JP2008051512A - 近接場光を用いたセンサおよびその作製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】蛍光法によるセンサを、高S/Nの蛍光測定が可能で、かつ光学系が簡素化されて安価に形成可能なものとする。
【解決手段】所定波長の励起光8を発する光源7と、励起光8を透過させる材料からなり、光源7からの励起光8を受ける位置に配された基板23と、励起光8を遮断する材料からなり、該励起光8の波長よりも小さい開口24aを有して、基板23の光源7とは反対側の一表面23aに形成された薄膜24と、基板23と反対側から薄膜24に試料1が接するように該試料1を保持する試料保持部26と、薄膜24に励起光8が照射されたとき前記開口24aの部分に生じる近接場光21に励起されて、試料1中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段9とからセンサを構成する。
【選択図】図1
【解決手段】所定波長の励起光8を発する光源7と、励起光8を透過させる材料からなり、光源7からの励起光8を受ける位置に配された基板23と、励起光8を遮断する材料からなり、該励起光8の波長よりも小さい開口24aを有して、基板23の光源7とは反対側の一表面23aに形成された薄膜24と、基板23と反対側から薄膜24に試料1が接するように該試料1を保持する試料保持部26と、薄膜24に励起光8が照射されたとき前記開口24aの部分に生じる近接場光21に励起されて、試料1中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段9とからセンサを構成する。
【選択図】図1
Description
本発明は、近接場光を用いて蛍光法により特定物質を検出するセンサ、およびその作製方法に関するものである。
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光体で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
図3は、上記の標識された物質を用いる蛍光法を実施する蛍光センサの一例を概略表示するものである。本例の蛍光センサは一例として試料1に含まれる抗原2を検出するためのものであり、基板3には抗原2と特異的に結合する1次抗体4が固定化されている。そしてこの基板3上に設けられた試料保持部5の中において試料1が流され、次いで同様に蛍光体10で標識されて抗原2と特異的に結合する2次抗体6が流される。その後、基板3の表面部分に向けて光源7から励起光8が照射され、また光検出器9により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器9によって所定の蛍光が検出されたなら、上記2次抗体6と抗原2との結合、すなわち試料中における抗原2の存在を確認できることになる。
なお以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは2次抗体6であるが、この2次抗体6は抗原2と結合しなければ流されてしまって基板3上に存在し得ないものであるから、この2次抗体6の存在を確認することにより、間接的に検出対象物質である抗原2の存在が確認されることとなる。
とりわけここ数年は、冷却CCDの発達など光検出器の高性能化が進んでいることもあって、以上述べた蛍光法はバイオ研究には欠かせない道具となっており、さらにバイオ以外の分野においても広範に利用されている。
しかしながら、図3に示したような従来の蛍光センサでは、基板と試料との界面における励起光の反射/散乱光や、検出対象物質以外の不純物/浮遊物M等による散乱光がノイズとなるため、せっかく光検出器を高性能化しても蛍光検出におけるS/Nは向上しないのが実情であった。
これに対する解決法として、例えば非特許文献1に示されるようなエバネッセント蛍光法、つまりエバネッセント波を用いる蛍光法が提案されている。この蛍光法を実施するセンサの一例を図4に概略的に示す。なおこの図4において、図3中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する(以下、同様)。
このセンサにおいては、前述の基板3に代わるものとしてプリズム13が用いられ、そして光源7からの励起光8は、このプリズム13と試料1との界面で全反射する条件で、プリズム13を通して照射される。この構成においては、励起光8が上記界面で全反射するとき該界面近傍に染み出すエバネッセント波11により2次抗体6が励起される。そして蛍光検出は、試料1に対してプリズム13と反対側(図中では上方)に配された光検出器9によってなされる。
このセンサにおいて、励起光8は図中の下方に全反射するので、上方からの蛍光検出において、励起光検出成分が蛍光検出信号に対するバック・グラウンドとなってしまうことがない。またエバネッセント波11は上記界面から数百nmの領域にしか到達しないので、試料中の不純物/浮遊物Mからの散乱を殆ど無くすことができる。そのため、このエバネッセント蛍光法は、従来の蛍光法と比べて(光)ノイズを大幅に低減でき、検出対象物質を1分子単位で蛍光測定できる方法として注目されている。
