DE60222430T2

DE60222430T2 - Biochip und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE60222430T2
Application number: DE60222430T
Authority: DE
Inventors: Jean-Rene Martin; Michel Garrigues; Jean-Paul Chauvet; Marlène BRAS; Francois Bessueille; Eliane Souteyrand; Michel Cabrera; Jean-Pierre Cloarec
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Centrale de Lyon
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Centrale de Lyon
Priority date: 2001-07-11
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2022-07-06
Also published as: WO2003008975A3; EP1412753B1; DE60222430D1; US7700348B2; WO2003008975A2; CA2453103C; CA2453103A1; JP2004535585A; JP4215636B2; EP1412753A2; AU2002329331A1; FR2827386B1; FR2827386A1; US20040248122A1; ATE373237T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biochip eines Typs, der den Nachweis von biologischen oder biochemischen Sonden durch Fluoreszenz ermöglicht, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Biochips sind sehr leistungsfähige Analysewerkzeuge auf molekularbiologischen Gebieten. Die Technologie für ihre Herstellung wird gerade Schritt für Schritt etabliert. Ihre Verwendung wird eine schnellere Forschung ermöglichen und insbesondere zu neuen diagnostischen Methoden führen.
Ein Biochip ist eine Anordnung von Erkennungssystemen für biologische Substanzen, wie biologische Moleküle, die parallel arbeiten. Unter den Biochips sind DNA-Chips zurzeit am besten entwickelt, und in der Molekulargenetik ruhen große Hoffnungen auf ihnen, dass sie zu einer Vervielfachung der Erkennungsleistung führen.
Physikalisch sind Biochips Strukturen, die aus einem festen Träger bestehen, auf dem distinkte, im Allgemeinen mikroskopisch dimensionierte Zonen verteilt sind, die identische biologische Erkennungssondensubstanzen tragen, wobei jede Zone oder Stelle nur einen Substanztyp umfasst, der biologischen oder biochemischen Ursprungs sein kann. Die Erkennung erfolgt durch eine spezifische Affinitätsinteraktion zwischen der auf dem Träger gebundenen Sondensubstanz und der in der zu analysierenden Lösung enthaltenen Ziel- oder Targetsubstanz. Das Auslesen des Biochips erfolgt durch die Markierung der Zielsubstanz mit einem im Allgemeinen fluoreszierenden Marker. Bei der Erkennung bringt die Zielsubstanz ihren Marker zu der Zone, die die Sondensubstanz trägt. Die Kenntnis der Art der Sonde ermöglicht es, die Zielsubstanz, mit der die Affinitätsinteraktion erfolgt, zu erkennen.
Die Erfindung zielt einerseits darauf ab, die technische Qualität des Biochips zu verbessern, und andererseits, die Qualität des Auslesens mittels Fluoreszenz zu verbessern.
Die Bindung von Molekülen, wie Oligonukleotiden oder DNA-Strängen, auf dem Träger zur Herstellung des Biochips beruht auf chemischen Reaktionen, die an der Oberfläche des Feststoffs stattfinden. Meistens befindet sich das zu bindende biologische Sondenmolekül in Lösung. Abhängig von den relativen Oberfächeneigenschaften zwischen dem Träger und der Lösung, die die zu bindenden Sonden enthält, kann die abgeschiedene Lösung dazu neigen, sich über das Substrat zu verteilen, was es unmöglich macht, Zonen von Interesse mit kontrollierter Größe und kleiner Dimension zu erhalten.
In gleicher Weise kann die lokalisierte direkte Synthese von biologischen Molekülen, wie von Oligonukleotiden, durch lokalisierte Abscheidung eines Teils der Reagenzien und insbesondere von Phosphoramiditen auf der Oberfläche des Substrats erfolgen. Diese diversen Reagenzien liegen gewöhnlich in Lösung in einem Lösungsmittel wie Acetonitril vor. Dieses Lösungsmittel hat die Eigenschaft, sehr benetzend zu sein, was ohne die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen dazu führt, dass sich die Reagenzien auf der Oberfläche verteilen. Diese Eigenschaften verhindern daher eine Eingrenzung der Synthesefläche und somit die geometrische Definition der Zonen von Interesse.
