DE69817850T2 - Kovalente immobilisierung mit hoher oberflächendichte von oligonukleotid-monoschichten - Google Patents

Kovalente immobilisierung mit hoher oberflächendichte von oligonukleotid-monoschichten Download PDF

Info

Publication number
DE69817850T2
DE69817850T2 DE69817850T DE69817850T DE69817850T2 DE 69817850 T2 DE69817850 T2 DE 69817850T2 DE 69817850 T DE69817850 T DE 69817850T DE 69817850 T DE69817850 T DE 69817850T DE 69817850 T2 DE69817850 T2 DE 69817850T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
thiol
group
biomolecule
substrate
carrier according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69817850T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69817850D1 (de
Inventor
Michael Thompson
E. Mark McGOVERN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sensorchem International Corp
Original Assignee
Sensorchem International Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sensorchem International Corp filed Critical Sensorchem International Corp
Publication of DE69817850D1 publication Critical patent/DE69817850D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69817850T2 publication Critical patent/DE69817850T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B17/00—Layered products essentially comprising sheet glass, or glass, slag, or like fibres
    • B32B17/06—Layered products essentially comprising sheet glass, or glass, slag, or like fibres comprising glass as the main or only constituent of a layer, next to another layer of a specific material
    • B32B17/10—Layered products essentially comprising sheet glass, or glass, slag, or like fibres comprising glass as the main or only constituent of a layer, next to another layer of a specific material of synthetic resin
    • B32B17/10005—Layered products essentially comprising sheet glass, or glass, slag, or like fibres comprising glass as the main or only constituent of a layer, next to another layer of a specific material of synthetic resin laminated safety glass or glazing
    • B32B17/1055—Layered products essentially comprising sheet glass, or glass, slag, or like fibres comprising glass as the main or only constituent of a layer, next to another layer of a specific material of synthetic resin laminated safety glass or glazing characterized by the resin layer, i.e. interlayer
    • B32B17/10688—Adjustment of the adherence to the glass layers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C17/00—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating
    • C03C17/28—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with organic material
    • C03C17/30—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with organic material with silicon-containing compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C17/00—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating
    • C03C17/34—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions
    • C03C17/3405—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions with at least two coatings of organic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/701—Integrated with dissimilar structures on a common substrate
    • Y10S977/702—Integrated with dissimilar structures on a common substrate having biological material component
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/92—Detection of biochemical
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/924—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis using nanostructure as support of dna analysis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/932—Specified use of nanostructure for electronic or optoelectronic application
    • Y10S977/953—Detector using nanostructure
    • Y10S977/957—Of chemical property or presence
    • Y10S977/958—Of biomolecule property

