CN110865063A - 具有反射层的微液滴荧光检测系统 - Google Patents

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王博
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Abstract

本发明提供一种具有反射层的微液滴荧光检测系统，所述微液滴荧光检测系统是微液滴成像检测系统，所述微液滴荧光检测系统包括一设置在微液滴下方的反射层，所述反射层对于微液滴成像的激发光反射率不小于20％，对于微液滴成像的激发发射光反射率不小于50％。本发明的微液滴荧光检测系统明显提高了微液滴荧光检测系统的信噪比，并且降低了曝光时间，提高了检测速度。

Description

具有反射层的微液滴荧光检测系统
技术领域
本发明涉及微液滴检测领域，尤其涉及一种具有反射层的微液滴荧光检测系统。
背景技术
微液滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是近年来新兴的一种PCR技术。在原有PCR的技术基础上，该技术进行了大幅度革新。与经典的荧光定量PCR相比，ddPCR可以对DNA或者RNA分子采用绝对定量的方式进行分析，不需要标准曲线辅助分析。该技术将传统PCR中的每一份样品反应体系均分为若干份，样品仅被包裹与微液滴内，然后再进行PCR反应。PCR反应结束后，利用检测设备读取每一个微液滴的荧光信号值，再根据荧光信号值的阈值来区分每一个液滴，荧光信号高于阈值的微液滴称为阳性液滴，荧光信号低于阈值的微液滴成为阴性液滴，根据泊松分布原理以及阴性液滴的个数以及比例，计算样品靶分子的起始拷贝数。该技术以及被广泛应用于癌症分子标志物的发现、传染病研究、基因结构变异分析、基因表达分析等领域。
在对PCR后的液滴进行检测时，成像法作为一种快速简单的方法在许多仪器中得到了广泛的应用。利用成像法检测时，首先将待检测的液滴单层平铺在某一基底上，所述基底往往为透明材质；再利用激发光源照射待检测液滴，在激发光的照射下阳性液滴会发出较强的荧光，阴性液滴则不发出或者发出较弱的荧光；最后利电荷耦合器件(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)等光学探测器对液滴进行荧光成像，通过识别每个液滴的荧光信号值来判断液滴的阴阳性，并根据泊松分布计算样本中的拷贝数。
但是在实际应用中，传统成像检测法有以下两点问题：1.光源发出的激发光往往不能全部照射到液滴上，一部分激发光会照射到液滴与液滴之间的空隙中并被基底吸收或透过基底继续传播，这降低了阳性液滴的荧光强度；2.当阳性液滴被激发光激发时，阳性液滴向空间的各个方向发射荧光，然而向基底发射的荧光大部分被基底吸收或透过基底继续传播，这使检测器检测到的荧光强度降低。以上两点问题导致检测信噪比低，曝光时间长，速率慢等问题。这就需要一种提高液滴荧光成像性能的新方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种具有反射层的微液滴荧光检测系统，所述微液滴荧光检测系统是微液滴成像检测系统，所述微液滴荧光检测系统包括一设置在微液滴下方的反射层，所述反射层对于微液滴成像的激发光反射率不小于20％，对于微液滴成像的激发发射光反射率不小于50％；和所述反射层在微液滴成像的激发发射光波长处的荧光背景低于所述微液滴自身发射荧光的10％，优选低于5％，更优选地低于1％。
在一种实施方式中，微液滴直接位于所述反射层上表面，所述反射层下表面与微液滴芯片基底上表面固定。
在一种实施方式中，微液滴直接位于微液滴芯片上表面，所述反射层上表面与微液滴芯片基底下表面固定。
在一种实施方式中，所述反射层表面粗糙度Ra在0.05至100μm之间，和其厚度为10nm至1cm。
在一种实施方式中，所述反射层是金属层，包括银、金、铝、铬、铟、铜、镍、钯、铂、锌、锡中的一种或几种的合金或金属化合物。
在一种实施方式中，所述反射层通过溅射、喷镀、电镀、蒸镀、粉刷或黏附方法与微液滴芯片基底固定。
在一种实施方式中，所述微液滴成像检测系统是电荷耦合器件微液滴成像检测系统或互补金属氧化物半导体微液滴成像检测系统。
在一种实施方式中，当所述反射层与微液滴接触时，所述反射层与微液滴接触的表面含有疏水层。
本发明的微液滴荧光检测系统明显提高了微液滴荧光检测系统的信噪比，并且降低了曝光时间，提高了检测速度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明基本原理示意图；
图2是本发明一种实施方式示意图；
图3是本发明另一种实施方式示意图；
图4是使用传统的微液滴荧光检测系统检测样品荧光成像的结果；和
图5是使用本发明的微液滴荧光检测系统检测与图4相同样品的荧光成像结果。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例一：本发明的基本原理
如图1(图1a和1b)所示，当激发光照射到样品时，部分射向液滴的光线直接激发液滴进而产生发射荧光信号；部分射向液滴间隙的光线在反射层表面发生反射，反射光线指向液滴方向，进而再次激发液滴产生荧光信号，从而提高了液滴荧光的收集效率，这是增强荧光收集效率的第一种途径。
当被激发的液滴发出荧光时，部分射向检测器方向的荧光可以直接被检测器检测到；部分射向反射层的荧光在反射层表面发生反射，反射光线指向检测器，从而进一步提高了荧光的搜集效率，这是增强荧光收集效率的第二种途径。
在本发明的系统中以上两种途径都增加了液滴荧光的收集效率，本发明人发现在这两种方式中，以第二种途径为主。因此在本发明的微液滴荧光检测系统中设置在微液滴下方的反射层，该反射层对于微液滴成像的激发发射光反射率越高，对于本发明的荧光检测系统的灵敏度提高越明显；通常要求对于微液滴成像的激发发射光反射率不小于50％。
如上所述，反射层对于微液滴成像的激发光反射也会增加系统的灵敏度，这是本发明系统灵敏度提高的次要原因；通常反射层对于微液滴成像的激发光反射率不小于20％。
由于反射层增加，一般会增加微液滴荧光检测背景荧光，从而降低了系统检测的灵敏度，因此要求述反射层在微液滴成像的激发发射光波长处的荧光背景低于所述微液滴自身发射荧光的10％，优选低于5％，更优选地低于1％。
实施例二：本发明的一种微液滴荧光检测系统
如图2所示，在本实施例中，将具有反射效果的反射层01作为样品 03荧光成像的背景，所述样品03为被连续油相包裹的水相微液滴，液滴单层平铺在反射层01上，所述样品03位于反射层01与激发光源之间，所述激发光源发出的部分或全部光朝向样品03方向。所述样品03与反射层01之间紧密连接，之间不存在介质层。所述反射层01为均匀的金属铝，所述反射层01通过金属溅射附着于基底02上，反射层表面粗糙度为Ra1.6，所述反射层厚度是30um。
反射层01于液滴接触的表面进行疏水处理，处理方法为：
(1)利用100％的乙醇对平铺结构超声清洗1h；
(2)利用氮气吹干表面残留的乙醇；
(3)利用100％的丙酮对平铺结构超声清洗1h；
(4)利用氮气吹干表面残留的丙酮；
(5)利用超纯水超声清洗平铺结构1h；
(6)利用氮气吹干表面残留的超纯水；
(7)将清洗好的平铺结构在过饱和硅烷蒸汽中放置6h。
在该实施例中，激发光源07为卤素灯光源，检测样本的检测器为CCD 传感器。
实施例三：本发明的另一种微液滴荧光检测系统
如图3所示，在本实施例中，将具有反射效果的反射层01作为样品 03的荧光成像的背景，所述样品03为被连续油相包裹的水相微液滴，液滴单层平铺在玻璃基底02上，玻璃基底02位于样品与反射层之间，所述样品03位于玻璃基底02与激发光源07之间，所述样品被检测器所检测，所述激发光源07发出的部分或全部光朝向样品03方向。
所述样品03与反射层01之间存在透明的基底02，样品03平铺在玻璃基底上02。所述反射层01为高度10mm的金属铬合金，表面粗糙度为 Ra1.2。
所述反射层于液滴接触的表面进行疏水处理，处理方法为：
(1)利用100％的乙醇对平铺结构超声清洗1h；
(2)利用氮气吹干表面残留的乙醇；
(3)利用100％的丙酮对平铺结构超声清洗1h；
(4)利用氮气吹干表面残留的丙酮；
(5)利用超纯水超声清洗平铺结构1h；
(6)利用氮气吹干表面残留的超纯水；
(7)将清洗好的平铺结构在过饱和硅烷蒸汽中放置6h；
所述激发光源为LED光源。所述对液滴进行成像的检测器为CMOS 传感器。
实施例四：本发明微液滴荧光检测系统与传统荧光检测系统的比较
如图4、5所示，图4为利用传统的透明基底作为样品荧光成像的背景所到的结果，检测器曝光时间2000ms。其中横坐标为荧光信号强度，纵坐标为液滴个数。图5为利用实施例1中的本发明的系统，对图4中的同一样品进行检测的结果，检测器曝光时间500ms，其中横坐标为荧光信号强度，纵坐标为液滴个数。从图4和图5可以看出，本发明的微液滴荧光检测系统显然明显提高了系统检测的信噪比，并且降低了曝光时间，提高了检测速度。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (8)