Auf der anderen Seite erfolgt die Analyse, indem man den Biochip mit einer Lösung in Kontakt bringt, die die Zielmoleküle enthält, die vor oder nach dem Kontakt mit einer fluoreszierenden Gruppe (oder gegebenenfalls radioaktiv) markiert werden. Die Erkennung beruht auf einer relativ starken Kupplung zwischen der Sonde und dem Analyten (beispielsweise durch Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen). Der Analyt wird auf diese Weise an der Erkennungsfläche gebunden und lässt sich mit Kenntnis der gekuppelten, auf dieser Fläche oder Stelle immobilisierten Sonde identifizieren.
Neben dieser spezifischen Erkennung können die Zielmoleküle abhängig von der Art des Trägers auch nichtselektiv an diesen binden (meistens durch einen Adsorptionsprozess). Dieses störende Phänomen führt dazu, dass das Signal/Rausch-Verhältnis beim Auslesen kleiner wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Lösung für diese Probleme zu finden, um die biologische Qualität des Chips durch Arbeiten an seiner optischen Qualität zu verbessern.
Gemäß einer vorteilhaften Variante lässt sich durch die Verbesserung der physikalisch-chemischen Qualität des Chips durch doppelte lokalisierte Funktionalisierung eine bessere geometrische Definition der Stellen erreichen, die die biologischen Sondenmoleküle tragen, wobei gleichzeitig sichergestellt wird, dass die Stellen eine identische Größe haben und ausgerichtet sind und eine nichtselektive Adsorption der Target-Biomoleküle deutlich verringert wird.
Die Erfindung betrifft also einen Biochip gemäß Anspruch 1, der ein Substrat umfasst, das eine reflektierende Hauptoberfläche zeigt.
Unter optischer Dicke wird das Produkt aus effektiver physikalischer Dicke und Brechungsindex der transparenten Schicht verstanden. λ' bedeutet eine Wellenlänge zwischen λ₀ und λ₁, wobei λ₀ eine Wellenlänge bedeutet, bei der Fluoreszenz angeregt wird, und λ₁ eine Wellenlänge bedeutet, bei der Fluoreszenz emittiert wird.
Der Biochip kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Hauptoberfläche Stellen aufweist, die durch eine transparente Schicht mit einer optischen Dicke von (2k + 1)λ₁/4 zur Fluoreszenzdetektion empfindlich gemacht sind, wobei k eine ganze positive Zahl oder null ist, wodurch die Fluoreszenzemission begünstigt wird.
Vorzugsweise ist die Hauptoberfläche außerhalb der empfindlichen Stellen mit einer transparenten Schicht mit einer optischen Dicke von mλ₀/2 bedeckt, wodurch sich eine Fluoreszenzanregung verhindern lässt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform, bei der eine lokalisierte Silanisierung angewandt wird, ist der Biochip dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Substrats außerhalb der empfindlichen Stellen mit einer Dünnschicht, insbesondere einer Molekülmonoschicht aus einer ersten Substanz A, bedeckt ist, die eine Kohlenwasserstoffkette vom Typ (CH₂)p mit 1 < p < 30 umfasst, die an einem Ende eine Gruppe wie ein Silan oder ein Silanol trägt, die die Bildung einer kovalenten Bindung erlaubt, und am anderen Ende eine stabile und inerte chemische Funktion, beispielsweise CH₃, oder halogenierte Derivate davon. Diese erste Substanz ist hydrophob.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Biochip dadurch gekennzeichnet, dass die empfindlichen Stellen mit einer zweiten Dünnschicht, insbesondere einer Molekülmonoschicht aus einer zweiten Substanz B, bedeckt sind, die an einem Ende eine Gruppe aufweist, die eine Bindung an das Substrat mittels kovalenter Bindung erlaubt, beispielsweise eine Silan- oder Silanolfunktion, und am anderen Ende eine Gruppe, die zur kovalenten Bindung eines Sondenmoleküls in der Lage ist, beispielsweise die Säurefunktion COOH oder die Alkoholfunktion OH.
Diese zweite Substanz ist hydrophil.
Der Biochip kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Oberfläche des Substrats mit einer Schicht aus der Substanz B bedeckt ist, und dadurch, dass diese Schicht außerhalb der empfindlichen Stellen mit einer Blockierschicht C bedeckt ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten Biochips, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

a) Abscheiden einer transparenten Schicht mit einer optischen Dicke von mλ'/2 auf einem Siliciumsubstrat;
b) Erzeugen von Vertiefungen oder Blöcken in der transparenten Schicht, bei denen die optische Dicke der transparenten Schicht (2k + 1)λ/4 beträgt, zur Bildung der empfindlichen Stellen.