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Herstellung von kovalent immobilisierten Nukleinsäuren auf festen Trägern unter Verwendung eines neuen Trichlorsilanadhäsionsmittels, das einen Monoschichtfilm bildet und eine reaktive Thiolfunktionalität bereitstellt, an die Oligonukleotide in sehr hoher Dichte gebunden werden können. Die Oligonukleotide können modifiziert werden, indem neue Verknüpfungsmittel eingesetzt werden, die es ermöglichen, Nukleinsäuren an die silanisierte Oberfläche unter Verwendung einer chemoselektiven Methode in gepufferter wässriger Lösung bei Raumtemperatur entweder permanent oder reversibel zu binden. Ein Protokoll zum Herstellen von hochreproduzierbaren Silanmonoschichten durch Steuerung der Feuchtigkeit und der Befeuchtung ist ebenfalls beschrieben. Teil der Erfindung sind Verfahren zur Synthese des Silans, der Synthese von neuen bifunktionellen Linkern für eine Nukleinsäuremodifikation und Immobilisierungsprotokolle.
  • Hintergrund der Erfindung: allgemeiner Rahmen
  • Die medizinische Diagnose und Behandlung von Krankheiten auf genetischer Ebene ist rasch zur Realität geworden. Strategien zum Arzneimitteldesign werden vermehrt von der Entwicklung neuer Methoden zur Regulierung der Genexpression abhängen. Die Früherkennung von infektiösen viralen Krankheiten und genetischen Mutationen unter Verwendung von schnellen, zuverlässigen Diagnosetechniken in Kombination mit Gentherapiestrategien eröffnen die Möglichkeit, eine Behandlung durchzuführen, bevor Krankheitssymptome auftreten. Es sind neue Technologien auf der Grundlage der Genisolierung und -Reinigung, -Synthese, -Amplifizierung und -Detektion erforderlich, um diesen Herausforderungen zu begegnen. Diese neu auftretenden Technologien erfordern verbesserte Verfahren zur Oligonukleotidimmobilisierung in mehreren Schlüsselfeldern einschließlich der Nukleinsäureauftrennung/Reinigung; Nukleinsäureamplifizierung (Festphasen-PCR); Oligonukleotidsynthese; Isolierung von Nukleinsäure-bindenden Proteinen und Arzneimitteln; und Detektion von Oligonukleotiden mittels Hybridisierung und Sequenzierung.
  • Amplifizierung von Oligonukleotiden durch Festphasen-PCR
  • Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) stellt ein schnelles Verfahren zur in vitro-Herstellung vieler Kopien eines spezifischen Segments von DNS dar. Diese Technik findet mittlerweile viele Anwendungen wie die Molekulargenetikforschung, Gensequenzierung, forensische/kriminalistische und klinische Untersuchungen und viele weitere, in denen nur eine winzige DNS-Menge zur Verfügung steht. Die PCR wurde ursprünglich für die Lösungsphase entwickelt und erfordert vier wesentliche Bestandteile: Taq-DNS-Polymerase, die das Enzym darstellt, das für die Erstellung der neuen DNS-Kopien verantwortlich ist, den zu amplifizierenden Original-DNS-Strang, die vier Triphosphatbasen und schließlich die Primersequenzen, von denen aus die neuen DNS-Kopien wachsen werden. Eine deutlich verbesserte Methode besteht darin, die Primersequenzen an einen festen Träger zu binden, was es ermöglicht, die amplifizierte DNS nach Vollendung der Reaktion chemoselektiv zu entfernen.
  • Oligonukleotidsynthese via Festphasenmethoden
  • Kurze Fragmente von Einzelstrang-DNS oder -RNS jeder gewünschten Sequenz können rasch synthetisiert werden, indem ein automatischer DNS-Synthesizer verwendet wird, der mittlerweile in vielen Labors zum Alltag gehört. Die Oligonukleotide werden durch die sequentielle Zugabe von aktivierten Monomeren zu einer wachsenden Kette hergestellt, die an einen unlöslichen festen Träger gebunden ist. Die Festphasensynthesemethode weist die folgenden Vorteile auf: die Reaktionsausbeuten können nahezu quantitativ sein, indem Reagenzien im Überschuss eingesetzt werden, die leicht durch Filtrationsverfahren entfernt werden können; die sich wiederholende Synthese kann einfach automatisiert werden; die Handhabung wird minimiert, wodurch die Gefahr von Verunreinigungen vermindert wird; und die Verschwendung von teuren Reagenzien wird ebenfalls minimiert. Als Träger werden im Allgemeinen funktionalisierte Polystyrolkügelchen oder Carboxyl-derivatisiertes Glas mit kontrollierten Poren eingesetzt, wobei das pulverförmige Material in einem Röhrchen, das zwei Fritten an beiden Enden aufweist, eingeschlossen wird. Üblicherweise wird das erste Nukleotid über eine Carbonsäure-Esterbindung an dem 3'-Hydroxyl am festen Träger verknüpft und die Synthese wird in der 3'-5'-Richtung durchgeführt. Ein hohes Verhältnis von Oligonukleotid zur Oberfläche ist erforderlich, um die Synthese optimal durchzuführen, um die Verschwendung von Reagenzien zu verhindern. Es ist von Vorteil, an einem der Kettenenden spezielle Verknüpfungsgruppen zu befestigen, die als chemischer "Griff' dienen, so dass die Einzelstrang-Nukleinsäure an andere feste Oberflächen wie Affinitätsäulen oder Biosensorgeräte gebunden werden kann. Es sollte angemerkt werden, dass die Festphasensynthese und die Immobilierungstechnologie, von der sie abhängt, auch auf die Synthese von anderen Polymerarten einschließlich Peptiden, Proteinen und auf die kombinatorische Synthese von unterschiedlichen Reihen jeder Molekülklasse angewendet werden kann.
  • Trennung, Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren, Oligonukleotid-anderes Molekül-Komplexen und weiteren Biomolekülen
  • Biomoleküle im Allgemeinen können durch Elektrophorese-, Chromatographie-, Filtrations- oder Affinitätstechniken gereinigt werden. Die Elektrophorese wird weitläufig eingesetzt, um Nukleinsäurefragmente in einer Gelmatrix aufzutrennen. Die Fragmente werden üblicherweise auf eine Membran transferiert oder "geblottet", die eine Affinität für die Nukleinsäuren aufweist, so dass eine weitere Verarbeitung durchgeführt werden kann. Die Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (Reverse-Phase Liquid Chromatography, RPLC) wurde eingesetzt, um Mischungen von Nukleinsäuren, Proteinen und weiteren Biomolekülen auf beschichteten festen Trägern aufzutrennen. Die Mikrofiltration wird angewendet, um Verunreinigungen aus Biomolekül-Präparationen zu entfernen.
  • Verbesserte Trennungen können erzielt werden, indem verschiedene Sequenzen der Nukleinsäuren auf den stationären Medien immobilisiert werden, um eine "Affinitäts"-Hybridtechnik zu ergeben. Einzelstrang-Nukleinsäuren können auf einem festen Träger immobilisiert werden, an dem der komplementäre Strang spezifisch hybridisieren kann; solch eine Technik wird als Hybridisierung bezeichnet. Verunreinigungen werden weggewaschen, während der komplementäre Strang fixiert bleibt, und die Eluierung tritt selektiv auf, wenn Variablen wie die Pufferstärke verändert werden. Auf diese Weise können verbesserte Elektrophoresemembranen für "Northern blots", Nukleinsäure-Chromatographieträger und Nukleinsäure-Bindungsfiltrationsmedien hergestellt werden.
  • Von Nukleinsäuren verschiedene Moleküle können spezifisch immobilisierte Nukleinsäuren erkennen. Die Forschung zur Entdeckung neuer Behandlungen von genetischen Krankheiten erfordert die Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Genen mit Regulationsproteinen. Die Gentranskription, -Replikation und -Reparatur werden durch viele DNS- oder RNS-Bindungsproteine vermittelt. Arzneimittel wie Cis-Diamindichlorplatin (II), bekannt als "Cis-Platin", das eine Antitumoraktivität für die Behandlung von Eierstock-, Blasen- und Hodenkrebs aufweist, Anthracyclinantibiotika und polycyclische aromatische Verbindungen können in DNS-Strukturen interkalieren. Die Innovationen im Bereich der Antisense-Arzneimitteltherapie sind darauf gerichtet, ein komplementäres Segment von Nukleinsäurematerial am Ziel-Gen auf hochselektive Weise stark zu binden. Ähnlich wie bei der vorhergehend beschriebenen Nukleinsäurereinigung durch immobilisierte Hybridisierung können Proteine, Arzneimittel und jede Art von Nukleinsäure bindendes Molekül mittels selektiver Wechselwirkungen mit immobilisierten Oligonukleotiden gereinigt werden. In allen diesen Fällen wird eine hohe Dichte der immobilisierten Oligonukleotide zu einer erhöhten Effizienz zusammen mit einer Minimierung der Abfallproduktion führen.
  • Detektion von Oligonukleotiden, Antisense-Verbindungen und kleinen Molekülen
  • Die Detektion von Oligonukleotiden für diagnostische Assays mittels Hybridisierung und Sequenzierung ist ebenfalls von der Oberflächenimmobilisierung in hoher Dichte von Oligonukleotiden abhängig. Die Bestimmung von genetischen Sequenzen stellt ein gut etabliertes Gebiet dar. Standardtechniken wie die elektrophoretische Auftrennung von teilweise verdauten Nukleinsäurefragmenten sind üblicherweise für klinische Arbeiten zu langsam. Ein anderer Ansatz ist das Sequenzieren mittels Hybridisierung oder SBH, bei dem eine Bibliothek von kurzen Oligonukleotidsonden, die auf irgendeine Art markiert sind und eine bekannte Sequenz aufweisen, unbekannter DNS präsentiert werden. Wenn komplementäre Sequenzen gefunden werden, so findet ein Prozess, der als Hybridisierung bekannt ist, statt, der es ermöglicht, das Vorliegen einer bestimmten Sequenz in dem Gen zu signalisieren. Neue Techniken wie Mikromaschinen-Kapillarelektrophorese-Reihen erfordern Immobilisierungstechniken mit hoher Dichte, da jeder Kanal eine sehr winzige Oberfläche aufweist.
  • Immobilisierte Nukleinsäuresonden auf Sensoroberflächen können sehr viel schnellere Analysen zum einen Bruchteil der Kosten bereitstellen. Dies ist die Grundlage für einen "Gen-Chip", bei dem eine breite Vielfalt von verschiedenen genetischen Sonden mit einer Länge von ungefähr 10 bis 30 Basen auf einen Silicium-Wafer, der ähnlich ist wie jene, die bei der Herstellung von Computerchips eingesetzt werden, immobilisiert werden. Die parallele Revolution in der Mikroelektronik, in Kombination mit Fortschritten bei der automatischen Nukleinsäuresynthese, hat die Entwicklung von neuen Biosensorgeräten für die Analyse von Gensequenzen und Arzneimittelentdeckungsschemata bewirkt. Ein Biosensor ist ein Gerät, das biologische Information in elektrische Form transformiert, die anschließend einfach mit Hilfe der Computertechnologie angeschlossen werden kann. Die meisten Biosensoren bestehen aus einer Plattform, üblicherweise eine feste Oberfläche, an die die biologisch aktiven Sondenmoleküle gebunden werden. Biomoleküle wie DNS sind extrem selektiv und können wirksam an ein spezifisches Zielmolekül in einer Lösung, die viele weitere Spezies enthält, binden. Die Sonden-Ziel-Wechselwirkung wird anschließend mittels einem Mechanismus (optisch, elektrochemisch oder piezoelektrisch) beobachtet, der chemischen Informationen in elektronische Daten umwandeln kann. All diese Techniken können Informationen in Echtzeit liefern, was ein Vorteil ist, den die Standardtechniken nicht aufweisen.
  • In allen Fällen muss die Nukleinsäuresonde auf irgendeine Art und Weise auf der Oberfläche immobilisiert werden, so dass der Biosensor kontinuierlich in einem Flussinjektionsanalyse-Format (flow injection analysis, FIA) wiederverwendet werden kann. Die Nukleinsäuresonden müssen in der richtigen Konzentration, unter milden Bedingungen, rasch immobilisiert werden, unter vielen weiteren Erwägungen. Die Biosensoroberfläche kann derart maßgeschneidert sein, dass mehr als eine Art von Nukleinsäuren an ihrer Oberfläche gebunden ist. Es wurde berichtet, dass die Verwendung von Photoschutzsystemen imstande ist, gemusterte Oberflächen zu ergeben.
  • Immobilisierungsmethoden
  • Für die Immobilisierung von Enzymen und Antikörpern sind zahlreiche Techniken entwickelt worden (Mosbach (Herausgeber), Methods in Enzymology, Vol. 137, 1988) und viele der Techniken, die für die Immobilisierung von Proteinen eingesetzt werden, können auch bei Nukleinsäuren angewendet werden (Dunlap, Advances in Experimental Medicine and Biology). Die Adsorption ist die einfachste Methode, um Nukleinsäuren an Oberflächen zu binden, da keine Reagenzien oder spezielle Nukleinmodifikationen erforderlich sind. Nicht-kovalente Kräfte fixieren die Nukleinsäure an Materialien wie Nitrocellulose, Nylonmembranen (Brent et. al., Current Protocols in Molecular Biology, 1993), Polystyrol oder Metalloxidoberflächen wie Palladium oder Aluminiumoxid. Die Hauptnachteile dieser Methode liegen darin, dass die Nukleinsäure leicht durch die Hybridisierungsbedingungen von dem Substrat desorbiert werden kann, und dass die Basenbestandteile nicht für Hybridisierung zur Verfügung stehen können, wenn sie am Substrat gebunden sind. Die Vernetzung oder der Einschluss (Licache et. al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 2915) in Polymerfilmen wurden verwendet, um eine permanentere Nukleinsäureoberfläche zu erzeugen. Die Nukleinsäure kann quervernetzt werden, indem sie UV-Licht ausgesetzt wird (Pyrimidin-Pyrimidin-Dimer), oder es sind Vinyl-substituierte Nukleotide hergestellt worden, die polymerisieren können (Pitha, Polymer, 1977, 18, 425). Die Nukleinsäure kann in eine Amino-enthaltende Dextranmatrix (Johnsson et. al., Anal. Biochem., 1991, 198, 268) oder mit Glutaraldehyd vernetzte Aminoethylcellulose, Silicamaterial oder in Polyacrylamid eingebettet werden.
  • Die Avidin/Streptavidin-Biotin-Komplexierung hat im Bereich der Nukleinsäure-Biosensoren beachtliche Anwendung gefunden (Ebersole et. al., J. of the Amer. Chem. Soc., 1990, 112, 3239). Avidin und Streptavidin sind große Proteine (70 kD), die jeweils vier Biotinbindungsstellen enthalten. Biotin ist kleines Molekül, das mit sehr hoher Affinität an die Bindungsstelle bindet (Kd = 10–15 M) und nur unter extremsten Bedingungen entfernt werden kann. Das Avidin wird zuerst auf dem Substrat absorbiert und wird anschließend einer wässrigen Lösung von biotinylierter Nukleinsäure ausgesetzt. Die inhärente wässrige Stabilität von Avidin und Biotin führt dazu, dass das System einfach zu handhaben ist, jedoch kann das Vorliegen der großen Proteinschicht nicht-spezifische Bindungsstellen präsentieren und die Empfindlichkeit und Selektivität von gewissen Arten von Sensoren gefährden.
  • Alternativ dazu kann die Nukleinsäure mit einem Thiol-Linker aufgebaut werden, der eingesetzt werden kann, um direkt an Goldoberflächen zu komplexieren (Ito et. al., Anal. Chim. Acta., 1996, 327, 29). Es ist wünschenswert, Anordnungen herzustellen, die den langkettigen, selbst-anordnenden Monoschichten von Alkanthiolen ähnlich sind, die in der Literatur beschrieben worden sind (Van Ness et. al, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 3345). Die Thiol-Nukleinsäure kann wahrscheinlich aufgrund ihrer großen hydrophilen Nukleinsäuregruppe keine dichtgepackte Oberfläche bilden, und daher ist ihre Stabilität fraglich.
  • Am wünschenswerten ist es, die Nukleinsäure mittels einem Linker, der mit einem der Enden der Nukleinsäurekette verknüpft ist, kovalent an die Oberfläche zu binden. Dadurch steht es der Nukleinsäuresonde relativ frei, ihre Konformation zu verändern, so dass die Hybridisierung stattfinden kann; sie kann jedoch nicht vom Sensor verdrängt werden. Viele Arbeiten haben sich auf diesen Bereich konzentriert, wobei frühe Anstrengungen darauf basierten, die 3'-Hydroxyl- oder Phosphat-Gruppe an Carboxylreste auf verschiedenen Cellulosen mittels Carbodiimidderivaten zu verknüpfen (Schott, Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins, 1984). Cyanurchlorid (Biagione et. al., Anal. Biochem., 1978, 89, 616) wurde eingesetzt, um Oligonukleotide mit einer Vielzahl von Materialien umzusetzen. Cyanogenbromid (Scowten, Affinity Chromatography: Bioselective Adsorption of Inert Matrices, 1986) wurde verwendet, um einen oder mehrere exocyclische Aminreste über Isoharnstoffethergruppen an Agarose zu binden. Carbonsäure- und Aldehydmodifizierte Nukleinsäuren wurden an Latexkugeln über Hydrazid- oder Schiffsche Basen-Typ-Bindungen geknüpft (Kremsky et. al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 2891).
  • Da viele Biosensoroberflächen aus Silica oder Metalloxiden bestehen, muss der Sensor zuerst mit einer Art Adhäsionsmittel modifiziert werden (EP Anmeldung Nr. 96-303245). Organosilane wie z. B. Aminopropyltriethoxysilan (APTES) (Wu et. al., Chinese J. Microbiol. Immunol., 1990, 23 147), 3-Mercaptopropyltriethoxysilan (MPS) (Bhatia et al., Anal. Biochem. 1989, 178, 408) und Glycidoxypropyltriethoxysilan (GOPS) (Maskos et. al., Nucleic Acids Res., 1992, 20, 1679) wurden eingesetzt, um auf Gläsern, Silicamaterialien, optischen Fasern, Silicium und Metallelektroden, um nur einige zu nennen, funktionalisierte Oberflächen zu erzeugen. Die Silane hydrolysieren auf der Oberfläche, um mit Oberflächensilanolen eine starke Siloxanbindung zu bilden, und sie vernetzen auch miteinander, um die Adhäsion weiter zu verstärken. Im Fall von APTES wird oft Succinsäureanhydrid eingesetzt, um die Aminofunktionalität in eine Carbonsäure zu überführen, die dann an eine Aminoverknüpfte Nukleinsäure über Carbodiimid-Kupplung verknüpft wird. MPS kann verwendet werden, um mit Thiol-enthaltenden Biomolekülen Disulfidbindungen zu bilden. GOPS ist in Systemen eingesetzt worden, bei denen lange Polyetherketten verwendet wurden, um eine größere Distanz und Flexibilität zwischen der Oberfläche und der Nukleinsäuresonde zu ergeben.
