WO2001079533A2 - Verfahren zur immobilisierung eines analyten an einer festen oberfläche - Google Patents

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WO2001079533A2
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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to a method for immobilizing an analyte on a solid surface and conjugates with analytes bound to solid surfaces.
  • the binding of analytes to solid surfaces is often implemented using linker molecules which connect the surface to the analyte.
  • linker molecules which connect the surface to the analyte.
  • Such crosslinkers are particularly preferred when the analyte to be bound to the solid surface is very small or when an increased free mobility of the analyte is desired for the interaction of the analyte with a ligand that is to be bound to the analyte is.
  • Preferred areas of use for such analyte / solid phase conjugates are, on the one hand, purification processes in which ligands to be isolated from complex mixtures can be bound to the immobilized analyte; on the other hand, such conjugates are used in the analytical / diagnostic field, in particular in the context of screening methods, for example for the detection of rare ligands in biological fluids or for diagnostic methods in the field of DNA technology. In the latter, solid-phase conjugates are used in increasing numbers as biochips.
  • conjugates described in the prior art are either extremely complex and costly to produce or have unsatisfactory steric properties, such as insufficient mobility of the analytes, inadequate distance from the surface of the solid phase (which can result in undesired electrostatic interactions with the surface). or badly or not at all controllable arrangement and distribution of the analytes on the solid surface. It is therefore an object of the present invention to provide conjugates which are improved over the known prior art and which in particular allow simple, low-risk production and still provide the analytes in a satisfactory three-dimensional arrangement.
  • the immobilization of the analyte on a solid surface can also be carried out by
  • cyclodextrins are a type of molecule that is widely used in industrial chemistry and are used for complexing a large number of biomolecules, due to the lack of cyclodextrin molecules specifically equipped with functional groups, cyclodextrin molecules have so far been able to do so Uses cannot be tapped. Only with the introduction of chemically definable, with functional ones Cyclodextrin molecules equipped with groups (cf. EP 0 697 415 Al), it was at all possible to conjugate cyclodextrins to solid phases, although they were still used to complex organic substances.
  • conjugates which can be produced by the process according to the invention, that is to say conjugates comprising a solid surface, a cyclodextrin bound thereto and an analyte covalently bound to the cyclodextrin, have various advantages over the conjugates known in the prior art. Due to the increased spacer length, the relatively large cyclodextrin molecule allows a largely unrestricted free mobility of the analyte, which not only significantly improves the interaction between crosslinker and analyte (and thus facilitates the coupling reaction), but also the interaction with the ligand molecule is significantly facilitated. Furthermore, cyclodextrins are biocompatible, non-toxic and temperature-resistant up to 200 ° C. and thus allow easy, non-hazardous work and good stability of the conjugate provided according to the invention.
  • cyclodextrins as a cross-liner between solid phase and analyte allows a high binding capacity, low non-specific adsorption and - for example in the case of fluorescence detection - a low (measurement) background, which can be reduced even further by choosing suitable solid phases.
  • crosslinkers can of course be provided between cyclodextrin and solid phase or cyclodextrin and analytes, e.g. by another crosslinker already sitting on the solid surface or by the analyte having already been modified with another crosslinker. Examples of such further crosslinkers are described in detail in the prior art (e.g. dihydrazides, ...)
  • nucleic acids in particular DNA, peptides, proteins, enzymes, are preferably used as analytes.
  • special oxidoreductases, transferases and hydrolases, antigens, antibodies, receptors, microorganisms (eg prokaryotic or eukaryotic cells, viruses, etc.) or mixtures of these analytes are used.
  • a metal film e.g. thin gold films
  • a plastic surface or glass are preferably used as the solid surface.
  • Biochips especially DNA chips, are used, for example, to analyze pathologically modified gene activity, to elucidate disease mechanisms or to identify new drug candidates, in the diagnosis and resistance analysis of infectious diseases, but also in the environmental field to identify pathogenic germs.
  • DNA carrier molecules are either synthesized in situ using photolithographic techniques using physical masks on the matrix, or pressed on using various methods.
  • the production of printed DNA microarrays is divided into the steps of activating or coating the solid chip matrix, to which biomolecules are fixed using a suitable coupling chemistry.
  • DNA can be immobilized on carrier material by means of adsorption, photolithographic deprotection and covalent and ionic binding.
  • Controlled pore glass (CPG), SiO 2 layers or polymers are used as carrier materials. CPG and SiO 2 surfaces are mostly etched to free OH groups on the surface generate areas that can be reacted directly with the DNA sequences or converted into other functional groups.
  • CPG and SiO 2 surfaces are mostly etched to free OH groups on the surface generate areas that can be reacted directly with the DNA sequences or converted into other functional groups.
  • copolymers which contain functional groups polymers into which functional groups can be introduced by chemical modification, chemically inert polymers such as polysulfones or Teflon which can be activated by radiation (for example UV, Co 60), and chemically inert polymers that are covered with functional copolymers.
  • Polymers that already have functional groups, the activation and conversion of which into other functional groups have been described, are, for example, polyamide, polyacrylamide and polyester.