Entsprechend den Werten k und m ist es möglich, empfindliche Stellen in Form von Vertiefungen oder von Blöcken zu erzeugen.
Falls die empfindlichen Zonen Vertiefungen sind, kann das Verfahren durch die folgenden Schritte gekennzeichnet sein:

c) doppelte lokalisierte Silanisierung durch selektives Abscheiden der ersten Dünnschicht, wobei dem Abscheiden gegebenenfalls eine Wärmebehandlung folgt;
d) Eintauchen des Substrats in eine Lösung, die die zweite Substanz B enthält.

Falls die empfindlichen Zonen Blöcke sind, ist das Verfahren durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:

c') doppelte lokalisierte Silanisierung durch selektives Abscheiden der Substanz B auf den Blöcken, wobei dem Abscheiden gegebenenfalls eine Wärmebehandlung folgt;
d') Eintauchen des Trägers in eine Lösung, die die Substanz A enthält.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt die doppelte lokalisierte Silanisierung (nach b) wie folgt:

e) Eine Schicht aus Substanz B wird auf der gesamten Oberfläche des Substrats abgeschieden, beispielsweise durch Eintauchen in eine Lösung, die Substanz B enthält. Die Funktion, mit der die Sondensubstanz gebunden werden soll, wird dann entschützt und aktiviert.
f) Eine Molekülmonoschicht aus einer Blockiersubstanz C wird dann lokal derart auf der Oberfläche abgeschieden, dass die empfindlichen Zonen frei bleiben. Die Moleküle der Substanz C tragen an einem Ende eine Funktion, die mit der aktivierten Funktion von Substanz B reagiert. Das andere Ende des Moleküls trägt eine chemisch sehr inerte Gruppe, wie eine Methylgruppe oder auch eine mit Fluor substituierte Methylgruppe. So sind nur die aktivierten empfindlichen Zonen in der Lage, Sondensubstanzen zu binden, während die Oberfläche außerhalb der empfindlichen Zonen gegenüber einer Bindung biologischer Substanzen zweifelsfrei inert ist.

Zwischen den funktionellen Gruppen des Moleküls der Substanz C kann es eine organische Kette geben, wie eine aliphatische Kette vom Typ (CH₂)q, wobei 0 < q < 30.
Es ist wichtig festzuhalten, dass die Funktionalisierungsschichten Dicken in einer Größenordnung von 1 bis 10 nm haben und daher eine optische Dicke aufweisen, die gegenüber der transparenten Schicht vernachlässigbar ist, und daher für die optischen Eigenschaften des Biochips keine unmittelbare Rolle spielen.
Gegebenenfalls kann auf die Schritte c und/oder d und/oder e und/oder f eine Wärmebehandlung folgen, die die Silanisierung erleichtert.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den anhängenden Zeichnungen deutlicher, wobei die 1a bis 1e eine erste Ausführungsform des Herstellungsverfahrens zeigen. Eine bevorzugte Ausführungsform ist in den 1a bis 1d und 2a bis 2c gezeigt. Eine Variante ist in 3 dargestellt.
Das US-Patent 6,008,892 beschreibt eine Struktur, die aus den optischen Eigenschaften dünner Platten Vorteile zieht: Wenn eine transparente Schicht, deren optische Dicke ein Viertel der Wellenlänge oder ein ungerades Vielfaches eines Viertels der Wellenlänge beträgt, auf einem reflektierenden (oder teilweise reflektierenden) Substrat liegt, ist die Lichtemission einer fluoreszierenden Quelle, die bei dieser Wellenlänge emittiert, maximal. Bei diesem Verfahren wird die gesamte Oberfläche des Substrats gleichmäßig behandelt, um die Fluoreszenzemission zu steigern. Die störende Fluoreszenz als Folge von außerhalb der empfindlichen Zonen adsorbierten biologischen Substanzen steigt daher in gleicher Weise wie die von Substanzen in den empfindlichen Zonen, weshalb keine Verbesserung im Signal/Rausch-Verhältnis zwischen den empfindlichen Zonen und den unempfindlichen Zonen erzielt wird.
Die vorliegende Erfindung beseitigt diesen Nachteil durch Strukturierung der Dicke der transparenten Schicht des Substrats, was es ermöglicht, die Fluoreszenz der empfindlichen Zonen zu steigern und im Gegenzug die Fluoreszenz außerhalb der empfindlichen Zonen zu unterdrücken.