  • Alkylsilane sind umfangreich eingesetzt worden, um eine breite Vielfalt von Biomolekülen an Oberflächen zu immobilisieren. Die Alkoxy- oder Chlorabgangsgruppen sind besonders reaktiv gegenüber Hydroxylgruppen, die auf Glas, Quarz, Silicium und Metalloxidoberflächen auftreten. Die Oberflächenhydroxylgruppe greift das Silicium in einer Sn2-Reaktion an, und die neue Si(Oberfläche)-O-Si(Silan)-Bindung ist eine Siloxanbindung. Monoalkoxy- oder Monochlorsilane können nur eine Siloxanbindung mit der Oberfläche bilden, und somit ist der Grad der Oberflächenbedeckung durch das Silan durch die Anzahl von verfügbaren Oberflächenhydroxylgruppen beschränkt, die im besten Fall (Glas) nicht mehr als etwa vier Hydroxylgruppen pro nm2 beträgt. Dioder Trialkoxy- oder Chlorsilane sind imstande, mehr als eine Siloxanbindung zu bilden. Die Anzahl an Oberflächenhydroxylgruppen pro Flächeneinheit ist üblicherweise zu gering für das Silan, um mehr als eine Siloxanbindung mit der Oberfläche zu bilden. Stattdessen können sich die Silane vernetzen, um zweidimensionale oder mehrschichtige Netzwerke auf der Oberfläche zu bilden, und so die Lücke zwischen Oberflächenhydroxylen zu überbrücken und den Grad der Oberflächenbedeckung zu erhöhen.
  • Diese Inter-Silan-Vernetzung erfordert eine stöchiometrische Menge an Wasser, damit die Polymerisation stattfindet, und kann in dem Lösungsmittel, das für die Silanisierungsreaktion eingesetzt wird, ausgeführt werden, oder kann durch Wasser, das an der Substratoberfläche absorbiert ist, zugeführt werden. Der eigentliche Silanisierungsmechanismus hängt von den verwendeten Bedingungen ab. In Lösung stellt der allgemein akzeptierte Mechanismus ein Dreischritt-Verfahren dar, wobei der erste Schritt die Hydrolyse der Chlorbestandteile eines Silans wie Octadecyltrichlorsilan (OTS) an der hydroxylischen Substratoberfläche darstellt, um ein Silantriol zu erzeugen, das anschließend auf dem Substrat über Wasserstoffbrückenbindungen physikalisch absorbiert und schließlich sowohl SiSubstrat-O-SiSilan als auch SSilan-O-SSilan vernetzte kovalente Bindungen bildet (Sagiv, J. of the Amer. Chem. Soc., 1980, 102, 92). Jedoch konnte gezeigt werden, dass die Hydrolyse der Chlorbestandteile von OTS in der Lösungsphase statt wie zuvor angenommen auf der Substratoberfläche stattfindet (Angst et. al., Langmuir 1991, 7, 2236).
  • Der Grad der Oberflächenbedeckung hängt von verschiedenen Variablen ab, wie der Reaktionszeit, Temperatur, Hydratisierungsgrad der Substrate, Beschaffenheit des Lösungsmittels, dem Reinigungsverfahren vor der Silanisierung der Substrate und der Beschaffenheit/Morphologie der Oxidschicht auf dem Substrat. Silberzan et al. (Langmuir 1991, 7, 1647) wie auch Angst und Simmons (Angst et al., Langmuir 1992, 7, 2236) erhielten eine dichtgepackte Monoschicht von OTS auf einer vollständig hydratisierten oxidierten Siliciumwaferoberfläche, während mit einem trockenen Siliciumwafer eine niedrigere Oberflächenbedeckung erhalten wurde. Tripp and Hair (Langmuir 1992, 8, 1120) zeigten mittels einer IR-Spektroskopiestudie, dass zwischen OTS und entweder den Silicaoberflächenhydroxylgruppen oder selbst der ersten Wasserschicht, die auf der verdampften Silicaoberfläche gebunden ist, keine Reaktion stattfindet. Trotz der zunehmenden Belege im Hinblick auf die Bedeutung der Oberflächenfeuchtigkeit liegt bisher kein Standardprotokoll vor, das verwendet werden kann, um die Reproduzierbarkeit der Silanfilme zu verbessern. Die Steuerung der Menge an Feuchtigkeit, die an die Oberfläche gebunden ist, wäre sicherlich ein Schritt in die richtige Richtung.
  • Alkoxysilan-3-mercaptopropyltrimethoxysilan (MPS) wurde umfangreich als Immobilisierungsmittel eingesetzt, jedoch treten mit diesem Reagenz einige Probleme auf. Caldwell (Yee et al., Langmuir 1991, 7, 307) zeigte, dass eine silberangefärbte MPS-Oberfläche rauh erschien, wenn sie mittels Rasterelektronenmikroskopie (scanning electron microscopy, SEM) untersucht wurde, und die MPS-Oberfläche bestand aus Teilchen mit einer Submikrometergröße. Sie bestätigten, dass das MPS-Silan eine mehrschichtige Struktur erzeugte. Die Arbeitsgruppe von Sligar und Bohn (Hong et. al., Langmuir, 1994, 10, 153) fand heraus, dass sowohl ein 17% MPS-Film (verdünnt mit n-Propyltrimethoxysilan) als auch ein 100% MPS-Film ähnliche Fähigkeiten auf weisen, Cytrochrom-b5 in einem 30%-Beladungsgrad zu beladen. Sie führten unter Verwendung des Ellman-Reagenz einen thiolfreien Assay durch und fanden heraus, dass die Menge an nicht-umgesetzten Thiolgruppen nach der Cytochrom-b5-Aussetzung auf den Oberflächen praktisch identisch mit der Menge an nicht-umgesetzten Thiolgruppen vor der Cytochrom-Aussetzung war. Die Autoren folgerten daraus, dass der Großteil des Cytochroms nicht-spezifisch an dem MPS-Film absorbiert wurde, jedoch formulierten sie keine Hypothese, an welche Funktionalität das Protein absorbiert wurde. Sehr wahrscheinlich wurde das Cytochrom an dem exponierten silanolhaltigen Rückgrat der ungeordneten MPS-Multischicht physikalisch absorbiert, oder an exponierte Glasflächen, die nicht durch MPS bedeckt worden waren. Sie bestätigten des Weiteren, dass MPS Multischichtstrukturen erzeugt, und stellten fest, dass die MPS-Massen hydrolytisch von der Oberfläche entfernt werden können.
  • Alkoxysilane neigen dazu, ungeordnete mehrschichtige Filme zu bilden. Dieser Effekt wird verstärkt, wenn das Alkoxysilan eine kurze Alkylkette enthält, die die Fähigkeit des Silans zur Selbstanordnung in hochgeordnete Filme vermindert. Diese Schwierigkeiten werden vergrößert, wenn nur wenig darauf geachtet wird, den Feuchtigkeitsgehalt des Substrats und des Lösungsmittels, die an dem Silanisierungsverfahren beteiligt sind, zu kontrollieren. Unter diesen ungünstigen Bedingungen wird das Alkoxysilan dazu neigen, in Lösung zu polymerisieren, wobei eventuell große Aggregate gebildet werden, die dann auf die Substratoberfläche wandern und anschließend darauf polymerisieren. Weitere Aggregate stapeln sich aufeinander auf ungleichmäßige Art und Weise, bis ein Film, der um ein Vielfaches dicker als die Länge eines Monomers ist, aufgebaut ist. Auch wenn diese Überzug immer noch für Immobilisierungszwecke verwendbar ist, ist er nicht effizient. Viele der funktionalisierten Enden des Silans stehen nicht normal zum Substrat in Richtung der Lösungsmasse, sondern sind in jeder vorstellbaren Richtung orientiert, einschließlich parallel zu der Substratoberfläche. Die stellt ohne Zweifel eine starke sterische Barriere dar und dieser Teil der Oberfläche steht für die Nukleinsäure-Immobilisierung nicht zur Verfügung, auch wenn kleine Sonden wie das Silberion imstande sein können, in die Poren hinein zu penetrieren. Die Poren können gegebenenfalls interferierende Moleküle auffangen, die die Interpretation der Biosensordaten komplizieren können.
  • Trichlorsilane sind sehr viel reaktiver als Trialkoxysilane und scheinen die dichtesten Filme zu bilden. Wenn die Alkylgruppe eine Länge von 8 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist, wird der Selbstanordnungsprozess dazu führen, dass die Silane einen "Monoschicht"-ähnlichen Überzug bilden, indem die Alkylketten nahezu mit der gleichen Dichte wie kristallines Polyethylen gepackt sind. Die Größe der Oberfläche (Montgo mery et al., Anal. Chem. 1992, 64, 1170), die jede Alkylkette besetzt, ist ungefähr 20 Å2.
  • Es wurden bifunktionale Trichlorsilane hergestellt, so dass im folgenden weitere Moleküle mit der silanisierten Oberfläche verknüpft werden können. 1-Thioactetat-l6-(trichlorsilyl)-hexadecan oder verwandte Analoga sind als potentielles Verknüpfungsmittel für Biomoleküle beschrieben worden (Balachander et. al., Langmuir 1990, 6, 1621). Im Gegensatz dazu bestehen kurzkettige Alkoxysilane wie APTES, MPS und GOPS, die zur Verknüpfung von Nukleinsäuren an Oberflächen eingesetzt wurden, üblicherweise aus einer Verknüpfung aus 3 Kohlenstoffen (3 carbon tether), und neigen dazu, ungeordnete mehrschichtige Strukturen zu bilden. Es ist möglich, dass aktive Silanmonomer mit einem Monomer, das nicht die Verknüpfungsgruppe enthält zu verdünnen. Beispielsweise kann ein einfaches Methyl-terminiertes "Verdünnungsmonomer" verwendet werden, um die aktiven Silanmonomeren, die auf der Oberfläche ablagern, wirksam "auszubreiten".
  • Es gibt viele Vorteile, die durch die Verwendung von Trichlorsilanlinkern für Biomolekülimmobilisierungssysteme gewonnen werden können. Das Avidinprotein weist einen hochpolares Äußeres auf, mit vielen Carbonsäure- und Aminresten, die exponiert sind. Diese könnten als potentielle Bindungsstellen für die Nukleinsäuresonde oder die Zielmoleküle dienen, oder könnten verunreinigende Materialien wie andere Proteine aus der Lösung absorbieren, was jeweils für die Wirkungsweise des Sensors schädlich sein kann. Methylterminierte Verdünnungssilane stellen eine hydrophobe Alternative zu polaren Materialien dar, die unerwünschte Verunreinigungen anziehen könnten. Es könnten weitere Verdünnungsmittel eingesetzt werden, um die Oberfläche mit weiteren Funktionalitäten zu versehen, beispielsweise könnte das Verdünnungsmittel Alkoholgruppen enthalten, um die Hydrophilie zu erhöhen und die Oberflächeneigenschaften könnten einfach gesteuert werden. Die Anzahl an Kohlenstoffen in dem Verdünnungsmittel könnte ebenfalls variiert werden, um die sterische Umgebung um den funktionellen Bestandteil des aktiven Silans zu steuern. Es ist von besonderer Bedeutung, dass das aktive Silan derart synthetisiert werden könnte, dass es eine breite Vielfalt von funktionellen Gruppen für die Immobilisierung aufweisen kann.
  • Die Verknüpfungsgruppe ist erforderlich, um das Oligonukleotid mit einer reaktiven Funktionalität zu versehen, so dass es chemisch manipuliert werden kann und ferner ermöglicht, dass sich das Oligonukleotid über jede gegebene Distanz von der Oberfläche erstreckt (Französische Patentanmeldung Nr. 94-12972). Thiol-verknüpfte Oli gonukleotide sind auf Bromacetyl-derivatisierten Polyacrylamid-Trägern immobilisiert worden (US-Patent Nr. 5,478,893).
  • Es ist wünschenswert, in der Lage zu sein, sowohl permanente als auch reversible Bindungen zwischen der Nukleinsäure und der Oberfläche zu erzeugen. Ein Patent (U. K. Patentanmeldung Nr. 89-21605) beschreibt eine Phosphor-Schwefel-Bindung, die im Rückgrat eines immobilisierten Oligonukleotids angeordnet ist, die durch Silbernitrat gespalten worden ist. Schwefel kann auch auf einem völlig anderen Weg in Form der Thiolgruppe verwendet werden, die zwei Hauptformen von Bindungen bilden kann: Disulfid und Thioether. Die reversible Disulfidbindung kann gebildet werden, indem die Reaktion, bekannt als Thiol-Disulfid-Austausch, verwendet wird, bei der ein Thiol-enthaltendes Molekül mit einem Disulfid-enthaltendem Molekül reagiert, so dass einer der Liganden des Disulfids auf die Originalthiolgruppe übertragen wird, um ein neues Disulfid zu bilden. Das Disulfid kann Teil eines bifunktionellen Kupplungsmittels sein (US-Patent Nr. 5,399,501). Das Disulfid kann spezifisch unter sehr milden Bedingungen mit einer Reihe von Reagenzien wie z. B. Dithiothreitol (DTT) gespalten werden, wodurch die freie Thiolgruppe erzeugt wird. Eine permanente Thioethergruppe kann aus einem Thiol und einer Vielzahl von Reagenzien, die reaktive Abgangsgruppen enthalten, gebildet werden. Thioloberflächen sind für die kovalente Bindung von biologisch-aktiven Verbindungen eingesetzt worden (US-Patent Nr. 4,886,755). Halobenzylverbindungen reagieren leicht mit Thiolen und die resultierende Thioetherbindung ist gegenüber Spaltung sehr resistent.
  • Feste Träger, die Nukleinsäuren, Enzyme, Peptide und weitere Biomoleküle für die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Zwecke tragen, sollten eine hohe Oberflächendichte von gebundenen Gruppen tragen. Dies ist erstrebenswert, so dass das Gerät mit maximaler Empfindlichkeit bei der Detektion und Bindung von Affinitätsbiomolekülen, die selektiv gebunden und für die Analyse entfernt werden, betrieben werden kann. Es ist auch wünschenswert, dass Geräte mit kleiner physischer Größe für die Analyse von sehr geringen Mengen der Reagenzien hergestellt werden können.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt beschichtete Träger, die eine sehr hohe Oberflächendichte von Monoschichtgruppen aufweisen, die mit einem Substrat verbunden sind, und ein Verfahren zur Herstellung solcher Träger bereit. Die Monoschichtgruppen sind permanent kovalent an das Substrat in hoher Oberflächendichte gebunden und tragen an ihren distalen Enden reaktive funktionelle Gruppen, nämlich Thiolgruppen, die verwendet werden können, um entweder permanent oder reversibel an ein Biomolekül wie ein Oligonukleotid, ein Enzym usw. durch das Verbindungsstück einer Verknüpfung oder eines Linkers zu binden. Die funktionellen reaktiven Thiolgruppen können bis zur Verwendung der Bindung an den Linker oder das verknüpfte Biomolekül chemisch geschützt werden. Die Erfindung stellt ferner neue Reagenzien und neue Verfahren zur Herstellung solcher beschichteter Träger und zur Herstellung von Biomolekül-präsentierenden festen Trägern aus den beschichteten Trägern bereit.
  • Ein Träger umfassend: ein festes Substrat; eine Oberfläche auf diesem Substrat; eine Monoschicht aus Alkylsilanen mit einer Alkylkette von 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer distalen Thiolgruppe, wobei die Alkylsilane über eine Si-O-Gruppe chemisch mit der Oberfläche in einer Dichte von mindestens 14 Picomol (pmol) pro Quadratzentimeter Fläche dieser Oberfläche verbunden sind, und die Alkylsilane über eine Si-O-Si-Bindung miteinander vernetzt sind; ein Verdünnungssilan innerhalb der Monoschicht aus Alkylsilanen; und eine an die distale Thiolgruppe gebundene Trifluoracetylschutzgruppe der allgemeinen Formel -S-CO-CF3.
  • Die Wahl der Länge der Alkylkette wird auf der Grundlage getroffen, dass sichergestellt wird, dass genügend exponierte distale funktionelle Gruppen für eine erfolgreiche Bindung an das verknüpfte Biomolekül bereitgestellt werden. Eine zu kurze Alkylkette an der Alkylsilylgruppe wird zu einer übermäßigen Vernetzung und Gelbildung auf der Substratoberfläche führen, mit dem Ergebnis, dass ungenügend funktionelle Gruppen präsentiert sind. Während Alkylketten mit nur 2C eingesetzt werden können, ist es bevorzugt, Silanverbindungen mit Alkylketten mit C8–C20, besonders bevorzugt C8–C18, einzusetzen.
  • Spezifische bevorzugte Alkylsilanverbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung sind jene, die der allgemeinen Formel Cl3Si-(CH2)n-SH entsprechen, insbesondere Thiol-geschützte Derivate davon, worin n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist, bevorzugt 8 bis 18. Die Reaktion dieser Silane mit festen Substraten wie Silicium, Silica, Chrom, Chromoxid usw. erfordert die vorherige Entschützung der Thiolgruppe, um einer Reaktion der Trichlorsilylgruppe mit der Thiolgruppe vorzubeugen, die zur Polymerisation des Alkylsilylreagenz führt.
  • Wie bereits angemerkt betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein wie vorstehend beschriebenes beschichtetes Substrat, bei dem die funktionelle distale Thiolendgruppe der Alkylsilanverbindung an eine Verknüpfung, die wiederum mit dem Biomo lekül verbunden ist, gebunden ist. Das verknüpfte Biomolekül kann permanent mit der Alkylsilanverbindung verbunden sein, z. B. durch Verwendung eines Linkers wie Bis(brommethyl)benzol, das praktisch in Form des wasserlöslichen Sulfonatderivats eingesetzt wird. Alternativ dazu kann das verknüpfte Biomolekül reversibel mit der Alkylsilanverbindung verbunden sein, z. B. durch Verwendung einer Disulfidbindung, so dass der Träger nach der Bindung eines Zielmoleküls an das Biomolekül für eine Wiederverwendung wieder aufgebaut werden kann. Ein Beispiel eines Verknüpfungsmittels, das zur Bildung einer entfernbaren, reversiblen Verknüpfung verwendet werden kann, ist ein Pyridyldisulfid der Formel:
  • Figure 00130001
  • Dieses wird mit einem Biomolekül wie einem DNS-Stück durch Bindung über eine reversible Disulfidbindung reagieren.
