sensor-Anwendung in einer wässrigen Lösung durchgeführt werden, und die Temperatur sollte 95°C nicht übersteigen.
Außerdem sollte die Kopplungsreaktion in einer angemessenen Geschwindigkeit ablaufen, so dass der Nachweis vorzugsweise innerhalb von weniger als 24 Stunden durchgeführt werden kann, ohne dass in der Lösung extreme pH-Werte nötig sind. Zur Immobilisierung von synthetischen Oligonukleotid-Einzelsträngen sollte der pH-Wert in einem Bereich zwischen 7 und 11 liegen, vorzugsweise zwischen 7 und 10. Während der Hybridisierungsreaktion der Nukleinsäure-Probenmoleküle mit den Sondenmolekülen müssen die Bindung zwischen der funktionellen Gruppe und dem synthetischen Oligonukleotid-Einzelstrang sowie die Bindungen des polyfunktionalen Polymernetzwerks zum Träger in der Lage sein, Temperaturen von mehr als 65°C und einem pH-Wert von 6–9 standzuhalten. Bei der Verwendung von DNA als Probenmolekül muss die Temperatur möglicherweise bis ungefähr 95°C erhöht werden, um eine Trennung der DNA-Stränge zu bewirken, was für eine Hybridisierung notwendig ist.
Da die meisten Sondenmoleküle, besonders in biologischen oder medizinischen Anwendungen, sterisch ungehinderte nukleophile Reste umfassen, umfassen bevorzugte Wechselwirkungen mit dem polyfunktionalen Polymernetzwerk nukleophile Substitutionen oder zusätzliche Reaktionen, die zu einer kovalenten Bindung zwischen den Polymer-Subketten und den Proben- oder Sondenmolekülen führen. Beispielsweise werden synthetische Oligonukleotide üblicherweise mit einer freien Amingruppe an einem Ende (5' oder 3') bereitgestellt. Folglich stellen beispielhafte funktionelle Gruppen zum Beispiel eine reaktive Doppelbindung, ein Äquivalent einer Doppelbindung (wie z.B. eine Epoxygruppe) oder eine reaktive Austrittsgruppe bereit. Jedoch können auch ionische oder van-der-Waals-Kräfte sowie Wasserstoffbindungen eingesetzt werden, um Probenmoleküle an das polyfunktionale Polymernetzwerk zu koppeln, sofern die funktionellen Gruppen dementsprechend ausgewählt werden.
Bevorzugte funktionelle Gruppen können aus der Literatur hinsichtlich der Molekülklassen, die immobilisiert werden sollen, und der anderen zuvor beschriebenen Anforderungen (Reaktionszeit, Temperatur, pH-Wert) ausgewählt werden. Eine allgemeine Liste kann beispielsweise dem Textbuch „Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson, Academic Press, 1996, entnommen werden. Im Falle der Anheftung aminoterminaler Oligonukleotide sind sog. aktive oder reaktive Ester, wie N-Hydroxysuccinimide (NHS-Ester), Epoxide, vorzugsweise Glycidylderivate, Isothiocyanate, Isocyanate, Azide, Carbonsäuregruppen oder Maleinimide Beispiele für geeignete Gruppen.
Als bevorzugte funktionelle Monomere, welche direkt zu polyfunktionalen Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks führen, können die folgenden Verbindungen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden:

– Acryl- oder Methacrylsäure-N-Hydroxysuccinimide,
– N-Methacryloyl-6-aminopropansäure-Hydroxysuccinimidester,
– N-Methacryloyl-6-aminocapronsäure-Hydroxysuccinimidester oder
– Acryl- oder Methacrylsäure-Glycidylester.