Die optimierte Struktur wird erfindungsgemäß ausgehend von einer Schicht 10 mit einer optischen Dicke von λ/2 (oder allgemeiner mλ/2) hergestellt, die aus einem auf der Oberfläche 6 eines Substrats 1 abgeschiedenen transparenten Material hergestellt ist, das bei der Auslesewellenlänge reflektiert, beispielsweise einer Schicht 10 aus Silicium oder Siliciumnitrid auf einem Siliciumsubstrat oder einer Metalloxidschicht auf einem Metallsubstrat, beispielsweise TiO₂ auf Titan, ZrO₂ auf Zirkonium usw. (1a). Auf dieser Schicht 10 wird ein Film 2 aus fotoempfindlichem Harz abgeschieden (1b). Das Harz wird durch eine Maske 3 belichtet, wodurch in dem Harz 2 nach Entwicklung Aperturen 4 geöffnet werden können, die zur Bildung empfindlicher Stellen auf dem Chip dienen sollen (1c). Dann wird zur Bildung der Vertiefungen 5, die die empfindlichen Stellen des Chips darstellen, chemisch geätzt, so dass eine optische Dicke des Films erzielt wird, die in den begrenzten Zonen gleich (2k + 1)λ/4 (1d) ist.
Vorzugsweise wird die Fluoreszenzemission durch die empfindlichen Stellen gefördert, indem man eine transparente Schicht mit einer optischen Dicke von (2k + 1)λ₁/4 wählt. Die Unterdrückung der Fluoreszenzanregung außerhalb der empfindlichen Stellen wird vorzugsweise verbessert, indem man eine transparente Schicht mit einer optischen Dicke von mλ₀/2 wählt.
Nach Entfernen von Harz 2 kann in den Vertiefungen 5 vorteilhaft ein Film aus einem Silan 15 abgeschieden werden, das am Ende eine funktionelle Gruppe trägt, die in der Lage ist, das biologische Molekül zu immobilisieren (1e). Die Struktur wird dann erhöhter Temperatur ausgesetzt, um die Silanisierungsreaktion zu fördern. Die Dicke dieser Dünnschicht (im Allgemeinen monomolekular) ändert die optischen Eigenschaften der Struktur nicht signifikant.
Anschließend werden die biologischen Sondenmoleküle ex situ oder in situ an den unterschiedlichen empfindlichen Stellen gebunden. Die freie obere Oberfläche der Schicht wird schließlich einer Behandlung unterzogen, in deren Folge die aktiven funktionellen Gruppen, die während der vorhergehenden Phase nicht reagiert haben, neutralisiert werden. Wenn beispielsweise durch Überlaufen der Abscheideflüssigkeit trotzdem Moleküle außerhalb der Kontaktstellen binden, ist das Fluoreszenzsignal außerhalb der Erkennungsflächen um einen Faktor von etwa 200 schwächer als das Signal, das vom Inneren der Kontaktfläche stammt, und hat auf das Auslesen in den meisten Fällen keinen Einfluss.
Der Unterschied in der optischen Weglänge zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Vertiefungen verbessert daher das Signal-Rausch-Verhältnis beim Auslesen der Fluoreszenz, indem eine Minimierung des Fluoreszenzsignals außerhalb der Vertiefungen ermöglicht und das Fluoreszenzsignal in den Vertiefungen optimiert wird.
Eine Verbesserung des Biochips lässt sich erhalten, indem man gleichzeitig die optische Qualität und die physikalisch-chemische Qualität des Substrats verbessert.
Das Substrat wird mikromaschinell durch chemisches Ätzen bearbeitet, um so wie oben beschrieben die empfindlichen Stellen in der Schicht zu erzeugen (1a bis 1d). Dann erfolgt eine Transferoperation.