「バイオイメージングでここまで理解る」p.104-113 楠見明弘他著 羊土社
「バイオイメージングでここまで理解る」p.104-113 楠見明弘他著 羊土社
しかしながら従来のエバネッセント蛍光法は、プリズム等の光学素子や導波路構造等を用いる必要があって、装置が複雑かつ高価となるため、あまり普及していない。また、従来のプリズムや導波路を用いたエバネッセント蛍光法においては、浮遊物による散乱は防げるものの、プリズム等の基板中に存在する不純物N等による光散乱はそのまま残るため、これが光ノイズとなっていた。とりわけ、基板材料として、安価でかつ大量生産可能な樹脂を用いる場合は、この問題が顕著であった。
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、高S/Nの蛍光測定が可能で、かつ光学系が簡素化されて安価に形成可能な、蛍光法によるセンサを提供することを目的とする。
さらに本発明は、そのようなセンサを安価に作製可能な方法を提供することを目的とする。
本発明によるセンサは、蛍光体の励起のために近接場光を用いたセンサであって、
所定波長の励起光を発する光源と、
前記励起光を透過させる材料からなり、前記光源からの励起光を受ける位置に配された基板と、
前記励起光を遮断する材料からなり、前記励起光の波長よりも小さい開口を有して、前記基板の前記光源とは反対側の一表面に形成された薄膜と、
前記基板と反対側から前記薄膜に試料が接するように該試料を保持する試料保持部と、
前記薄膜に励起光が照射されたとき前記開口の部分に生じる近接場光に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたことを特徴とするものである。
所定波長の励起光を発する光源と、
前記励起光を透過させる材料からなり、前記光源からの励起光を受ける位置に配された基板と、
前記励起光を遮断する材料からなり、前記励起光の波長よりも小さい開口を有して、前記基板の前記光源とは反対側の一表面に形成された薄膜と、
前記基板と反対側から前記薄膜に試料が接するように該試料を保持する試料保持部と、
前記薄膜に励起光が照射されたとき前記開口の部分に生じる近接場光に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたことを特徴とするものである。
なお、この近接場光を用いたセンサにおいて、前記基板としては平板状のものが好適に用いられる。
そして上記薄膜の開口の径は、5〜200nmの範囲にあることが望ましい。また、この薄膜の開口率は、5〜50%の範囲にあることが望ましい。
一方、本発明による近接場光を用いたセンサの作製方法は、上述した本発明によるセンサを作製する方法において、開口を有する薄膜の製法に特開2005−079352号公報に示される方法を適用したものであり、より具体的には、
前記基板の上に微粒子分散溶液を塗布して微粒子を付着させ、
その上から前記薄膜の材料を基板に蒸着させ、
次に前記微粒子を除去することにより、前記開口を有する薄膜を形成することを特徴とするものである。
前記基板の上に微粒子分散溶液を塗布して微粒子を付着させ、
その上から前記薄膜の材料を基板に蒸着させ、
次に前記微粒子を除去することにより、前記開口を有する薄膜を形成することを特徴とするものである。
本発明の近接場光を用いたセンサにおいては、薄膜の開口部分に生じた近接場光によって試料中に含まれる物質を励起するようにしたので、励起光は基板と試料との界面から数十nm程度の領域にしか到達しない。そこで、試料中の不純物/浮遊物からの散乱を皆無とすることができる。それに加えて本発明の近接場光を用いたセンサにおいて、基板中の不純物等で散乱した光(これは通常の伝搬光である)は薄膜の開口を通過することができないので、該薄膜で遮断され、光検出器に到達することがない。以上により本発明の近接場光を用いたセンサにおいては、光ノイズを殆ど皆無までに低減することができ、極めて高S/Nの蛍光検出が可能となる。
そして本発明の近接場光を用いたセンサにおいては、励起光を基板と試料との界面で全反射させる必要がないので、基板としては特殊なプリズム状のものではない単純形状のもの、例えば平板状のもの等が随意に適用可能となる。そこで本発明の近接場光を用いたセンサは、光学系が簡素化されて安価に形成可能なものとなる。
また、上記全反射を利用する従来装置においては、前述した通り、基板中に存在する不純物等による光ノイズが問題となり、この問題は特に基板材料として樹脂を用いる場合に顕著であったが、本発明の近接場光を用いたセンサにおいてはこの全反射をさせる必要がないので、基板材料として樹脂を用いても光ノイズの問題を招くことがない。そこで本発明の近接場光を用いたセンサにおいては、安価でかつ大量生産可能な樹脂を好適に用いることが可能となる。その場合の好ましい樹脂としては、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリカーボネイト(PC)、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン(APO)等が挙げられる。