In Abhängigkeit von der Anwendung gibt es die Möglichkeit, die Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks mit einer Kombination aus zwei oder mehreren funktionellen Gruppen bereitzustellen, z.B. durch Ausführung der zu den Polymer-Subetten führenden Polymerisation in Anwesenheit verschiedener Arten funktionalisierter Monomere. Alternativ können die funktionellen Gruppen identisch sein.
Ein vorteilhaftes und bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerks wird im Folgenden beschrieben.
In einem ersten Schritt wird eine Oberfläche mit einem Monolayer aus Polymerisationsinitiatoren oder Startermolekülen beschichtet. Die Gruppen in diesen Initiatoren, welche den Beginn der Polymerisation erlauben, werden üblicherweise ausgewählt aus z.B. Peroxogruppen oder Azogruppen, sofern ein thermisch initiierter radikalischer Mechanismus Anwendung findet. Aromatische Ketone wie Benzoin, Benzil oder Benzophenonderivate werden vorzugsweise verwendet, wenn die Polymere durch photochemische Initiation gebildet werden. Schwefel umfassende aromatische Ketone können gewünschtenfalls ebenso verwendet werden, um die geeignete Wellenlänge zur Photoinitiation auf einen längeren Wellenlängenbereich zu verschieben. Neben derartig labilen Gruppen tragen geeignete Initiatoren für das erfindungsgemäß bevorzugte Verfahren eine oder mehrere Gruppen, die für ihre Anheftung an die Oberfläche geeignet sind, welche mit den Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks zu beschichten ist. Die gleichen oder verschiedene Initiatoren können auch in der Polymerisationsmischung vorhanden sein.
Die Polymer-Subketten des erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerks werden üblicherweise durch eine Kettenreaktion von der Oberfläche wachsen gelassen und gleichzeitig vernetzt (vernetzende Polymerisation unter teilweiser Verwendung von immobilisierten Initiatoren). Obwohl aus praktischen Gründen radikalische Mechanismen bevorzugt sind, ist die Anwendung ionischer oder anderer Polymerisationstechniken ebenfalls möglich.
Die in den Initiatormolekülen zur Oberflächenanheftung umfassten funktionellen Gruppen müssen an die verwendete Sensoroberfläche angepasst sein. Zur Herstellung des Initiator-Monolayers auf Metalloxiden, insbesondere Siliziumoxid-Oberflächen (bedampfte oder gesputterte SiO_x-Schichten, SiO₂-Oberflächen von Silizium-Wafern, Glas, Quartz), werden Chlorsilanreste oder Alkoxysilane verwendet. Zur Modifikation von Goldoberflächen können Thiol- oder Disulfidgruppen eingesetzt werden. Allerdings werden Silane üblicherweise aufgrund ihrer erhöhten Stabilität auf Oberflächen bevorzugt. Ferner ist die vorliegende Erfindung nicht auf anorganische Oberflächen beschränkt. Organische Polymeroberflächen können auch als Träger für das polyfunktionale Polymernetzwerk verwendet werden, und es besteht auch die Möglichkeit, die Starter für die Polymerisationsreaktion direkt in ein solches Oberflächen bildendes Polymer einzubinden.
Bevorzugte Beispiele für Initiatoren, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind nachfolgend zusammen mit ihrer Strukturformel aufgelistet:

– 4,4'-Azobis-(4-cyanopentansäure(3''-chlordimethylsilyl)Propylester), Verbindung 1 oder die jeweilige Di- und Trichlor- oder Mono-, Di- und Trialkoxysilan-Analoga,
– 2,4'-Azo-(4-cyanopentansäure(3''-chlordimethylsilyl)Propylester), Verbindung 2 oder die jeweilige Di- und Trichlor- oder Mono-, Di- und Trialkoxysilan-Analoga; oder die jeweiligen Verbindungen mit einem Undecylspacer anstelle eines Propylspacers, oder Disulfid- oder Thiolderivate von diesem allgemeinen Typ von Azoverbindungen,
– 4-(3''-Chlordimethylsilyl)propyloxy)-Benzophenon, Verbindung 3 oder die jeweilige Di- und Trichlor- oder Mono-, Di- und Trialkoxysilan-Analoga,
– Silan- und Disulfid-/Thiolderivate von Arylazomalodinitrilen, wie zum Beispiel Verbindung 4.

Bevorzugte Beispiele für geeignete Vernetzer sind: Bisacrylate, Bismethacrylate, zum Beispiel Oligoethylenglycol-Bismethacrylate wie Ethylenglycol-Bismethacrylat, und Bisacrylamide, zum Beispiel Ethylendiamin-Bisacrylamid.
Nach Initiierung der Polymerisationsreaktion, vorzugsweise durch einen Erwärmungsschritt (thermische Initiierung) oder Bestrahlung (Photoinitiierung) in Anwesenheit von polymerisierbaren funktionalisierten Monomeren und Vernetzern, können von der Oberfläche Polymer-Subketten gebildet und gleichzeitig vernetzt werden. Die Polymerisation kann unter bekannten Standardbedingungen des Standes der Technik durchge führt werden. Sofern diese Technik angewandt wird, können die Pfropfdichten des resultierenden polyfunktionalen Polymernetzwerks über einen weiten Bereich gesteuert werden, zum Beispiel durch Änderung der Polymerisationszeit. Ferner können Pfropfdichten erzielt werden, die für andere Verfahren unerreichbar sind. Auf diese Weise können die Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks so gekoppelt werden, dass der durchschnittliche Abstand zwischen den Ankerstellen auf der Oberfläche 5 nm oder weniger beträgt, z.B. 2 bis 5 nm. Vorteilhafterweise können solche Pfropfdichten unabhängig vom Molekulargewicht der gekoppelten Ketten erzielt werden, z.B. selbst für Molekulargewichte von 100.000 g/Mol oder mehr. Darüber hinaus erlaubt die bevorzugte in-situ Bildung eines erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerks auf einer Oberfläche die Steuerung des durchschnittlichen Molekulargewichts der gekoppelten Polymer-Subketten des polyfunktionalen Polymernetzwerks unabhängig von der Pfropf dichte.
Entsprechend dieser präzisen Steuerung der Parameter Pfropfdichte, Vernetzerdichte und Molekulargewicht ist es möglich, die Eigenschaften des jeweiligen polyfunktionalen Polymernetzwerks an eine Vielfalt von Anwendungen anzupassen. Durch Einstellung der Reaktionsbedingungen können Netzwerke mit einer Dicke in einem Bereich von wenigen Nanometern bis zu einigen Millimetern oder sogar mehr erstellt werden. Es ist auch möglich die Eigenschaften des resultierenden polyfunktionalen Polymernetzwerks feinabzustimmen, z.B. in Bezug auf die Zugänglichkeit der funktionellen Gruppen für anschließend gekoppelte Sonden- und Probenmoleküle, die in ihrer Größe und Struktur beträchtlich variieren können.
Die durch das obige bevorzugte Verfahren erhaltenen polyfunktionalen Polymernetzwerke behalten ein Fragment des Initiators in ihrer Struktur bei, welcher sie auf der Oberfläche immobilisiert, und zwar das Teil, welches mit der Ankerungsstelle beginnt und zur vorbestimmten Initiierungsstelle führt, wie es im Stand der Technik für alle Typen von Initiatoren bekannt ist, insbesondere die in dieser Anmeldung genannten.
Detaillierte Informationen zur Synthese von Initiatormolekülen, ihrer Reaktion mit Oberflächen und die bevorzugten Polymerisationsbedingungen sind beschrieben in:

