JP2003507705A - 複数の分析物を測定するためのデバイス及び方法 - Google Patents
複数の分析物を測定するためのデバイス及び方法Info
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Abstract
Description
いて、異なる分析物の特異的認識と結合とのための異なる生物学的又は生化学的
認識要素が、これらの標本区画において5つ以上の離散的な測定領域に固定化さ
れ、前記測定領域におけるこれらの生物学的又は生化学的認識要素は、直接的に
、又は付着促進層と場合によってはさらなる層とによって、前記標本区画の境界
を形成するセンサープラットフォームの一部として、光導波路の表面上に固定化
されている。かくしてセンサープラットフォームは、異なる実施形態で提供する
ことができる。
よるデバイスと、少なくとも1つの励起光源と測定領域から発せられる光を検出
する少なくとも1つの検出器とを有するルミネセンスの測定のための光学系と、
センサープラットフォーム上の測定領域と1以上の標本を接触せしめる供給手段
と、を含む分析システムにも関する。本発明のさらなる目的は、本発明によるセ
ンサープラットフォームと、光学系と、分析システムとを用いたルミネセンスの
検出のための方法、及び定量的親和力の検知やその他の利用分野のためのこれら
の方法の使用である。
のであり、複数の少量標本区画を有する測定構成を提供することにある。
いわゆるマイクロタイタープレートの「ウェル」内で実施されるような方法が主
として現在用いられている。最も一般的には、単一のウェルを満たすのに数百マ
イクロリットルの量が必要とされる標準的に約8cm×12cmの占有面積に対し8
×12ウェルのピッチ(幾何上の行と列の配置)を有するプレートである。しか
しながら、数多くの応用分野において、できるかぎり少ない標本量を用いて単一
の標本区画内の多くの分析物を測定できることが望ましい。
から複数のマーカーを測定することに基づき心筋梗塞を早期認識するための測定
用配置及び方法が記述されており、ここでは、これらのマーカーの測定は、個別
標本区画内又は共通の標本区画内で実施でき、単一の(共通の)標本区画は、後
者のケースについての開示に従うと、連続した流路として具備され、その1つの
境界は例えば、3つの異なるマーカーについての抗体が上に固定化されている膜
によって形成されている。しかしながら、共通の支持体上にこのタイプの複数の
標本区画又は流路の配置についての提案は全く存在しない。さらに、測定領域の
サイズに関する幾何学的情報も全く存在しない。
37,551号及び米国特許第5,432,099号においては、固体支持体上
において、部分的に1mm2を大きく下回る小さな「スポット」の形状における分
析物についての特異的認識要素を固定化することが提案されている。この固定化
した形状の目的は、インキュベーション時間のみに依存し、絶対的標本量(連続
流がない状態で)とは基本的に無関係であるようなやり方で、存在する分析物分
子のわずかな部分のみを結合させながら、分析物の濃度を測定できるということ
にある。関連した例で開示されている測定用配置は、従来のマイクロタイタープ
レート内での螢光測定による測定に基づいている。そのために、最高3つの異な
る螢光標識づけされた抗体のスポットが共通のマイクロタイタープレートウェル
内で測定されるような配置も記述されている。これらの特許明細書において理論
的論証に従って、スポットサイズを最小限にすることが望ましいと思われる。し
かしながら、背景信号から区別しなければならない最低の信号の大きさのために
、スポットサイズについてさらに低い限界が設定されることになる。
とのその相互作用に基づき、これが光導波路内の光の誘導と結びつけられており
、又ここで、分析物分子の特異的認識及び結合のための生化学又は生物学的認識
要素が導波路の表面上に固定化されているような数多くの測定用配置が開発され
てきた。
いる平面の薄膜導波路内に結合されている場合、導波層の界面での全反射によっ
て誘導される。この配置では、わずかな電磁エネルギーが、より低い屈折率の媒
質内に進入する。この部分はエバネッセント(減衰)場と呼ばれる。エバネッセ
ント場の強度は、導波層自体の厚さ及び導波層とそれをとり囲む媒質の屈折率の
比によって大幅に左右される。薄い導波管の場合、すなわち層厚さが誘導すべき
光の波長と同じか又はそれよりも小さい場合、誘導される光の離散的モードを区
別することができる。かかる方法の利点は、分析物との相互作用が、およそ数百
ナノメートルにある隣接媒質内へのエバネッセント場の進入深度に制限され、(
バルク)媒質の深いところからの干渉信号を主として回避できる点である。この
タイプの第1の提案されている測定用配置は、数百マイクロメートルから数ミリ
メートルまでの厚さをもつ透明なプラスチック又はガラスの繊維又はプレートの
如ききわめて多モードの自立式単層導波路を基礎とするのであった。
ティ内に引き込まれ、光透過性の側壁が自立式多重モード導波路として設けられ
、少なくともキャビティに面するこの側壁(「パッチ」)の一部の表面上におい
て、標本からの分析物の認識及び結合のための生化学認識要素が固定化されてい
る測定用配置が開示されている。複数の離散的なパッチの配置を有するアレイの
製造について記述されているが、さらなる説明によると、パッチが、毛細管のカ
バープレートとベースプレートの組合せのために設けられた連結用リンクによっ
て互いに横方向に分離されており、このため、アレイの分離後に、毛細管の各々
が、固定化された認識要素の1つのパッチのみを収納することが教示されている
。さらに、この配置の欠点は、毛細管内に引き込まれた液体の交換が用意されて
おらず、例えば多重工程分析試験にはかかる交換が望ましいという点である。
要素を有する「パッチ」が自立式光学基板導波路(単層導波路)上に固定化され
、励起光は末端表面で内部結合し(「前面」又は「末端端部」結合)、横方向に
選択的な固定化が光活性化可能な架橋剤を用いて実施される測定用配置が開示さ
れている。開示によると、いくつかのパッチを共通の平行な流路又は標本区画内
に行の形のように配置することができ、平行な流路又は標本区画は、導波路内の
光誘導を損なうことがないようにするため、センサーとして使用される導波路上
の範囲の全長にわたり伸長している。しかしながら、比較的小さいサイズ、即ち
、1cm2のベース面積よりも著しく小さいサイズの標本区画内に複数のパッチを
2次元に集積することについての示唆は全くない。WO97/35203に開示
されている類似の配置においては、配置についてのいくつかの実施形態が開示さ
れており、これは、異なる分析物を測定するための異なる認識要素が、低い分析
物濃度、場合によっては高い分析物濃度の検量用溶液のため及び標本のための分
離した平行流路又は標本区画の中に固定化されているものである。ここでも、標
本収容用の共通区画内で異なる認識要素に高い集積密度をいかに達成するかにつ
いての示唆は全く示されていない。さらに、非常に多モードの自立式単層導波路
の感度は、非常に低い検出限界を達成する必要のある数多くの利用分野にとって
充分なものではない。
提案されてきた。最も単純なケースでは、平面型薄膜導波路は、支持部材(基板
)、導波層、上層(それぞれ分析すべき標本)といった3層系から成り、導波層
は最も高い屈折率を有している。付加的な中間層がさらに、平面型導波路の作用
を改善することができる。
最も早期に使用されていた方法は、前面結合又はプリズム結合に基づくものであ
り、エアギャップに起因する反射を低減すべくプリズムと導波路との間に液体を
一般に採り入れたものであった。これら2つの方法は主として、比較的厚い層厚
の導波路、すなわち特に自立式導波路と、屈折率が2よりも極めて小さい導波路
と、に適している。しかしながら、高屈折率の非常に薄い導波層に励起光を内部