  • Das Verfahren zur Herstellung der beschichteten Träger gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst einen Schritt des Umsetzens des vorbereiteten gereinigten Substrats mit dem Alkylsilan, so dass die -Si(Cl)3-Gruppe darauf mit der Substratoberfläche, d. h. dem Si-Atom, reagiert, um eine Bindung Substrat-Si-O-Si-Alkyl zu bilden. Diese Reaktion erfordert die Gegenwart einer kleinen Menge an Wasser auf der Siliciumoberfläche und die Gegenwart eines Lösungsmittels für das Alkylsilan, das die richtige Polarität und Wasseraffinität aufweist, so dass es die geeignete Wassermenge von der Siliciumoberfläche entfernt. Geeignete Lösungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe wie Toluol, Benzol, Naphthalin, Xylol und ähnliches. Wassermischbare Lösungsmittel wie Dioxane sind ungeeignet. Stark wasserabstoßende Lösungsmittel wie Pentan sind ebenfalls ungeeignet. Die Wahl von geeigneten Lösungsmitteln auf der Grundlage der Wasseraffinität ist bereits beschrieben worden, z. B. in dem Artikel "Rote of Solvent on the Silanization of Glass with Octadecyltrichlorosilane", McGovern et al., Langmuir, 1994, 10, Seiten 3607–2614 (A.C.S.).
  • Die Endung umfasst folglich mehrere wesentliche Aspekte.
  • Ein erster Aspekt der Erfindung ist ein neues Silan, 1(Thiotrifluoracetato)-11-trichlorsilyl)-undecan (als TTU bezeichnet), das in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen als eine Komponente des neuen Silanisierungsverfahrens eingesetzt wird, wodurch ermöglicht wird, eine Monoschicht von exponierten Thiolgruppen in sehr hoher Dichte auf einer Vielfalt von hydroxylischen Oberflächen auf reproduzierbare Art und Weise aufzubringen. Die Erfindung umfasst ferner die Verwendung von Verdünnungssilanen wie n-Octyltrichlorsilan, um die Packungsdichte der Thiolfunktionalität auf der Oberfläche weiter zu steuern. Es ist wichtig zu beachten, dass das im Folgenden beschriebene Silanisierungsverfahren Monoschichtfilme von Trichlorsilanen mittels der Feuchtigkeitssteuerung der Lösungsmittel und Oberflächen, die bei der Herstellung eingesetzt werden, produziert und auch auf weitere Silane übertragen werden kann.
  • Gewisse Ausführungsformen betreffen die Methode, nach der Nukleinsäuren mit einer Thiol-funktionalisierten Silanoberfläche verbunden werden, entweder durch Verwendung eines neuen wasserlöslichen Bis(brommethyl)benzolsulfonat-Linkers (BMBS), der eine permanente Thioetherbindung zwischen der Oberfläche und der Nukleinsäure bildet, oder durch eine reversible Disulfidbindung, die durch ein Verfahren gebildet wird, bei dem ein Verknüpfungsmittel teilnimmt, das eine gemischte Pyridylsulfid-Nukleinsäurefunktionalität erzeugt (DNDS-Reagenz).
  • Ferner wird ein Verfahren beschrieben, durch das ein Linker oder ein Verknüpfungsmittel mit dem Nukleinsäurebestandteil verbunden wird. Nukleinsäuren können derart synthetisiert werden, dass sie eine integrale Verknüpfung (tether) enthalten, die in der Thiolgruppe endet. Diese Verknüpfung kann eine Länge von 2 bis 20 Einheiten aufweisen, die entweder aus Kohlenwasserstoffalkylketten oder Polyetherfunktionalitäten aufgebaut sind. Die Verknüpfung kann ein Reagenz in Lösung wie ein Phosphoramidit oder ein modifiziertes Nukleotidtriphosphat sein, das enzymatisch mit der Nukleinsäure verknüpft wird. Die Verknüpfung könnte auch mit der festen Phase verbunden werden, auf der die Nukleinsäurekette synthetisiert wird. Die Thiolgruppe der Verknüpfung reagiert entweder mit dem neuen BMBS-Linker oder mit Pyridyldisulfid-Nukleinsäure über ein Verknüpfungsmittel wie dem DNDS-Reagenz, das anschließend mit dem Oberflächenthiol reagiert, welches durch die silanisierte Oberfläche bereitgestellt wird. Im Fall der Disulfidbindung, die durch die letztere Methode erzeugt wird, kann dessen Spaltung und Freisetzung der Nukleinsäure chemoselektiv durchgeführt werden, indem Reagenzien wie Dithiothreitol (DTT) eingesetzt werden.
  • Es wird ferner ein beschichteter Träger beschrieben, der folgendes umfasst: einen festen Träger, eine Verbindung, die eine Monoschicht bildet und eine Funktionalität enthält, die kovalent an den Träger bindet; ein Rezeptormolekül oder "Biomolekül", das fähig ist, andere Moleküle zu erkennen und daran zu binden, eine Verknüpfung, die an dem Rezeptormolekül gebunden ist und die einen Spacer enthält, wobei das verknüpfte Rezeptormolekül kovalent mit der funktionalisierten Verbindung, die die Monoschicht bildet, verbunden ist.
  • Bei einer Ausführungsform wird der feste Träger ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Metallen, Metalloxidverbindungen, Silicamaterialien, Quarz, Glas, Halbleiter auf Siliciumbasis, keramische Materialien, Elektrophoresemembranen, Filtermembranen, und natürliche oder synthetische Polymere, die vor der Bindung mit einer Spacergruppe Hydroxylgruppen oder andere funktionelle Gruppen aufweisen, die in Hydroxylgruppen umgewandelt werden können.
  • Der beschichtete Träger kann in Anwendungsgebieten wie der Nukleinsäuretrennung, -Reinigung, -Isolierung, -Synthese, -Amplifizierung, Diagnose oder Detektion eingesetzt werden.
  • Die Monoschicht-bildende Verbindung kann ein polymerisierbares Trichlorsilan mit einer Alkylkette mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen darstellen.
  • Gemäß einer Form werden eine oder mehrere Monoschicht-bildende Verbindungen verwendet, um einen multifunktionalisierten Träger zu erzeugen. Solche Verbindungen sind die vorstehend beschriebenen Alkylsilanverbindungen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist eine der Silanverbindungen mit einer distalen Thiolgruppe funktionalisiert, d. h. optimal geschützt, während die andere, die eine kürzere Alkylkette als die erste aufweist, eine inaktive distale Endgruppe hat. Gemäß dieser Ausführungsform dient die zweite, kürzere Verbindung als ein Spacer zwischen den aktiven distalen Endgruppen der ersten Verbindung, um diese vor einer sterischen Hinderung in der folgenden Reaktion mit dem Biomolekül zu schützen, ermöglicht jedoch die Bewahrung der Oberflächendichte der gebundenen Alkylsilylgruppen für einen geeigneten Schutz des Substrats.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist das Biomolekül ein Oligonukleotid.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist die Verbindung, die die Monoschicht bildet, von 1-(Thiotrifluoracetato)-11-(trichlorsilyl)-undecan abgleitet.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Trägers bereitgestellt, umfassend: Auswählen eines Substrats mit Hydroxylgruppen auf seiner Oberfläche; Anfeuchten des Substrats; und Umsetzen der Hydroxylgruppen mit einem Alkylsilan mit einer Alkylkette aus 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, wobei das Alkylsilan eine Trichlorgruppe als eine erste Endgruppe, eine Thiolgruppe als eine zweite Endgruppe und eine an die Thiolgruppe gebundene Trifluoracetylschutzgruppe hat, um die erste Endgruppe des Alkylsilans mit der Oberfläche des Substrats zu verbinden, um eine vernetzte Monoschicht zu bilden.
  • Das Verfahren kann ferner die Schritte des Entfernens der Trifluoracetylschutzgruppe von der distalen Thiolgruppe zur Bildung eines freien Thiols und des Bindens eines verknüpften Biomoleküls direkt oder indirekt an das freie Thiol aufweisen.
  • Das verknüpfte Biomolekül kann über eine Disulfidbindung direkt an das freie Thiol gebunden werden. Die Disulfidbindung kann in Gegenwart eines Verknüpfungsmittels gebildet werden. Das Verknüpfungsmittel kann 6,6-Dithiodinicotinsäure oder ein Salz davon sein.
  • Alternativ dazu kann das verknüpfte Biomolekül über einen Linker indirekt an das freie Thiol gebunden werden. Der Linker kann Bis(brommethyl)benzolsulfonat sein. Der Linker kann mit dem freien Thiol eine Thioetherbindung bilden.
  • Die hohe Dichte der Alkylsilanbeladung auf dem Substrat, die in der vorliegenden Erfindung erreicht wird, wird über die DNS-Menge nachgewiesen, die auf den derivatisierten Oberflächen immobilisiert ist, wie in den folgenden Beispielen dargestellt. Die folgende Tabelle 11 zeigt Mittelwerte von 14,5 × 10–12 bis 54 × 10–12 mol DNS pro cm2 Fläche der Oberfläche. Nimmt man an, dass wenigstens 90% der Monoschichtoberfläche-gebundenen Gruppen mit einer DNS-Gruppe verbunden sind, so zeigt dies eine Dichte von wenigstens 14 Pikomol und wenigstens bis zu 60 Pikomol von Monoschichtoberfläche-gebundenen Gruppen pro cm2 der Substratoberfläche.
  • Solch eine hohe Dichte weist neben der verbesserten analytischen Empfindlichkeit in der Praxis weitere Vorteile auf. Sie ermöglicht auch einen besonders wirksamen Schutz des Substrats gegen schädigende "korrosive" Wirkungen des wässrigen Mediums, in dem die Analysen unter Verwendung der Erzeugnisse gemäß der vorliegenden Erfindung üblicherweise durchgeführt werden. Die Oberflächendichten von Alkylsilangruppen, die hydrophob sind, in den so erzielten hohen Levels versiegeln die Oberfläche wirksam vor dem Wasser. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn Metallträger wie Chrom verwendet werden, die Korrosionsverschlechterungen unterliegen. Die Erzeugnisse gemäß der vorliegenden Erfindung sind somit in der Praxis dauerhafter und länger haltbar. Dieser Abdichtungseffekt von dem Monoschichtüberzug in hoher Dichte wird ohne einen bedeutenden Verlust an Empfindlichkeit erzielt, insbesondere in dem Fall, bei dem ein nicht-terminal funktionalisiertes Alkylsilan mit kürzerer Kettenlänge zusammen mit dem C8 bis C18 thiol-terminiertem Alkylsilan eingesetzt wird, wie vorstehend beschrieben.
  • Weitere Aspekte der Erfindung ergeben sich aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • In den Zeichnungen, die die Erfindung ausführlich darstellen,
  • ist 1 eine Darstellung von chemischen Reaktionen, die zur Bildung von: A) einem neuen Silan und B) einem neuen Linker führen.
  • 2 zeigt die Reinigung und Befeuchtung des Substrats, das in der Silanisierung eingesetzt wird.
  • 3 zeigt: A) die Silanisierung von dem angefeuchteten Substrat mit einer Mischung von 30% TTU und 70% Octyltrichlorsilan, und B) die Entschützung der Oberfläche mit einem Hydroxylaminreagenz.
  • 4 zeigt die Herstellung von: A) Thiol-Verknüpfung an Oligonukleotid, B) BMBS-Reagenz an Oligonukleotid-Verknüpfungs-Komplex und C) DNDS-Reagenz an Oligonukleotid-Verknüpfungs-Komplex.
  • 5 zeigt die Immobilisierung von Oligonukleotid-Verknüpfungs-Linker-Komplex an thiolfunktionalisierte Oberflächen mittels: A) permanenter Thioetherbindungsbildung und B) chemoselektiv reversibler Disulfidbindung.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Experimenteller Teil
  • Silansynthese
  • Materialien. ω-Undecenylalkohol 98%, Kaliumthioacetat 98%, Trifluoressigsäureanhydrid 99%, Hydrogenhexachlorplatinat(IV)hydrat 99,995%, Trichlorsilan 99%, neut rales Alumina (Standardqualität, 150 mesh, 58 Å), Silicagel (Merck, Qualität 9385, 230–400 mesh, 60 Å) wurden von Aldrich bezogen und wie erhalten eingesetzt. Triphenylphosphin 98%, N-Bromsuccinimid (NBS) 98%, wasserfreies Magnesiumsulfat, Phosphorpentoxid, Kaliumhydroxid, Hexane, Diethylether, Tetrahydrofuran, Isopropanol, Methanol und Salzsäure wurden von BDH bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Dichlormethan und Acetonitril wurden von BDH bezogen und wurden vor der Verwendung über Phosphorpentoxid destilliert. Pyridin wurde von BDH bezogen und vor der Verwendung über KOH destilliert.
  • Instrumente. NMR-Spektren werden in δ-Einheiten angegeben und wurden entweder auf einem Varian Gemini 200 Spektrometer unter Verwendung einer 1H – 13C umschaltbaren Probe oder auf einem Varian VXR400S Spektrometer (1H, 13C, 19F, 29Si) unter Verwendung einer 5 mm umschaltbaren Probe aufgenommen. Im Fall von 29Si wurde entweder inverse-gated Entkopplung oder DEPT angewendet. Die Proben wurden in CDCl3 gelöst, das 0,03% TMS enthielt. Sowohl die 1H- als auch die 29Si-NMR-Spektren wurden auf TMS bei 0,00 ppm bezogen, während die 13C-NMR-Spektren auf das Zentrum des CDCl3-Triplets bei 77,00 ppm bezogen wurden.
  • Die Massenspektrometrie wurde auf einem VG 70-250S (double focussing) Massenspektrometer durchgeführt. Die Probe wurde einer Elektronenionisierung bei 70 eV und einer Beschleunigungsspannung von 8 KeV unterworfen. Die Quelle wurde auf 250°C und einen Druck von 10–6 mbar gesetzt. Perfluorkerosin wurde in das Spektrometer über ein separates, kontinuierliches Einführsystem eingeführt und das CF3 +-Ion (Masse 68,9952) wurde als Referenz verwendet. Unter diesen Bedingungen hatte das Massenspektrometer eine Auflösung von etwa 1200 (m/Δm) bei 10% Valley.
  • Elementaranalysen wurden durch die "Canadian Microanalytical Service Ltd. (Delta, B. C.)" durchgeführt. Das Silan wurde während dem Hantieren und der Analyse unter einer inerten Atmosphäre gehandhabt. Es wurden alle Elemente außer Sauerstoff bestimmt.
  • Die Fourier-transformierte Infrarotspektrometrie wurde auf einem Nicolet SDXB-Spektrometer durchgeführt, wobei die Software vom Hersteller angewendet wurde. Es wurden zehn Messungen gesammelt und bei einer Auflösung von 2 cm–1 gemittelt und als Referenz diente Polystyrol. Die flüssigen Proben wurden auf NaCl-Platten rein analysiert.
  • Synthese von ω-Undecenylbromid (2). In einen flammgetrockneten 200 ml Zweihalsrundkolben, versehen mit einem teflonbeschichteten Magnetrührstab und einem Kühler und N2-Einlass, wurden 8,5 g (50 mmol) ω-Undecenylalkohol (1) und 100 ml getrocknetes Dichlormethan gegeben. Der Kolben wurde mit Aluminiumfolie bedeckt und die Mischung wurde gerührt und in einem CCl4/Trockeneisbad (–23°C) gekühlt. Zu der Mischung wurden 15,7 g (60 mmol) Triphenylphosphin gegeben und bis zu dessen Auflösung gerührt. 9,8 g (55 mmol) NBS wurden auf einmal zu der Mischung gegeben und es wurde bei –23°C für 1 Stunde gerührt. Der Kolben wurde aus dem Kühlbad entfernt und man ließ die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten ruhen. Die Lösung wurde in einen Scheidetrichter überführt und wurde mit Natriumcarbonat-gesättigtem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet, filtriert und in einem Rotationsverdampfer konzentriert. Das lila Präzipitat wurde mit 3 × 50 ml Hexanmengen extrahiert, unter Verwendung einer Kombination von mechanischem Rühren, Erhitzen und Ultraschall. Die resultierende Suspension wurde filtriert, und die Hexane wurden in einem Rotationsverdampfer entfernt. Das Material wurde über eine kurze Säule von neutralem Alumina (5 cm Höhe, 3 cm Durchmesser) mit Hexanen unter Vakuum filtriert und das Produkt wurde in einem Rotationsverdampfer konzentriert, um eine klare Flüssigkeit zu ergeben. Ausbeute 10,64 g (91%); IR (rein) 3074, 2926, 1639, 1458, 999, 909 cm–1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 5,79 (1H, dddd, J = 17,2, 10,2, 7,0, 7,0 Hz), 4,93 (2H, m), 3,38 (2H, t), 2,02 (2H, dd, J = 6,2, 1,1 Hz), 1,83 (2H, m), 1,24–1,44 (12H, m); 13C NMR (400 MHz, CDCl3), δ 139,03, 114,05, 33,93, 33,79, 32,86, 29,38, 29,08, 28,92, 28,76, 28,18.
  • ω-Undecenyl Thioacetat (3). In einen 50 ml Rundkolben, versehen mit einem teflonbeschichteten Magnetrührstab, einem Kühler und einem N2-Einlass, wurden 3,50 g (15 mmol) ω-Undecenylbromid (2), 1,71 g (15 mmol) Kaliumthioacetat und 25 ml 95%-iges Ethanol gegeben. Die Mischung wurde über Nacht rückflussiert, anschließend wurde die Lösung in einen Scheidetrichter überführt, 50 ml Wasser wurde dazugegeben und mit 3 × 50 ml Hexanmengen extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet, filtriert und in einem Rotationsverdampfer konzentriert. Ausbeute 3,32 g (97%); IR (rein) 3074, 2926, 1696, 1639, 1458, 1360, 1138, 999, 909 cm–1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,79 (1H, dddd, J = 17,2, 10,2, 7,0, 7,0 Hz), 4,93 (2H, m), 2,85 (2H, t), 2,35 (3H, s), 2,02 (2H, dd, J = 6,2, 1,1 Hz), 1,55 (2H, m), 1,24–1,44 (12H, m); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 195,91, 139,12, 114,07, 33,79, 30,62, 29,49, 29,39, 29,38,29,14, 28,90, 28,79.
  • ω-Undecenylthiol (4). In einem 50 ml Rundkolben, versehen mit einem teflonbeschichteten Magnetrührstab, einem Kühler und einem N2-Einlass, wurden 2,0 g (8,76 mmol) ω-Undecenylthioacetat (3), 20 ml 95%-iges Ethanol und 5 ml 1 M NaOH gegeben. Die Mischung wurde für 1 Stunde rückflussiert, anschließend wurde die Lösung in einen Scheidetrichter überführt, 50 ml Wasser wurde dazugegeben und mit 3 × 50 ml Hexanmengen extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSo4 getrocknet, filtriert und in einem Rotationsverdampfer konzentriert. Man beachte, dass dieses Material unverzüglich eingesetzt werden sollte oder in einem gefrorenen Zustand aufbewahrt werden sollte. Ausbeute 1,49 g (91%); IR (rein) 3074, 2926, 2550, 1639, 1458, 999, 909 cm–1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,79 (1H, dddd, J = 17,2, 10,2, 7,0, 7,0 Hz), 4,93 (2H, m), 2,52 (2H, dd, 8,0, 4,0), 2,02 (2H, dd, J = 6,2, 1,1 Hz), 1,57 (1H, t), 1,24–1,44 (12H, m); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 139,09, 114,07, 34,04, 33,78, 29,44, 29,39, 29,08, 29,04, 28,90, 28,36, 24,63.