なお、上述の薄膜の開口径が5〜200nmの範囲にある場合は、染み出しによる近接場光を効果的に発生させると同時に、検出を行う抗体やタンパクなどの生物試料のサイズが数nm〜数十nmであることから、これらを効率的かつ確実に孔の部分に補足できるという効果が得られるので、特に好ましい。
また、蛍光強度(信号量)を稼ぐという点では、上記薄膜の開口率はある程度大きい方が望ましいが、ポリマー微粒子を密に塗布した場合、遮光膜の蒸着時にポリマー微粒子に対するまわり込み等により膜厚が不揃いになったり、基板との密着強度が劣化する等の不具合が生じる場合がある。上記薄膜の開口率が5〜50%の範囲にある場合は、これらが両立され、特に好ましい。
一方、本発明による近接場光を用いたセンサの作製方法は、基板の上に微粒子分散溶液を塗布して微粒子を付着させ、その上から前記薄膜の材料を基板に蒸着させ、次に前記微粒子を除去することにより、開口を有する薄膜を形成するようにしたので、この開口を有する薄膜を低コストで大量生産可能となり、よって本発明のセンサを安価に提供できるものとなる。
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
図1は、本発明の一実施形態による近接場光を用いたセンサ(以下、単にセンサという)を示す概略側面図である。図示の通りこのセンサは、所定波長の励起光8を発する例えば半導体レーザ等の光源7と、上記励起光8を透過させる材料からなり、この励起光8を受ける位置に配された平板状の基板23と、励起光8を遮断する材料からなり、この励起光8の波長よりも小さい開口24aを有して、基板23の光源7とは反対側の一表面23aに形成された薄膜24と、基板23と反対側から薄膜24に試料1が接するように該試料1を保持する試料保持部26と、例えば2次元CCDセンサ等からなる光検出器(蛍光検出手段)9とを備えてなるものである。
上記基板23は、例えば透明樹脂やガラス等から形成されたものである。一方多数の開口24aを有する薄膜24は、一例として金等の金属からなるものであり、開口24aの径は5〜200nmの範囲にある値、多くは数十nm程度とされている。なお、この薄膜24の具体的な形成方法については、後に詳しく説明する。
なお、基板23を樹脂から形成する場合は、前述したようにポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリカーボネイト(PC)、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン(APO)等の樹脂を好適に用いることができる。
以下、上記センサの作用について、一例として試料に含まれる抗原を検出する場合について説明する。その際、基板23の薄膜24の上には、検出対象物質である抗原2と特異的に結合する1次抗体4が固定化される。そして試料保持部26の中において試料1が流され、次いで同様に蛍光体10で標識されて抗原2と特異的に結合する2次抗体6が流される。なお上記蛍光体10は、励起光8によって励起されて所定波長の蛍光を発するものである。
その後、基板23に向けて光源7から励起光8が照射され、そして光検出器9により蛍光検出がなされる。このとき、薄膜24の開口24aから近接場光21が染み出すようになる。そこで、もし1次抗体4に抗原2が結合していれば、さらに該抗原2に2次抗体6が結合し、その2次抗体6の標識である蛍光体10が近接場光21によって励起されることとなる。励起された蛍光体10は所定波長の蛍光を発し、その蛍光は光検出器9によって検出される。こうして、光検出器9が所定波長の蛍光を検出した場合は、それにより、抗原2に2次抗体6が結合していること、すなわち試料1に抗原2が含まれていることを確認可能となる。
なお上記近接場光21は、基板23と試料1との界面から数十nm程度の領域にしか到達しない。そこで、試料中の不純物/浮遊物からの散乱を略皆無とすることができる。それに加えてこのセンサにおいて、基板23中の不純物N等で散乱した光(これは通常の伝搬光である)は薄膜24の開口24aを通過することができないので、該薄膜24で遮断され、光検出器9に到達することがない。以上によりこのセンサにおいては、光ノイズを殆ど皆無までに低減することができ、極めて高S/Nの蛍光検出が可能となる。
そして本実施形態のセンサにおいては、励起光8を基板23と試料1との界面で全反射させる必要がないので、基板23として、特殊なプリズム状のものではない単純な平板状のものが適用可能となっている。そこでこのセンサは、光学系が簡素化されて安価に形成可能なものとなる。
なお、上記開口24aの径が5〜200nmの範囲にある場合は、染み出しによる近接場光を効果的に発生させると同時に、検出を行う抗体やタンパクなどの生物試料のサイズが数nm〜数十nmであることから、これらを効率的かつ確実に孔の部分に補足できるという効果が得られるので、特に好ましい。