– O. Prucker, J. Rühe, Macromolecules, 1998,31, 592;
– O. Prucker, J. Rühe, Macromolecules, 1998, 31, 602 und
– O. Prucker, J. Rühe, Langmuir, 1998, 24 (14), 6893.

Nicht reagierte Monomere sowie nicht gebundene oder vernetzte Polymerketten sollten nach der Polymerisation mit geeigneten Lösungsmitteln sorgfältig entfernt werden.
Nach einem alternativen Verfahren kann in einem ersten Schritt ein polyfunktionales Polymernetzwerk vorgeformt werden, welches dann kovalent an eine Oberfläche gebunden wird. Ein weiteres alternatives Verfahren umfasst das Synthetisieren langer Polymerketten mit geeigneten funktionellen Gruppen ausgehend von immobilisierten (oberflächengebundenen) Initiatoren (sogenannte „Polymerbürsten"), gefolgt vom Vernetzen der Letzteren.
Die nach den obigen Verfahren erstellten polyfunktionalen Polymernetzwerke können, unabhängig von ihrer Form, auf eine breite Vielfalt von Oberflächen aufgebracht werden. Sogar Oberflächen, die für konventionelle Verfahren zur Oberflächenmodifikation unzugänglich sind, können mit dem erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerk bereitgestellt werden, da keine massigen Polymermoleküle zur Oberfläche diffundieren müssen.
Außerdem ist es auf verschiedene Art und Weise möglich, gerasterte Arrays des polyfunktionalen Polymernetzwerks zu erzeugen. Eine Möglichkeit besteht in der Durchführung standardmäßiger photolitographischer Prozesse, die entweder nach der Polymerisation (Photoablation der Polymere durch Masken), vor diesem Schritt (Photodekomposition oder Photoablation der Initiatormonolayer-Masken), oder während der Polymerisation mittels Photopolymerisation durch Masken angewandt werden können. Andere mögliche Techniken zur Erzeugung gerasterter polyfunktionaler Polymernetzwerke sind Mikrokontaktdrucken oder verwandte Verfahren, die während der Bildung der Initiatorschicht oder während der Polymerisation angewandt werden können. Schließlich können Inkjet-Techniken oder andere Mikrodruckverfahren benutzt werden, um gerasterte Initiator-Monolayer zu erzeugen, welche anschließend in gerasterte polyfunktionale Polymernetzwerke überführt werden können. Bei jeder dieser Techniken können Oberflächenstrukturen mit Dimensionen im Mikrometerbereich erzeugt werden. Die hochparallele Art der Signalerzeugung und eine signifikante Verbesserung bei der Integration analytischer Daten sind die vielversprechendsten Merkmale derartiger Techniken, welche dementsprechend die Optimierung automatischer analytischer Methoden erlauben.
Zum Nachweis einer erfolgreichen Immobilisierung von Proben- oder Sondenmoleküle auf einem polyfunktionalen Polymernetzwerk kann eine Vielfalt von Techniken angewandt werden. Insbesondere ist gefunden worden, dass die polyfunktionalen Polymernetzwerke der vorliegenden Erfindung eine signifikante Zunahme in ihrer Dicke erfahren, was mit geeigneten Verfahren, z.B. Ellipsometrie, nachgewiesen werden kann. Massensensitive Verfahren können ebenfalls angewandt werden.
Sofern Nukleinsäuren wie beispielsweise Oligonukleotide mit einer gewünschten Nukleotidsequenz oder DNA-Moleküle in einer biologischen Probe analysiert werden sollen, können synthetische Oligonukleotid-Einzelstränge mit dem polyfunktionalen Polymernetzwerk umgesetzt werden. Die Reaktion wird unter hoher Luftfeuchtigkeit durchgeführt, vorzugsweise in einer gepufferten wässrigen Lösung. Die Reaktionstemperatur kann über Raumtemperatur erhöht werden, so lange es für die Oligonukleotide nicht nachteilig ist. Bevorzugte Temperaturen liegen im Bereich von 40 bis 60°C. Bei dieser Anwendung kann eine Vielzahl identischer synthetischer Oligonukleotidstränge oder eine Mischung verschiedener Stränge verwendet werden. Sofern verschiedene Stränge verwendet werden, sollten deren Sequenzen vorzugsweise bekannt sein. Bevor die auf diese Weise präparierte Oberfläche in einer Hybridisierungsreaktion verwendet wird, erfolgt die Deaktivierung nicht reagierter funktioneller Gruppen durch Zugabe von geeigneten Nukleophilen, vorzugsweise C₁-C₄-Amine, wie einfache primäre Alkylamine (z.B. Propyl- oder Butylamin), sekundäre Amine (Diethylamin) oder Aminosäuren (Glycin).
Bei der Exposition gegenüber einer Mischung aus Oligonukleotid-Einzelsträngen, beispielsweise erhalten aus einer PCR, welche markiert sind, zeigen beim Scannen aufgrund einer Hybridisierung nur solche Oberflächenbereiche ein nachweisbares Signal, die synthetische Stränge als zum PCR-Produkt komplementäre Sonden aufweisen. Um den parallelen Nachweis verschiedener Oligonukleotidsequenzen zu erleichtern, können Drucktechniken angewendet werden, welche die Auftrennung der Sensoroberfläche in Bereiche erlauben, in denen der Testlösung verschiedene Arten von synthetischen Oligonukleotidsonden präsentiert werden.
Der erfindungsgemäß verwendete Begriff „Hybridisierung" kann stringente oder nicht stringente Bedingungen betreffen. Sofern nicht näher angegeben, sind die Bedingungen vorzugsweise nicht stringent. Die Hybridisierungsbedingungen können nach den beschriebenen konventionellen Protokollen etabliert werden, beispielsweise Sambrook, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989), Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1989), oder Higgins und Hames (Hrsg.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). Die Einstellung der Bedingungen liegt innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns und sollte entsprechend der im Stand der Technik beschriebenen Protokolle festgelegt werden. Demnach erfordert der Nachweis von nur spezifisch hybridisierenden Sequenzen üblicherweise stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen, wie beispielsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Beispielhafte nicht stringente Hybridisierungsbedingungen zum Nachweis homologer oder nicht exakt komplementärer Sequenzen können mit 6 × SSC, 1% SDS bei 65°C angegeben werden. Bekanntlich betreffen die Länge der Sonde und die Zusammensetzung der zu bestimmenden Nukleinsäure weitere Parameter der Hybridisierungsbedingungen.