結合するためには、結合格子を使用することがはるかに簡潔な方法である。
定の異なる方法を区別することができる。適用される測定原理に基づいて、例え
ば、一方では螢光やより一般的なルミネセンス方法、そして他方では屈折方法を
判別することができる。このため、表面プラズモン共鳴を生成するための発射さ
れた励起光の共鳴角を測定対象量とした場合には、屈折率がより低い誘電層上に
おける薄い金属層内での表面プラズモン共鳴の生成方法を屈折方法の群内に含め
ることができる。表面プラズモン共鳴も同様に、ルミネセンスの増幅のためや、
ルミネセンス測定における信号対バックグランドの比の改善のために使用可能で
ある。表面プラズモン共鳴の生成のための条件と、導波構造だけでなくルミネセ
ンス測定との組合せと、については、文献、例えば米国特許第5,478,75
5号、5,841,143号、5,006,716号及び4,649,280号
の中で記述されている。
は生化学又は熱励起の如き光励起以外の励起の後に、紫外線から赤外線までの範
囲内での光子の自然発出を意味する。例えば、化学ルミネセンス、生物ルミネセ
ンス、電気ルミネセンス、さらに、特に螢光及びリン光が「ルミネセンス」とい
う語の中に内含される。
の結果としてもたらされる有効屈折率の変化が、分析物検出のために使用される
。有効屈折率のこの変化は、格子結合器センサーの場合には格子結合器センサー
内へ又は外への内部結合又は外部結合のための結合角度の変化から測定され、干
渉計センサーの場合には検知用分岐及び干渉計の基準用分岐の中に誘導された測
定光の間の位相差の変化から測定される。
ための技術的現状は、例えば、K.Tiefenthaler, W.Lukosz,「集積光化学センサ
ーとしての格子結合器の感度」、J. Opt. Soc. Am.B6、209(1989);W
.Lukosz, Ph.M.Nellen, Ch.Stamm, P.Weiss「集積光化学センサーとしての平面
導波路上の出力格子結合器」、Sensors and Actuators B1、585(1990
);及びT. Tamir, S.T.Peng,「格子結合器の分析と設計」Appl. Phys.14、2
35−254(1977)の中で記述されている。
イクロタイタープレートと、ベースプレートとしての薄膜導波路と、から成る配
置が開示されており、後者の薄膜導波路は、透明な自立式基板上の薄い導波フィ
ルムで構成されている。観察された結合角度の変化の結果から、測定すべき分析
物分子の吸着又は脱着に起因する有効屈折率の変化を測定するために、励起光の
内部及び外部結合のための回折格子は、孔を有するマイクロタイタープレートと
ベースプレートとしての薄膜導波路とによって形成された開放標本区画に接触し
た状態で設けられている。格子構造上で標本区画内に認識要素を結合すると、1
つの標本区画内で複数の分析物を測定することに注意が払われておらず、屈折測
定原理、すなわち結合角度の相対的な変化の測定のため、ほとんど実施できない
ものと思われる。
使用することなく適用できるという利点を有している。しかしながら、これらの
無標識方法の欠点は、測定原理の選択性がさらに低いことに起因して、達成可能
な検出限界が、分析物の分子量に応じてピコないしはナノモル濃度範囲に制限さ
れており、例えば診断の応用分野といったような近代の微量成分分析の数多くの
応用分野にとって不充分であるという点にある。
成の選択性がより高いものであるために、より適切なものと思われる。この配置
では、ルミネセンス励起は、より屈折率の低い媒質内へのエバネッセント場の進
入深度、すなわち、媒質内への進入深度が約数百ナノメートルの導波部域のすぐ
近傍に制限される。この原理は、エバネッセントルミネセンス励起と呼ばれてい
る。
めて屈折性の高い薄膜導波路を用いることにより、近年、感度を著しく増大させ
ることができた。例えば、WO95/33197では、回折光学素子としてのレ
リーフ格子によって励起光が導波フィルム内に結合される。センサープラットフ
ォームの表面は、分析物を含有する標本に接触し、エバネッセント場の進入深度
内に位置づけられたルミネセンス能力をもつ物質から等方発出されたルミネセン
スは、フォトダイオード、光電子増倍管又はCCDカメラの如き適切な測定用配
置によって測定される。導波路内にバック結合されたエバネッセント励起された
放射の一部も同様に、格子のような回折光学素子によってアウト結合され測定さ
れ得る。この方法は、例えばWO95/33198号の中で記述されている。
として記述されたエバネッセンス励起されたルミネセンスの検出のための全ての
方法の欠点は、均質なフィルムとして層が形成されたセンサープラットフォーム
の導波層上ではつねに1つの標本しか分析できないという点にある。同じセンサ
ープラットフォーム上でさらなる測定を行うためには、単調で退屈な洗浄又は清
浄工程を連続して必要とする。このことは、特に第1の測定における分析物とは
異なる分析物を測定しなくてはならない場合にあてはまる。免疫検定においては
、これは一般に、センサープラットフォーム上に固定化された層全体を交換しな
ければならないこと、さらには丸ごと新しいセンサープラットフォームを使用し
なければならないことを意味している。
導波路で同時に又は逐次的にルミネセンスベースの複数の測定を専ら実施するた
めに、励起光が別々に発射される少なくとも2つの離散的な導波部域が1つのセ
ンサープラットフォーム上に設けられた配置(アレイ)が提案されてきた。しか
しながら、離散的な導波部域へのセンサープラットフォームの分割が結果として
もたらす欠点は、共通のセンサープラットフォーム上における離散的な導波領域
内に離散的な測定領域を備えるためには比較的広いスペースが必要となり、その
ため再び比較的低い密度の異なる測定領域(つまりいわゆる「特徴」)しか行え
ない点にある。
は生化学的又は合成の認識要素により占有されている領域によって、空間的に分
離した測定領域(d)が画定されることになる。これらの領域は、例えば、点、
円、矩形、三角形、楕円又は線といった形のあらゆる幾何形状を有することがで
きる。
用配置のための標本区画の設計のための数多くのその他の配置に加えて、WO9
8/22799では、既知のマイクロタイタープレートの形状を有する配置も提
案されている。しかしながら、単一の標本区画内で固定化された異なる認識要素
に結合された複数の分析物の測定は、この開示中においても同様に扱かわれてい
ない。
析物を同様に測定することができ、適切なセンサープラットフォームと組合わさ
れた小容積の標本区画を提供する必要性が存在する。
元アレイの一部として単一の標本区画内の異なる生物学的又は生化学的認識要素
を有する複数の測定領域の配置によって、特に薄膜導波路である適切な導波路の
エバネッセンスフィールドの非常に効率の良い螢光励起の選ばれた組合せに基づ
いて、(従前のマイクロタイタープレート上でのELISA試験といったような
)既知の古典的配置及び方法に比べて著しく低い検出限界及び高い測定領域集積
密度を達成することができることが発見された。これにより、分析を単純化すべ
く付加的な洗浄工程なく実際の生物学的親和性分析のためにルミネセンス標識付
けされた結合パートナーを添加した上で、ある一定の分析の検出工程中のルミネ
センスによる分析物の測定を実施することができる。
に、単一の標本区画内に異なる生物学的又は生化学的認識要素及び複数の測定領
域を配置することに基づいて、単一の標本の添加後に単一の測定において生成可
能である。それによって生成されたデータは、離散的な標本区画内の対応する数
の単一の測定の結果よりも低い変動性によって特徴づけられており、これは互い
に独立した測定値の変動性及び誤差の数多くの潜在的な付加的な原因が同時測定
においては除外され得るからである。かくして、上述の既知の分析方法(例えば
ELISA)と比較して、分析時間及び標本及び試薬の所要量の著しい削減を達
成することができる。特に、非特異的結合、交差反応性、標本溶液のpH又はP