  • Unreactive polymers e.g. Polyethylene
  • a reactive monomer such as e.g. Glycidyl methacrylate or N-vinylformamide
  • a very elegant method for introducing functional groups is surface modification using plasma treatment.
  • plasma treatment In the case of polypropylene, various sub-types of plasma treatment make it possible to introduce amino, hydroxy or thiol groups.
  • slides are etched and amino- or epoxysilanized.
  • Oligonucleotide arrays e.g. Filter materials such as nitrocellulose or nylon (Clontech, USA) with polylysine or with glass slides derivatized with various silanes, carboxymethylated dextrans (Biacore AB, Sweden) or polyacrylamide gel pads (Packard / Motorola, USA) are used.
  • Filter materials such as nitrocellulose or nylon (Clontech, USA) with polylysine or with glass slides derivatized with various silanes, carboxymethylated dextrans (Biacore AB, Sweden) or polyacrylamide gel pads (Packard / Motorola, USA) are used.
  • nylon membranes are characterized by a high binding capacity, but with fluorescent detection they have a higher background than glass.
  • Polyacrylamide and dextran are three-dimensional hydrogels which, in contrast to flat surfaces such as glass, have a very high binding capacity and a low non-specific binding.
  • the choice of the specific cyclodextrin molecule or of the functional groups is generally not critical, so that in particular ⁇ -, ⁇ - or ⁇ -cyclodextrins can be used.
  • the cyclodextrin molecule are selected from halogen, amine, thiol, isothiocyanate and sulfonic acid groups, aromatic groups, preferably aromatics with heteroatoms, in particular with the above functional groups, or combinations thereof.
  • a suitable cyclodextrin for use in the context of the present invention is a monochlorotriazinyl, substituted ⁇ -cyclodextrin, which is already known as a crosslinking agent or surface-modifying agent, for example on textiles or papers. This ⁇ -cyclodextrin derivative can easily be prepared, for example by treating cyanuric chloride with ⁇ -cyclodextrin in water.
  • a cyclodextrin molecule used according to the invention preferably contains 2 to 4 functional groups, in particular identical functional groups.
  • the binding to the solid phase can thus also preferably take place covalently.
  • more than two functional groups per cyclodextrin molecule several analytes can also be bound to one cyclodextrin molecule.
  • the present invention relates to a conjugate comprising a solid surface, a cyclodextrin bound to it and an analyte covalently bound to the cyclodextrin.
  • This conjugate is obtainable according to the inventive method described above.
  • the conjugate according to the invention is preferably designed as a biochip, ie the solid surface and the analytes are designed in accordance with the established methods known for biochips and are incorporated in methods adapted for such biochips, in particular as regards the software and hardware detection of the reactions at the solid surfaces (see the already established biochip products from Affimetrix Inc. and Incyte).
  • the conjugate according to the invention preferably comprises, especially in practical use, a ligand molecule specifically bound to the analyte, for example a complementary nucleic acid, an antibody, an antigen, a receptor ligand, a receptor, and the like.
  • a ligand molecule specifically bound to the analyte for example a complementary nucleic acid, an antibody, an antigen, a receptor ligand, a receptor, and the like.
  • the conjugate according to the invention is a biochip.
  • the conjugate according to the invention comprises a whole series (a library) of analytes, the analyte library preferably being applied to the solid surface in such a way that the localization of the different analytes is spatially exactly possible.
  • the present invention relates to a method for the specific detection and possibly isolation of a ligand molecule from a sample, which is characterized in that a sample containing the ligand molecule to be detected or isolated (or a sample , which may contain such a ligand molecule) is contacted with a conjugate according to the invention, the ligand molecule is specifically bound to the bound analyte and this specific binding is verified by measures known per se, whereupon the ligand molecule is optionally detached from the conjugate and is isolated.
  • the verification of the specific binding can be adapted to the respective ligand / analyte system or can be carried out by generally accepted methods, such as (secondary) antibody reactions, dye reactions, signaling methods via the solid phase (biochip), radioactivity or fluorescence labeling, etc ,
  • Biomolecules such as enzymes, antibodies, microorganisms and oligonucleotides (DNA, RNA) can be adsorbed or embedded in polymers.
  • lyvinyl alcohol PVA
  • Polyvinyl alcohol has a large, porous surface in which biomolecules can be embedded. The pore size can be determined by basic or acid catalysis during gel crosslinking. Three-dimensional networks are created that are mechanically stable and have excellent swelling behavior in water.
  • PVA gels can be cross-linked covalently with glutaraldehyde, which leads to an increase in gel hardness.
  • functional, reactive groups can easily be introduced into polyvinyl alcohol by acetylation or acylation.
  • PVA with styrylpyridinium groups for example, is photosensitive and includes biomolecules in its pores when irradiated by cyclodimerization.
  • PVA gels crosslinked with polyallylamine and polyacrylic acid are also used for biosensors. Due to the large pores of PVA and the property of swelling into a three-dimensional network in water, a high immobilization capacity is achieved. However, the large-pore matrix also means that immobilized biomolecules are washed out very easily.