  • ω-Undecenylthiotrifluoracetat (5). In einem 25 ml Rundkolben, versehen mit einem teflonbeschichteten Magnetrührstab, wurden 0,939 g (3,33 mmol) ω-Undecenylthiol (4) und 5 ml trockenes Pyridin gegeben. 0,699 g (3,33 mmol) Trifluoressigsäureanhydrid wurde dazugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt, während das System verschlossen war. Das Pyridin wurde unter Vakuum entfernt und das feste Material wurde mit 3 × 20 ml Hexanmengen extrahiert. Die Hexane wurden mit einem Rotationsverdampfer entfernt, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde kugelrohrdestilliert und eine Fraktion wurde bei 90°C und 0,1 mm Hg gesammelt. Ausbeute 0,556 g (59%); IR (rein) 3074, 2926, 1704, 1639, 1458, 1285, 1203, 1162, 999, 909 cm–1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,79 (1H, dddd, J = 17,2, 10,2, 7,0, 7,0 Hz), 4,93 (2H, m), 3,05 (2H, t), 2,02 (2H, dd, J = 6,2, 1,1 Hz, 1,55 (2H, m), 1,24–1,44 (12H, m); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 184,81, 139,03, 114,11, 33,79, 29,43, 29,35, 29,32, 29,29, 28,95, 28,90, 28,67, 28,60, 24,66.
  • 1-(Thiotrifluoracetato)-11-(trichlorsilyl)-undecan (TTU) (6). In eine flammgetrocknete dickwandige Ampulle wurden 0,99 g (3,5 mmol) ω-Undecenylthiotrifluoracetat (5), 0,47 g (3,5 mmol) HSiCl3 und 1 Tropfen einer 4%-igen Lösung von H2PtCl6 in Isopropanol gegeben. Die Ampulle wurde bei –195°C dicht verschlossen und nach dem Auftauen bei Raumtemperatur wurde sie bei 60°C über Nacht erhitzt. Die Ampulle wurde anschließend bei –195°C geöffnet und das restliche HSiCl3 wurde unter leichtem Vakuum entfernt. Die Hauptbestandteile der Ampulle wurden in einer Kugelrohrdestillationsapparatur destilliert. Das Produkt destillierte bei 140°C bei 0,1 mm Hg. Ausbeute 1,17 g (80%); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3,05 (2H, t), 1,20–1,80 (20H, m); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 184,90, 115,53, 31,82, 29,45, 29,35, 29,30, 29,00, 28,97, 28,68, 28,63, 24,32, 22,28; 29Si NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13,32; Elementaranalyse: berechnet %: C(37,47), H(5,32), F(13,68), S(7,69), Cl(25,52), Si(6,74), gefunden: C(38,91), H(5,58), F(8,32), S(9,05), Cl(21,92), Si(1,20).
  • Synthese von Einzelstrang-DNS
  • Materialien: Die DNS-Synthese wurde auf einem Applied Biosystems Inc. (ABI) 392 DNS/RNS automatisiertem Synthesizer hergestellt, unter Verwendung von Standard CE Phosphoramidit-Chemie. Die Reagenzien wurden frisch von ABI bezogen und wie erhalten eingesetzt, einschließlich den Benzoyl- und Isobutyryl-geschützten Standard 500 mg Phosphoramidit DNS-Nukleotiden. 0,02 Molar Iodoxidationslösung wurde für die Synthese in Kombination mit 3'-Thiolmodifikationspatronen verwendet (1 μmol, 3'-Thiol modifier C3 S-S CPG, cat # 20-2933-41), wobei beide von Glen Research bezogen wurden. Standard-Basen-1 μmol-Synthesesäulen wurden von ABI bezogen. Konzentriertes Ammoniumhydroxid wurde frisch von Aldrich bezogen und wurde eingefroren, wenn es nicht verwendet wurde. Wasserfreies Acetonitril wurde von Aldrich bezogen und wie erhalten eingesetzt. Die Synthese wurde mit der DMT-Gruppe links an der Endbase durchgeführt, und die ersten zwei und letzten zwei Tritylfraktionen wurden für die Quantifizierung gesammelt. Poly-Pak-DNS-Reinigungspatronen wurden von Glen Research bezogen. 2 M-Triethylaminacetat (TEAA) wurde bei ABI gekauft. Acetonitril, Trifluoressigsäure (TFA) und Ammoniumhydroxid wurden von Aldrich bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Verdünnte Reagenzien wurden hergestellt, indem die geeignete Menge an deionisiertem Wasser eingesetzt wurde. p-Toluolsulfonsäure, Natriumacetat (ACS), Natriumchlorid (ACS) und Essigsäure (ACS) wurden von Aldrich bezogen.
  • Es wurden die folgenden DNS-Sequenzen synthetisiert:
  • Figure 00210001
  • DNS-Entschützung. Es wurde das Standard-End-Syntheseprogramm eingesetzt, um das Produkt von dem festen Träger über Ammonolyse zu spalten. Die Sammelfläschchen wurden mit teflonbeschichteten Drehkappen verschlossen und wurden für 16 Stunden auf 55°C erhitzt, um die Entschützung zu vervollständigen. Die Gläschen wurden gekühlt, bevor die Probe in 3 Aliquotes aufgeteilt wurde, jedes ungefähr 700 μl, in abgedeckten Polypropylen-Minizentrifugeröhrchen. Das Ammoniumhydroxid wurde auf einem SpeedVac entfernt, bei der niedrigen Temperatureinstellung.
  • DNS-Reinigung. Es wurde eine Poly-Pak-Festphasenreinigungspatrone konditioniert, indem 2 ml Acetonitril mit einer Polypropylenspritze durch die Patrone gedrückt wurden. Die Patrone wurde anschließend mit 2 ml 2 M TEAA gewaschen. Die lyophilisierte DNS wurde in 1 ml 1 M TEAA gelöst, auf die Patrone geladen und die eluierte Flüssigkeit wurde gesammelt und wiederum in die Patrone eingeführt, insgesamt 4 mal. Die Patrone wurde mit 3 ml 5% Ammoniumhydroxid gewaschen, gefolgt von 2 ml Wasser. 4 ml 2% TFA wurde auf die Säule gegeben, gefolgt von 2 ml Wasser. Das Produkt wurde mit 1 ml 20% Acetonitril in ein Polypropylenfläschchen eluiert.
  • Kupplungseffizienz via Trityl-Analyse
  • Das gesammelte DMT ("Trityl") wurde auf 50 ml mit 0,1 M p-Toluolsulfonsäure (TSA) in Acetonitril verdünnt. Etwa 2 ml des verdünnten Trityls wurden in eine Standard-UV-Quarzküvette gegeben, und die Absorption bei 498 nm wurde gemessen, mit Referenz auf eine 0,1 M TSA-Blindprobe, unter Verwendung eines Perkin Elmer UV-vis-Spektrophotometers.
  • Quantifizierung der gereinigten DNS. Die gesamten DNS-Synthese-Aliquots wurden konzentriert, so dass ein Polypropylenröhrchen das gesamte Produkt von einer Synthesesäule enthielt, in 1 ml Wasser. 20 μl der DNS-Lösung wurden zu 980 μl PBS-Puffer gegeben. Die Probe wurde auf einem Perkin Elmer UV-vis-Spektrophotometer bei 210–310 nm analysiert, nach Grundliniensubtraktion von einer PBS-Blindprobe (10 μl Wasser, 980 μl PBS).
  • Chromatographische Bestimmung der DNS-Reinheit
  • Ein Dionex DX 500 Ionenaustauschchromatographiesystem, ausgestattet mit einer GP40-Gradientenpumpe und AD20 UV-vis-Absorptionsdetektor, und einem Säulentauschventil (P/N 044858). Die analytische Säule war eine Dionex Nucleopac PA-100 (4 × 250 mm) Anionenaustauschersäule, geschützt mit einer Nucleopac PA-100 Schutzsäule. Die Module wurden mit dem Peak Net Softwaresystem gesteuert. Die mobile Phase "A" bestand aus 25 mM Natriumacetat in 10% Acetonitril (pH 5,2), während die mobile Phase "B" aus 1 M Natriumchlorid, gelöst in "A", bestand. Die Säule wurde mit "A" bei 1,5 ml/min äquilibriert, und anschließend wurden 20 μl der DNS-Probe injiziert, woraufhin der Anteil "B" linear gesteigert wurde, bis ein Verhältnis von 20% "A" : 80% "B" über 40 min erhalten wurde. "B" wurde während der nächsten 5 Minuten auf 100% erhöht und die Säule wurde für 10 Minuten mit 1,5 ml/min gespült, anschließend wurde "A" auf 100% über 5 Minuten zurück gesteuert, und die Säule wurde für 5 Minuten vor der nächsten Injektion äquilibriert. Die Absorption wurde bei 260 nm gemessen.
  • Synthese von 2,5-Bis(brommethyl)benzolsulfonatnatriumsalz (BMBS)
  • Materialien. P-Xylol, Kohlenstofftetrachlorid, Natriumhydroxid und N-Bromsuccinimid (NBS) wurden von BDH erhalten und wie bezogen eingesetzt. 1,1'-Azobis(cyclohexancarbonitril) (ACN) und DMF-Sulfurtrioxidkomplex wurden von Aldrich bezogen und wie erhalten eingesetzt. DMF und Benzol wurden von BDH bezogen und wurden über 4 Å Molekularsieb (Aldrich) vor dem Einsatz getrocknet.
  • 1,4-Bis(brommethyl)benzol (8). 19,58 g (0,11 mol) NBS wurden in einen 250 ml Rundkolben übertragen, der einen teflonbeschichteten Magnetrührstab aufwies. 5,3 g (0,1 mol) p-Xylol (7), 100 ml Kohlenstofftetrachlorid und 500 mg ACN wurden in den Kolben gegeben und der Inhalt wurde für 3 Stunden unter Rückfluss gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Lösung filtriert und der Rückstand wurde mit Kohlenstofftetrachlorid extrahiert, filtriert und mit der ersten Fraktion kombiniert. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer entfernt und der weiße Rückstand wurde aus Heptan kristallisiert. Ausbeute: 23,5 g.
  • 2,5-Bis(brommethyl)benzolsulfonatnatriumsalz (BMBS) (10). 2,64 g (0,01 mol) 1,4-Bis(brommethyl)benzol (8) wurde in einen 25 ml Rundkolben übertragen und wurde mit 7 ml getrocknetem DMF verdünnt. 1,8 g (0,012 mol) DMF-Schwefeltrioxidkomplex wurde zu dem Kolben zugegeben und die Mischung wurde gerührt und bei 100°C für 3 Stunden erhitzt. Das DMF wurde mittels einem Rotationsverdampfer entfernt und das Material wurde mit 1 M Natriumhydroxid neutralisiert. Die wässrige Phase wurde zweifach mit Benzol extrahiert, bevor das Wasser durch azeotrope Destillation mit trockenem Benzol entfernt wurde. Das Material wurde über Nacht vakuumgetrocknet, um 3,42 g einer klebrigen opaken Substanz zu ergeben. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7,83–7,42 (3H, m), 4,63 (4H, s); 13C NMR (400 MHz, D2O) δ 132,47, 132,36, 131,99, 131,47, 61,26, 43,07, 35,39.
  • Herstellung von 6,6'-Dithionicotinsäuredinatriumsalz (DNDS) (21). 1,54 g (0,005 mol) 6,6'-Dithiodinikocinsäure (Aldrich, eingesetzt wie bezogen) wurden mit 10 ml 1 M NaOH und 10 ml destilliertem Wasser für 15 Minuten gerührt. Der Großteil des Wassers wurde in einem Rotationsverdampfer entfernt, bevor der Feststoff azeotrop mit Benzol destilliert und vakuumgetrocknet wurde. Ausbeute: 1,86 g.
  • Silanisierungsverfahren
  • Materialien. Siliciumwafer, erhalten von International Wafer Service, wurden etwa 0,4 mm dick geliefert und wurden auf einer Seite spiegelglatt poliert. Sie wurden auf eine Größe von ungefähr 1 × 1 cm unter Verwendung eines Diamantspitzenstifts geschnitten. Magnesiumnitrathexahydrat wurde von Sigma erhalten. Octadecyltrichlorsi-lan (OTS), Octyltrichlorsilan (C8), 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPS) und Chloroform wurden von Aldrich bezogen. Toluol wurde von BDH bezogen und über Na unter N2 unmittelbar vor dem Einsatz destilliert. Deionisiertes Wasser wurde von IWT (Illinois Water Treatment Company)-System erhalten.
  • Instrumente. Röntgenstrahlphotoelektronische Spektren wurden auf einem Leybold MAX-200 Röntgenstrahlphotoelektrodenspektrometer gemessen, unter Verwendung einer nicht monochromatischen Mg Kα-Quelle, eingestellt bei 15 kV und 20 mA. Die Energieskala des Spektrometers wurde auf die Ag 3d5/2 und Cu 2p3/2 Peaks bei jeweils 368,3 eV und 932,7 eV kalibriert. Die Bindungsenergieskala wurde auf 285 eV für das Haupt-C(1s)-Merkmal kalibriert. Für alle Proben wurde ein Überwachungslauf (Passenergie = 192 eV, und von 0 – 1000 eV auf der Bindungsenergieskala) durchgeführt, zusammen mit Scans höherer Auflösung der meisten relevanten Regionen. Jede Probe wurde bei einem 90° Winkel relativ zu dem Elektronendetektor analysiert, unter Verwendung von einer Röntgenstrahl-Punktgröße von 4 × 7 mm. Die Satellitensubtraktion und Datennormalisierung wurden mit Software durchgeführt, die vom Hersteller erhalten wurden, während quantitative Arbeiten und Peak-Fit-Arbeiten mit dem ESCATools-Programm durchgeführt wurden. Die Quantifizierung der Spektren mit niedriger Auflösung wurde durchgeführt, indem empirisch abgeleitete Empfindlichkeitsfaktoren eingesetzt wurden (erhalten vom Hersteller). Die Empfindlichkeitsfaktoren waren C(1s) = 0,34, O(1s) = 0,78, Si(2p) = 0,4, F(1s) = 1,00.
  • Reinigungs- und Hydratationsverfahren für Silicium. Die Wafer wurden zuerst mild mit Orvus-Seifenlösung mit der Hand gewaschen, um die großen Staubkörner sanft zu entfernen, und anschließend reichlich mit destilliertem Wasser gespült und an der Luft getrocknet. Die Wafer wurden anschließend mit ACS-Chloroform gewa schen, mit Stickstoff trocken geblasen und anschließend in 30%-igem Wasserstoffperoxid für 30 Minuten ultraschallbehandelt (2, 11–12). Sie wurden 5 mal mit deionisiertem Wasser gespült, und anschließend bei 120°C für 30 Minuten ofengetrocknet. Die Wafer wurden in einer Feuchtigkeitskammer über Nacht gelagert, die mit Mg(NO2)2)-gesättigtes Wasser enthielt (2, 12–13).
  • Silanisierung von Siliciumsubstraten mit TTU. Die hydratisierten Wafer wurden rasch aus der Feuchtigkeitskammer entfernt und in Teströhrchen (vorhergehend mit OTS silanisiert) gegeben und verstöpselt. Eine Trockenbox, gefüllt mit Luft, die durch eine Drierit/Molekularsieb-Kolonne getrocknet worden war, wurde verwendet, um für die Silanisierungsreaktionen eine Umgebung mit geringer Feuchtigkeit bereitzustellen. Die Substrate wurden für 2 Stunden silanisiert, indem 2 ml einer 1 × 10–3 M-Lösung in trockenem Toluol der Mischung 30% TTU (6)/70% Octyltrichlorsilan (14) verwendet wurden (3, 13-15). Die Proben wurden anschließend mit trockenem Toluol, anschließend mit Chloroform gespült, bevor sie unter Stickstoff getrocknet wurden. Die röntgenstrahlphotoelektronenspektroskopische (XPS)-Oberflächenanalyse wurde mit zwei 50% TTU/50% Octyltrichlorsilan-beschichteten Wafern, die unter identischen Bedingungen hergestellt worden waren, und mit 2 Vergleichsproben Siliciumwafern durchgeführt.
  • Silanisierung von Siliciumsubstraten mit MPS. Das für TTU angewendete Silanisierungsverfahren wurde für 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan angewendet, außer dass eine 1 × 10–2 M (ähnlich zu der Methode von Bhatia)-Lösung von MPS eingesetzt wurde. Die röntgenstrahlphotoelektronenspektroskopische (XPS)-Oberflächenanalyse wurde mit einer Zufallsprobe von 2 MPS-beschichteten Wafern durchgeführt.
  • Entschützung von TTU-Oberflächen. Die TTU-beschichteten Wafer wurden mit 2 ml 0,5 M Hydroxylamin in Wasser (pH 8,5) für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt, anschließend wurden sie mit reichlichen Mengen an deionisiertem Wasser gespült und schließlich mit Methanol gespült und wurden mit N2 trockengeblasen, bevor sie in sauberen, drehverschlossenen Gläschen gelagert wurden (3, 15–16). Die röntgenstrahlphotoelektronenspektroskopische (XPS)-Oberflächenanalyse wurde mit 2 entschützten 50% TTU/50% Octyltrichlorsilan-beschichteten Wafern durchgeführt.
  • Experimente zur radioaktiven Markierung
  • Tag 1 500 ml PBS-Puffer (pH 7,5) wurde aus Tabletten (Sigma) hergestellt, die in deionisiertem Wasser gelöst wurden (Millipore). 100 ml dieses Puffers wurden in einen separaten Behälter überführt, als "Markierungs-Puffer" bezeichnet, und MgSO4 (BDH ACS-Qualität, erhitzt auf 150°C für 30 Minuten vor der Verwendung) wurde zu der Lösung in einer Konzentration von 10 mM gegeben. Die beiden Lösungen wurden bei 120°C für 30 Minuten im Autoklaven behandelt.
  • Die Inhalte von 3 Röhrchen "Thiol-DNS" wurden in einer Gesamtmenge von 200 μl Markierungspuffer gelöst und in einem Eppindorf-Röhrchen vermischt. Das gleiche wurde mit der "Kontroll-DNS" durchgeführt.
  • 2 μl der Thiol-DNS wurden zu 500 μl Wasser gegeben und dessen U.V.-Absorption wurde unter Verwendung eines Beckman DU640-Spektrophotometers gemessen. λ260 nm = 0,1069, λ280 nm = 0,0593.
  • 2 μl der Kontroll-DNS wurden zu 500 μl Wasser dazugegeben und dessen U.V.-Absorption wurde gemessen. λ260 nm = 0,8393, λ280 nm = 0,7273.
  • Ein Behälter Polynukleotidkinase (Pharmacia, cat # 27-0736-01, 200u, vor kurzem erhalten und bei –20°C ungeöffnet vor dem Einsatz gelagert) wurde mit 20 μl PBS verdünnt und wurde in einem Kühler bei –20°C im Labor gelagert, sofern nicht unmittelbar eingesetzt.
  • Zwei Behälter mit γ32P ATP (Amersham, Sonderbestellung, enthält kein β-Mercaptoethanol (BME) oder weitere Konservierungsmittel, gelöst in 50% Ethanol) waren ein paar Stunden davor eingetroffen und wurden vorbereitet, um jeweils eine Aktivität von 2 mCi/ml in einem Gesamtvolumen von 125 μl für den folgenden Tag aufzuweisen.
  • Beachte: alle Experimente, die die Handhabung von Radiochemikalien umfassten, wurden hinter 1 cm dicken Plexiglasschildern in einem speziellen Bereich des Labors durchgeführt. Wann immer möglich, wurden Zangen oder kleine Plexiglas-Eppindorf-Röhrchenhalter verwendet, um die Probenröhrchen zu bewegen, und es wurden Schutzbrillen getragen.
  • 198 μl der "Thiol-DNS"-Lösung und 9 μl der Kinaselösung und 125 μl der ATP-Lösung wurden vermischt.
  • 25 μl der Kontroll-DNS-Lösung und 173 μl des Markierungspuffers und 9 μl der Kinaselösung und 125 μl der ATP-Lösung wurden vermischt.
  • Beide Röhrchen wurden bei 37°C über Nacht (16 Stunden) in einem zirkulierenden Wasserbad inkubiert.
  • Tag 2 100 ml der PBS-Lösung wurde auf einen pH von 3 eingestellt und wurde bei 120°C für 30 Minuten im Autoklaven behandelt.
  • Beide DNS-Proben wurden zweimal mit 200 μl Chloroform (BDN-Spektroqualität) extrahiert, und 75 μl der wässrigen Phase wurde vorsichtig entfernt, um nicht Material an Grenzfläche miteinzubeziehen. 5 μl der Lösungen wurden in dem –20°C-Tiefkühler gelagert.