O2の測定といったような化学パラメータの測定のための基準用測定は、かかる
基準用測定のための標本区画内に1以上の測定領域を設けると、あらゆる単一標
本区画内で実施することができる。かくして、かかる測定が異なる標本区画内で
実施される従来の方法と比べて、これらの基準用測定の信頼性を著しく改善し得
る。
数及び処理量を著しく改善することができる。かくしてプレート間における標準
的に大きい変動を除去することによる他のものに加えて、測定の再現性と異なる
標本での結果の比較可能性とを著しく改善することができる。例えば、単一のセ
ンサープラットフォーム上の400個の測定領域の各々を含む96個の標本区画
の場合、標準的に400個のマイクロタイタープレートを必要とする例えば薬品
開発用の広範な連結した測定を単一のセンサープラットフォーム上で実施するこ
とができる。標本及び試薬の量の著しい削減及びそれに付随する標本調製のため
の労力の削減に加えて、結果の信頼性及び精度は、上述の理由から著しく改善さ
れる。
び方法では提供できない次のような機能を提供する: − 単一のセンサープラットフォーム/デバイス上での高速分析の展開; − 単一のセンサープラットフォーム/デバイス上での未知の標本の用量応答曲
線の測定、クロストーク及び分析; − 単一で少量の標本内でのきわめて感度の高い多重分析物測定; − 単一のセンサープラットフォーム上での広範な測定セットの実行。
、前記プラットフォームに直接的に又は封止媒体によって接続された層(g)(
図1に従う)と、を含み、前記層は、緊密シールを直接的に形成し又は封止媒体
によって密封層を形成し、センサープラットフォームに向かって少なくとも開放
された複数の凹部を含み、対応する複数の標本区画を2次元配置で形成するデバ
イスであって、前記標本区画の各々において、異なる分析物の特異的認識と結合
とのための異なる生物学的又は生化学的認識要素が、これらの標本区画においけ
る5つ以上の離散的な測定領域(d)(図1に従う)に固定化され、前記測定領
域は、前記標本区画の境界表面を形成するセンサープラットフォームの一部とし
て、光学的に相互作用して前記光導波路から励起光を発し、前記標本区画は、収
容した標本又は試薬溶液を除去し、かつ次いで、場合によっては洗浄工程を経る
ことなく、同じ前記標本区画に引き続いて供給される標本又は試薬溶液を収容す
るように作動し得るデバイスである。
のが、基準のために使用することができる。
ラットフォームにわたって分布した複数の標本区画内で使用され、センサープラ
ットフォームにわたって前記化学的又は光学的パラメータの横方向の分布を測定
することができるときに、有利となる。例えば、利用できる励起光の強度は、測
定されるべき光学パラメータとして理解されるべきものである。このようにして
測定された化学パラメータの分布から、特に、異なる標本、例えば、標本の準備
の結果として異なる標本区画に加わえられる標本の組成、濃度又は体積の相違を
考慮に入れることができる。
いて光学的に相互作用して励起光のエバネッセント場を誘導するものである。
ガラス、又は有機材料、好ましくはポリメチルメタクリレート、ポリカーボネー
ト若しくはポリスチレンを含む群から選択されるプラスチックを含む多重モード
又は単一モードの導波路であり、これらの材料は、少なくとも励起及びルミネセ
ンス波長において光透過性を示す。この場合に、センサープラットフォームの一
部としての光導波路は、自己支持するものでよい。
波路が、層(a)よりも低い屈折率を有する第2の光透過層(b)(図1に従う
)の上の第1の光透過層(a)(図1に従う)を有するフィルム光導波路である
ものである。
ト、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート若しくはポリスチレンを含む群の透
明な熱可塑性プラスチックを含むこととしてもよい。
は、導波性光透過層(a)の屈折率が、隣接する層の屈折率よりも極めて大きい
ものであることが望ましい。第1の光透過層(a)の屈折率が、1.8より大き
いときには、特に有利となる。
HfO2、又はZrO2を含むことが好ましい。特に、第1の光透過層(a)が、
Ta2O5又はNb2O5を含むことが好ましい。
る隣接層と層(a)との間の界面で可能なかぎり強いエバネッセント場を生成す
るための第2の制御パラメータである。層厚さが、励起波長の少なくとも1つの
モードにおける誘導にとって充分であるかぎり、導波層(a)の厚さが減少する
に従って、エバネッセント場の強度は増大する。このようにして、1つのモード
を誘導する最小の「カットオフ」層厚さは、このモードの波長に依存する。「カ
ットオフ」層厚さは、より短かい波長の光の場合よりも長い波長の光の場合の方
が大きい。しかしながら、「カットオフ」層厚さに近づくにつれて、同様に望ま
しくない伝搬損失も強く増大し、かくして、好ましい層厚さを選択するための下
限が更に設定される。好ましいのは、所定の励起波長において1モードから3モ
ードまでのもののみを誘導することができる光透過層(a)の層厚さである。特
に、好ましいのは、この所定の励起波長について単一モード導波路に至らしめる
層厚さである。誘導された光の離散的なモードの特性が、横方向モードを基準と
するもののみであることがわかる。
0nm、好ましくは100〜200nmである。第1の光透過層(a)の厚さが10
0〜200nmの間にあるときに、特に有利となる。
層の表面粗さによって、及びこの支持層中に含まれ得る発色団の吸収によって大
きく決定され、これは、(この支持層内への)層(a)で誘導されたモードのエ
バネッセント場の進入したときにおけるこの支持層内の望ましくないルミネセン
スの励起の危険性と付加的に結びつけられる。さらには、光透過層(a)及び(
b)の異なる熱膨張率に起因して、熱応力が発生しうる。化学的に感応性ある光
透過層(b)の場合、例えば、透明な熱可塑性プラスチックからなる層の場合に
は、層(b)を侵し得る溶剤が進入するのを防ぐ、例えば、光透過層(a)中の
微細孔を通して防ぐことが望ましい。
かつ層(a)に接触し、かつ、厚さが5nm〜10000nm、好ましくは10nm〜
1000nmである付加的な光透過層(b′)(図1に従う)が位置づけられてい
るときには、有利となる。この中間層の目的は、下側に位置づけられた層に対し
層(a)における微細孔を密封することにより、表面粗度を層(a)よりも小さ
く減少させること、又は下側に位置づけられた1以上の層へ層(a)内で誘導さ
れた光のエバネッセント場が進入することを減少させること、又は下側に位置づ
けられた1以上の層に対する層(a)の付着性を改善すること、又は光センサー
プラットフォーム内で熱により誘発された応力を低減すること、又は下側に位置
づけられた層から光透過層(a)を化学的に分離することにある。
の方法は数多く存在する。例えば、物理的吸着又は静電的相互作用により被着を
なし得る。更に一般には、認識要素の配向性は、統計的なものである。さらに、
分析プロセス内で用いられた試薬及び分析物を含む標本が、異なる組成を有する
ときには、固定化された認識要素の一部分が洗い流される危険性が存在する。従
って、生物学的、生化学的又は合成の認識要素の固定化のために、付着促進層(
f)が、光透過層(a)上に被着されているときには、有利なものとなる。この
付着促進層も透明であるべきである。特に、付着性促進層の厚さは、導波層(a
)から上に位置付けられた媒質内へのエバネッセント場の進入深度を上回ってい
てはならない。従って、付着促進層(a)は、200nm未満、好ましくは20nm
未満の厚さを有するべきである。付着促進層は、シラン、エポキシド及び「自己
組織化した機能化単層」を含む群の化合物を含むことができる。
ンサープラットフォーム上の生物学的、生化学的又は合成の認識要素を横方向に
選択的に被着させることによって生成され得る。ルミネセンス能力を有する分析