  • MCT monochlorotriazinyl- ⁇ -cyclodextrin, Na salt
  • the advantages of these methods are:
  • the PVA gels described are stable, hydrophilic and porous. They swell on contact with an aqueous solution. This increases the surface area and increases the immobilization capacity.
  • the hydrophilic character of the gel enables easy and quick access of the biomolecules to the polymer surface and reduces non-specific adsorption.
  • Biomolecules can be immobilized in PVA in a hydrophilic, three-dimensional, porous matrix in a solution-like state. Due to the resulting greater freedom of movement, biomolecules immobilized in PVA are more reactive than on planar surfaces. Due to the covalent cross-linking of the gel and the covalent binding of the biomolecules to the gel (see 2.), the washing out of the biomolecules can be prevented.
  • PVA gels which is not only suitable for immobilizing oligonucleotides (DNA, RNA), but also for immobilizing antibodies, enzymes and microorganisms, was demonstrated using a 16S rRNA chip.
  • the oligonucleotides spotted on PVA / Palam or PVA / Palam / MCT remained after washing in hybridization solution (20 mM Tris, pH 7.4, 0.01% lauryl sulfate, 0.9 M NaCl and 35% formamide) bound.
  • PVA Polyvinyl alcohol
  • PVA-1 to PVA-5 PVA gels were used (PVA-1 to PVA-5), which hydrolyzed 5 g of a 10% aqueous PVA (99 +%, MW 85,000-146,000, Aldrich, AT), 0.1 g Palam (Aldrich, AT), 0.1 g monochlorotriazinyl-ß-cyclodextrin (ß-CD)), Cavasol W7 MCT (Wacker, DE) in 5 ml of distilled water and contained pH's of 4 (PVA-1), pH 6.8 (PVA-2), pH 8 (PVA-3) and pH 9 (PVA-4) (with the addition of Na2C0 3 ).
  • PVA-5 and PVA-1 were identical except for the addition of ß-CD (PVA-5 contained no ß-CD).
  • the thickness of the PVA films was approximately 8 ⁇ m (with a resolution of 10 nm).
  • the PVA gels on the chips were polymerized by 6 freezing (-18 ° C) and drying (25 ° C) steps.
  • Unmodified and amino-modified EUB338 (5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3 '), ALFlb (5' -CGT TCG (CT) TC TGA GCC AG-3 ') and BET42a (5' -GCC TTC CCA CTT CGT TT-3 ') (with and without Cy5 label) were dissolved in 0.05 M phosphate buffer, pH 8 and spotted onto the chips by a piezoelectric biochip array.
  • the oligonucleotides were lined up in blocks of 5 x 3 spots from 0.35 to 1 nl. The distance between the spots was 300 ⁇ m.
  • the ⁇ -CD-containing chips produced according to the invention were compared with commercially available products such as CMT-GAPS TM, FAST TM, Silane-Prep TM and Hybond N +.
  • the results are shown in FIG. 3.
  • the fluorescence after spotting ti the fluorescence after blocking and t2 the fluorescence after hybridization of the complementary DNA on the chip.
  • immobilization capacity the ß-cyclodextrin chips (except for PVA-5) were well above all tested, commercially available products. Immobilization capacities between 85 and 120% after hybridization were significantly better than the comparison products (below 40%).
  • the chips according to the invention accordingly have a immobilization capacity which is far better than that of all other products.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Immobilisierung eines Analyten an einer festen Oberfläche, welches gekennzeichnet ist durch die folgenden Schritte: Binden eines Cyclodextrin-Moleküls mit mindestens zwei funktionellen Gruppen an eine feste Oberfläche, so dass noch mindestens eine funktionelle Gruppe des Cyclodextrin-Moleküls mit einem Analyten kovalent gebunden werden kann, und kovalentes Binden des Analyten an das Oberflächen-gebundene Cyclodextrin-Molekül. Alternativ kann auch zunächst der Analyt kovalent an das Cyclodextrin-Molekül gebunden werden und danach das Cyclodextrin-Molekül mit der festen Oberfläche verbunden werden.

Description

Verfahren zur Immobilisierung eines Analyten an einer festen Oberfläche
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung eines Analyten an einer festen Oberfläche sowie Konjugate mit an festen Oberflächen gebundenen Analyten.
Die Bindung von Analyten an festen Oberflächen wird häufig unter Verwendung von Linker-Molekülen realisiert, welche die Oberfläche mit dem Analyten verbinden. Derartige Crosslinker werden vor allem dann bevorzugt, wenn der Analyt, der an die feste Oberfläche gebunden werden soll, sehr klein ist bzw. wenn zur Wechselwirkung des Analyten mit einem Liganden, der an den Analyten gebunden werden soll, eine erhöhte freie Beweglichkeit des Analyten erwünscht ist.
