JP5328915B2

JP5328915B2 - 高感度蛍光検出デバイス

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Publication number: JP5328915B2
Application number: JP2011520947A
Authority: JP
Inventors: 友幸坂井; 剛志曽根原; 孝信芳賀
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2030-06-30
Also published as: JPWO2011002010A1; WO2011002010A1

Description

参照による取り込み

本出願は、２００９年７月３日に出願された日本特許出願第２００９−１５８３５６号の優先権を主張し、その内容を参照することにより本出願に取り込む。

本発明は，ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はタンパク質等の生体物質の計測，分析に使用される高感度蛍光検出に関する技術分野に属する。

ＤＮＡやタンパク質等の生体物質を計測する手段として，前記物質に蛍光体を標識して，前記蛍光体にレーザ等の励起光を照射して発生する蛍光を検出する方法が一般的である。従来の高感度蛍光検出のための照射検出方式として，例えば非特許文献１に記載の全反射エバネッセント照射検出方式がある。前記文献では，蛍光標識生体物質の単分子レベルの高感度イメージングを行っている。石英ガラスに蛍光体Ｃｙ３標識ヘビーメロミオシン固定し，水溶液を滴下する。石英ガラス（高屈折率）と水溶液（低屈折率）の境界面に対して，石英ガラスよりレーザ光を前記境界面の臨界角で照射すると，全反射が起こり，前記境界面の水溶液側にエバネッセント場が生じる。このエバネッセント場により励起された蛍光体Ｃｙ３の蛍光を，レーザ光照射側の反対側から，対物レンズを用いて２次元検出器であるＣＣＤ上に結像することによって検出される。エバネッセント場では，励起光強度が屈折率境界平面から離れるに従って指数関数的に減衰するため，落射蛍光検出方式と比較して励起光照射体積および蛍光検出体積を大幅に低減することができ，対象とする生体分子に標識された蛍光体以外の遊離の蛍光体の蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。

一方，非特許文献２および特許文献１では，全反射エバネッセント照射検出方式よりも励起光照射体積の一層の低減が可能となるナノ開口照射検出方式によって，蛍光検出の感度を更に向上させている。ガラス基板の表面に直径５０ｎｍの微小開口（ナノ開口）を有する膜厚約１００ｎｍの平板上のＡｌ薄膜を成膜する。ガラス基板のＡｌ薄膜が成膜されている面とは反対の面よりレーザ光を前記面に対して直角に照射すると，前記微小開口内部にエバネッセント場が生じる。エバネッセント場では，励起光強度がナノ開口底平面から離れるに従って指数関数的に減衰する。更に，ナノ開口エバネッセント照射検出方式では，全反射エバネッセント照射検出法と異なり，ガラス基板と平行方向の励起光照射幅が開口径すなわち５０ｎｍに限定されるため，励起光照射体積が一層低減される。このため，遊離の蛍光体の蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。その結果，より高濃度の遊離の蛍光体存在下で，対象とする生体分子に標識された蛍光体だけを選択的に検出することが可能となり，非常に高感度な蛍光検出を実現できる。非特許文献２では，ナノ開口照射検出方式を用いて，微小開口内底面部にポリメラーゼを固定し，蛍光体標識ｄＣＴＰのポリメラーゼへの取込み計測に応用している。

特許文献２では，ナノ開口内部に透明材質を充填し，その上にターゲット蛍光体を固定する，もしくはナノ開口底面のガラス基板を数百ｎｍ程度掘下げ，その底面にターゲット蛍光体を固定することにより，ターゲット蛍光体の発光の検出効率を向上させている。