物に接触せしめられたとき、又は固定化された認識要素に対する結合のため分析
物と競合する分析物のルミネセンスによりマーキングされた類似体に接触せしめ
られたとき、又は多工程分析においてルミネセンスによりマーキングされた結合
パートナーに接触せしめられたときに、ルミネセンス能力を有するこれらの分子
は、固定化された認識要素によって占有された領域によって画定される測定領域
内でのみ選択的にセンサープラットフォームの表面に結合する。
ポッティング、ピン若しくはペンによる機械的スポッティング、マイクロ接触印
刷、又は平行若しくは交差微細流路内に供給された時点、圧力差の適用時点又は
電気若しくは電磁ポテンシャルの印加時点でのの生物学的又は生化学的又は合成
の認識要素と測定領域との流動的接触、を含む方法の群のうちの1以上の方法が
、適用され得る。
べく、核酸(DNA、RNA)、核酸疑似体(ペプチド核酸、PNA)、抗体、
アプタマー、膜に結合した及び単離されたレセプター、それらのリガンド、抗体
に対する抗原、「ヒスチジンタグ成分」、化学合成によって生成されたキャビテ
ィなどを含む群の成分が被着させら得る。
に記載されている方法によって生成されるキャビティのことである。この手順に
おいては、大部分が有機溶液中にある分析物又は分析物−類似体は、重合体構造
の中に封入されている。このため、それは「インプリント」と呼ばれる。次に分
析物又はその類似体は、適切な試薬の添加時点で重合体構造から溶解させられ、
重合体構造内に空のキャビティを残す。この空のキャビティは次に、分析物の測
定のその後のプロセスにおいて高い立体選択性を有する結合箇所として使用され
得る。
て被着され得る。
利用される分析物又はその他の成分の結合によってひき起こされる信号による分
析方法の検出限界の多くの場合において、生物学的、生化学的又は合成の認識要
素が設けられた領域に結合されているのみならず、これらの認識要素によって占
有されていない、例えば、疎水性吸着又は静電相互作用の時点でセンサープラッ
トフォームの領域内でも結合されている。従って、分析物に関して「化学的に中
性」である化合物が、非特異的結合又は吸着を低減すべく、横方向に分離された
測定領域(d)の間に被着されているときに、有利なものとなる。それ自体分析
物又は分析物の類似体又は多工程分析内のさらなる結合パートナーの認識及び結
合のための特異的結合箇所をもたず、その存在のために分析物又はその類似性又
はさらなる結合パートナーがセンサープラットフォームの表面にアクセスするの
を妨げているような化合物が、「化学的に中性の」化合物と呼ばれる。
チレングリコールを含む群の化合物を、「化学的に中性の」化合物として利用す
ることができる。
の格子構造(c)(図1に従う)によって実施されることが好ましい。
結合された光、特にバック結合されたルミネセンス光が広がったときに発生しう
る。かかるクロストークを防止するためには、光透過層(a)に誘導された光の
外部結合が、光透過層(a)内に形成された格子構造(c′)(図1に従う)に
よって実施されることときに有利となる。その結果、光透過層(a)内に形成さ
れた格子構造(c)及び(c′)が同じか又は異なる周期性を有し、かつ互いに
平行にか又は非平行に配置され得る。
互換性があるようにして使用することができる。
〜1000nmの周期、及び3nm〜100nm、好ましくは10nm〜30nmの格子変
調深度を有するときには、有利となる。
が好ましい。
又は実質的に平面の光透過層(a)内の屈折率の周期的変調を有する位相格子又
は体積格子であってもよい。
金又は銀の層は、場合によっては層(a)、例えばシリカ又はフッ化マグネシウ
ムの層よりも小さい屈折率の付加的誘電層上において、光透過層(a)と固定化
された生物学的又は生化学的認識要素との間に被着されており、金属層と、場合
によっては付加的中間層と、の厚さは、励起波長及び/又はルミネセンス波長に
おいて表面プラズモンが励起されうるように選択されるときには、さらに有利と
なり得る。
あることが有利となる。このとき、格子構造(c)による励起光の内部結合の測
定領域に対する共鳴角度は、格子構造の全領域で均等である。しかしながら、極
めて異なる波長を有する異なる光源からの励起光を内部結合することが意図され
ている場合には、内部結合のための対応する共鳴角度は、極めて異なるものであ
り得、このためセンサープラットフォームを収納する光学系における調整のため
、又は不利な結合角度を空間的に変動させるための付加的なコンポーネントに対
する必要性を招く可能性がある。例えば、結合角度の大きい差を減少させるべく
、格子構造(c)が、多重回折格子であることが有利であり得る。標本との接触
に起因する内部及び外部結合角度の変化を回避しなければならない利用分野につ
いては、格子構造(c)と、場合によっては付加的格子構造(c′)とが、標本
区画の領域の外側に位置づけられていることが有利となり得る。
と、場合によっては付加的格子構造(c′)とが、複数の又は全ての標本区画の
範囲にわたって伸長していることが好ましい。
る範囲にわたって、光透過層(a)に伝搬し得る場合には、上に重なる表面領域
でセンサープラットフォームに接触する緊密封止層(g)の材料が、少なくとも
エバネッセント場の進入深度内の励起されたルミネセンス放射及び励起放射の双
方について光透過性であることが必要である。
の形で設けられ、そのうちセンサープラットフォームの表面に接触する状態とな
る第1の層は、励起放射及び励起されたルミネセンス放射に対し透過性であり、
一方センサープラットフォームからさらに離れて位置づけられる隣接層は、励起
放射及び励起されたルミネセンス放射のスペクトル範囲内で吸収性であることが
有利となる。
て生成されたルミネセンス光の伝搬が、層(a)内で単一の標本区画の範囲に制
限され得る利用分野のためには、センサープラットフォームに接触する緊密封止
層(g)の材料が、励起放射及び励起されたルミネセンス放射のスペクトル範囲
内で吸収性であることが有利となる。
であるときには、有利となるる。
リシロキサンを含むことが特に好ましい。
位置づけられることが好ましい。
異なる測定領域が、類似の又は異なるサイズをもち得ることが好ましい。
双方で作動できる。第1の場合には、デバイスは、光透過層(a)から離れて面
した側で、標本区画は、標本、又は場合によっては付加的な試薬の供給又は除去
のための入口及び出口の開口部を除いて閉じられており、標本、及び場合によっ
ては付加的な試薬の供給又は除去が、閉鎖型フロースルーシステム内で実施され
、かつ共通の入口及び出口の開口部を有する測定領域又はセグメントに液体を供
給する場合には、前記入口及び出口の開口部が、好ましくは行毎又は列毎に指定
される。
又は電磁ポテンシャルの影響を受ける平行又は交差型微細流路の中で実施される
。
(a)から離れる方に面する側で、標本又はその他の試薬の供給又は除去を局所
的に指定する開口部を有するようになされている。さらに、分析中に加湿されか
つ測定領域に接触される試薬のための区画が設けられていてもよい。
れ、光学系内の調整が容易になり、かつ/又は標本区画の凹部を含む層(g)に
センサープラットフォームを組合せることが容易になると有利である。
ムであって、 − 少なくとも1つの励起光源、 − 上に開示した実施例の1つのデバイス、 − センサープラットフォーム上の少なくとも1つ以上の測定領域(d)から
発出する光を記録するための少なくとも1つの検出器、 を含む分析システムである。
光であり、光透過層(a)内への内部結合のために、共鳴角度で1以上の測定領
域上に向けられているときには、有利となる。
つの光源の励起光が、拡大用光学部分により実質的に平行な光束まで広げられ、
光透過層(a)内に内部結合する共鳴角度で1以上の測定領域上に向けられてい
ることが好ましい。
様に、少なくとも1つの光源からの励起光が、1つの光源の場合には1つの又は
複数の光源の場合には複数の回折光学素子好ましくはダマン格子又は屈折光学素