  • 70 μl der "Thiol-DNS" wurden mit ungefähr 5 mg DNDS (21) für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt.
  • Ein anderer Aliquot von 70 μl der "Thiol-DNS" wurde mit ungefähr 5 mg BMBS (10) für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt.
  • 70 μl der "Kontroll-DNS" wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen.
  • 2 NAP-5-Entsalzungssäulen (Pharmacia) wurden mit PBS (pH 7,5)-Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers äquilibriert, während eine separate NAP-5-Säule mit PBS (pH 3) äquilibriert wurde.
  • Die "Kontroll-DNS" und DNDS-umgesetzte Probe wurden auf die NAP-5-Säulen, die vorhergehend mit PBS (pH 7,5) äquilibriert worden waren, geladen, daraufhin wurden 430 μl PBS (pH 7,5) zugegeben und man ließ die Flüssigkeit durch die Säule herablaufen. Die BMBS-umgesetzte Probe wurde auf eine separate NAP-5-Säule (pH 3) geladen, 430 μl PBS (pH 3) wurde zugegeben, und man ließ die Flüssigkeit durch die Säule durchlaufen.
  • 900 μl des geeigneten Puffers wurden verwendet, um die Proben zu eluieren, die in 1 ml Eppindorfs gesammelt wurden.
  • 10 μl 1 M NaOH wurde zu der BMBS-Probe gegeben, um die Säure zu neutralisieren.
  • Ein 100 μl Aliquot wurde von jeder Probe entnommen und bei –20°C gelagert.
  • Im Vorfeld war eine besondere Zelle aufgebaut worden (Machine Shop, Dept of Chemistry, University of Toronto), um die silanisierten Oberflächen aufzunehmen. Die Zelle wurde aus rostfreiem Stahl hergestellt und bestand aus zwei 1 cm dicke Platten, die mit neun Schrauben gesichert werden konnten. Durch die obere Platte wurden 12 Löcher gedreht, mit jeweils einem Durchmesser von 5 mm, und jeweils mit einem Abstand von 1,5 cm untereinander oder zu einer Ecke. Es wurde eine Silicondichtung geschnitten, so dass 12 (5 mm Durchmesser) Löcher mit der oberen Platte in einer Reihe waren. Es wurden 6 entschützte 30% TTU-Wafer über den Löchern auf einer Seite der Silicondichtung angeordnet, und 6 100% MPS-Wafer wurden auf der anderen Seite angeordnet, so dass die polierte Seite der Wafer den Löchern zugewandt war. Es wurde darauf geachtet, dass die Wafer über den Löchern zentriert waren und dass kein Leck auftreten konnte. Eine Kautschukdichtung wurde über die Rückseite der Wafer angeordnet, und die Bodenplatte wurde daraufgesetzt. Die gesamte Anordnung wurde gewendet, so dass die Löcher nun sichtbar waren, und die Schrauben wurden angedreht, so dass ein gut passender, aber nicht zu enger Sitz erzielt wurde.
  • 200 μl der Proben, die von den NAP-5-Säulen eluiert worden waren, wurden zu den Proben in den folgenden Anordnungen gegeben:
  • Figure 00280001
  • Man ließ die Proben über Nacht mit den Oberflächen reagieren (16 Stunden).
  • Tag 3 Die Flüssigkeiten wurden aus der Zelle entfernt, und die Oberflächen wurden in situ mit 2 × 200 μl PBS (pH 7,5) und anschließend mit 2 × 200 μl destilliertem Wasser gewaschen. Es wurde darauf geachtet, alle Flüssigkeit zu entfernen, bevor die Zelle geöffnet wurde. Die Proben wurden entfernt und es war offensichtlich, dass kein Leck aufgetreten war. Die Wafers wurden mit der glänzenden Seite nach oben in 20 ml Gläschen gelegt, mit 20 ml destilliertem Wasser gefüllt und bei Raum temperatur für eine Stunde gewirbelt. Das Wasser wurde ersetzt und der Vorgang wurde noch zweimal wiederholt. 1 ml der Endwäsche von einer zufällig ausgesuchten Probe (TTU DNDS #2) wurde aufbewahrt.
  • Die Wafer wurden jeweils in separate 20 ml Plastikszintillationsröhrchen (Fisher 3-337-11B) eingeführt, die mit 20 ml ACS wässrigem Szintillationsmittel (Amersham NACS104) gefüllt wurden. 1 ml der Endwäsche von (TTU DNDS #2) wurde in ein 20 ml Plastikszintillationsröhrchen gegeben und 19 ml des Szintillationsmittels wurde zugefügt. Die Proben wurden mittels einem Beckman LS 5000TD automatischem Zähler gezählt, wobei das Standard 32P-Programm verwendet wurde.
  • Tag 4 30 μl Aliquots des Materials, das von den NAP-5-Säulen am Tag davor eluiert worden war, wurden zu den separaten 20 ml Szintillationsröhrchen gegeben und mit 20 ml Szintillationsflüssigkeit verdünnt. Drei Szintillationsröhrchen wurden mit der Szintillationsflüssigkeit gefüllt, um als Blindproben eingesetzt zu werden. Diese Proben wurden etwa einen Tag nach der Zählung der Oberflächen ausgezählt, ±1 Stunde.
  • 50 μl des Materials, das von den NAP-5-Säulen eluiert worden war, wurde jeweils mit 500 μl Millipore-Wasser verdünnt, und deren U.V.-Absorption bei 260 nm wurde mit einem Beckman DU640-Spektrophotometer gemessen.
  • Ergebnis und Diskussion
  • Es zeigte sich, dass TTU (6) für die Monoschichtimmobilisierung von Nukleinsäuren auf hydroxylischen Oberflächen aus vielen Gründen ein sehr geeignetes Material darstellt.
  • Die TTU-Silanmonoschichtfilme wurden mittels Winkel-aufgelöster XP5 (angleresolved XPS, ARCXPS) charakterisiert, wodurch die Dicke des 50% TTU /50% Octyltrichlorsilan-Films auf dem Siliciumsubstrat vor dem Entschützen bestimmt wurde (siehe 3, Struktur 15). Die Tabellen 2 und 3 zeigen sowohl die experimentellen Ergebnisse als auch einen Vergleich mit einem dreischichtigen theoretischen Modell (Andrade, Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, Vol. 1, 1985), das Werte für die Filmdicke des Kohlenwasserstoffteils des Films (tb), für die Dicke des fluorierten Teils (tc) und den Bedeckungsgrad im Hinblick auf den fluorierten Teil (fc) bereitstellt. Um die theoretischen Modellwerte zu erzeugen, wurde die mittlere freie Weglänge (mean free path, MFP) λ-Werte von jedem bestimmten Wert wie folgt abgeschätzt: Si(2p)λa = 28, C(1s)λb = 35 und F(1s)λc = 44 (Andrade). Die Dicke des Kohlenwasserstoffteils des Films lag bei 15 Å, und die Dicke des fluorierten Teils lag bei 1 Å in beiden Proben. Der Bedeckungsgrad wurde mit 0,91 und 0,89 bestimmt, was einen Mittelwert von 0,90 ergibt. Aus Molekülenmodellen wurde eine Gesamtlänge des TTU-Moleküls von 17,15 Å gemessen, und die Länge von Octyltrichlorsilan wurde mit 8,85 Å bestimmt, die Durchschnittsdicke des 50% TTU/ 50% Octyltrichlorsilanfilms lag somit bei 13 Å. Ohne Zweifel ist die experimentell bestimmte Gesamtfilmdicke des Silans 15 Å + 1 Å = 16 Å, was gut mit dem Idealwert von 13 Å übereinstimmt, in Anbetracht davon, dass die Genauigkeit dieser Technik etwa ±2 Å ist. Da der Bedeckungsgrad bei 90% liegt, ist der Silanfilm der idealen Monoschicht sehr stark angenähert.
  • Die ARXPS-Ergebnisse des TTU-Silanisierungssystems wurden mit einem allgemein verwendeten Thiol-enthaltenden Silan, 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPS), verglichen. Unter Verwendung eines zweischichtigen theoretischen Modells für den Vergleich wurde gefunden, dass 100% MPS-Filme eine mittlere Dicke von 33,5 Å und eine mittlere Oberflächenbedeckung von etwa 0,66 aufwiesen. Aus Computermodellen geht hervor, dass die Kohlenwasserstoffkette von MPS nur 2,86 Å beträgt. Somit entspricht der MPS-Film 11 Monoschichten in der Dicke. Der geringe Bedeckungswert von 66% zeigt, dass der MPS-Film sehr porös ist.
  • Aufgrund seiner Trifluoracetyl-geschützten Thiolgruppe kann das immobilisierte Silan mittels Röntgenstrahlphotoelektronenspektroskopie (X-Ray photoelectron spectroscopy, XPS) vor oder nach dem Entschützen charakterisiert werden (3, 15–16). Tabelle 1 zeigt einen Vergleich von 50% TTU/50% Octyltrichlorsilanfilm auf einem Siliciumsubstrat vor und nach dem Entschützen. Es ist offensichtlich, dass 89,2% der geschützten Thiolgruppen durch das Hydroxylaminreagenz (0,5 M, pH 7,5) wirksam entschützt worden sind. Dieses Reagenz und die verwendeten Bedingungen erwiesen zum Entschützen von TTU Silanfilmen als optimal.
  • Die Oligonukleotidsequenzen "Kontroll-DNS" und "Thiol-DNS" wurden als repräsentative Oligonukleotidproben ausgewählt. Die Analyse des DMT-Kations mittels UV-VIS-Spektroskopie bei 498 nm zeigte, dass die schrittweisen Ausbeuten für beide DNS-Arten überhalb von 97% lagen, und eine Ionenaustausch-HPLC ergab, dass die gereinigten Produkte für die Immobilisierungsanwendung rein genug waren (etwa 90%).
  • Die 32P-Radiomarkierung wurde verwendet, um die Menge von immobilisierten Oligonukleotiden auf dem Silanwafer zu bestimmen. In den experimentellen Aufbau wurden mehrere wichtige Faktoren eingebaut. Die "Kontroll-DNS" wurde verwendet, um die Menge an DNS zu bestimmen, die durch nicht-spezifische Adsorption "immobilisiert" worden war. Da die "Kontroll-DNS" keinerlei Disulfid- oder Thioether-bildende funktionelle Gruppen enthält, kann sie an die Silanoberflächen nur durch nicht kovalente physische Absorptionskräfte wie Wasserstoffbrückenbindung und Hydroph-Hydroph-Wechselwirkungen haften. Die "Thiol-DNS" enthält eine primäre Thiolgruppe, die an einer kurzen Kohlenwasserstoffverknüpfung gebunden ist, die mit BMBS oder DNDS reagieren kann, welche anschließend mit den Thiolgruppen der silanisierten Oberflächen über kovalente Kräfte reagieren kann. Vor der radioaktiven Markierung der Oligonukleotide wurden die Mengen der beiden Arten von Nukleotiden durch UV-Absorption untersucht, und deren Konzentrationen wurden derart eingestellt, dass sie ähnlich waren. Sowohl die 30% TTU/70% Octyltrichlorsilanoberflächen als auch die 100% MPS-Oberflächen wurden im Hinblick auf die Immobilisierungsausbeute miteinander verglichen, wobei drei Arten von 32P- markierter DNS eingesetzt wurde, die aus dem gleichen Versuch stammten (Kontroll-DNS, DNDS-DNS und BMBS-DNS). Auf diese Weise wurden sowohl die MPS- als auch die TTU-Oberflächen mit dergleichen Konzentration und Radioaktivität der markierten DNS-Produkte zur gleichen Zeit behandelt. Die für die Immobilisierung verwendete Zelle stellte sicher, dass jede Oberfläche 0,196 cm2 Fläche der Oberfläche für die Immobilisierung exponiert hatte, und folglich sind die Daten, die auf allen Oberflächen gesammelt wurden, miteinander vergleichbar.
  • Die Rohdaten, die die Hintergrundzahlen der Zählungen pro Minute (counts per minute CPM) darstellen, sind in Tabelle 6 angegeben, und der Roh-CPM auf jedem Wafer ist in Tabelle 7 dargestellt, mit und ohne Hintergrundsubtraktionen. Die gemessenen Konzentrationen der radioaktiv markierten Produkte in Lösung sind in Tabelle 8 dargestellt, das gemessene CPM/Einheit Volumen ist in Tabelle 9 angegeben (mit und ohne Zeitkorrektur), das berechnete CPM/mol DNS ist in Tabelle 10 dargestellt. Die in Tabelle 9 verwendete Zeitkorrektur war nötig, da die CPM-Messung in Lösung einen Tag nach der Bestimmung von CPM auf den Oberflächen durchgeführt wurde und sie wurde berechnet mit der Formel N(t) = N(0)e–(λt), worin λ die Verfallsrate für 32P (0,0447 d–1) ist, die Zeit betrug einen Tag.
  • Die Endergebnisse sind tabellarisch in Tabelle 11 dargestellt, und die allgemeinen Strukturen der modifizierten und immobilisierten Nukleinsäuren sind in den 4 und 5 dargestellt. Es ist offensichtlich, dass die TTU- silanisierte Oberfläche sehr ho he Mengen BMBS-Oligonukleotiden tragen kann (siehe 4, Verbindung 20 und 5, Struktur 23), im Vergleich zu den MPS-Oberflächen. Insbesondere wurde BMBS-DNS im Mittelwert mit 54,00 pmol/cm2 auf den TTU-Oberflächen gemessen, während nur 13,78 pmol/cm2 auf den MPS-Oberflächen gefunden wurden, eine Steigerung von 392%. Dies stellt einen deutlichen Erfolg dar, insbesondere wenn berücksichtigt wird, dass gefunden wurde, dass der MPS-Film als eine sehr dicke Multischicht vorliegt (11 Monoschichteinheiten) unter Verwendung der vorstehend beschriebenen ARXPS, im Vergleich zu der TTU-Monoschicht. Die beiden Systeme wurden etwa mit den gleichen Mengen der DNDS-DNS geladen (4, 22 und 5, 24), auch wenn der genaue Grund dafür unklar bleibt. Es ist offensichtlich, dass TTU-Oberflächen nicht so viel nicht-spezifische Adsorption wie MPS-Oberflächen anziehen (Verhältnis 1 : 3 der Kontroll-DNS) und es ist klar, dass sich die Ergebnisse von den DNDS-DNS- und BMBS-DNS immobilisierten TTU-Oberflächen stark von der Kontroll-DNS-Probe unterscheiden. Beim MPS-System ist dies weniger deutlich und es ist möglich, dass ein Teil der CPM, die auf den MPS-Oberflächen gemessen wurde, auf nicht-spezifische Adsorptionseffekte zurückgeht. Auch wenn es möglich ist, dass etwas nicht-spezifische Adsorption von DNDS-DNS und BMBS-DNS auf den TTU-Oberflächen vorliegen könnte, wird allgemein davon ausgegangen, dass wenn die Menge an immobilisierten Molekülen ansteigt, die Menge an nicht-spezifischer Adsorption abnimmt, da die Anzahl an verfügbaren Bindungsstellen abnimmt. Die TTU-Ergebnisse für DNDS-DNS und BMBS-DNS zeigen im Vergleich zu den MPS-Resultaten keine verbesserte Reproduzierbarkeit (±11,55% und ±7,24% vs. ± 21,34% und ±38,53%).
  • Die Ergebnisse von immobilisierter BMBS-DNS auf TTU-Oberflächen können mit dem Avidin-Biotin-Immobilisierungssystem verglichen werden. Bei Verwendung einer dünnen Avidinschicht auf einer Goldoberfläche und anschließender Immobilisierung von 32P- radioaktiv markierter biotinylierter DNS ( wird publiziert werden) wurde gefunden, dass 0,973 pmol/cm2 der DNS immobilisiert wurden. Die TTU-Oberflächen immobilisieren somit 5550% Nukleinsäure im Vergleich mit der Avidin-Biotinmethode. Der Grund dafür liegt darin, dass Avidin ein großes Protein ist (etwa 100 Å im Durchmesser) mit nur vier Biotinbindungsstellen. Der Großteil der Avidin- beschichteten Oberfläche ist von daher ungenutzt, während sich das TTU-Silan derart anordnet, um die Maximaldichte an funktionellen Gruppen pro Flächeneinheit mit einen theoretischen Abstand in der Größenordnung des Durchmessers von einer Kohlenwasserstoffkette zu ergeben.
  • Die Methode kann auch auf Silane und Substrate angewendet werden, die verschieden sind von TTU (6) und Silikonwafern. Beispielsweise kann die Kohlenwasserstoffkettenlänge verkürzt oder verlängert werden von C2 bis C20, sowohl in dem geschützten Thiol-enthaltendem Silan wie auch dem Silan, das für Verdünnungszwecke eingesetzt wird. Das Verdünnungssilan kann in einer Methylgruppe enden, wie dies auch der Fall ist für Octytrichlorsilan, oder könnte in einer breiten Vielfalt von funktionellen Gruppen enden, wie z. B. Alkohol, Amin, Ammonium, Carbonsäure oder Sulfonsäure, um den Silanfilm mit einer Vielfalt von chemischen Funktionalitäten auszustatten. Das beschriebene Silanisierungssystem kann auf eine breite Vielfalt von Substraten, die Hydroxylgruppen tragen, angewendet werden: z. B. Siliciumdioxid wie oxidiertes Silicium, Quartz und Gläser, Keramikmaterialien, Metalloxidoberflächen wie Aluminium, Chrom, Stahl, Zinnoxid, Palladium und Platin, um nur einige zu nennen. Das beschriebene Hydratisierungsprotokoll kann ebenfalls auf diese Oberflächen angewendet werden.
  • Der neue Linker BMBS (10) ist ferner für die Immobilisierung von Oligonukleotiden auf Substrate ohne Bindung über ein Silan geeignet. Die Benzylbromidfunktionalität von BMBS kann mit einer breiten Vielfalt von Nukleophilen auf funktionalisierten Polymeren reagieren, z. B. Polystyrol/Divinylbenzol, Polyacrylamid, Kohlenwasserstoffpolymere wie Cellulosen, Dextrosen, Sepharosen, modifiziertes Polyethylen und Polytetrafluorethylen. Das BMBS kann als homobifunktionelles Reagenz für die Verknüpfung mit vielen Arten von Biomolekülen im Allgemeinen, an andere Biomoleküle wie Proteine, Antikörper und Oligonukleotide verwendet werden, und wie vorstehend besprochen für die Verknüpfung von Biomolekülen mit vielen Substratarten.
  • Die Thiol-enthaltende Verknüpfung (tether), die an die Säule für die Festphasen-Oligonukleotidsynthese gebunden ist, ist kommerziell erhältlich, es können jedoch auch andere Arten von Thiolverknüpfungen für diesen Zweck eingesetzt werden. Die Verknüpfung kann eine Länge von 2 bis 50 Einheiten aufweisen, die entweder aus Kohlenwasserstoff- oder Polyetherfunktionalitäten aufgebaut ist. Die Verknüpfung muss nicht ein integraler Bestandteil der Festphasen-Oligonukleotidsynthesesäule sein, sondern kann auch ein Reagenz sein, das in Lösung eingesetzt wird, wie ein Phosphoramidid oder ein modifiziertes Nukleotidtrisphosphat, das enzymatisch mit der Nukleinsäure verbunden werden kann. Das hergestellte Reagenz DNDS (21) kann verwendet werden, um das Thiol-verknüpfte Oligonukleotid in ein reaktives Disulfidbildendes Oligonukleotid umzuwandeln, oder könnte eingesetzt werden, um weitere Biomoleküle in die entsprechenden Pyridyldisulfide zur Anwendung in Biomolekülkonjugationsreaktionen oder für Immobilisierungszwecke umzuwandeln.
  • Tabelle 1
    Figure 00340001
  • Tabelle 2
    Figure 00340002
  • Tabelle 3
    Figure 00350001
  • Tabelle 4
    Figure 00350002
  • Tabelle 5
    Figure 00360001
  • Tabelle 6
    Figure 00360002
  • Tabelle 7
    Figure 00370001
  • Tabelle 8
    Figure 00370002
  • Tabelle 9
    Figure 00370003
  • Tabelle 10
    Figure 00380001
  • Figure 00390001