米国特許第６，９１７，７２６特開２００７−１９８８０１

Ｎａｔｕｒｅ１９９５，Ｖｏｌ．３７４，ｐｐ．５５５−５５９．ＳＣＩＥＮＣＥ２００３，Ｖｏｌ．２９９，ｐｐ．６８２−６８６．

一般に蛍光標識された生体物質を単分子レベルで高感度に計測するためには，背景光の低減とシグナル強度の増加が必要となる。

背景光低減に関しては，励起光照射体積を縮小することが有効である。非特許文献２および特許文献１のナノ開口照射検出方式では，エバネッセント場による蛍光検出光軸方向での励起光照射領域低減だけでなく，蛍光検出光軸と垂直方向の励起光照射領域を回折限界レベル以下に制御することができるため，背景光の影響を大幅に低減することが可能である。しかしながら，前記ナノ開口照射検出方式では，以下の理由による背景光上昇の可能性が生じる。ナノ開口照射検出方式では，ガラス基板上面に直径５０ｎｍ程度の開口を設けたアルミ薄膜を有したナノ開口デバイスを使用する。励起光であるレーザ光をダイクロイックミラーで反射させ，対物レンズを用いて集光し，ナノ開口デバイス下面より前記ガラス基板面と垂直方向に照射するとナノ開口内部にエバネッセント場が生じる。ナノ開口内部に蛍光標識のターゲット分子が存在すると，前記エバネッセント場により蛍光が励起されて発光する。この発光蛍光をナノ開口デバイスの下面より前記対物レンズを用いて集光し，前記ダイクロイックミラーを透過させ，検出器で検出する。この時，ガラス基板の散乱光や励起光のガラス基板やアルミ薄膜面での反射光も同時に集光される。ダイクロイックミラーの性能にもよるが，前記散乱光や励起光の反射光も僅かながら透過して検出される。前記検出されてしまう散乱光や励起光の反射光は背景光となり，検出感度の低下につながる。

ナノ開口デバイス上面より検出すれば，前記ガラス基板で生じる散乱光や励起光の反射光による背景光の上昇を防ぐ事は可能である。しかしながら，アルミ薄膜を励起光が僅かながら透過してしまうため，それを検出してしまい背景光が上昇してしまう。アルミ薄膜を厚くする事により前記透過光を防ぐ事も可能ではあるが，ナノ開口の深さが深くなり，底面部で発光した蛍光の検出感度が低下してしまう。

前記問題を解決するため，励起光の入射角を大きくして照射し，ナノ開口デバイス上面より検出する方法が考えられる（ナノ開口斜め照射検出方式）。例えば，臨界角以上で入射すれば，アルミ薄膜からの検出側への励起光の漏れ光は事実上０になる。

高感度検出方法として前記背景光を低減する以外に，シグナル強度の増加がある。励起光の強度を強くする事により，シグナル強度を増加させることはできる。しかしながら，一般的に光源のコストはその出力強度とともに上昇する。そのため，効率良い照射方式が望まれる。また，効率良く照射できれば，検出感度に必要な照射強度を維持したまま広範囲を照射することが可能となる。これは，基板表面に固定された複数のターゲットを同時に照射することができるため，スループットの向上にもつながる。

本発明では，低背景光照射検出方式であるナノ開口斜め照射検出方式において，効率良く励起光を照射することによるシグナル強度の増加方法を提供する。

透明基板上に微小開口を設けた遮光膜を有したナノ開口デバイスの透明基板側から、入射角度を付けて励起光を照射し，遮光膜側から蛍光検出するナノ開口斜め照射検出方式において，ナノ開口デバイスの遮光膜と透明基板間に透明基板よりも低屈折率な透明薄膜を設けることにより，効率良く励起光をナノ開口内のターゲット分子に照射することができる。

また，上記デバイスにおいて，ナノ開口底面にプラズモン共鳴を発生させるための金属薄膜や励起光波長よりも小さな微細構造を設けることにより，より高効率にターゲット分子に励起光を照射することが可能となる。