Bevorzugte Einsatzgebiete für derartige Analyt-/Festphasenkonju- gate sind einerseits Reinigungsverfahren, bei welchen aus komplexen Gemischen zu isolierende Liganden an den immobilisierten Analyten gebunden werden können; andererseits werden solche Konjugate im analytisch/diagnostischen Bereich, insbesondere im Rahmen von Screening-Verfahren, verwendet, beispielsweise zum Nachweis seltener Liganden in biologischen Flüssigkeiten oder für diagnostische Verfahren im Bereich der DNA-Technologie. In Letzterer kommen Festphasenkonjugate in immer stärkerer Zahl als Biochips zur Anwendung.
Verfahren zur Herstellung derartiger Chips sind beispielsweise in der WO 98/20967, EP 947 819 A, WO 99/27140 A, DE 19823876 AI, WO 99/57310 A, sowie EP 890 651 AI, beschrieben.
Die im Stand der Technik beschriebenen Konjugate sind jedoch entweder äußerst aufwendig und kostspielig in ihrer Herstellung oder aber weisen unbefriedigende sterische Eigenschaften auf, wie z.B. mangelnde Beweglichkeit der Analyten, ungenügender Abstand zur Oberfläche der Festphase (wodurch sich unerwünschte elektrostatische Wechselwirkungen mit der Oberfläche ergeben können) oder schlecht oder gar nicht kontrollierbare Anordnung und Verteilung der Analyten auf der festen Oberfläche. Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Konjugate zur Verfügung zu stellen, die gegenüber dem bekannten Stand der Technik verbessert sind und die insbesondere eine einfache, möglichst risikoarme Herstellung erlauben und trotzdem den Analyten in zufriedenstellender dreidimensionaler Anordnung zur Verfügung stellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Immobilisierung eines Analyten an einer festen Oberfläche, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:
- Binden eines Cyclodextrin-Moleküls mit mindestens zwei funk- tionellen Gruppen an eine feste Oberfläche, so dass noch mindestens eine funktionelle Gruppe des Cyclodextrin-Moleküls mit einem Analyten kovalent gebunden werden kann, und
- kovalentes Binden des Analyten an das Oberflächen-gebundene Cyclodextrin-Molekül .
Alternativ kann die Immobilisierung des Analyten an einer festen Oberfläche auch durch
- kovalentes Binden eines Cyclodextrin-Moleküls mit mindestens zwei funktioneilen Gruppen an einen Analyten, so dass noch mindestens eine funktionelle Gruppe des Cyclodextrin-Moleküls an eine feste Oberfläche gebunden werden kann, und
- Binden des Cyclodextrin-Moleküls mit dem gebundenen Analyten an eine feste Oberfläche
bewerkstelligt werden.
Mit der vorliegenden Erfindung werden erstmals Festphasenkonjuga- te von Analyten zur Verfügung gestellt, die Cyclodextrin-Linker aufweisen. Cyclodextrine sind zwar eine in der industriellen Chemie weit verbreitete Molekülart, die für die Komplexierung von einer Vielzahl von Biomolekülen verwendet werden, auf Grund des Mangels an gezielt mit funktioneilen Gruppen ausgestatteten Cyc- lodextrin-Molekülen konnten bislang aber für die Cyclodextrin-Mo- leküle derartige Verwendungen nicht erschlossen werden. Erst mit der Einführung von chemisch definierbaren, mit funktionellen Gruppen ausgestatteten Cyclodextrin-Molekülen (vgl. EP 0 697 415 AI) war es überhaupt möglich, Cyclodextrine an festen Phasen zu konjugieren, wobei sie aber nach wie vor zur Komplexierung organischer Substanzen verwendet worden sind.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Konjugate, also Konjugate umfassend eine feste Oberfläche, ein daran gebundenes Cyclodextrin und einen kovalent an das Cyclodextrin gebundenen Analyten, weisen gegenüber den im Stand der Technik bekannten Konjugaten verschiedene Vorteile auf. So gestattet das relativ große Cyclodextrin-Molekül bedingt durch die erhöhte Spacer- länge, eine weitgehend uneingeschränkte freie Beweglichkeit des Analyten, wodurch nicht nur die Wechselwirkung zwischen Crosslin- ker und Analyten entscheidend verbessert (und damit die Kopplungsreaktion erleichtert) , sondern auch die Wechselwirkung mit dem Liganden-Molekül maßgeblich erleichtert wird. Weiters sind Cyclodextrine biokompatibel, nicht-toxisch und temperaturresis- tent bis zu 200°C und gestatten damit ein leichtes, ungefährliches Arbeiten und und eine gute Stabilität des erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten Konjugates.
Weiters gestattet die Verwendung von Cyclodextrinen als Crosslin- ker zwischen Festphase und Analyten eine hohe Bindungskapazität, geringe unspezifische Adsorption und - beispielsweise bei Fluo- reszenzdetektion - einen niedrigen (Mess-) Hintergrund, der durch die Wahl geeigneter Festphasen noch weiter verringert werden kann.
Gegebenenfalls können selbstverständlich zwischen Cyclodextrin und Festphase bzw. Cyclodextrin und Analyten weitere Crosslinker vorgesehen werden, z.B. indem ein weiterer Crosslinker bereits an der festen Oberfläche sitzt oder indem der Analyt bereits mit einem weiteren Crosslinker modifiziert worden ist. Beispiele für derartige weitere Crosslinker sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben (z.B. Dihydrazide, ...)