Claims (22)

  1. Träger, der Folgendes umfasst: ein festes Substrat; eine Oberfläche auf diesem Substrat; eine Monoschicht aus Alkylsilanen mit einer Alkylkette von 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer distalen Thiolgruppe, wobei die Alkylsilane über eine Si-O-Gruppe chemisch mit der Oberfläche in einer Dichte von mindestens 14 Picomol (pmol) pro Quadratzentimeter Fläche dieser Oberfläche verbunden sind, und die Alkylsilane über eine Si-O-Si-Bindung miteinander vernetzt sind; ein Verdünnungssilan innerhalb der Monoschicht aus Alkylsilanen; und eine an die distale Thiolgruppe gebundene Trifluoracetylschutzgruppe der allgemeinen Formel -S-CO-CF3.
  2. Träger nach Anspruch 1, bei dem die distale Thiolgruppe für ein Entschützen durch Entfernen der Schutzgruppe, um ein freies Thiol zu bilden, und für ein Binden des freien Thiols direkt oder indirekt an ein angeknüpftes Biomolekül geeignet ist.
  3. Träger nach Anspruch 1, bei dem die Alkylsilane eine Alkylkette aus 8 bis 18 Kohlenstoffatomen haben.
  4. Träger nach Anspruch 3, bei dem die Alkylsilane eine lineare Alkylkette aus 11 Kohlenstoffatomen haben.
  5. Träger nach Anspruch 4, bei dem die Alkylsilane von 1-(Thiofluoracetat)-11-(trichlorsilyl)-undecan abgeleitet sind.
  6. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Alkylsilane an die Oberfläche in einer Dichte von 14,5 bis 60 pmol/cm2 der Fläche der Oberfläche gebunden sind.
  7. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das Verdünnungssilan ein Alkylsilan ist, dessen Alkylkette kürzer ist als die der Alkylsilane mit der Trifluoracetylschutzgruppe und das an seinem distalen Ende chemisch inert ist.
  8. Biomolekülträger umfassend: der Träger nach Anspruch 1, der dahingehend modifiziert ist, dass die Trifluoracetylschutzgruppe entfernt und durch eine an der distalen Thiolgruppe über eine Disulfidbindung angeordnete Verknüpfung ersetzt wird und ein Biomolekül an einer von der Disulfidbindung entfernten Stelle dieser Verknüpfung angefügt wird.
  9. Biomolekülträger nach Anspruch 8, der zusätzlich einen zwischen der Verknüpfung und dem Biomolekül angeordneten Linker aufweist.
  10. Träger nach Anspruch 8, bei dem der Linker aus 2,5-Bis(brommethyl)benzolsulfonat (BMBS) oder einem Salz davon gebildet wird.
  11. Biomolekülträger nach Anspruch 8 zur Verwendung als Affinitätssäule oder als ein Biosensorgerät.
  12. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das feste Substrat aus folgender Gruppe gewählt wird: Metalle, Metalloxidverbindungen; Silikamaterialien; Siliziumoxide; Quarz; Glas; Halbleiter auf Siliziumbasis; keramische Materialien; Elektrophoresemembranen; Filtermembranen; und natürliche oder synthetische Polymere, die vor der Bindung mit den Alkylsilangruppen Hydroxylgruppen oder andere funktionale Gruppen haben, die in Hydroxylgruppen umgewandelt werden können.
  13. Verfahren zur Bildung des Trägers nach Anspruch 1 mit den Schritten: a) Auswählen eines Substrats mit Hydroxylgruppen auf seiner Oberfläche; b) Anfeuchten des Substrats; und c) Umsetzen der Hydroxylgruppen mit einem Alkylsilan mit einer Alkylkette aus 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, wobei das Alkylsilan eine Trichlorgruppe als eine erste Endgruppe, eine Thiolgruppe als eine zweite Endgruppe und eine an die Thiolgruppe gebundene Trifluoracetyl-Schutzgruppe hat, um die erste Endgruppe des Alkylsilans mit der Oberfläche des Substrats zu verbinden, um eine vernetzte Monoschicht zu bilden.
  14. Verfahren zur Bildung eines Biomolekülträgers, der das Verfahren nach Anspruch 13 und die anschließenden Schritte des Entfernens der Trifluoracetyl-Schutzgruppe von der distalen Thiolgruppe zur Bildung eines freien Thiols und des Bindens eines verknüpften Biomoleküls direkt oder indirekt an das freie Thiol aufweist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das verknüpfte Biomolekül über eine Disulfidbindung direkt mit dem freien Thiol verbunden ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Disulfldbindung in Anwesenheit eines Verknüpfungsmittels gebildet wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das Verknüpfungsmittel 6,6-Dithiodinikotinsäure oder ein Salz davon ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das verknüpfte Biomolekül über einen Linken indirekt mit dem freien Thiol verbunden ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der Linker Bis(brommethyl)benzolsulfonat ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der Linker eine Thioetherbindung mit dem freien Thiol bildet.
  21. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Biomolekül ein Oligonucleotid ist.
  22. 1-(Thiotrifluoracetato)-11-(trichlorsilyl)-undecan.
DE69817850T 1997-10-16 1998-10-16 Kovalente immobilisierung mit hoher oberflächendichte von oligonukleotid-monoschichten Expired - Fee Related DE69817850T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US951448 1997-10-16
US08/951,448 US6169194B1 (en) 1997-10-16 1997-10-16 High surface density covalent immobilization of oligonucleotide monolayers using a 1-(thiotrifluoroacetato)-11-(trichlorososilyl)-undecane linker
PCT/CA1998/000969 WO1999020640A2 (en) 1997-10-16 1998-10-16 High surface density covalent immobilization of oligonucleotide monolayers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69817850D1 DE69817850D1 (de) 2003-10-09
DE69817850T2 true DE69817850T2 (de) 2004-07-15