1.一种具有反射层的微液滴荧光检测系统，其特征在于，所述微液滴荧光检测系统是微液滴成像检测系统，所述微液滴荧光检测系统包括一设置在微液滴下方的反射层，所述反射层对于微液滴成像的激发光反射率不小于20％，对于微液滴成像的激发发射光反射率不小于50％；和所述反射层在微液滴成像的激发发射光波长处的荧光背景低于所述微液滴自身发射荧光的10％，优选低于5％，更优选地低于1％。
2.根据权利要求1所述的微液滴荧光检测系统，其特征在于，微液滴直接位于所述反射层上表面，所述反射层下表面与微液滴芯片基底上表面固定。
3.根据权利要求1所述的微液滴荧光检测系统，其特征在于，微液滴直接位于微液滴芯片上表面，所述反射层上表面与微液滴芯片基底下表面固定。
4.根据权利要求1所述的微液滴荧光检测系统，其特征在于，所述反射层表面粗糙度Ra在0.05至100μm之间，和其厚度为10nm至1cm。
5.根据权利要求1所述的微液滴荧光检测系统，其特征在于，所述反射层是金属层，包括银、金、铝、铬、铟、铜、镍、钯、铂、锌、锡中的一种或几种的合金或金属化合物。
6.根据权利要求5所述的微液滴荧光检测系统，其特征在于，所述反射层通过溅射、喷镀、电镀、蒸镀、粉刷或黏附方法与微液滴芯片基底固定。
7.根据权利要求1所述的微液滴荧光检测系统，其特征在于，所述微液滴成像检测系统是电荷耦合器件微液滴成像检测系统或互补金属氧化物半导体微液滴成像检测系统。
8.根据权利要求1-7任一所述的微液滴荧光检测系统，其特征在于，当所述反射层与微液滴接触时，所述反射层与微液滴接触的表面含有疏水层。
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WO2021208978A1 (en) * 2020-04-15 2021-10-21 Highfly Therapeutics (Hk) Limited A system and a method for fluorescence detection

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