Als Analyten können erfindungsgemäß sämtliche kovalent an das Cyclodextrin zu bindenden Moleküle, insbesondere Biomoleküle, verwendet werden. Bevorzugt kommen erfindungsgemäß als Analyten Nukleinsäuren, insbesondere DNS, Peptide, Proteine, Enzyme, ins- besondere Oxidoreduktasen, Transferasen und Hydrolasen, Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Mikroorganismen (z.B. prokaryontische oder eukaryontische Zellen, Viren, etc.) oder Mischungen dieser Analyten zum Einsatz.
Bevorzugterweise werden als feste Oberfläche ein Chromatographiematerial, ein Metallfilm (z.B. dünne Goldfilme), eine Kunststoffoberfläche oder Glas verwendet.
Besonders bevorzugt sind selektiv maskierte Kunststoffoberflächen und selektiv geätzte Glasoberflächen, bei welchen nur Teile der Oberfläche chemisch aktiviert werden und somit nur auf ganz bestimmten Positionen auf der Oberfläche Crosslinker und somit Analyten bereitgestellt werden. Die Wahl der für die jeweilige Fragestellung optimalen Oberfläche kann jedoch der Fachmann ohne weiteres auf Grund seiner Kenntnisse bzw. auf Grund des Standes der Technik vornehmen. Speziell bei der DNA-Chip-Technologie kommen bevorzugterweise die, gemäß der eingangs zitierten Patentanmeldung geoffenbarten Trägermaterialien zum Einsatz.
Biochips, vor allem DNA-Chips, werden beispielsweise zur Analyse pathologisch veränderter Genaktivität, zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen oder zur Identifizierung neuer Arzneimittel-Kandidaten, in der Diagnostik und Resistenzanalyse von Infektionskrankheiten, aber auch im Umweltbereich zur Identifizierung pa- thogener Keime eingesetzt.
Bei der Chipherstellung werden DNA-Trägermoleküle entweder in situ mittels photolithographischer Techniken unter Verwendung physikalischer Masken auf der Matrix synthetisiert oder durch verschiedene Verfahren aufgedrückt. Die Herstellung von gedruckten DNA-Mikroarrays gliedert sich in die Schritte der Aktivierung bzw. Beschichtung der festen Chipmatrix, an die Biomoleküle über eine geeignete Kopplungschemie fixiert werden.
DNA kann mittels Adsorption, photolithographischer Entschützung und kovalenter und ionischer Bindung an Trägermaterial immobilisiert werden. Als Trägermaterialien werden controlled pore glass (CPG) , Siθ2-Schichten oder Polymere verwendet. CPG und Siθ2-Ober- flachen werden meist angeätzt, um freie OH-Gruppen an der Ober- fläche zu erzeugen, die direkt mit den DNA-Sequenzen zur Reaktion gebracht oder in andere funktionelle Gruppen umgewandelt werden können. Bei Polymeren als TrägerSubstanzen unterscheidet man Co- polymere, die funktionelle Gruppen enthalten, Polymere, in die durch chemische Modifizierung funktionelle Gruppen eingeführt werden können, chemisch inerte Polymere wie Polysulfone oder Teflon, die durch Bestrahlung (z.B. UV, Co 60) aktiviert werden können, und chemisch inerte Polymere, die mit funktionellen Co- polymeren bedeckt werden.
Polymere, die bereits funktionelle Gruppen besitzen, deren Aktivierung und Überführung in andere funktionelle Gruppen beschrieben ist, sind beispielsweise Polyamid, Polyacrylamid und Polyester. Unreaktive Polymere, wie z.B. Polyethylen, können mit einem reaktiven Monomer, wie z.B. Glycidylmethacrylat oder N-Vinyl- formamid, gepfropft werden. Eine sehr elegante Methode zur Einführung funktioneiler Gruppen ist die Oberflächenmodifizierung durch Plasmabehandlung. Bei Polypropylen wird durch verschiedene Unterarten der Plasmabehandlung eine Einführung von Amino-, Hy- droxy- oder Thiolgruppen möglich. Zur Verwendung von Glas als Trägermaterial werden Objektträger angeätzt und amino- oder epo- xysilanisiert .