Die zu analysierenden Nukleinsäuren können aus einer DNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek stammen, einschließlich synthetischer und semisynthetischer Nukleinsäurebibliotheken. Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäurebibliothek Oligonukleotide.
Um ihren Nachweis in einem immobilisierten Zustand zu erleichtern, sollten die Nukleinsäuremoleküle vorzugsweise markiert sein. Geeignete Markierungen schließen radioaktive, fluoreszierende, phosphoreszierende, biolumineszierende oder chemolumineszierende Markierungen, ein Enzym, einen Antikörper oder ein funktionelles Fragment oder funktionelles Derivat davon, Biotin, Avidin oder Streptavidin ein.
Antikörper können polyklonale, monoklonale, chimäre oder single-chain-Antikörper oder funktionelle Fragmente oder Derivate solcher Antikörper einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die allgemeine Methodik zur Herstellung von Antikörpern ist gut bekannt und beispielsweise beschrieben worden in Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 494, rezensiert in J. G. R. Hurrel, Hrsg., "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982). Ebenso anwendbar ist das von L. T. Mimms et al. beschriebene Verfahren (Virology 176 (1990), 604–619). Wie oben erwähnt, bezieht sich der Begriff „Antikörper" erfindungsgemäß auf monoklonale oder polyklonale Antikörper. Funktionelle Antikörperfragmente oder Derivate weisen die selbe Spezifität wie der ursprüngliche Antikörper auf und umfassen F(ab')₂-, Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente (siehe beispielsweise Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, N. Y). Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Ferner können die Derivate in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch Peptidomimetics hergestellt werden. Solche Herstellungsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt und können ohne weitere Umstände vom Fachmann angewandt werden.
Abhängig vom angewandten Markierungsverfahren kann der Nachweis durch im Stand der Technik bekannte Verfahren bewirkt werden, z.B. durch Laserscanning oder Verwendung von CCD-Kameras.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren, in denen der Nachweis indirekt herbeigeführt wird. Ein Beispiel eines solchen indirekten Nachweises ist die Verwendung eines sekundären markierten Antikörpers, der auf eine erste Verbindung wie beispielsweise einen Antikörper gerichtet ist, welcher an das biologische Zielmolekül (Probenmolekül) bindet.
Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerke liegt im Bereich der Affinitätschromatographie, z.B. zur Aufreinigung von Substanzen. Für diesen Zweck werden bevorzugt polyfunktionale Polymernetzwerke mit identischen funktionellen Gruppen oder Sondenmolekülen verwendet, welche mit einer Probe in Kontakt gebracht werden. Nachdem die gewünschte Substanz durch das polyfunktionale Polymernetzwerk immobilisiert worden ist, kann ungebundenes Material entfernt werden, z.B. in einem Waschschritt. Mit geeigneten Elutionsmitteln kann die aufgereinigte Substanz dann von der Affinitätsmatrix abgetrennt werden.
Bevorzugte Substanzen, die auf einer solchen Matrix immobilisiert werden können, sind Nukleinsäuremoleküle, Peptide oder Polypeptide (oder Komplexe davon), wie Antikörper, funktionelle Fragmente oder Derivate davon, Saccharide oder Polysaccharide.
Nachdem die Immobilisierung durchgeführt worden ist, ist eine Wiederherstellung der Oberflächen möglich, jedoch sind einmalige Verwendungen bevorzugt, um die Qualität der Ergebnisse sicherzustellen.
Mit den polyfunktionalen Polymernetzwerken der vorliegenden Erfindung können verschiedene Probentypen sowohl in seriellen als auch in parallelen Nachweisverfahren mit erhöhter Präzision und/oder reduziertem Platzbedarf analysiert werden. Die Sensoroberflächen, an denen die erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerke haften, können deshalb in diagnostischen Geräten oder anderen medizinischen Anwendungen eingesetzt werden, z.B. zum Nachweis von Komponenten in physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Serum, Sputum etc..
Oberflächen mit den erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerken können auch Startermoleküle für synthetische Anwendungen immobilisieren, insbesondere bei der Festphasensynthese, z.B. während der in-situ Bildung von Oligo- oder Polymeren. Vorzugsweise sind die Oligo- oder Polymere Biomoleküle und umfassen Peptide, Proteine, Oligo- oder Polysaccharide oder Oligo- oder Polynukleinsäuren. Als immobilisierte Initiatoren können Monomere dieser Makromoleküle verwendet werden.
Ferner können die polyfunktionalen Polymernetzwerke der vorliegenden Erfindung als Gele bei der Trennung von Molekülen, wie vorzugsweise von Biomolekülen in einem elektrischen Feld, verwendet werden.
Allgemein erlaubt die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von mit polyfunktionalen Polymernetzwerken homogen modifizierten Oberflächen, welche bessere adhäsive Oberflächeneigenschaften und verbesserte mechanische Festigkeit aufweisen. Ferner können strukturierte Oberflächen bereitgestellt werden, z.B. durch Starten der Polymerisation aus gerasterten Arrays von Initiatormolekülen. Als Folge kann das polyfunktionale Polymernetzwerk optimal an die jeweiligen Anwendungen angepasst werden.
Der Offenbarungsgehalt der in der vorliegenden Beschreibung zitierten Dokumente ist durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden durch die nachfolgenden Punkte näher erläutert.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer Probe, vorzugsweise von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, unter Verwendung eines erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerks umfasst die Schritte:

