JP2006234583A

JP2006234583A - 検出用基板

Info

Publication number: JP2006234583A
Application number: JP2005049770A
Authority: JP
Inventors: Yuichiro Yamaguchi; 雄一朗山口
Original assignee: Kyocera Corp
Current assignee: Kyocera Corp
Priority date: 2005-02-24
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2006-09-07
Also published as: WO2006090753A1

Abstract

【課題】基体から発せられるバックグラウンドの蛍光を遮断することが可能であるとともに蛍光強度を高めることが可能な、検出精度の高い検出用基板を提供すること。
【解決手段】基体１の上面に光反射膜２を形成するとともに、光反射膜２の上面に柱状の透光性部材３を複数分布させ、透光性部材３間に位置する光反射膜２上に撥水性部材４を形成し、透光性部材３の表面に検体固定化膜５を被着した。
【選択図】図１

Description

本発明はＤＮＡやＲＮＡなどの生物構成物質の配列を測定するための検出用基板に関し、より詳細には蛍光検出法による検出用基板からのバックグラウンドの蛍光を遮断すると共に、測定される生物構成物質に修飾された蛍光体からの蛍光の利得をより大きくする方法に関し、検出感度の向上と安定化を目的とする。

ＤＮＡマイクロアレーをはじめとする検出用基板は、ガラス基体上にアミノシラン、アミノアルキルシランまたはポリ−Ｌ−リジンなどの検体固定化膜を形成した上にオリゴヌクレオチドやｃＤＮＡ等の検体が被着されており、これに予め蛍光修飾した検体ＤＮＡを反応させ、その反応レベルにより変化する蛍光レベルを検出することによって核酸配列の分析が行なわれている。このため、ガラス基体から発せられるバックグラウンドの蛍光は分解能の低下の原因となる。特にＤＮＡマイクロアレーではスタンフォード大学方式については安価ではあるが検出精度がアフィメトリックス社（Affimetrix）タイプに比較して劣るため、検出精度向上のための感度向上が必要とされている。

この対策として、アミノシラン、アミノアルキルシランまたはポリ−Ｌ−リジンなどの検体固定化膜を形成した上にガラス基体から発せられる蛍光を減衰させるためのブロッキング材や消光材を被着したりすることが検討されている。

例えば、下記の特許文献１には、検出精度向上のために消光剤をコートすることが提案されており、また特許文献２には、図２に示すように、ガラス基体２１上に設けた光反射膜２２表面に金属と結合性の良い官能基を有する検体固定化膜２５を形成した検出用基板が提案されている。
特開2003−84002号公報特開2002−323498号公報

しかしながら、特許文献１に示されるような、消光剤やブロッキング剤をコートする方法は、消光剤やブロッキング剤が透光性の有機物質のため、バックグラウンドの蛍光を完全に除去できないという問題点を有していた。また、特許文献２に示されるような、光反射膜２２表面に金属と結合性の良い官能基を有する検体固定化膜２５を形成する方法は、光反射膜２２によりガラス基体２１の蛍光を遮断できるものの、ＡｕやＰｔ等の高価な貴金属を用いる必要があるとともに、検体固定化膜２５として金属と結合性のよい官能基を有する特殊な材料を用いる必要があり、比較的高価となることや、またＳやＳｅ等を含む毒性物質を用いることもあるため、取り扱いに注意を要するという問題点を有していた。

従って、本発明は上記問題点を鑑みて完成されたものであり、その目的は、基体から発せられるバックグラウンドの蛍光を遮断することが可能であるとともに蛍光強度を高めることが可能な、検出精度の高い検出用基板を提供することを目的とする。

本発明の検出用基板は、基体の上面に光反射膜を形成するとともに、該光反射膜の上面に柱状の透光性部材を複数分布させ、該透光性部材間に位置する前記光反射膜上に撥水性部材を形成し、前記透光性部材の表面に検体固定化膜を被着したことを特徴とする。

本発明の検出用基板において好ましくは、前記撥水性部材の上面が前記透光性部材の上端面よりも低いことを特徴とする。

本発明の検出用基板において好ましくは、前記光反射膜がＣｒまたはＴｉであることを特徴とする。

本発明の検出用基板は、基体の上面に光反射膜を形成するとともに、光反射膜の上面に柱状の透光性部材を複数分布させ、透光性部材間に位置する光反射膜上に撥水性部材を形成し、透光性部材の表面に検体固定化膜を被着したことから、検体ＤＮＡに修飾した蛍光体への励起光は光源からの光と光反射膜にて反射された光となるため、励起光の強度が増す。このため、蛍光体からの出射光量も増大するとともに、蛍光体からの出射光も光反射膜により反射されるため、受光測定子は蛍光体からの直接光と光反射膜からの反射光の双方を感受することができるようになり、検出精度が向上する。