Nach dem chemischen Ätzen und dem anschließenden Entfernen des Harzes (1d) wird der Chip mit einer Transferoberfläche 30 in Kontakt gebracht, auf der eine feine Schicht 21 eines Lösungsmittels abgeschieden ist, die eine Substanz vom Typ A, beispielsweise ein hydrophobes Silan, enthält (2a). Auf diese Weise wird das Silan zur Bildung einer Dünnschicht 22 auf die obere Oberfläche des Chips transferiert (2b). Das Abscheiden des Silans kann auch mit einer Farbauftragsvorrichtung unter Verwendung der das Silan enthaltenden Lösung erfolgen. Eine Wärmebehandlung fördert die Silanisierungsreaktion auf der Chipoberfläche. Ein zweiter Silanisierungsschritt, beispielsweise durch Eintauchen des Chips in eine Lösung, die das zweite Silan enthält, ermöglicht die Silanisierung des Bodens der anfänglich bloßen Vertiefungen mit einer Dünnschicht 23 (das zweite Silan bindet nicht an das erste) (2c). Das spezielle zweite Silan trägt an seinem freien Ende eine an sich bekannte funktionelle Gruppe, die entweder eine kovalente Bindung mit der biologischen Substanz zur Immobilisierung dieser biologischen Substanz erlaubt, oder den Start einer in situ-Synthese des biologischen Sondenmoleküls: diese Startreaktion entspricht ebenfalls der Etablierung einer kovalenten Bindung.
Die Dicke der Dünnschichten 22 und 23 (höchstens ein paar Molekülschichten) reicht nicht aus, um die optischen Eigenschaften der Oberfläche signifikant zu modifizieren, die so die durch die beiden Methoden vermittelten Selektivitätseigenschaften vereint.
Das Verfahren nutzt daher ein physikalisch-chemisches Rückhaltevermögen. Es besteht darin, die gewünschten Zonen, die die Sonden mit hydrophilem Charakter aufnehmen sollen, zu begrenzen, indem durch Mikrotransfer lokal die Moleküle abgeschieden werden, die im Bereich zwischen den empfindlichen Stellen eine hydrophobe Monoschicht bilden sollen. Das Innere der empfindlichen Stellen wird dann mit einem Silan silanisiert, das die Immobilisierung vorsynthetisierter Sonden oder die in situ-Synthese biochemischer Moleküle erlaubt. Mikrotransfer der hydrophoben Monoschicht erfolgt mittels einer Transferoberfläche 30, die eben sein kann oder auch aus einem Mikrostempel bestehen kann, bei dem die Transferregionen erhaben sind.
Die Transferoberfläche 30 wird mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die das hydrophobe Silan enthält. Ein feiner Lösungsfilm 22 wird dann durch Kontakt auf begrenzte Positionen der Schicht 10 von Substrat 1 transferiert. Das Substrat 1 wird dann auf eine Temperatur von etwa 100 °C gebracht, um die Silanisierungsreaktion zu erleichtern. Mit Hilfe eines speziellen Protokolls und durch die Wahl eines geeigneten Moleküls ist es möglich, eine organisierte und kompakte Monoschicht zu erhalten (SAM für Self Assembled Monolayer). Zonen, die kein Silan erhalten haben, werden dann so behandelt, dass sie mit einem weiteren Silan bedeckt werden, das an seinem freien Ende eine funktionelle Gruppe besitzt, die die in situ-Synthese von Oligonukleotiden ermöglicht (beispielsweise eine Hydroxygruppe), oder die die Immobilisierung von vorsynthetisierten biologischen Molekülen oder Molekülen biologischen Ursprungs über eine geeignete funktionelle Gruppe (beispielsweise eine Säure) ermöglicht. Die Pfropfreaktion des zweiten Silans findet an den Silanolgruppen der Kieselsäure oder des Glases statt, die das Substrat bilden, sie kann aber nicht auf der Monoschicht des fixierten ersten Silans stattfinden. So werden nur die Zonen funktionalisiert, die als empfindliche Stellen dienen sollen.
Außerdem begrenzt das hydrophobe Silan die nichtselektive Adsorption sehr stark und verbessert dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis des Auslesens durch Fluoreszenz (oder gegebenenfalls radioaktive Markierung) höchst signifikant, indem es nämlich das Verhältnis von echtem Signal in Zonen, die die biologischen Sonden tragen, zu Signal, das möglicherweise von freien Zonen stammt, auf denen eine nichtselektive Adsorption erfolgt sein könnte, erhöht.
Allgemein ist es möglich, die gleiche Funktion mit anderen Substanzen als Silan zu erreichen.
Tatsächlich ist es möglich, auf dem oberer Teil des Trägers außerhalb der empfindlichen Stellen eine physikalisch und chemisch inerte Schicht abzuscheiden, die die Adsorption und die Bindung von Sondenbiomolekülen bei der Herstellung der Biochips und die Adsorption oder die Bindung der Target-Biomoleküle bei der biologischen Analyse einschränkt, was das Signal/Rausch-Verhältnis bei der Messung verbessert.