Family

ID=25491697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69817850T Expired - Fee Related DE69817850T2 (de) 1997-10-16 1998-10-16 Kovalente immobilisierung mit hoher oberflächendichte von oligonukleotid-monoschichten

Country Status (9)

Country Link
US (2) US6169194B1 (de)
EP (1) EP1023309B1 (de)
JP (1) JP2001520396A (de)
AT (1) ATE248851T1 (de)
AU (1) AU9526098A (de)
CA (1) CA2306631A1 (de)
DE (1) DE69817850T2 (de)
IL (1) IL135672A0 (de)
WO (1) WO1999020640A2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008046707A1 (de) * 2008-09-11 2010-03-18 Universität Bielefeld Vollständig vernetzte chemisch strukturierte Monoschichten

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6503711B1 (en) * 1997-06-18 2003-01-07 Ulrich J. Krull Nucleic acid biosensor diagnostics
US6979728B2 (en) 1998-05-04 2005-12-27 Baylor College Of Medicine Articles of manufacture and methods for array based analysis of biological molecules
CA2271179A1 (en) * 1999-05-05 2000-11-05 Sensorchem International Corporation Process for monitoring and detecting small molecule - biomolecule interactions
JP2001149060A (ja) * 1999-11-29 2001-06-05 Nisshinbo Ind Inc 核酸固定化基板
EP1130120A3 (de) * 2000-01-26 2004-02-04 Nisshinbo Industries, Inc. Methode zum Trennen und Sammeln von Nukleinsäuren
EP1276702A2 (de) * 2000-03-31 2003-01-22 Genentech, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur detektion und quantifizierung von genexpression
CA2302827A1 (en) 2000-04-12 2001-10-12 Michelle Furtado Oligonucleotide and dna de-hybridization on surfaces
AU2001294777A1 (en) * 2000-09-28 2002-04-08 Matrix Technologies Corporation Improved support for solid phase hybridization assays
US6528264B1 (en) * 2000-11-01 2003-03-04 Corning Incorporated Polymer support for DNA immobilization
US20020137074A1 (en) * 2000-11-21 2002-09-26 Piunno Paul A.E. Selectivity of nucleic acid diagnostic and microarray technologies by control of interfacial nucleic acid film chemistry
FR2818662B1 (fr) * 2000-12-22 2003-09-19 Commissariat Energie Atomique Procede d'immobilisation de sondes, en particulier pour realiser des puces biologiques
US6632536B2 (en) * 2000-12-28 2003-10-14 International Business Machines Corporation Self-assembled monolayer etch barrier for indium-tin-oxide useful in manufacturing thin film transistor-liquid crystal displays
EP1223149A1 (de) * 2001-01-10 2002-07-17 Corning Incorporated Silsesquioxan beschichtete Substrate zur Imobilisierung von Biomolekülen
AU2002231934A1 (en) † 2001-01-30 2002-08-12 Solexa Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US6764768B2 (en) * 2001-02-28 2004-07-20 Arch Development Corporation Controlled release composition
US6660338B1 (en) * 2001-03-08 2003-12-09 Agilent Technologies, Inc. Functionalization of substrate surfaces with silane mixtures
US20020168667A1 (en) * 2001-03-23 2002-11-14 Fuji Photo Film Co., Ltd. Antigen detecting agent and antigen detecting kit, antigen detecting apparatus and antigen detecting method using the same
US7077982B2 (en) * 2001-03-23 2006-07-18 Fuji Photo Film Co., Ltd. Molecular electric wire, molecular electric wire circuit using the same and process for producing the molecular electric wire circuit
US20020168291A1 (en) * 2001-03-23 2002-11-14 Fuji Photo Film Co., Ltd. Agent for health inspection and health inspection apparatus using the same
US20030003476A1 (en) * 2001-03-23 2003-01-02 Fuji Photo Film Co., Ltd. Waste water inspecting agent and waste water inspecting apparatus using the same
US20040171808A1 (en) * 2001-05-30 2004-09-02 Kazunori Kataoka Method of bonding substance to be incorporated into polymer terminal
US6869532B2 (en) * 2001-06-04 2005-03-22 Cuno Incorporated Nucleic acid binding matrix
KR100438320B1 (ko) * 2001-08-30 2004-07-01 제네티카 주식회사 친핵성 그룹 표면을 갖는 기질상에 직접 고밀도의아민기를 함유하는 분자층의 형성방법
KR20030038932A (ko) * 2001-11-09 2003-05-17 바이오인포메틱스 주식회사 회전코팅법을 이용한 고체표면기질 상의 균일한 고분자층형성방법
US20030148284A1 (en) * 2001-12-17 2003-08-07 Vision Todd J. Solid phase detection of nucleic acid molecules
KR100450191B1 (ko) * 2001-12-28 2004-10-02 삼성에스디아이 주식회사 생체물질 고정용 기판 및 이의 제조방법
KR20030057219A (ko) * 2001-12-28 2003-07-04 삼성에스디아이 주식회사 기질에 중간층을 형성시키는 화합물, 이를 포함하는중간층 형성용 조성물 및 이를 이용한 바이오칩
KR100450202B1 (ko) * 2002-01-07 2004-09-24 삼성에스디아이 주식회사 생체물질 고정용 관능기의 패턴 형성 방법
KR100869784B1 (ko) * 2002-01-08 2008-11-21 삼성에스디아이 주식회사 생체물질 고정용 발색 화합물 및 이를 이용한 생체물질고정용 코팅막 제조방법
US20030179381A1 (en) * 2002-03-18 2003-09-25 Fuji Photo Film Co., Ltd. Sensor, color sensor and apparatus for inspection using the same
US7217512B2 (en) * 2002-05-09 2007-05-15 Corning Incorporated Reagent and method for attaching target molecules to a surface
US20040005614A1 (en) * 2002-05-17 2004-01-08 Nurith Kurn Methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
DE10232139A1 (de) * 2002-07-04 2004-01-22 Technische Universität Dresden Mit Nukleinsäuren und Nukleinsäurederivaten beschichteter metallischer Gegenstand, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung
DE10329928A1 (de) * 2002-07-12 2004-02-05 Benq Corp., Kweishan Verfahren zur Aufbereitung von Biochips und Biochip
JP2004101516A (ja) * 2002-07-19 2004-04-02 Canon Inc プローブ担体およびその製造方法
KR100475126B1 (ko) * 2002-08-22 2005-03-10 (주)누리셀 바이오칩 기판의 제조 공정
US20040076961A1 (en) * 2002-10-21 2004-04-22 Lewis Mark A. Biomolecule retaining material and methods for attaching biomolecules to a surface
US7195908B2 (en) * 2002-10-31 2007-03-27 Corning Incorporated Supports treated with triamine for immobilizing biomolecules
US20090093375A1 (en) * 2003-01-30 2009-04-09 Stephen Arnold DNA or RNA detection and/or quantification using spectroscopic shifts or two or more optical cavities
EP1452868A2 (de) 2003-02-27 2004-09-01 Pepscan Systems B.V. Verfahren zur Selektion eines potenziellen Arzneimittels
US20050208538A1 (en) 2003-12-29 2005-09-22 Nurith Kurn Methods for analysis of nucleic acid methylation status and methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
GB0410448D0 (en) * 2004-05-11 2004-06-16 Hammersmith Imanet Ltd Purification methods
US20060121501A1 (en) * 2004-10-22 2006-06-08 Stanislaw Burzynski Method for immobilizing molecular probes to a semiconductor oxide surface
GB2420849B (en) * 2004-12-02 2007-06-27 Schlumberger Holdings Optical pH sensor
US7456309B2 (en) * 2004-12-16 2008-11-25 Council Of Scientific And Industrial Research Reusable universal polymer support for repetitive oligonucleotide synthesis
US20060147943A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Lewis Mark A Substrates having pendant epoxide groups for binding biomolecules and methods of making and using thereof
KR100682919B1 (ko) 2005-01-20 2007-02-15 삼성전자주식회사 미세 금속 박막 패턴 형성 방법, 이를 채용한 생체물질고정용 기판 및 바이오칩
US7416883B2 (en) * 2005-05-24 2008-08-26 Steris Inc. Biological indicator
US20100022403A1 (en) * 2006-06-30 2010-01-28 Nurith Kurn Methods for fragmentation and labeling of nucleic acids
JP4805283B2 (ja) * 2007-03-22 2011-11-02 信越化学工業株式会社 マイクロアレイ作製用基板の製造方法
US7794837B2 (en) * 2007-08-06 2010-09-14 The United States of America as represented by the Secretary of Commerce, the National Institute of Standards and Technology Covalently immobilized fluorinated carboxylic acid stationary phase for liquid chromatography
JP5365005B2 (ja) * 2008-01-17 2013-12-11 富士通株式会社 中性で切断可能な核酸合成用レジン
US8058005B2 (en) 2008-10-23 2011-11-15 Honeywell International Inc. Method for single nucleotide polymorphism and mutation detection using real time polymerase chain reaction microarray
US20120222312A1 (en) * 2011-03-03 2012-09-06 Beata Bordas Adjustable peeler
US9206418B2 (en) 2011-10-19 2015-12-08 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
US20130165350A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-27 Affymetrix, Inc. Surface linkers for array synthesis
SG11201404243WA (en) 2012-01-26 2014-08-28 Nugen Technologies Inc Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
CA2877094A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
US9822408B2 (en) 2013-03-15 2017-11-21 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
US10024851B2 (en) * 2013-10-15 2018-07-17 International Business Machines Corporation Use of disulfide bonds to form a reversible and reusable coating for nanofluidic devices
CN105849264B (zh) 2013-11-13 2019-09-27 纽亘技术公司 用于鉴别重复测序读数的组合物和方法
WO2015131107A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
JP6273315B2 (ja) * 2016-05-16 2018-01-31 インテル コーポレイション 選択的表面固定化部位を有するナノギャップ・トランスデューサ
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
EP3962917A1 (de) * 2019-04-30 2022-03-09 Momentive Performance Materials Inc. Verfahren zur herstellung von alkoxysilylhaltigen thiocarbonsäureestern

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8200442L (sv) * 1982-01-27 1983-07-28 Forsvarets Forsknings Forfarande vid detektion av organiska molekyler, sasom biomolekyler

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008046707A1 (de) * 2008-09-11 2010-03-18 Universität Bielefeld Vollständig vernetzte chemisch strukturierte Monoschichten

Also Published As

Publication number Publication date
US6169194B1 (en) 2001-01-02
AU9526098A (en) 1999-05-10
JP2001520396A (ja) 2001-10-30
ATE248851T1 (de) 2003-09-15
EP1023309A2 (de) 2000-08-02
WO1999020640A2 (en) 1999-04-29
WO1999020640A3 (en) 1999-09-16
DE69817850D1 (de) 2003-10-09
US6159695A (en) 2000-12-12
EP1023309B1 (de) 2003-09-03
IL135672A0 (en) 2001-05-20
CA2306631A1 (en) 1999-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69817850T2 (de) Kovalente immobilisierung mit hoher oberflächendichte von oligonukleotid-monoschichten
DE69531667T2 (de) Festphasen, spezifisch für biologische reaktionen, ihre herstellung und anwendung
EP1461619B1 (de) Verbesserte strukturiert-funktionale bindematrices für biomoleküle
DE60123480T2 (de) Behandlung von hydrophoben oder hydrophilen oberflächen mit polymeren
DE60029561T2 (de) Immobilisierung von molekülen auf oberflächen über polymerbürsten
Shen et al. Molecularly imprinted polymers for clean water: analysis and purification
US20060286682A1 (en) Surface treatment
EP0561239A1 (de) Optischer Festphasenbiosensor auf Basis fluoreszenzfarbstoffmarkierter polyionischer Schichten
EP1831690A1 (de) Dreidimensionale nano- und mikrostrukturierte träger
DE60225593T2 (de) Immobilisierung von bindungsstoffen
DE60105828T2 (de) Verfahren zur erhaltung einer oberflächenaktivierung eines festen trägers zur bildung von biochips mikroanordnungen
EP2252410B1 (de) Oberflächenmodifikation
DE60207080T2 (de) Verfahren zur funktionalisierung von festen trägern
EP0664452B1 (de) Biotinsilan-Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende Bindematrix
DE102004003595A1 (de) Substrat zur Immobilisierung von physiologischem Material und Verfahren zu dessen Herstellung
DE19736736A1 (de) Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen mit definierten Molekülschichten
DE60033648T2 (de) Auf einer Oberfläche befestigte polyfunktionelle Polymernetzwerke für Sensorchips
DE69637317T2 (de) Molekulare ausrichtung von makromolekuelen mit hilfe eines fluessigkeitsmeniskus auf einer hochspezifischen oberflaeche
DE102008014298A1 (de) Hochgeordnete Nanostruktur und Sensor und deren Verwendung
US7456028B2 (en) Electrochemical method for detecting water born pathogens
DE102004010430A1 (de) Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Biomolekülen an organischen Oberflächen
DE60222430T2 (de) Biochip und verfahren zu seiner herstellung
WO2004017071A2 (de) Verfahren zum verbinden von oberflächen, halbleiter mit verbundenen oberflächen sowie bio-chip und bio-sensor
WO2004099430A2 (de) Substrat als träger von ligaten
WO2001079533A2 (de) Verfahren zur immobilisierung eines analyten an einer festen oberfläche

Legal Events

Date Code Title Description
8339 Ceased/non-payment of the annual fee