Zur Herstellung spezifischer Arrays, z.B. Oligonukleotid-Arrays, werden z.B. Filtermaterialien, wie Nitrozellulose oder Nylon (Clontech, USA) mit Polylysin oder mit verschiedenen Silanen de- rivatisierte Glas-Objektträger, carboxymethylierte Dextrane (Biacore AB, Schweden) oder Polyacrylamidgel-Pads (Packard/Motorola, USA) verwendet. Nylonmembranen zeichnen sich im Gegensatz zu Glasoberflächen durch eine hohe Bindungskapazität aus, weisen aber bei fluoreszenter Detektion einen gegenüber Glas erhöhten Hintergrund auf. Polyacrylamid und Dextran sind dreidimensionale Hydrogele, die im Unterschied zu flachen Oberflächen wie Glas eine sehr hohe Bindungskapazität und eine geringe unspezifische Bindung aufweisen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Wahl des spezifischen Cyclodextrin-Moleküls bzw. der funktionelle Gruppen in der Regel nicht kritisch, es können also insbesondere α-, ß-, oder γ-Cyclo- dextrine verwendet werden. Als bevorzugte reaktive Gruppen auf dem Cyclodextrin-Molekül sind ausgewählt aus Halogen-, Amin-, Thiol-, Isothiocyanat- und Sulfonsäuregruppen, aromatische Gruppen, vorzugsweise Aromaten mit Heteroatomen, insbesondere mit den vorstehenden funktioneilen Gruppen, oder Kombinationen derselben. Ein geeignetes Cyclodextrin zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Monochlorotriazinyl, substituiertes ß- Cyclodextrin, welches bereits als Vernetzungsmittel oder Oberflä- chen-modifizierendes Mittel, beispielsweise auf Textilien oder Papieren, bekannt ist. Dieses ß-Cyclodextrin-Derivat kann leicht, beispielsweise durch Behandlung von Cyanurinchlorid mit ß-Cyclo- dextrin in Wasser, hergestellt werden.
Vorzugsweise enthält ein erfindungsgemäß eingesetztes Cyclodextrin-Molekül 2 bis 4 funktionelle Gruppen, insbesondere identische funktionelle Gruppen. Bevorzugterweise kann somit auch die Bindung zur festen Phase kovalent erfolgen. Bei mehr als zwei funktionellen Gruppen pro Cyclodextrin-Molekül können auch mehrere Analyten an ein Cyclodextrin-Molekül gebunden werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Konjugat umfassend eine feste Oberfläche, ein daran gebundenes Cyclodextrin und ein kovalent an das Cyclodextrin gebundener Analyt. Dieses Konjugat ist erhältlich gemäß dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren.
Bevorzugterweise ist das erfindungsgemäße Konjugat als Biochip ausgebildet, d.h., die feste Oberfläche sowie die Analyten sind gemäß den für Biochips bekannten etablierten Methoden ausgeführt und in für derartige Biochips angepassten Methoden eingebaut, insbesondere, was die Soft- und Hardware-mäßige Erfassung der Reaktionen an der festen Oberflächen anlangt (vgl . die bereits etablierten Biochip-Produkte der Firmen Affimetrix Inc. und Incyte) .
Das erfindungsgemäße Konjugat umfasst bevorzugterweise vor allem bei der praktischen Anwendung weiters ein am Analyten spezifisch gebundenes Liganden-Molekül, beispielsweise eine komplementäre Nukleinsäure, ein Antikörper, ein Antigen, ein Rezeptor-Ligand, ein Rezeptor, und dgl .
Vor allem, wenn das erfindungsgemäße Konjugat als Biochip ausge- bildet ist, umfasst das erfindungsgemäße Konjugat eine ganze Reihe (eine Bibliothek) an Analyten, wobei die Analyten-Bibliothek bevorzugterweise in einer Weise auf der festen Oberfläche aufgebracht ist, dass die Lokalisierung der verschiedenen Analyten räumlich exakt möglich ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur spezifischen Detektion und gegebenenfalls Isolierung eines Liganden-Moleküls aus einer Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Probe, enthaltend das zu detektie- rende bzw. isolierende Liganden-Molekül (bzw. eine Probe, die ein derartiges Liganden-Molekül enthalten kann) mit einem erfindungsgemäßen Konjugat kontaktiert wird, das Liganden-Molekül spezifisch an den gebundenen Analyten gebunden wird und diese spezifische Bindung durch an sich bekannte Maßnahmen verifiziert wird, worauf das Liganden-Molekül gegebenenfalls vom Konjugat gelöst und isoliert wird. Die Verifizierung der spezifischen Bindung kann dabei an das jeweilige Liganden-/Analytensystem angepasst werden oder aber durch allgemein gängige Methoden vollzogen werden, wie (Sekundär-) Antikörperreaktionen, Farbstoffreaktionen, Signalgebungsmethoden über die Festphase (Biochip) , Radioaktivi- täts- oder Fluoreszenzmarkierung, etc.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt ist, näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1: Die Bindung von Oligonukleotiden auf PVA/Palam,
Fig. 2: Die Bindung von Oligonukleotiden auf PVA/Palam/MCT, und
Fig. 3: Die Immobilisierungskapazität von erfindungsgemäßen Chips im Vergleich mit kommerziellen Produkten.