生体試料としては、ＤＮＡ，ＲＮＡ，タンパク質等、蛍光検出可能なものが挙げられる。

本発明の蛍光検出デバイスは、入射される光に対して透明な透明基板と、生体試料を配置させる開口を設けた非導光膜と、透明基板と非導光膜との間に設けられ、基板の屈折率よりも低い屈折率を有し、基板を通して入射される光に対して透明なスペーサ層とを備えることを特徴とする。ここで、基板に入射する光は、基板に対して入射角を直角以上にする等、基板に対して傾きを設けて入射するのがよい。

また、本発明の分析システムは、光源と、生体試料を設置するデバイスと、光源からの光が生体試料に照射されて発光した蛍光を検出する検出器と、検出器から検出された蛍光を分析する計算器とを有し、当該デバイスは、光源から入射される光に対して透明な透明基板と、生体試料を配置させる開口を設けた非導光膜と、透明基板と非導光膜との間に設けられ、基板の屈折率よりも低い屈折率を有し、基板を通して入射される光に対して透明なスペーサ層とを備えることを特徴とする。

本発明により，ナノ開口内への高効率照射が可能となり，蛍光標識された生体物質を単分子レベルで高感度に計測することが可能となる。

実施例１における分析用システムの概観図実施例１におけるナノ開口デバイスの拡大図実施例１におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例１におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例１におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例１におけるシミュレーションモデルナノ開口中央部の照射強度と伝播距離の関係のグラフナノ開口中央部の照射強度と伝播距離の関係のグラフ低屈折率透明薄膜の各厚さにおける開口底部の照射強度の関係のグラフＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図実施例２におけるナノ開口デバイスの構成図実施例２におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例２におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例２におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例２におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例２におけるシミュレーションモデル構造物の有無における照射強度と伝播距離の関係のグラフ実施例３におけるナノ開口デバイスの構成図実施例３におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例３におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例３におけるナノ開口デバイスの作製方法の例実施例３におけるシミュレーションモデル充填層の有無における照射強度と伝播距離の関係のグラフ

以下，図面に従って本発明の実施の形態を説明する。

図１に，分析用システムの概観を示す。本実施例では，前記システムを用いたＤＮＡシーケンシングを行う。本システムは，照射部，検出部，ナノ開口デバイスおよびチャンバ部の４つの構成から成る。

励起光源１０１および励起光源１０２から発振するレーザ光をλ／４板１０３，１０４によってそれぞれ円偏光にし，ミラー１０５およびダイクロイックミラー１０６（波長５５０ｎｍ以上を反射）によって２本のレーザ光の光軸を同一にする。前記光軸が同一となった２本のレーザ光をミラー１０７によって入射角度を調整し，レンズ１０８で絞り，プリズム１０９に入射し，さらにナノ開口デバイス１１０に入射する。プリズム１０９とナノ開口デバイス１１０の間はマッチングオイルで満たされており，前記２つの界面では全反射が起こらないようにしてある。本実施例では励起光源１０１として波長４８８ｎｍのＡｒ−ｉｏｎレーザを，励起光源１０２として波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザを使用したが，もちろんＹＡＧレーザ，半導体レーザを用いても良い。

チャンバ部は，カバープレート１１５と検出窓１１６と溶液交換用口である注入口１１２と排出口１１３から構成される。カバープレート１１５の材質として，アクリル樹脂を使用した。検出窓１１６は，光学的に透明な材質が望ましく，ここでは，石英ガラス性のカバーガラスを使用し，その厚さは０．１７ｍｍとした。スペーサ１１１を用いて，ナノ開口デバイス１１０とカバープレート１１５の間に隙間を設け，サンプル溶液等が流れる流路１１４（高さ：２５μｍ）を作製した。