子好ましくはマイクロレンズアレイによって、共通の光源から発せられた個別ビ
ームは可能なかぎり同じ強度で複数の個別ビームへと分割され、該個別ビームは
、互いに実質的に平行に、横方向に分離された測定領域上へと向けられるときに
も、有利となり得る。
る場合、例えば、生物学的利用分野の場合には、等しいか又は異なる放射波長を
有する2つ以上のコヒーレント光源が、励起光源として使用されるときには、有
利となる。
向分解検出器が、検出のために使用されることが好ましい。かくして、少なくと
も1つの横方向分解検出器として、CCDカメラ、CCDチップ、フォトダイオ
ードアレイ、アバランシェダイオードアレイ、マルチチャンネルプレート及びマ
ルチチャンネル光電子増倍管で形成された群の中の少なくとも1つの検出器が使
用され得る。
と、透過された光束の整形のためのレンズ又はレンズ系、光束を偏移させるため
、及び場合によっては付加的に整形するための平面又は曲面ミラー、光束を偏移
させるため、及び場合によってはスペクトル分離するためのプリズム、光束の一
部分をスペクトル的に選択的に偏向するためのダイクロイックミラー、透過され
た光の強度を調節するためのニュートラルフィルタ、光束の一部分をスペクトル
的に選択的に透過させるための光学フィルター若しくはモノクロメータ、又は励
起光又はルミネセンス光の離散的な偏光方向を選択するための偏光選択的要素、
を含む群の光学部品が、1以上の励起光源とセンサープラットフォームとの間、
及び/又は前記センサープラットフォームと1以上の検出器との間に位置づけら
れている。
の形で発射されると有利である。
ットフォーム自体の材料又は標本中の螢光汚染と高速崩壊螢光の弁別のためには
、測定領域からの発出光が、時間分解測定されることが有利である。
後における励起光若しくは個別ビームへ多重化した後における励起光、1以上の
横方向に分離された測定領域の位置からの励起波長の散乱光、及び格子構造(c
)又は(c′)により外部結合された励起波長の光、を含む群のうちの光の信号
を、基準のために測定するための専用コンポーネントを含むことがさらに好まし
い。かくして、放射光及び基準信号の測定のための測定領域が同一であることが
特に有利となる。
数又は複数の標本区画について逐次的に実施され得る。かくして、逐次的励起及
び検出を、ミラー、偏向プリズム及びダイクロイックミラーを含む群の中の可動
光学コンポーネントを用いて実施することができる。標準的には、市販のいわゆ
るスキャナが、逐次的励起のため及び生物分析アレイシステムのために使用され
、これは、励起光ビームを、通常は可動ミラーを用いて、調査すべき領域にわた
り逐次的に走査させるものである。かくして、大部分のスキャナシステムの場合
には、照射された表面と励起光ビームとの間の角度は変更される。しかしながら
、本発明によるセンサープラットフォームの導波層内への励起光の内部結合のた
めの共鳴条件を満たすためには、この角度は基本的に一定に保たなければならず
、すなわち、本発明による光学系内で実現すべきスキャナは、角度保持機能を有
しなければならない。しかしながら、同時に、センサープラットフォーム上の励
起された領域の大きさも変化してはならない。従って、本発明のもう1つの対象
は、逐次的励起及び検出が、実質的に焦点及び角度を保つスキャナを用いて実施
される光学系にある。
の間で移動する。この場合、1以上の励起光源と、検出のために使用されるコン
ポーネントとは、空間的に固定された位置に位置づけされ得る。
光導波路と、前記プラットフォームに直接的に又は封止媒体によって接続された
層(g)と、を含み、前記層は、緊密シールを直接的に形成し又は封止媒体によ
って密封層を形成し、センサープラットフォームに向かって少なくとも開放され
た複数の凹部を含み、対応する複数の標本区画を2次元配置で形成するデバイス
を用いて、横方向に分離した少なくとも5つの測定領域上の1以上の標本におけ
るルミネセンスにより1以上の分析物を測定する方法であって、前記標本区画の
各々において、異なる分析物の特異的認識と結合とのための異なる生物学的又は
生化学的認識要素が、これらの標本区画内おいて5つ以上の離散的な測定領域(
d)に固定化され、前記測定領域は、前記標本区画の境界を形成するセンサープ
ラットフォームの一部として、光学的に相互作用して前記光導波路から励起光を
発し、前記標本区画は、収容した標本又は試薬溶液を除去し、かつ次いで、場合
によっては洗浄工程を経ることなく、同じ前記標本区画に引き続いて供給される
標本又は試薬溶液を収容するように作動可能し得て、励起光が測定領域へと誘導
され、標本中又は測定領域上の発光し得る物質を励起してルミネセンスを放射せ
しめ、発せられたルミネセンスを測定する方法である。
ント場と光学的に相互作用することが好ましい。
は(2)光透過層(a)内に内部結合された格子構造(c)により外部結合され
るルミネセンス、又は(1)及び(2)の両方の部分を含むルミネセンスが同時
に測定される。
〜1100nmの波長で励起されることができ放射するルミネセンス又は螢光標識
を使用することができる。
に基づくいわゆる発光又は螢光ナノ粒子であってもよい(W.C.W.Chan and S.Nie
「超感応性非等方性検出のための量子ドット生物接合体」Science 281 (1998) 2
016-2018)。
物類似体に結合され得るか、多工程分析においては固定化された生物学的、生化
学的若しくは合成の認識要素の結合パートナーの1つに結合され得るか、又は生
物学的、生化学的若しくは合成の認識要素に結合され得る。
異なる放射波長の第2の又はそれ以上のルミネセンス標識を使用することもでき
る。かくして、第2の又はそれ以上のルミネセンス標識が、第1のルミネセンス
標識と同じ波長で励起され、別の波長で放射することと有利となり得る。
が、重複しないか又は部分的にのみ重複すると有利となる。
て作用する第2の発光染料への電荷又は光学エネルギーの伝達が、分析物の検出
のために使用されることも有利となる。
が、測定されると有利となり得る。さらに、1以上のルミネセンス、及び/又は
励起波長での光信号の測定が、偏光選択的に実施されると有利となり得る。この
方法は、同様に、1以上のルミネセンスが、励起光のものとは異なる偏光で測定
されることをも可能にしている。
抗体又は抗原、レセプター又はリガンド、キレート剤又は「ヒスチジン−タグ成
分」、オリゴヌクレオチド、DNA又はRNAストランド、DNA又はRNA類
似体、酵素、酵素コファクター又は阻害物質、レクチン、及び炭水化物を含む群
の中の1以上の分析物を同時に又は逐次的に、定量的に又は定性的に測定するこ
とを可能にする。
学的又は生化学的増殖メカニズムを用いることなく、生体材料を直接測定するこ
とを可能にする。アプローチの単純化以外に、ここでは、mRNAと観察された
シグナルとの間の線形相関が達成される;すなわち(非常に低い濃度で生ずる生
物学的に関連性あるmRNAである)aksiいわゆる「稀少メッセージ」を定
量的にかつ高感度で測定できる。96個のウェルのプレートプラットフォーム上
の測定を並列に実施することにより、これまでにない品質及び処理量を得る結果
(例1.e参照)に至ることが可能になる。その結果として、前臨床及び臨床研
究によって生成される複数の標本を、手操作による現行の方法に比べてはるかに
高速でかつより精確に分析することができる。
、単一の実験内で相対的誘発を直接測定することが可能となる(例2.e参照)
。従って、チップからチップの参照は必要とされない。従って、センサープラッ
トフォームの一括処理から一括処理の再現性について必要とされる質は、十分に
低くすることができる。
る体液でもよい。
、又は生体ブロス若しくはプロセスブロスでもよい。
開発におけるスクリーニング方法の化学的、生化学的又は生物学的分析物を定量
的又は定性的に測定するための、親和性スクリーニング及び調査におけるリアル
タイム結合性研究及び動態パラメータの測定のための、分析物、特にDNA及び