– Bereitstellung einer mit einem erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerk beschichteten Oberfläche,
– Immobilisierung geeigneter Sondenmoleküle, vorzugsweise Oligonukleotid-Einzelstränge, auf dem polyfunktionalen Polymernetzwerk durch eine Reaktion mit den im polyfunktionalen Polymernetzwerk vorhandenen funktionellen Gruppen,
– Stattfinden lassen einer Hybridisierungsreaktion zwischen den Oligonukleotid-Einzelsträngen und den Nukleinsäuremolekülen der Probe,
– Entfernen der nicht hybridisierten Nukleinsäuremoleküle in einem Waschschritt, und
– Nachweis der hybridisierten Nukleinsäuremoleküle, vorzugsweise fluorometrisch.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Aufreinigung einer Verbindung aus einer Probe unter Verwendung eines erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerks umfasst die Schritte:

– Bereitstellung einer mit einem erfindungsgemäßen polyfunktionalen Polymernetzwerk modifizierten Oberfläche,
– Immobilisierung einer Vielzahl identischer Sondenmoleküle auf dem polyfunktionalen Polymernetzwerk,
– Kontaktieren der Probe mit dem resultierenden Polymernetzwerk unter Bedingungen, die eine Bindung der Verbindung mit den Sondenmolekülen erlauben, und
– Entfernen von Material aus der Probe, das nicht an die Sondenmoleküle gebunden worden ist.