また、蛍光強度(信号量)を稼ぐという点では、薄膜24の開口率はある程度大きい方が望ましいが、ポリマー微粒子を密に塗布した場合、遮光膜の蒸着時にポリマー微粒子に対するまわり込み等により膜厚が不揃いになったり、基板23との密着強度が劣化する等の不具合が生じる場合がある。薄膜24の開口率が5〜50%の範囲にある場合は、これらが両立され、特に好ましい。
次に、薄膜24を形成する具体的方法の一例について、図2を参照して説明する。まず基板23の上に微粒子分散溶液を塗布して微粒子30を付着させ(1)、次にその上に金属からなる薄膜24を真空蒸着し(2)、その後微粒子30を適当な溶媒中で超音波振動を加えて除去する(3)。こうすることにより、微粒子30の外径と同程度の径の開口24aを多数有する薄膜24を低コストで大量生産可能となり、よって図1のセンサを安価に提供できるようになる。
なお、上に述べた微粒子30は、ポリスチレン等のポリマー微粒子またはシリカ等の無機微粒子のいずれでもよく、また無機微粒子表面をポリマーでコートした有機・無機複合微粒子でもよい。付着強度は微粒子30の形状および表面処理法によって変化するので、制御性良く分散付着し、かつ液中超音波処理によって完全に除去可能な付着強度を得るには、適当な形状を有しかつ適当な表面処理が施された微粒子を用いることが肝要である。微粒子30の形状は球状、楕円球状、多面体等が好ましく、球状がより好ましい。
微粒子30を基板23に付着させる方法は、微粒子30の分散液を基板表面に均一に塗布できる方法であれば特に限定されず、バーコート法、スキージ塗布法、スピンコート法、インクジェット法、スプレー法等を用いることができる。中でも比較的小面積に均一に処理を行うのであればスピンコート法が好ましく、大面積に均一に処理を行うのであればスプレー法が好ましい。
分散液は、処理プロセス中微粒子を安定して分散させることができる溶媒を用い、塗布方法に応じて適切な濃度に調整する。例えば、スピンコート法によって塗布する場合は0.001〜30質量%、好ましくは0.01〜10質量%の範囲で分散液の微粒子濃度を調節する。分散液の濃度と塗布量で、付着粒子の密度を制御し、結果として薄膜24に形成される開口24aの開口率および開口分布を制御する。微粒子30の分散性を良くするため適当な界面活性剤を添加してもよい。
基板23の表面の親疎水性、電荷、凹凸等は微粒子30の付着力に大きく影響を与えるので、これらを適正に制御する必要がある。
なお、基板23として疎水的な樹脂を用いる一方、薄膜24として親水的な金を用いることにより、それらの違いから異なる表面修飾をすることが可能となり、試料の固定のパターン化(例えば金以外の部分にタンパクを吸着させる)が容易になる。またそれにより、タンパク等の高価な試料を最少限の量だけ使用することが可能になるので、試料節約による経済的効果も大となる。
1 試料
2 抗原
4 1次抗体
6 2次抗体
7 光源
8 励起光
9 光検出器
10 蛍光体
21 近接場光
23 基板
23a 基板の一表面
24 薄膜
24a 薄膜の開口
26 試料保持部
2 抗原
4 1次抗体
6 2次抗体
7 光源
8 励起光
9 光検出器
10 蛍光体
21 近接場光
23 基板
23a 基板の一表面
24 薄膜
24a 薄膜の開口
26 試料保持部
Claims (5)
- 所定波長の励起光を発する光源と、
前記励起光を透過させる材料からなり、前記光源からの励起光を受ける位置に配された基板と、
前記励起光を遮断する材料からなり、前記励起光の波長よりも小さい開口を有して、前記基板の前記光源とは反対側の一表面に形成された薄膜と、
前記基板と反対側から前記薄膜に試料が接するように該試料を保持する試料保持部と、
前記薄膜に励起光が照射されたとき前記開口の部分に生じる近接場光に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたことを特徴とする近接場光を用いたセンサ。 - 前記基板が平板状のものであることを特徴とする請求項1記載の近接場光を用いたセンサ。
- 前記薄膜の開口の径が5〜200nmの範囲にあることを特徴とする請求項1または2記載の近接場光を用いたセンサ。
- 前記薄膜の開口率が5〜50%の範囲にあることを特徴とする請求項1から3いずれか1項記載の近接場光を用いたセンサ。
- 請求項1から4いずれか1項記載の近接場光を用いたセンサを作製する方法において、
前記基板の上に微粒子分散溶液を塗布して微粒子を付着させ、
その上から前記薄膜の材料を基板に蒸着させ、
次に前記微粒子を除去することにより、前記開口を有する薄膜を形成することを特徴とする近接場光を用いたセンサの作製方法。
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- 2006-08-22 JP JP2006224986A patent/JP2008051512A/ja not_active Abandoned
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