ナノ開口デバイス１１０表面での発光は，対物レンズ１１７（×４０，ＮＡ０．９５）で集光されて，平行化された後に，ノッチフィルタ１１８（波長４８８ｎｍのみをカット），１１９（波長６３３ｎｍのみをカット）によって発光のうち励起光と同一の波長を持つ成分（弾性散乱光）が除去される。その後に分散素子１２０で波長ごとに異なる方向へ分散させ，結像レンズ１２１でイメージセンサ１２２の光電面上に結像させる。イメージセンサ１２２で得られた画像は，演算，記憶および制御機能を備えたコンピュータとしての機能を有する制御部１２３に記録される。本実施例では分散素子としてプリズムを使用しているが，回折格子でももちろんかまわない。

図２は本実施例におけるナノ開口デバイス１１０の拡大図である。ナノ開口デバイスは，光学的に透明な基板２０１，透明基板２０１上に成膜された低屈折率透明薄膜２０２，低屈折率透明薄膜２０２に成膜された遮光性薄膜２０３，遮光性薄膜に形成されたナノ開口２０４から構成される。低屈折率透明薄膜２０２は，屈折率が透明基板２０１よりも低いものであればよく，また，入射される光に対して透明であればよい。

図３Ａ−図３Ｃにナノ開口デバイス１１０の作製方法を示す。まず，透明基板２０１である石英製基板の片面に塗布防止用フィルム２０６を貼り，ＣＹＴＯＰ（Ｒ）を２００ｎｍの厚さになるよう浸漬引き上げにてコーティングし，低屈折率透明薄膜２０２を透明基板２０１の片面に形成させる（図３Ａ）。低屈折率透明薄膜成膜後に塗布防止用フィルム２０６を取り除く。次いで，低屈折率透明薄膜２０２の表面にスパッタにてアルミニウムを厚さ１００ｎｍになるように成膜し，遮光性薄膜２０３を形成させる（図３Ｂ）。遮光性薄膜２０３は、金属膜を用いることができるが、ここでのアルミニウム以外の材質として，例えば、銀，金，クロム，炭化シリコンなどを用いて遮光性薄膜としても良い。遮光性薄膜２０３上に，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｂｅａｍｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ（ＥＢリソ）技術により直径２００ｎｍのナノ開口２０４を１μｍの間隔で格子状に複数形成する（図３Ｃ）。開口サイズはナノ開口デバイス１１０に入射される光の波長以下であれば良い。
なお，ナノ開口２０４の底面に，単分子のビオチン２０５を固定しておく。後述するように，単分子ＤＮＡポリメラーゼをナノ開口底面２０４に固定する方法として，本実施例ではビオチン−アビジン結合を用いているが，非特異吸着を用いて直接固定する方法を用いても良い。

励起光がナノ開口デバイス１１０に照射されるとナノ開口２０４内部にエバネッセント場が生じる。ナノ開口内部の電界強度（以下，照射強度とする）を時間領域差分法シミュレーションＯｐｔｉＦＤＴＤ（Ｏｐｔｉｗａｖｅ社）によりシミュレートした。図４にシミュレーションに用いたモデルを示す。２ＤＴｒａｎｓｖｅｒｓｅＭｏｄｅにおいて，ガラス基板３０１（屈折率１．４６）上に，低屈折率透明薄膜（屈折率１．３４）３０２，アルミニウム膜３０３（厚１００ｎｍ）の順に積層し，アルミニウム膜に直径２００ｎｍの開口３０４を設けた。アルミニウム膜３０３上面と開口３０４内部には溶媒３０５（屈折率１．３３）が満たされていると想定した。励起光の波長を４８８ｎｍおよび６３３ｎｍとし，入射角度３１１を７０度とした。モデル幅３０８を２μｍ，ガラス幅３０９を１μｍ，モデル長さ３０７を照射光波長４８８ｎｍでは１．０６７０９μｍ，照射光波長６３３ｎｍでは１．３８４１６μｍとし，メッシュサイズを０．００３μｍとした。低屈折率透明薄膜３０２の厚みを０〜５００ｎｍに変化させシミュレーションを行った。