Diese inerte Schicht besteht aus einem Molekül, das eine Kohlenwasserstoffkette des Typs (CH2)p mit 1 < p < 30 oder eine Polymerkette umfasst, beispielsweise Polyethylenglykol usw. oder ein Aggregat aus verschiedenen Kettenteilen, das an einem Ende eine Gruppe trägt, die die Bildung einer kovalenten Bindung mit dem Substrat erlaubt, beispielsweise eine Silan- oder ein Silanolbindung, wobei das andere Ende eine stabile und inerte chemische Funktion wie CH₃, trägt, oder halogenierte Derivate davon, bei denen alle oder ein Teil der Wasserstoffe der aliphatischen Kette (CH₂)p und von CH₃ substituiert sind. Die gebildete Schicht kann abhängig von der Art der ersten terminalen Gruppe monomolekular oder polymer sein. Das Abscheiden der Schicht kann vorteilhaft durch Kontakt mit einer ebenen Oberfläche erfolgen, die zuvor mit einer Lösung dieses Moleküls bedeckt wurde.
Danach sollte auf den empfindlichen Stellen eine Monoschicht von Molekülen abgeschieden werden, die an jedem ihrer Enden eine andere Funktionalität aufweisen: Die eine erlaubt durch kovalente Bindung eine Bindung an das Substrat, wie die Silanolfunktion, und die andere erlaubt es, das Sondenbiomolekül kovalent zu binden, beispielsweise die Säurefunktion COOH oder die Alkoholfunktion OH. Diese Monoschicht erlaubt es dann, vorsynthetisierte Biomoleküle oder Biomoleküle natürlichen Ursprungs zu immobilisieren, oder auch Sondenbiomoleküle (Oligonukleotide, PNA, Proteine usw.) in den Vertiefungen in situ zu synthetisieren.
Ein weiteres Verfahren wird in Verbindung mit 3 beschrieben.
Die Oberfläche des Substrats wird mit einer Schicht 30 aus Substanz B bedeckt, und dann wird eine Schicht 31 aus Blockiersubstanz C lokal außerhalb der empfindlichen Stellen, hier der Vertiefungen 5, abgeschieden.
Vorzugsweise wird die Detektionseffizienz der empfindlichen Stellen dadurch erreicht, dass man zwei Methoden verwendet, die ergänzende Wirkungen haben: die physikalische Wirkung, die mit dem Höhenunterschied zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Stellen zusammenhängt, und die physikalisch-chemische Wirkung, die mit den Unterschieden in den Eigenschaften der Oberfläche zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Stellen zusammenhängt. Deswegen sind Geometrie und relative Position der mit einer mikrotechnologischen Methode erhaltenen empfindlichen Stellen vollkommen definiert. Dies trägt zur Qualität des Chips und zur besseren Auslesbarkeit bei.
Schließlich ermöglicht es die Kombination von zwei Methoden, der dreidimensionalen Strukturierung des Trägers und der Präparation der Oberfläche zur bevorzugten Bindung an den empfindlichen Stellen, beispielsweise durch doppelte Silanisierung, die Qualität des Chips zu verbessern und sein Auslesen zu optimieren, indem an vier Aspekten gearbeitet wird, die getrennt oder gemeinsam umgesetzt werden:

– Verbesserung der geometrischen Definition des Chips durch Maskierungs- oder Transfermethoden,
– Verringerung der Größe der empfindlichen Stellen durch kombinierte Wirkung des physikalisch-chemischen Rückhaltevermögens und der maschinellen Bearbeitung der Stellen,
– Verringerung der unspezifischen Adsorption in der Zone zwischen den Erkennungsflächen durch Abscheidung von beispielsweise einer Monoschicht aus hydrophobem Silan durch Mikrotransfer,
– Verbesserung der Qualität beim optischen Auslesen des Chips durch Optimierung der Dicke der transparenten Trägerschicht.