RNA分析物の定性的及び定量的測定のため、及び単一ヌクレオチド多形現象の
如きゲノム内のゲノミック又はプロテオミック差を測定するための、タンパク質
−DNA相互作用を測定するための、mRNA発現及びタンパク質(生)合成に
ついての制御メカニズムを測定するための、毒性研究の発生のため及び発現プロ
フィールの測定のため、特にmRNA、タンパク質、ペプチド又は小分子有機(
メッセンジャー)化合物の如き生物学的及び化学的マーカー化合物を測定するた
めの、及び医薬品の開発研究、人間及び獣医学診断、農業化学製品の開発研究に
おける抗体、抗原、病原体又は細菌を測定するための、症候性及び前症候性の植
物診断のための、医薬品開発における患者の層別化のため及び治療薬選択のため
の、食品及び環境分析における病原体、有害物質及び有害細菌、特にサルモネラ
、プリオン及び細菌の測定のための上述の実施形態のいずれかに従った方法の使
用。
の同時測定のためのデバイス及び方法 組織を、孤立した腫瘍(この場合、前立腺)上の異なる部位から採取し、腫瘍
組織内の部位の機能として選択されたmRNAの発現パターンの差について検査
する。結果は、組織学検査とは独立して、専ら遺伝的な情報に基づく結論を考慮
する。このような標本の中のその方法及び見方の生物学的関連性については、文
献中で記述されている(Kristina A .Col,David B.Krizmann 及び Michael R,
Emmert-Buch,「ガンの遺伝学−3Dモデル」,Nature Genetics Supplement 21
(1999)38−41)。
のセンサープラットフォーム上における生物学的認識要素の準備及び被着 a) 発ガン現象又は炎症反応に関与する100個の遺伝子のクローン −文献
中(Kristina A .Col,David B.Krizmann 及び Michael R,Emmert-Buch,「ガン
の遺伝学−3Dモデル」、Nature Genetics Supplement 21(1999)38
−41及びその中で引用された参考文献を参照)に記述された結果に基づく−
と、典型的にはこれらの反応に関与しないが理想的な場合には一定の発現レベル
を示し、このため標準化のために利用できるような遺伝子(β−アクチン、GA
PDH、チュブリン−a、ユビキチン、ホスホリパーゼA2などといったような
いわゆる「ハウスキーピング遺伝子」)のクローンと、をセンサープラットフォ
ーム上の別々の測定領域内で固定化させるべき生物学的認識要素として選択する
。
/トレオニンキナーゼ(STK2)、プロテアソームのベータサブユニット(P
SMB4)、CD36−抗原(コラーゲンI型レセプター、トロンボスポンジン
レセプター)、ホスフォリパーゼA2(PLA2G1B)、リボソームタンパク
質L17(RPL17)、デスモグレイン(COL4A4)、「活性化転写因子
3」(ATF3)、アネクチン1(ANX)、さらなる修復酵素、キナーゼなど
が含まれる。
Projectsからか又は代替的には、I.M.A.G.E連関の材料を販売する商
業的供給業者からプラスミドの形で得ることができる。対応するcDNAを生成
するためのプラスミド内の遺伝子配列のトランスファー及び増幅は、対応するプ
ライマー対を用いて実施され、約300〜1000塩基対の長さをもつ2本鎖分
子(プローブcDNA)を導く。
ットフォームを使用し、その表面上に、古典的マイクロタイタープレートの7mm
×7mmの内径をもつ96個のウェルを配置することができる。基板材料(光透過
層(b))は、AF45のガラス(633nmでの屈折率n=1.52)から成る
。周期360nm、格子深さ25+/−5nmで、上述のとおりのセンサープラット
フォームの幅に対し平行な格子ラインの配向性をもつ表面レリーフ格子の連続構
造を基板内に生成する。光透過層(b)上のTa2O5の導波性光透過層(a)は
、633nmで2.15の屈折率(層の厚さが150nm)をもつ。被着プロセスに
より、格子構造は、ほぼ1:1の縮尺で導波層の表面内に移送される。
波装置内のクロロホルムでセンサープラットフォームを清浄し、グリシジルオキ
シプロピルトリメトキシンでのシラン化反応によって化学的に活性化され、かく
して生物学的認識要素としてプローブcDNAの固定化のために準備される。市
販の圧電制御されたマイクロピペット(GeSIM,GroBerkmannsdorf, DE)を
用いて、各々10滴(0.1nl)のスポットとして50ng/μlの濃度で個々の
cDNAを被着し、約150μmの離散的な測定領域としてのスポットを結果と
して得る。20×20のスポット配置(400個のアレイを特徴とする)の中に
は、固定化工程の終わりで、統計アルゴリズムによって定義された認識要素とし
ての100の異なるcDNAの位置は、純粋な統計的な手法で既知で予め定めら
れている方法で、同じcDNAを有するつねに4つの測定領域が設けられている
。スポットの中心間距離は、300μmであり、スポットは、センサープラット
フォーム上で6mm×6mmの領域に及び、アレイを包囲する7mm×7mmの正方形の
凹部を有するポリジメチルシロキサン(PDMS)の密封層(g)と共に、96
個のウェルのプレートを形成する。96個のあらゆる標本区画の底部には、セン
サープラットフォーム上に同一パターンの離散的な測定領域が生成される。固定
化は、熱処理、すなわち30分間に最高60℃まで加熱することによって最適化
できる。
えば、微細な組織片として組織材料(約50000〜10000細胞)を採取す
る。組織を凍結状態で切開し、標準フェノール/クロロホルム抽出により「全R
NA」を抽出する。Oligotexスピンカラム(Oiagen, Hilden, DE)を用いて、全
RNA片からmRNAを分離する。Cy5−標識づけされた核酸塩基(Cy5−
dUTP;Pharmacia Amersham)の存在下で逆転写酵素プロセス(例えばLife T
echnologies)により、螢光標識付けされたcDNA分子中へ全てのmRNA分
子を移す。得られた材料を、ハイブリダイゼーション緩衝液内で溶解し、かくし
て、最大10ng/μlの合計濃度を有する液体標本を得る。
られており、例1bに挙げられているセンサープラットフォーム内への内部結合
のため格子構造(I)上に発射された励起光ビームによって照射された領域の主
軸に運動の中心がある状態で、格子ラインに対し平行な軸を中心とした回転及び
格子ラインに対し平行かつ垂直な並進運動を可能にする。レーザーが励起光源と
して作用した直後に、測定データが収集されない場合に光路を遮断するためのシ
ャッターが光路内に存在する。さらに、励起光強度を段階的に又は連続的に変動
させるため、センサープラットフォームに向かって励起光の光路において、この
位置や他の位置にも、ニュートラルフィルタ又は偏光子を取付けることができる
。
レンズを用いて、断面が直径25mmの円形の平行光束にまで拡張される。この励
起光束の中心部分から、長さ10mm×幅10mmの正方形の領域(格子構造の用語
に基づく)を選択し、ダイクロイックミラー(650DRLP、Omega Optical,
Brattle borough, VT, USA)を通過した後、励起光スポット内を中心とする9
6個のアレイのうちの1つの上に光透過層(a)を介して向ける。センサープラ
ットフォームは、最大の内部結合となるように調整され、これは測定精度内で反
射光と同じ角度で内部結合した後、センサープラットフォームを介しての励起光
の透過の最小値によって確定され、及び連続格子構造(c)により外部結合され
た励起光と反射した励起光の総和の最大値によって確定される。最適な内部結合
の角度は、目視により、又はコンピュータ制御の下では、増幅器に接続されたフ
ォトダイオードの信号から測定され得、このフォトダイオードは、関連した光路
に位置づけられている。このようにして、内部結合のための共鳴角度として3.