図５Ａ，図５Ｂにシミュレーションにより得られた様々な低屈折率透明薄膜３０２の厚さにおける開口中央部３１０の照射強度と伝播距離の関係を示す。図５Ａは励起光波長４８８ｎｍ，図５Ｂは励起光波長６３３ｎｍのシミュレーション結果である。いずれも，横軸が伝播距離を，縦軸が照射強度を示す。伝播距離の原点０はナノ開口部における低屈折率透明薄膜と溶媒３０５の境界面とした。照射光波長４８８ｎｍにおいて伝播距離５０ｎｍ程度まで照射強度が若干上昇傾向を示すが，それ以外は伝播距離にしたがって急速に照射光強度が減少する。図６に低屈折率透明薄膜３０２の各厚さ（Ｓｐａｃｅ）における開口３０４底部の照射強度の関係を示す。開口底部の照射強度は，開口底部全面の照射強度の平均値とし，低屈折率透明薄膜３０２の厚み０の時の値で規格化した。いずれの励起光波長における開口底部の照射強度は，低屈折率透明薄膜３０２の厚み０から２５０ｎｍ近傍までは増加し，２５０ｎｍ以上になると減少する。図６から，低屈折率透明薄膜３０２の厚さは１００〜４００ｎｍ程度あれば，薄膜が無い場合に比べて１．５以上強度向上を図ることが出来る。また，低屈折率透明薄膜３０２の厚さが２００〜３００ｎｍ程度あれば，薄膜が無い場合に比べて２倍前後の強度向上を図ることが出来る。本実施例において低屈折率透明薄膜３０２の厚みは２００ｎｍであるため，低屈折率透明薄膜が無い時に比べ，照射強度は約２倍程度向上する。

励起光のガラス基板３０１における入射角度３１１は０度よりも大きい場合，上記低屈折率透明薄膜３０２の存在による照射効率向上という効果が得られるが，遮光膜の流路側への励起光の漏れ光を小さく，つまり低背景光にするために入射角度３１１はガラス基板３０１と低屈折率透明薄膜３０２の境界面における臨界角以上が好ましい。

以下，図７Ａ−図７Ｆを用いてＤＮＡシーケンシングの工程を説明する。ストレプトアビジン６０２を加えたバッファを注入口１１２より流路１１４に導入し，ストレプトアビジン６０２をナノ開口の底面６０３に固定されているビオチン６０１に結合させ，ビオチン−アビジン複合体をナノ開口底面６０３に形成させる（図７Ａ）。固定反応後に，余剰のストレプトアビジンを洗浄用バッファにて流路１１４より洗い流した。ビオチン修飾したＤＮＡポリメラーゼ６０４を注入口１１２より流路１１４に導入し，ビオチン−アビジン結合を介して，単分子のＤＮＡポリメラーゼ６０４をナノ開口底面６０３に固定する（図７Ｂ）。固定反応後に，余剰のＤＮＡポリメラーゼを洗浄用バッファにて流路１１４より洗い流した。ターゲット一本鎖鋳型ＤＮＡ６０５にプライマ６０６をハイブリダイゼーションさせて鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体を形成させ，注入口１１２より流路１１４に導入し，前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体とＤＮＡポリメラーゼ複合体を形成させる（図７Ｃ）。固定反応後に，余剰な鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体を洗浄用バッファにて流路１１４より洗い流した。リン酸末端に蛍光標識した４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ−（Ａｌｅｘａ４８８）６０８，ｄＣＴＰ−（Ｃｙ３）６０９，ｄＧＴＰ−（Ｃｙ５）６０７，ｄＴＴＰ−（Ｃｙ５．５）６１０）を注入口１１２より流路１１４へ導入して伸長反応を行うと同時に，励起光を照射しナノ開口内部にエバネッセント場６１１を形成した（図７Ｄ）。プライマ６０６の３’末端の塩基の次に位置するところの相補的な位置にある一本鎖鋳型ＤＮＡ６０５の配列上の塩基と相補的なｄＮＴＰが伸長反応によって前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれると同時に，前記取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体はエバネッセント場６１１に進入するため発光する（図７Ｅ）。この時，発光の有無とその発光蛍光の波長の特定をすることにより，ナノ開口内の鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰの種別を判断する。前記伸長反応と同時に前記取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体はリン酸末端に標識されているため，ｄＮＴＰから切断され，伸長反応が続く（図７Ｆ）。本システムでは，複数のナノ開口底面６０３からの発光を同時計測できるため，各ナノ開口底面６０３にそれぞれ異なる鋳型ＤＮＡを固定した場合，前記複数の異なる鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰの塩基種を，つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を同時に決定できる。