また、光反射膜の上面に柱状の透光性部材を複数分布させるため、検出用基板の面積当たりの表面積が極めて大きくなる。この透光性部材の表面に検体固定化膜を被着させるため、検出基板表面に固定される検体量はきわめて多くなる。このため、検出用基板に固定された検体に反応する検体ＤＮＡ量もきわめて多くなって検体ＤＮＡに修飾した蛍光体の量が増大し、出射蛍光量も増大する。そのため、受光測定子の受光量が増大し検出精度が向上する。

さらに、透光性部材間には撥水性部材を形成しているために、検体を固定する際に検体溶液が毛管現象によって広がらないようにできる。このため、小さなスポットに多くの検体溶液を保持することができ、検体を効率よく透光性部材に固定してより多くの検体を保持し、蛍光量を増大することができる。

本発明の検出用基板は、前記撥水性部材の上面が前記透光性部材の上端面よりも低いことから、撥水性部材の上端面よりも高い位置の透光性部材の側面にも検体を固定できる。このため、検体と反応する蛍光修飾された検体ＤＮＡも効率よく高密度に固着されるため、受光測定子の受光量が増大して検出精度が向上する。

本発明の検出用基板は、光反射膜がＣｒまたはＴｉであることから、ＣｒやＴｉの表面に不動体化した酸化膜が存在するため、光反射膜の上面に柱状に形成された透光性部材の密着性や透光性部材間に位置する光反射膜上に形成された撥水性部材の密着性を高めることができる。このため、製造工程中における透光性部材や撥水性部材の脱落を有効に防止できる。

さらにＣｒやＴｉの不動体化した酸化膜は化学的に安定なため、種々の薬品や環境に曝されても腐食溶解しない。このため、検体の固定から検体ＤＮＡの測定までの生化学的プロセスにおける検出用基板の劣化を有効に防止できる。このため、生化学的プロセスの条件の変更にも多くの場合耐えられるため、適用範囲が広がる。

次に本発明の検出用基板を添付の図面に従って詳細に説明する。

図１は本発明の検出用基板の実施の形態の一例の断面図である。図１に示すように１は基体、２は光反射膜、３は柱状の透光性部材、４は撥水性部材、５は検体固定化膜である。

基体１はガラス板や金属板、セラミックス板等であるが、これらに限定されず、表面を鏡面仕上げができ、平坦化が可能であり、かつ、生物構成物質の処理に関わる耐薬品性や耐熱耐湿性が満たされるならば何でも良い。

光反射膜２は金属膜や誘電体光反射膜等が上げられるが、これらに限定されず、蛍光体の励起のための励起光や蛍光体から出射される出射光を反射する皮膜であり、かつ、基体１と密着性が良く、かつ、上面に被着される透光性部材３や撥水性部材４と密着性が良く、かつ、生物構成物質の処理に関わる耐薬品性や耐熱耐湿性が満たされるならば何でも良い。例えば、耐薬品性の優れる金属としてＣｒやＴｉ等が上げられるが、これらはアルミニウムや金程は光の反射率は良くないが、基体１や透光性部材３や撥水性部材４との密着性が良いため、総合的に優れた光反射膜２となる。

撥水性部材４は、水の接触角が５０度以上の撥水性の材料であり、例えば、無機フッ化物やフッ素樹脂、ポリプロピレン樹脂、エポキシ樹脂、フェノールノボラック樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂等である。

このような撥水性部材４は、例えば、原料の液体をスピンコートして塗布、乾燥を行い、必要に応じてキュアを行い熱硬化させることにより作製できる。あるいは、光反射膜２の表面を弗化物ガスにてプラズマ処理して撥水化処理を行なってもよい。蒸着やスパッタリング等で作製してもよい。

撥水性部材４は、隣接するもの同士が互いに間隔をあけて配置され、島状に点在するように形成されてもよく、隣接するもの同士がつながった膜状に形成されてもよい。好ましくは、島状に点在するのがよい。このように島状とすると透光性部材４と撥水性部材４との間に隙間を多く形成することができ、この隙間に検体が入り込んで検体固定化膜に固定される検体の量を多くすることができる。

透光性部材３は、ガラス等の透明な柱状体であり、隣接するもの同士が互いに間隔をあけて林立している。なお、柱状とは、円柱状や角柱状、円錐状、多角錐状、薄片状など様々な形状とし得る。このような透光性部材３は低温高ガス圧力スパッタリングや斜め蒸着することによって作製される。

好ましくは、透光性部材３と撥水性部材４との間に隙間があるのがよい。これにより、透光性部材３の側面にも検体固定化膜を被着できるとともに検体を透光性部材３の表面全面に被着できるようになる。