B e i s p i e l e:
Biomoleküle wie Enzyme, Antikörper, Mikroorganismen und Oligonuk- leotide (DNA, RNA) können durch Adsorption oder Einbetten in Po- lyvinylalkohol (PVA) immobilisiert werden. Polyvinylalkohol weist eine große, poröse Oberfläche auf, in die Biomoleküle eingelagert werden können. Die Porengröße kann durch basische bzw. saure Katalyse bei der Gelvernetzung bestimmt werden. Es entstehen dreidimensionale Netzwerke, die mechanisch stabil sind und ein exzellentes Quellverhalten in Wasser aufweisen. PVA-Gele können durch Crosslinking mit Glutaraldehyd kovalent vernetzt werden, was zu einer Erhöhung der Gelhärte führt. Außerdem können leicht funktionelle, reaktive Gruppen durch Acetylierung oder Acylierung in Polyvinylalkohol eingebracht werden. PVA mit Styrylpyridinium- Gruppen beispielsweise ist photosensitiv und schließt Biomoleküle bei Bestrahlung durch Cyclodimerisierung in seine Poren ein. Für Biosensoren werden auch PVA-Gele, die mit Polyallylamin und Poly- acrylsäure vernetzt sind, verwendet. Aufgrund der großen Poren von PVA und der Eigenschaft, in Wasser zu einem dreidimensionalen Netzwerk aufzuquellen, wird eine hohe Immobilisierungskapazität erreicht. Allerdings führt die großporige Matrix auch dazu, dass immobilisierte Biomoleküle sehr leicht ausgewaschen werden.
1. Für die Immobilisierung von Biomolekülen, speziell der Immobilisierung von Oligonukleotiden auf Biochips, wurde eine dünne Schicht PVA/Polyallylamin auf einen Objektträger aufgezogen und darauf das unmodifizierte Oligonukleotid (DNA, RNA) aufgetragen. Dieses bindet elektrostatisch über die Phosphatgruppe an das Amin. Die Bindung wird durch UN-Cross- linking gefestigt.
2. Um PVA kovalent zu vernetzen und Biomoleküle, im speziellen Oligonukleotide (DNA/RNA) , kovalent an PVA zu binden, werden Polymere bestehend aus PVA, Polyallylamin (und Polyacrylsäu- re) und Monochlortriazinyl-ß-Cyclodextrin, Na-Salz (MCT) hergestellt. MCT enthält 2 bis 3 reaktive Chlortriazinyl- gruppen pro Cyclodextrin-Molekül und bindet kovalent an Polyallylamin und das aminmodifizierte Oligonukleotid. MCT stellt einen bifunktioneilen Crosslinker dar, der einerseits über Polyallylamin mit PVA kovalent vernetzt ist, andererseits kovalent an ein Biomolekül, das nukleophile Gruppen wie -OH und -NH2 aufweist, binden kann.
Die Vorteile dieser Methoden sind: Die beschriebenen PVA-Gele sind stabil, hydrophil und porös. Bei Kontakt mit einer wässerigen Lösung quellen sie auf. Dadurch wird die Oberfläche vergrößert und die Immobilisierungskapazität erhöht. Der hydrophile Charakter des Gels ermöglicht einen leichten und schnellen Zugang der Biomoleküle zu der Polymeroberfläche und vermindert die unspezifische Adsorption. Biomoleküle können in PVA in einer hydrophilen, dreidimensionalen, porösen Matrix in einem lösungsähnlichen Zustand immobilisiert werden. Aufgrund der darauf resultierenden größeren Bewegungsfreiheit verhalten sich in PVA immobilisierte Biomoleküle reaktiver als auf planaren Oberflächen. Durch die kovalente Vernetzung des Gels und die ko- valente Bindung der Biomoleküle an das Gel (s. 2.), kann das Auswaschen der Biomoleküle unterbunden werden.
Die Anwendbarkeit der PVA-Gele, die nicht nur zur Immobilisierung von Oligonukleotiden (DNA, RNA) , sondern auch zur Immobilisierung von Antikörpern, Enzymen und Mikroorganismen geeignet ist, wurde an Hand eines 16S rRNA-Chips gezeigt.
Die Oligonukleotide, die auf PVA/Palam bzw. PVA/Palam/MCT gespottet wurden, blieben auch nach Waschen in Hybridisierungslösung (20 mM Tris, pH 7,4, 0,01 % Laurylsulfat, 0,9 M NaCl und 35 % Formamid) gebunden.
87 % des auf PVA/Palam aufgetragenen Oligonukleotids blieb nach exzessivem Waschen in Hybridisierungslösung bei 60°C immobilisiert (Fig. 1) .
Auf PVA/Polyallylamin/MCT konnten ≥90 % des ursprünglich aufgetragenen Oligonukleotids nach Waschen in Hybridlösung bei 60°C immobilisiert werden (Fig. 2).
Immobilisierung von Oligonukleotiden auf vernetzten. Polyvinylalkohol (PVA) zur Anwendung in DNA-Chips.