本実施例で示した照射方式において，励起光強度は，ナノ開口底面から離れるに従って指数関数的に減少するため，ナノ開口より上方には励起光は存在しない。また，蛍光検出光軸と垂直方向においてナノ開口外部に励起光は伝播されないため，遮光性薄膜２０３に非特異吸着した蛍光体やゴミは励起されない。そのため，背景光の上昇を抑えることが可能となる。さらに，透明基板２０１と遮光薄膜２０３の間に低屈折率透明薄膜２０２を設けることにより，照射効率が向上するため，低出力の励起光源でもナノ開口底面に固定された鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を高感度に検出することができる。

本実施例では，より照射効率を向上させる方法を用いてＤＮＡシーケンシングを行う。照射効率向上の方法としては本発明とプラズモン共鳴を利用する。ナノ開口デバイスの形状以外は，実施例１と同等である。

図８に本実施例におけるナノ開口デバイスの構造を示す。また，図９Ａ−図９Ｄに本実施例のナノ開口デバイスの作製方法を示す。実施例１と同等の方法でナノ開口デバイスを作製した後に，レジスト２０７をナノ開口デバイスの遮光性薄膜２０３上面に塗布し（図９Ａ），ＥＢリソ技術によりナノ開口２０４の中心に直径５０ｎｍの開口２０８をレジスト上に設ける（図９Ｂ）。スパッタにより銀２０９を厚さ５０ｎｍになるように成膜し（図９Ｃ），レジストを剥離する。上記方法によりナノ開口２０４底面中心部に直径５０ｎｍ高さ５０ｎｍ円柱形状の構造体７０１を形成させる（図９Ｄ）。次いで，構造体７０１の上面縁にビオチン７０２を固定する。構造体７０１の材質としては，アルミニウム，金，白金，タングステンなどの金属であれば良く，形状は円錐や立方体などの微細な突起でも，微粒子を用いても良い。また，構造体７０１の大きさはナノ開口の直径よりも小さければ良い。

照射効率向上の効果を確認するため，実施例１の図４と同等のシミュレーションを行った。図１０にシミュレーションに用いたモデルを示す。開口中央に構造体８０１を設けた以外は実施例１図４と同等である。開口中央部に設けた構造体８０１の材質を銀，構造体幅８０２を０．０５μｍ，構造体長さ８０３を０．０５μｍとした。図１１にシミュレーションにより得られた（構造物あり）照射強度と伝播距離の関係を示す。比較対象として実施例１図４で得られた結果（構造物なし）も示す。構造物なしでは，実施例１図４開口中央部３１０の照射強度を，構造物ありでは図１０構造体左端部８０４の照射強度を示す。いずれの場合も励起光波長は４８８ｎｍとし，低屈折率透明薄膜３０２の厚みは２００ｎｍとした。また，伝播距離の原点０はナノ開口部における低屈折率透明薄膜と溶媒３０５の境界面とした。構造物ありでは，構造体８０１の上面縁の照射強度がプラズモン共鳴により構造物なしに比べて３０倍程度高いことが分かる。

本デバイスを用いる事により，ターゲット蛍光体に対して非常に効率的に励起光を照射することが可能となり，低出力の励起光源でも銀構造体縁に固定された鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を高感度に検出することができる。