Dieses Verfahren kann ferner den Schritt der Abtrennung der Verbindung von den Sondenmolekülen durch Verwendung eines geeigneten Elutionsmittels einschließen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Synthese des Initiators
Als ein Beispiel wird die Herstellung der Verbindung 1 beschrieben. Der Reaktionsweg ist unten veranschaulicht. Die Indizes i–iii in der Figur beziehen sich auf die Beschreibung der verschiedenen Schritte im Text.

i) Zu einer mit einem Eisbad gekühlten Suspension von 40 g Phoshorpentachlorid (PCl₅) in 50 ml Methylenchlorid wurde tropfenweise eine Suspension von 10 g 4,4'-Azobis-(4-cyanopentansäure) in 50 ml Methylenchlorid gegeben. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Der Überschuss an PCl₅ wurde abfiltriert, und die verbleibende Lösung wurde konzentriert, bis kein PCl₅ mehr abgetrennt werden konnte. Die Mischung wurde nochmals filtriert, und das Filtrat wurde 300 ml kaltem Hexan zugegeben, was die Abtrennung des Säurechlorids als weißer Feststoff bewirkte (Ausbeute: 90%).
ii) Zu einer Lösung von 2,7 ml Allylalkohol und 6,5 ml Pyridin in 50 ml Methylenchlorid von 0°C wurde tropfenweise eine Lösung von 10 g Säurechlorid in 50 ml Methylenchlorid gegeben. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Danach wurde die Lösung zweimal mit 2N H₂SO₄, wässrigem NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der entstehende bis-Allylester wurde aus Methanol umkristallisiert (Ausbeute: 90%).
iii) Zu einer Suspension von 3 g des bis-Allylesters in 30 ml Dimethylchlorsilan wurde eine Lösung von 30 mg Hexachloroplatinsäure in 0,5 ml Dimethylether/Ethanol (1/1 vol/vol) gegeben, und die Mischung wurde unter Rückfluß 3 Stunden lang erhitzt. Der Silanüberschuss wurde verdampft, wodurch die Verbindung 1 als schwachgrünes Öl in quantitativer Ausbeute erhalten wurde. Der Rest an Platinkatalysator wurde durch Filtrierung einer Methylenchloridlösung des Produkts über wasserfreies Na₂SO₄ entfernt.

Bildung eines Initiator-Monolayers
Der gemäß (1) synthetisierte Initiator wurde bei Raumtemperatur auf einer Glassoberfläche unter inerten Bedingungen (trockene Stickstoffatmosphäre) unter Verwendung von wasserfreiem Toluol als Lösungsmittel und trockenem Triethylamin als Katalysator immobilisiert. Die Toluollösung weist eine Konzentration des Initiators von ungefähr 50 mmol/l auf, und Triethylamin wird bis zu einer Konzentration von ungefähr 10 mmol/l zugegeben. Die Proben wurden über Nacht in der Lösung gehalten und dann durch umfangreiches Spülen mit Methanol und Chloroform gereinigt.
Synthese des funktionalisierten Monomers
Als ein Beispiel wird die Synthese von N-Methacryloyl-6-aminocapronsäure-Hydroxysuccinimidester beschrieben. Der Reaktionsweg ist unten gezeigt. Die Indizes i–iii in dieser Figur beziehen sich auf die Beschreibung der verschiedenen Schritte im Text.
Eine Lösung von 13,2 g 6-Aminocapronsäure und 20 g NaHCO₃ in 100 ml Wasser und 50 ml 1, 4-Dioxan wurde langsam einer Lösung von 10,3 ml Methacrylsäurechlorid in 50 ml 1,4-Dioxan zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt. Danach wurden 50 ml Wasser zugegeben, und die Mischung wurde dreimal mit jeweils 100 ml Ethylacetat gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit verdünnter Salzsäure angesäuert (pH-Wert 2) und dann mit drei Volumina von jeweils 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über N₂SO₄ getrocknet, auf ein Volumen von ungefähr 50 ml konzentriert und zu 350 ml kaltem Hexan gegeben. Diese Mischung wurde auf –20°C gekühlt, und das Produkt setzte sich über Nacht langsam in Form weißer Kristalle ab (Ausbeute: ca. 14 g).

i) Eine Lösung von 14 g der Säure in 300 ml Methylenchlorid wurde auf 5°C gekühlt, und 8,2 g N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 14,6 g N,N-Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Die Mischung wurde bei 5°C über Nacht stehen gelassen. Das Präzipitat (Dicyclohexylharnstoff) wurde abfiltriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Während dieses Schrittes schied in einigen Fällen zusätzlicher Harnstoff aus und wurde ebenfalls abfiltriert. Das Rohprodukt wurde aus Isopropanol umkristallisiert und ergab ungefähr 15 g des NHS-Estermonomers.