5°という角度が決定される。
trocam, Cambridge, UK)を、横方向の分解検出器として使用する。信号収集及
びCCDチップ上への集光は、Heligon Tandem対物レンズ(Rodenstock, 2×Ci
ne-Heligon 2.1/100mm)を用いて実施される。中心波長680nmで、帯域
幅40nmの2つの干渉フィルター(Omega Optical, Brattleborough, Vermont)
と、(減衰された散乱励起光と、測定領域からのはるかに弱いルミネセンス光と
、の透過のための)ニュートラルフィルタ又は(測定領域からの減衰励起光の透
過のための)干渉フィルターと組合わせたニュートラルフィルタのいずれかと、
が、Heligon Tandem 対物レンズの2つの部分の間で、フィルターホイール上に
取付けられる。励起波長と発出波長との信号を交互に測定する。市販の画像分析
ソフトウェア(Image Pro Plus)を用いてデータ分析を実施する。
を、手動で又は実験室用ロボット(例えばBeckman 2000)を用いて、上述し
た如きデバイスの96個の標本区画の各々の中に充てんする。次に、標本区画を
フタで密封し、各ウェル上に100μlの蒸気空間を残す。
された2本鎖cDNAを、デハイブリダイゼーションし(分離させ)、標本中の
Cy5標識づけされた1本鎖cDNAを用いたハイブリダイゼーションのために
準備する。43℃までゆっくりと冷却して(1分あたり約2℃)、その後の8時
間にわたる43℃での熱平衡状態にすると、いわゆるストリンジェントな条件下
で、相補的Cy5標本付けされた分子を有する固定化された1本鎖cDNAのハ
イブリダイゼーションを可能にする(完全に相補的な1本鎖のみのハイブリダイ
ゼーション)。これらの状況は、残留標本液体を交換し、かつ温度を周囲温度ま
で低下させると安定化させることができる。
を、開示した分析システム内に挿入し、上述した如く、励起波長の透過のために
フィルターホイールの位置において制御されて、96個の標本区画のうちの最初
のもののアレイの中で励起光の最大内部結合に調整される。その後、測定領域(
スポット)からの螢光の強度を、ルミネセンス波長での透過のためのフィルター
位置で測定する。次の標本区画からのルミネセンス信号の読取りのための次の位
置までデバイスを搬送すると、他の標本区画内のアレイの読取りが逐次的に(つ
ねに各々400個の測定領域を有する標本区画が次々と)実施される。
定方法による毒物学及び薬物代謝における酵素誘導の型及び量の測定 薬品開発においては、薬物代謝の検査及び毒物学研究は、実験動物及び人間に
おける生体異物(生物学的及び/又は薬学的に活性の化学物質)の適用後に実施
される。その他のもの以外で、「第1経路代謝」として肝臓内の第1の代謝分解
反応が調査される。かかる物質の適用の後、往々にして「酵素誘導」すなわち標
準的にP450イソ酵素(混合型機能性モノオキシゲナーゼ)の群の中の肝臓内
の代謝に関与する酵素の濃度に対する影響が観察される。この変化は次に、かか
る物質のさらなる代謝の質及び速度に影響を及ぼす。新しい薬学的に活性な物質
をテストする過程で、テストプログラムの非常に早期の段階で、未処置の(誘発
されていない)生体の代謝に比較して高い感度でかつ定量的にmRNAのレベル
に対するこれらの影響を測定することが必要である。
のセンサープラットフォーム上での生物学的認識要素の調製及び被着 a) 肝臓内の「第1経路代謝」に関与する文献中に記述された20の最も重要
なシトクロムP450イソ酵素のクローンと、標準的にこれらのプロセスに関与
せず理想的なケースではその発現レベルが恒常なものにとどまり、従って標準化
のために利用できるような遺伝子(β−アクチン、GAPDH、チュブリン−a
、ユビキチン、ホスホリパーゼA2などといったようないわゆる「ハウスキーピ
ング遺伝子」)の5つのクローンと、を、センサープラットフォーム上の別々の
測定領域内で固定化させるべき生物学的認識要素として選択する。
P1A1、CYP1A2、CYP2B1、CYP2B2、CYP3A1、CYP
3A2、CYP4A1が含まれる。
る。対応するcDNAを生成するためのプラスミド内の遺伝子配列の移送及び増
幅は、対応するプライマー対を用いて実施され、約300〜1000塩基対の長
さをもつ2本鎖分子(プローブcDNA)を導く。
ラットフォームを使用し、その表面上には、センサープラットフォームに面する
開放凹部を有するポリカーボネートプレートに前記センサープラットフォームを
組合わせることにより、古典的マイクロタイタープレートのピッチ(行列の配置
内)の幅7mm×長さ7mm×高さ0.15mmの内形寸法を有する96個のマイクロ
フローセルを配置することができる。凹部を囲むシールリングを用いて、凹部は
、互いに対し密封されている。
52)から成る。格子ライン(360nm周期)がセンサープラットフォームの幅
に対し平行で格子深さが12+/−3nmである内部及び外部結合格子対の周期的
な配列(「ラスタ」)が基板内に生成され、ここで格子ラインはセンサープラッ
トフォームの全幅にわたって伸長している。後続する格子対の間の距離は9mmで
あり、個々の格子構造(センサープラットフォームの長さに対し平行な)個々の
格子構造の長さは0.5mmである。格子対の内部及び外部結合格子間の距離は5
.5mmであり、上述のポリカーボネートプレートにセンサープラットフォームを
組合せた後、つねに標本区画の(内側)領域内での励起光の内部及び外部結合を
可能にする。
の屈折率(層厚さ150nm)を有する。被着プロセスによって、格子構造は、ほ
ぼ1:1の縮尺で導波層の表面内に移送される。
て形成された標本区画には、センサープラットフォームと反対側の境界表面に円
錐形に開けられた開口部を有し、かくして、標準型の市販のポリプロピレンのピ
ペットチップを挿入することによって標本区画の充てん又は除去が可能となる。
波装置内のクロロホルムでセンサープラットフォームを清浄し、グリシジルオキ
シプロピルトリメトキシンでのシラン化反応によって化学的に活性化され、かく
して生物学的認識要素としてプローブcDNAの固定化のために準備される。市
販の圧電制御されたマイクロピペット(GeSIM,GroBerkmannsdorf, DE)を
用いて、各々10滴(0.1nl)のスポットとして50ng/μlの濃度で個々の
cDNAを被着し、約150μmの離散的な測定領域としてのスポットを結果と
して得る。10×10のスポット配置(100のアレイを特徴とする)の中には
、固定化工程の終わりで、統計アルゴリズムによって定義された認識要素として
の25の異なるcDNAの位置は、純粋な統計的な手方で既知で予め定められて