本実施例では，本発明とターゲット蛍光体の発光検出効率を向上させる方法を用いてＤＮＡシーケンシングを高感度に行う。ナノ開口デバイスの形状以外は，実施例１と同等である。

図１２に本実施例におけるナノ開口デバイスの構造を示す。また，図１３Ａ−図１３Ｃに本実施例のナノ開口デバイスの作製方法を示す。実施例１と同等の方法でナノ開口デバイスを作製した後に，ナノ開口デバイス１１０の透明基板２０１側面に塗布防止用フィルム２０６を貼り，ＣＹＴＯＰ（Ｒ）２１０を浸漬引き上げにてコーティングする（図１３Ａ）。前記コーティング後に前記塗布防止用フィルムを取り除く。ＣＹＴＯＰ（Ｒ）コーティング後に，遮光性薄膜２０３と等しい高さになるまで，余剰のＣＹＴＯＰ（Ｒ）を研磨し，ＣＹＴＯＰ（Ｒ）の溶液層側表面と遮光性薄膜２０３の溶液層側表面が，ほぼ同一平面になるように表面を平面にし，透明充填相１００１を形成する（図１３Ｂ）。次いで，透明充填層１００１表面に一分子のビオチン１００２を固定する（図１３Ｃ）。透明充填層１００１の材質として，光学的に透明な材質であれば良く，本実施例では，低屈折率透明薄膜と同じＣＹＴＯＰ（Ｒ）を使用した。

照射効率を求めるため，実施例１の図４と同等のシミュレーションを行った。図１４にシミュレーションに用いたモデルを示す。開口３０４内に透明充填層１１０１を設けた以外は実施例１の図４と同等である。開口３０４内に設けた透明充填層１１０１の材質を低屈折率透明薄膜３０２と同一（屈折率１．３４）とした。図１５にシミュレーションにより得られた（充填剤あり，薄膜あり）照射強度と伝播距離の関係を示す。比較対象として実施例１図４で得られた結果「充填剤なし，薄膜あり」ならびに「充填剤なし，薄膜なし」を示す。「薄膜あり」では低屈折率薄膜３０２の厚みを２００ｎｍ，「薄膜なし」では低屈折率薄膜３０２の厚みを０ｎｍとした。いずれの場合も，照射強度は開口中央部（図４開口中央部３１０，図１４開口中央部１１０２）での値を求め，励起光波長は４８８ｎｍとした。また，伝播距離の原点０はナノ開口部における低屈折率透明薄膜と溶媒３０５の境界面とした。「充填剤あり，薄膜あり」の前記境界面での照射強度は，「充填剤なし，薄膜あり」に比べて約５／６程度減少するが，「充填剤なし，薄膜なし」に比べて２倍程度向上する。これに加え，特許文献２で示すように「充填剤あり，薄膜あり」では，前記境界面上での発光蛍光の検出効率が向上する。

本デバイスを用いる事により，ターゲット蛍光体に対して非常に効率的に励起光を照射することが可能となり，また検出効率も向上するため，低出力の励起光源でも固定された鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を高感度に検出することができる。

この他に実施例２に示すようなプラズモン共鳴を起す励起光波長以下の微細金属構造体を図１２に示す透明充填層１００１表面に固定し，前記微細金属構造体の表面で蛍光発光を行うことにより，より高感度検出が可能となる。

尚、これらの実施例においては、生体試料としてＤＮＡを用いているが、その他にも、ＲＮＡ、タンパク質等の分析にも用いることができる。

本発明は、前述の説明および実施例に特に記載した態様以外でも実施できることは明らかである。そのため、本発明の多くの改変および変形が可能であり、したがって、それらも本件添付の特許請求の範囲内のものである。