Bildung eines polyfunktionalen Polymernetzwerks
Es wurde eine Lösung mit den folgenden Inhaltsstoffen verwendet:

– 40 Mol% N,N-Dimethylacrylamid (für das in Wasser quellbare Basispolymer),
– 10 Mol% N-Methacryloyl-6-Aminocapronsäure-Hydroxysuccinimidester (für die funktionalisierten sich wiederholenden Einheiten),
– 5 Mol% Ethylenglykol-Bismethacrylat (für die vernetzenden Einheiten),
– 1 Mol% Azobisisobutyronitril (als ein Initiator),
– Rest (auf 100 Mol%) Ethanol.

Diese Lösung wurde in eine Form gegeben, welche fest auf ein Initiator-modifiziertes Substrat (mit immobilisiertem Initiator) gepresst wurde. Nach Erwärmung auf 70°C wurde die Polymerisation 10 Stunden lang durchgeführt. Danach wurde die Form entfernt und das resultierende Oberflächen-gekoppelte Netzwerk mit Ethanol gewaschen.
Nachweis von Oligonukleotidsträngen
Auf die erhaltene Oberfläche wurde 1 nl einer 10 μM Oligonukleotid-Lösung gegeben, und die Kopplungsreaktion wurde für zwei Stunden bei ca. 40 bis 50°C in einer wässrigen Lösung durchgeführt.
Das synthetische Oligonukleotid wurde 5'-Amino-modifiziert, und die Lösung wurde mit einem 100 mM Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8,0 gepuffert. Nach der Kopplungsreaktion wurde die Sensoroberfläche mit dem Natriumphosphatpuffer gespült. Um die räumliche Ausdehnung der spezifischen Oligonukleotidtypen auf der Sensoroberfläche für einen Parallelnachweis zu definieren, wurde der Reaktionspartner auf das polyfunktionale Polymernetzwerk aufgedruckt.
Die so präparierte Oberfläche ließ man mit einem Cy5-markierten PCR-Produkt in einem Puffer aus 2 × SSC, 10 Dextransulfat und 50% Formamid 12 Stunden lang bei 28°C reagieren. Der DNA-Gehalt betrug 100 ng DNA/80 μg Probe.
Nach Ablauf der Hybridisierungsreaktion wurde die Oberfläche in SSC-Puffer gewaschen, und das Ergebnis wurde fluorometrisch durch Laseraktivierung mit einer CCD-Kamera nachgewiesen. Ein Fluoreszenzsignal konnte nur in solchen Bereichen nachgewiesen werden, die synthetische Oligonukleotide mit Komplementarität zum PCR-Produkt tragen.