Claims

Biochip umfassend ein Substrat, das eine reflektierende Hauptoberfläche aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Hauptoberfläche (6) begrenzte Stellen (5) aufweist, dadurch, dass diese begrenzten Stellen (5) durch eine transparente Schicht mit einer optischen Dicke von (2k + 1)λ/4 zur Fluoreszenzdetektion empfindlich gemacht sind, wobei k eine ganze positive Zahl oder null ist und λ eine Wellenlänge bedeutet, die zwischen einer Wellenlänge λ₀ liegt, bei der Fluoreszenz angeregt wird, und einer Wellenlänge λ₁, bei der Fluoreszenz emittiert wird, und dadurch, dass die Hauptoberfläche (6) außerhalb der empfindlichen begrenzten Stellen (5) mit einer transparenten Schicht mit einer optischen Dicke von mλ'/2 bedeckt ist, wobei m eine ganze positive Zahl ist und λ' eine Wellenlänge zwischen λ₀ und λ₁ bedeutet.
Biochip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die transparente Schicht, die die zur Fluoreszenzdetektion empfindlich gemachten Stellen (5) bedeckt, eine optische Dicke von (2k + 1)λ₁/4 hat, wobei k eine ganze positive Zahl oder null ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hauptoberfläche (6) außerhalb der empfindlichen Stellen mit einer transparenten Schicht mit einer optischen Dicke von mλ₀/2 bedeckt ist.
Biochip nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (6) des Substrats (1) außerhalb der empfindlichen Stellen (5) mit einer Dünnschicht (22), insbesondere einer Molekülmonoschicht, aus einer ersten Substanz (A) bedeckt ist, umfassend eine Kohlenwasserstoffkette vom Typ (CH₂)p mit 1 < p < 30, die an einem Ende eine Ankergruppe wie ein Silan oder ein Silanol trägt, die die Bildung einer kovalenten Bindung mit dem Substrat erlaubt, und am anderen Ende eine stabile und inerte chemische Funktion, beispielsweise CH₃, und halogenierte Derivate davon.
Biochip nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Substanz (A) ein hydrophobes Silan ist.
Biochip nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die empfindlichen Stellen (5) mit einer Dünnschicht (23), insbesondere einer Molekülmonoschicht, aus einer zweiten Substanz (B) bedeckt sind, die an einem Ende eine Gruppe aufweist, die eine Bindung an das Substrat mittels kovalenter Bindung erlaubt, beispielsweise eine Silan- oder Silanolfunktion, und am anderen Ende eine Gruppe, die in der Lage ist, ein Sondenmolekül kovalent zu binden, beispielsweise eine Gruppe, die eine Säurefunktion COOH oder eine Alkoholfunktion OH aufweist.
Biochip nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Substanz (B) ein hydrophiles Silan ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Substrats mit einer Schicht aus der zweiten Substanz (B) bedeckt ist, die an einem Ende eine Gruppe aufweist, die eine Befestigung auf dem Substrat mittels kovalenter Bindung erlaubt, beispielsweise eine Silan- oder Silanolfunktion, und am anderen Ende eine Gruppe, die in der Lage ist, ein Sondenmolekül kovalent zu binden, und dadurch, dass die Schicht aus der zweiten Substanz (B) außerhalb der empfindlichen Stellen (5) mit einer Blockiersubstanz (C) bedeckt ist, die an einem Ende eine Funktion aufweist, die mit der aktivierten Gruppe der zweiten Substanz (B) reagiert, und am anderen Ende eine Gruppe, die sie für eine Bindung von biologischen Substanzen chemisch inert macht.
Verfahren zur Herstellung eines Biochips nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch: a) Abscheiden einer transparenten Schicht (10) mit einer optischen Dicke von mλ'/2 auf einem Substrat (1); b) Erzeugen von Vertiefungen oder Blöcken (5) in der transparenten Schicht zur Bildung der empfindlichen Stellen, bei denen die optische Dicke der transparenten Schicht (2k + 1)λ/4 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet dass die Erzeugung der Vertiefungen (5) umfasst: c) Abscheiden der ersten Dünnschicht (22) aus der ersten Substanz (A) durch selektiven Transfer; d) Eintauchen des Substrats in eine Lösung, die die zweite Substanz (B) enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass nach c) und/oder d) eine Wärmebehandlung folgt, die die Bildung einer kovalenten Bindung erleichtert.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es nach Schritt b) umfasst: e) Abscheiden auf der gesamten Oberfläche (6) von Substrat (1) einer Dünnschicht (30) aus der zweiten Substanz (B) und Aktivierung der zur Bindung der Sondenmoleküle vorgesehenen Funktion; f) Abscheiden einer Schicht (31) aus der Blockiersubstanz (C) außerhalb der empfindlichen Stellen (5).