ＤＮＡシーケンサ等への利用が可能と考えられる。

１０１：励起光源
１０２：励起光源
１０３：λ／４
１０４：λ／４
１０５：ミラー
１０６：ダイクロイックミラー
１０７：ミラー
１０８：レンズ
１０９：プリズム
１１０：ナノ開口デバイス
１１１：スペーサ
１１２：注入口
１１３：排出口
１１４：流路
１１５：カバープレート
１１６：検出窓
１１７：対物レンズ
１１８：ノッチフィルタ
１１９：ノッチフィルタ
１２０：分光素子
１２１：結像レンズ
１２２：イメージセンサ
１２３：制御部
２０１：透明基板
２０２：低屈折率透明薄膜
２０３：遮光性薄膜
２０４：ナノ開口
２０５：ビオチン
２０６：塗布防止用フィルム
２０７：レジスト
２０８：開口
２０９：銀
２１０：ＣＹＴＯＰ（Ｒ）
３０１：ガラス基板
３０２：低屈折率透明薄膜
３０３：アルミニウム膜
３０４：開口
３０５：溶媒
３０７：モデル長さ
３０８：モデル幅
３０９：ガラス幅
３１０：開口中央部
３１１：入射角度
６０１：ビオチン
６０２：ストレプトアビジン
６０３：ナノ開口底面
６０４：ＤＮＡポリメラーゼ
６０５：一本鎖鋳型ＤＮＡ
６０６：プライマ
６０７：ｄＧＴＰ−Ｃｙ５
６０８：ｄＡＴＰ−Ａｌｅｘａ４８８
６０９：ｄＧＴＰ−Ｃｙ３
６１０：ｄＴＴＰ−Ｃｙ５．５
６１１：エバネッセント場
７０１：構造体
７０２：ビオチン
８０１：構造体
８０２：構造体幅
８０３：構造体長さ
８０４：構造体左端部
１００１：透明充填層
１００２：ビオチン
１１０１：透明充填層
１１０２：開口中央部

Claims

入射される光に対して透明な透明基板と、
生体試料を配置させる開口を設けた非導光膜と、
前記透明基板と前記非導光膜との間で、前記開口領域を含む領域に設けられ、前記基板の屈折率よりも低い屈折率を有し、前記基板を通して入射される光に対して透明なスペーサ層とを備えた蛍光検出デバイス。
前記入射される光の角度は、前記基板と前記スペーサ層の境界面における臨界角以上であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出デバイス。
前記開口の径は、入射される光の波長以下の大きさであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出デバイス。
前記非導光膜は、金属膜であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出デバイス。
前記開口には、前記生体試料を設置する構造体が設けられていることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出デバイス。
前記構造体は、金属であることを特徴とする請求項５記載の蛍光検出デバイス。
前記開口は、前記基板より入射される光に対して透明な材料で充填されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出デバイス。
前記充填された開口上に前記生体試料を配置する構造体が設けられていることを特徴とする請求項７に記載の蛍光検出デバイス。
光源と、
生体試料を設置するデバイスと、
前記光源からの光が前記生体試料に照射されて発光した蛍光を検出する検出器と、
前記検出器から検出された蛍光を分析する計算器とを有し、
前記デバイスは、前記光源から入射される光に対して透明な透明基板と、前記生体試料を配置させる開口を設けた非導光膜と、前記透明基板と前記非導光膜との間で、前記開口領域を含む領域に設けられ、前記基板の屈折率よりも低い屈折率を有し、前記基板を通して入射される光に対して透明なスペーサ層とを備えたことを特徴とする分析システム。
前記光源から前記デバイスに対して照射される光の入射角度は、前記基板と前記スペーサ層との境界面における臨界角以上であることを特徴とする請求項９記載の分析システム。
前記デバイスと前記検出器との間にはカバープレートを備え、前記カバープレートと前記デバイスとの間において溶液の流路を構成することを特徴とする請求項９記載の分析システム。
前記生体試料はＤＮＡであって、前記計算器は、前記検出器によって検出された蛍光に基づいて、前記ＤＮＡの配列決定を行うことを特徴とする請求項９に記載の分析システム。