Claims

Verfahren zur Bildung eines an eine Sensoroberfläche kovalent gekoppelten polyfunktionalen Polymernetzwerkes, wobei das Netzwerk vernetzte Polymer-Subketten umfasst, die eine Vielzahl identischer oder unterschiedlicher sich wiederholender Einheiten aufweisen, welche eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen, die eine Wechselwirkung des Polymers mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben, umfassend die Schritte: a) Beschichtung der Sensoroberfläche mit einem Monolayer eines Polymerisationsinitiators, welcher eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfasst, die für eine kovalente Kopplung an die Oberfläche geeignet sind; b) Kontaktieren des Polymerisationsinitiator-Monolayers mit einer Lösung umfassend Polymerisationsinitiatoren, Vernetzer, und eine polymerisierbare Mischung von Monomeren und Comonomeren, die funktionelle Gruppen tragen, welche eine Wechselwirkung mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben; wobei nach dem Kontaktieren gleichzeitig sowohl in Lösung als auch auf der Sensoroberfläche eine vernetzende Polymerisationsreaktion initiiert und durchgeführt wird.
Verfahren zur Bildung eines an eine Sensoroberfläche kovalent gekoppelten polyfunktionalen Polymernetzwerkes, wobei das Netzwerk vernetzte Polymer-Subketten umfasst, die eine Vielzahl identischer oder unterschiedlicher sich wiederholender Einheiten aufweisen, welche eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen, die eine Wechselwirkung des Polymers mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben, umfassend die Schritte: (a) Beschichtung der Sensoroberfläche mit einem Monolayer eines Polymerisationsinitiators, welcher eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfasst, die für eine kovalente Kopplung an die Oberfläche geeignet sind, wobei der Initiator eine Chlorsilan-, Disufid- oder Thiolgruppe umfasst; (b) Kontaktieren des Polymerisationsinitiator-Monolayers mit einem polyfunktionalen Polymernetzwerk, welches vernetzte Polymer-Subketten umfasst und erhalten wurde durch Polymerisation von Monomeren und Comonomeren, die funktionelle Gruppen tragen, welche eine Wechselwirkung mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben, in Anwesenheit von Vernetzern; wobei nach dem Kontaktieren eine kovalente Bindungsreaktion zwischen dem Polymernetzwerk und den an der Sensoroberfläche gebundenen Polymerisationsinitiatoren initiiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Initiator eine Chlorsilan-, Alkoxysilan-, Disulfid- oder Thiolgruppe umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Initiator eine Gruppe umfasst, die aus Azogruppen, Peroxogruppen, oder einer Ketogruppe in Verbindung mit einem aromatischen System ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Initiator eine Gruppe umfasst, die aus aromatischen Ketonen oder aromatischen schwefelhaltigen Ketonen ausgewählt ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Vernetzer ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Bisacrylaten, Bismethacrylaten und Bisacrylamiden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die eine oder mehreren funktionellen Gruppen ausgewählt werden aus Carbonsäuren, Maleinimiden, N-Hydroxysuccinimiden, Epoxiden, Isothiocyanaten, Isocyanaten, und Aziden.
Sensoroberfläche mit einem kovalent daran gekoppelten polyfunktionalen Polymernetzwerk, welches vernetzte Polymer-Subketten mit einer Vielzahl identischer oder unterschiedlicher sich wiederholender Einheiten umfasst, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen, welche eine Wechselwirkung des Polymers mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben, erhalten durch ein Verfahren umfassend die Schritte: (a) Beschichtung der Sensoroberfläche mit einem Monolayer eines Polymerisationsinitiators, welcher eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfasst, die für eine kovalente Kopplung an die Oberfläche geeignet sind; (b) Kontaktieren des Polymerisationsinitiator-Monolayers mit einer Lösung umfassend Polymerisationsinitiatoren, Vernetzer, und eine polymerisierbare Mischung von Monomeren und Comonomeren, die funktionelle Gruppe tragen, welche eine Wechselwirkung mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben; wobei nach dem Kontaktieren gleichzeitig sowohl in Lösung als auch auf der Sensoroberfläche eine vernetzende Polymerisationsreaktion initiiert und durchgeführt wird.
Sensoroberfläche mit einem kovalent daran gekoppelten polyfunktionalen Polymernetzwerk, welches vernetzte Polymer-Subketten mit einer Vielzahl identischer oder unterschiedlicher sich wiederholender Einheiten umfasst, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen, welche eine Wechselwirkung des Polymers mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben, erhalten durch ein Verfahren umfassend die Schritte: (a) Beschichtung der Sensoroberfläche mit einem Monolayer eines Polymerisationsinitiators, welcher eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfasst, die für eine kovalente Kopplung an die Oberfläche geeignet sind, wobei der Initiator eine Chlorsilan-, Disulfid- oder Thiolgruppe umfasst; (b) Kontaktieren des Polymerisationsinitiator-Monolayers mit einem polyfunktionalen Polymernetzwerk, welches vernetzte Polymer-Subketten umfasst und erhalten wurde durch Polymerisation von Monomeren und Comonomeren, die funktionelle Gruppen tragen, welche eine Wechselwirkung mit Proben- oder Sondenmolekülen erlauben, in Anwesenheit von Vernetzern; wobei nach dem Kontaktieren eine kovalente Bindungsreaktion zwischen dem Polymernetzwerk und den an der Sensoroberfläche gebundenen Polymerisationsinitiatoren initiiert wird.
Sensoroberfläche nach Anspruch 8 oder 9, wobei die eine oder mehreren funktionellen Gruppen ausgewählt werden aus Carbonsäuren, Maleinimiden, N-Hydroxysuccinimiden, Epoxiden, Isothiocyanaten, Isocyanaten, und Aziden.
Sensoroberfläche nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10, ferner umfassend eine Vielzahl unterschiedlicher Sondenmoleküle, die an den Polymer-Subketten durch eine Reaktion mit den funktionellen Gruppen immobilisiert sind, wobei die Sondenmoleküle ausgewählt sind aus Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Nukleinsäuren, PNAs, und Derivaten davon.
Sensoroberfläche nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Polymer-Subketten Segmente umfassen, die das Polymernetzwerk in Wasser quellbar machen.
Sensoroberfläche nach Anspruch 12, wobei die Quellbarkeit in Wasser durch Monomere bereitgestellt wird, die aus Acrylsäure, Methacrylsäure, Dimethylacrylamid, oder Vinylpyrrolidon ausgewählt sind.
Sensoroberfläche nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13, wobei das polyfunktionale Polymernetzwerk auf der Oberfläche eine rasterartige Anordnung bildet.
Verwendung einer Sensoroberfläche gemäß irgendeinem der Ansprüche 11 bis 14 zum Nachweis von Nukleinsäure-Probenmolekülen, wobei die Verwendung die Schritte umfasst: (a) Stattfinden lassen einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der Probe, gefolgt von (b) Entfernen der nicht hybridisierten Nukleinsäuremoleküle in einem Waschschritt, und (c) Nachweis der hybridisierten Nukleinsäuremoleküle.
Medizinisches oder diagnostisches Gerät, umfassend eine Oberfläche gemäß irgendeinem der Ansprüche 8 bis 14.
Verwendung einer Oberfläche gemäß irgendeinem der Ansprüche 8 bis 14 zur Immobilisierung von Startermolekülen für die Bildung von Oligo- oder Polymeren, vorzugsweise für die Nukleinsäure- oder Peptidsynthese.