また、撥水性部材４の高さは透光性部材３よりも低い方がよい。これは撥水部材４の高さが透光性部材３よりも高いと透光性部材３に被着される検体固定化膜５が透光性部材４の根元まで被着され難くなるとともに、検体固定化膜５に固定化されるべき生物構成物質が透光性部材４の根元まで到達し難くなる。このため、単位面積当たりの生物構成物質の固定割合が低下する。

撥水性部材４の高さは低ければ低い方がよいが、０．５ｎｍ未満になると透光性部材４間の毛管現象を阻害する性能が低下するので撥水性部材４の高さは０．５ｎｍ以上がよい。更に、透光性部材３と撥水性部材４の高さの差は３０ｎｍ未満であると、隣接する透光性部材４間に生物構成物質を含む溶液が十分入り込まないために生物構成物質から出射される蛍光強度が低下しやすくなる。このため、透光性部材３と撥水性部材４の高さの差は３０ｎｍ以上がよい。

また、隣接した透光性部材４同士の間隔は測定される生物構成物質の厚みの２倍以上がよい。これにより、隣接した透光性部材４間に十分に生物構成物質が充填され、検体固定化膜に固定化されるため、より高密度に生物構成物質が捕集される。このため、生物構成物質から出射する蛍光強度がより高くすることができる。

本発明の検出用基板の実施例を以下に説明する。

基体１については硼珪酸ガラスとして２６ｍｍ×７６ｍｍ×１．１ｍｍのものを準備した。準備した硼珪酸ガラスはアルカリ脱脂を行って十分に純水洗した後、希塩酸にて中和処理を行い、十分に純水洗し、さらに希弗酸液にてガラス表面をライトエッチングして後、十分に純水洗を行った。乾燥はアルコール置換した後にアルコール蒸気乾燥を行った。

次に乾燥した基体１の上面にスパッタ装置にてＣｒ膜から成る光反射膜２を成膜した。そして、光反射膜２の上面に弗化マグネシウムから成る撥水性部材４を光学薄膜用蒸着装置によって成膜した。なお、撥水性部材４の被着の際は成膜条件を調整することにより、島状や膜状に形成した。

さらに、撥水性部材４の隙間に透光性部材３としてＳｉＯ_２を成膜した。この際、ＳｉＯ_２の成膜に当たっては膜が稠密とならないように加熱温度や成膜速度および真空度について配慮し、隙間の多い柱状の析出をするようにした。また、斜め蒸着も行い薄片状の透光性部材３も形成した。

成膜の終わった基板はＲＣＡ洗浄を行って十分に純水洗浄した後、アルコール置換し、乾燥はアルコール蒸気乾燥を行った。

次に検体固定化膜５として３−アミノプロピルトリエトキシシラン（以下ＡＰＳと略す）のコート液を作成した。コート液は溶媒としてイソプロピルアルコール（以下ＩＰＡと略す）を９４体積％、ＡＰＳを４体積％混ぜ、その後、純水を２体積％添加して直ちに良く攪拌した後に成膜後の洗浄が終わったガラスを３０秒浸漬した。その後、ガラスはＩＰＡにて５秒のリンスを施した後、リンサードライヤーにて乾燥を行った。次にＡＰＳの固着化を進めるために１５０℃にて１０分間のキュアを行い、サンプルとしての検出用基板とした。

比較例としては硼珪酸ガラス基板に同様の洗浄を施した後に同様にＡＰＳコートを行った。評価については５‘末端をＣｙ３蛍光体にて化学的に修飾した１５塩基長のオリゴＤＮＡを用いた。オリゴＤＮＡは０．５μＭとなるように純水に溶解してスポット液とした。準備した基板にスポットした後は湿潤箱に２５℃にて１２時間放置してオリゴＤＮＡを作成した基板に固定した。次にクエン酸緩衝液にて洗浄した後に純水リンスを行い、ブロー乾燥した。

励起波長５３２ｎｍにて励起したサンプルをスキャニングして、固定化されたオリゴＤＮＡの蛍光体から発生した蛍光の強度を数値化した。結果を表１に示す。表１より、本発明の検出用基板の蛍光強度が高く、優れていることがわかった。

なお、本発明は上述の最良の形態および実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の変更を行うことは何等差し支えない。

本発明の検出用基板の実施の形態の一例を示す断面図である。従来の検出用基板の断面図である。

符号の説明

１：基体
２：光反射膜
３：透光性部材
４：撥水性部材
５：検体固定化膜

Claims

基体の上面に光反射膜を形成するとともに、該光反射膜の上面に柱状の透光性部材を複数分布させ、該透光性部材間に位置する前記光反射膜上に撥水性部材を形成し、前記透光性部材の表面に検体固定化膜を被着したことを特徴とする検出用基板。
前記撥水性部材の上面が前記透光性部材の上端面よりも低いことを特徴とする請求項１に記載の検出用基板。
前記光反射膜がＣｒまたはＴｉであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の検出用基板。