Vorgereinigte, mikroskopische Glasplättchen wurden mit einer kommerziell erhältlichen Vorrichtung (Bickel & Wolf, AT) gecoatet. Es wurden hierbei fünf PVA-Gele verwendet (PVA-1 bis PVA-5) , welche 5 g einer 10 %igen, wässerigen PVA (99+% hydrolysiert, MW 85.000-146.000, Aldrich, AT) , 0,1 g Palam (Aldrich, AT) , 0,1 g Monochlortriazinyl-ß-cyclodextrin (ß-CD) ) , Cavasol W7 MCT (Wacker, DE) in 5 ml destilliertem Wasser enthielten und pH's von 4 (PVA-1), pH 6,8 (PVA-2), pH 8 (PVA-3) und pH 9 (PVA-4) enthielten (unter Zugabe von Na2C03) . PVA-5 und PVA-1 waren identisch, außer hinsichtlich der Zugabe von ß-CD (PVA-5 enthielt kein ß- CD) . Die Dicke der PVA-Filme betrug ungefähr 8 um (bei einer Auflösung von 10 nm) . Die PVA-Gele auf den Chips wurden durch 6 Einfrier- (-18°C) und Trocknungs- (25°C) -Schritte polymerisiert . Un- modifiziertes und Amino-modifiziertes EUB338 (5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'), ALFlb (5' -CGT TCG (CT)TC TGA GCC AG-3 ' ) und BET42a (5' -GCC TTC CCA CTT CGT TT-3 ' ) (mit und ohne Cy5-Label) wurden in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 8, aufgelöst und auf die Chips durch einen piezoelektrischen Biochip-Arrayer aufgespottet . Die Oligo- nukleotide wurden in Blöcken von 5 x 3 Spots von 0,35 bis 1 nl aufgereiht. Die Entfernung zwischen den Spots war 300 um.
Die erfindungsgemäß hergestellten, ß-CD enthaltenden Chips wurden mit kommerziell erhältlichen Produkten, wie CMT-GAPS™, FAST™, Silane-Prep™ und Hybond N+ verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Dabei ist to die Fluoreszenz nach dem Spotten; ti die Fluoreszenz nach dem Blocken und t2 die Fluoreszenz nach Hybridisierung der komplementären DNA auf dem Chip. In der Immobilisierungskapazität lagen demnach die ß-Cyclodextrin-Chips (außer PVA-5) deutlich über allen getesteten, kommerziell erhältlichen Produkten. Immobilisierungskapazitäten zwischen 85 und 120 % nach Hybridisierung waren deutlich besser als die Vergleichsprodukte (unter 40 %) .
Die erfindungsgemäßen Chips weisen demnach eine gegenüber allen anderen Produkten bei weitem verbesserte Immobilisierungskapazität auf.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Verfahren zur Immobilisierung eines Analyten an einer festen Oberfläche, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Binden eines Cyclodextrin-Moleküls mit mindestens zwei funktionellen Gruppen an eine feste Oberfläche, so dass noch mindestens eine funktionelle Gruppe des Cyclodextrin-Moleküls mit einem Analyten kovalent gebunden werden kann, und
- kovalentes Binden des Analyten an das Oberflächen-gebundene Cyclodextrin-Molekül .
2. Verfahren zur Immobilisierung eines Analyten an einer festen Oberfläche, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- kovalentes Binden eines Cyclodextrin-Moleküls mit mindestens zwei funktionellen Gruppen an einen Analyten, so dass noch mindestens eine funktionelle Gruppe des Cyclodextrin-Moleküls an eine feste Oberfläche gebunden werden kann, und
- Binden des Cyclodextrin-Moleküls mit dem gebundenen Analyten an eine feste Oberfläche
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Analyten Nukleinsäuren, insbesondere DNS, Enzyme, insbesondere Oxidoreduktasen, Transferasen und Hydrolasen, Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Rezeptor-Liganden oder Mischungen dieser Moleküle eingesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass als feste Oberfläche ein Chromatographiematerial, eine KunststoffOberfläche, ein Metallfilm oder Glas verwendet werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine selektiv maskierte KunststoffOberfläche als feste Oberfläche verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn- zeichnet, dass eine selektiv geätzte Glasoberfläche als feste Oberfläche verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Cyclodextrin ein ß-Cyclodextrin ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Cyclodextrin reaktive Gruppen aufweist, die ausgewählt sind aus Halogen-, Amin-, Thiol-, Isothiocyanat- und Sulfonsäuregruppen, aromatische Gruppen, vorzugsweist Aromaten mit Heteroatomen, insbesondere mit den vorstehenden funktionellen Gruppen, oder Kombinationen derselben.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet, dass als Cyclodextrin ein Monochlorotriazinyl-ß-Cyclo- dextrin verwendet wird.
10. Konjugat, umfassend eine feste Oberfläche, ein daran gebundenes Cyclodextrin und einen kovalent an das Cyclodextrin gebundenen Analyten.
11. Konjugat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es erhältlich ist gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
12. Konjugat nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es als Biochip ausgebildet ist.
13. Konjugat nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters ein am Analyten spezifisch gebundenes Liganden-Molekül umfasst.
14. Konjugat nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Bibliothek an Analyten umfasst.
15. Verfahren zur spezifischen Detektion und gegebenenfalls Isolierung eines Liganden-Moleküls aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe, enthaltend das Liganden-Molekül, mit einem Konjugat nach einem der Ansprüche 10 bis 14 kontaktiert wird, das Liganden-Molekül spezifisch an den gebundenen Analyten gebunden wird und diese spezifische Bindung durch an sich bekannte Maßnahmen verifiziert wird, worauf das Liganden-Molekül gegebenenfalls vom Konjugat gelöst und isoliert wird.
DA/Se
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