いる方法で、同じcDNAを有し、つねに4つの測定領域が設けられている。ス
ポットの中心間距離は、400μmであり、スポットは、センサープラットフォ
ーム上で4mm×4mmの領域に及ぶ。固定化は、熱処理、すなわち30分間で最高
60℃まで加熱することによって最適化できる。
って形成された100個の測定領域のアレイが標本区画の底面を中心となるよう
に、記述されたポリカーボネートプレートは、準備されたセンサープラットフォ
ームに組合わせられる。
、乳鉢内ですりつぶし、クロロホルムで脱脂する。その後、標準フェノール/ク
ロロホルム抽出により「全RNA」を分離する。Oligotexスピンカラム(Oiagen
, Hilden, DE)を用いて、全RNA分画からmRNAを分離する。Cy5−標識
づけされた核酸塩基(Cy5−dUTP;Pharmacia Amersham)の存在下で逆転
写酵素プロセス(例えばLife Technologies)内で、螢光標識付けされたcDN
A分子中へと全てのmRNA分子を移送する。得られた材料を、ハイブリダイゼ
ーション緩衝液内で溶解させ、かくして、最大10ng/μlの全濃度を有する液
体標本を得る。
らのmRNA 螢光標識付けをCy5ではなくCy3(Amersham Pharmacia)を用いて実施す
るという点を唯一の相違点として、例2.c.i)に類似した方法で調製を実施
する。
する。
られており、例2bに挙げられているセンサープラットフォーム内への内部結合
のため格子構造(I)上に発射された励起光ビームによって照射された領域の主
軸に運動の中心がある状態で、格子ラインに対し平行な軸を中心とした回転及び
格子ラインに対し平行かつ垂直な並進運動を可能にする。レーザーが励起光源と
して作用した直後に、測定データが収集されない場合に光路を遮断するためのシ
ャッターが光路内に存在する。さらに励起光強度を段階的に又は連続的に変動さ
せるため、センサープラットフォームに向かって励起光の光路内において、この
位置や他の位置にも、ニュートラルフィルタ又は偏光子を取付けることができる
。
ンサープラットフォームの格子ラインに対して平行に)断面スリットタイプの光
ビームまで広げる。励起光ビームの周辺上部及び下部領域をスリット絞りでマス
キングし、ここで励起光ビームは、わずかに発散するものの格子ラインに対して
平行で、格子ラインに対し垂直な投射において平行である。格子構造上のスリッ
トタイプの断面を有する結果として得られた光束は、標本区画の1つの中の内部
結合格子の右縁部上に向けられる。励起光スポットのサイズは、およそ長さ0.
8mm×幅4mmである。センサープラットフォームは、最大内部結合について調整
され、これは、内部結合された励起光の誘導モードに沿って(散乱により)発出
された発散光の最大強度によって確定される。この最大値は、誘導モードに沿っ
て発散された光の画像化と同時に目視によっても決定でき、光電子検出器の上に
、例えば横方向の分解能検出器の一例としてはCCDカメラの画素の上に、又は
横方向には分解しない検出器の1例としてはフォトダイオードの上に、画像シス
テムによって収光される。同じ条件下で、導波路内で透過し、外部結合格子で外
部結合した励起光のための最大信号も測定される。3.8°という値が、内部結
合のための共鳴角度として決定される。
使用される。励起光ビームは、上述のヘリウムネオンレーザーの赤色ビーム(6
33nm)と同じ光路内に誘導され得、その後、その光路は、固定位置間における
モータの駆動により又は手動により揺動することも可能であるミラーにより、妨
げられる。内部結合のための共鳴角度の調整は、上述した如き同じ方法で実施さ
れ、ここでは、15°という値が決定される。
trocam, Cambridge, UK)を、横方向の分解検出器として使用する。信号の収集
及びCCDチップ上への集光は、Heligon Tandem対物レンズ(Rodenstock, 2×
Cine-Heligon 2.1/100mm)を用いて実施する。中心波長680nmで帯域幅
40nmの2つの干渉フィルター(Omega Optical, Brattleborough, Vermont)と
、(減衰された散乱励起光と、測定領域からのはるかに弱いルミネセンス光と、
の透過のための)ニュートラルフィルタ又は(測定領域からの減衰励起光の透過
のための)干渉フィルターと組合わせたニュートラルフィルタのいずれかと、が
、Heligon Tandem 対物レンズの2つの部分の間で、フィルターホイール上に取
付けられる。励起波長と発出波長との信号を交互に測定する。市販の画像分析ソ
フトウェア(Image Pro Plus)を用いてデータ分析を実施する。
6マイクロフローセルの各々に個別に充てんする。第1の熱工程では(30分間
で85℃まで温度を上昇させる)、表面に固定化された2本鎖cDNAを、デハ
イブリダイゼーションし(分離させ)、次いで、標本中のそれぞれCy5標識づ
け又はCy3標識づけされた1本鎖cDNAを用いたハイブリダイゼーションの
ために準備する。43℃までゆっくりと冷却して、(1分あたり約2℃)次いで
、8時間にわたる43℃での熱平衡状態にすると、いわゆるストリンジェントな
条件下で、ただし異なる標識のついた分子のいずれをも動力学的にも熱力学的に
も選ぶことなく、それぞれ相補的にCy5又はCy3標識分子を用いた固定化さ
れた1本鎖cDNAのハイブリダイゼーションを可能にする(完全に相補的な1
本鎖のみのハイブリダイゼーション)。もう1つの工程では、螢光まで励起でき
る未結合材料ならびに表面に非特異的に結合した材料を除去するため、実験室ロ
ボットを使用して、純粋なハイブリダイゼーション緩衝液で、残存液体を交換す
る。
素を実験室用ロボットに供給することができる。この(再生)プロセスは、80
℃まで温度が上昇することによって達成される。10mMのリン酸緩衝液でのフラ
ッシング及び純粋ハイブリダイゼーション緩衝液内の再平衡化の後、流体/アレ
イシステムを再使用することができる。
を、開示した分析システム内に挿入し、上述した如く、励起波長の透過のために
フィルターホイールの位置において制御されて、96個の標本区画のうちの最初
のもののアレイの中で励起光(最初は633nmのもの)の最大内部結合に調整さ
れる。その後、測定領域(スポット)からの螢光の強度を、ルミネセンス波長で
の透過のためのフィルター位置で測定する(最初はCy5についてフィルター6
80DF40、Omega Optical, Bratlleborough,Vtを用いる)。次の標本区画か
らのルミネセンス信号の読取りのための次の位置までデバイスを搬送すると、他
の標本区画内のアレイの読取りが逐次的に(つねに各々100個の測定領域を有
する標本区画が次々と)実施される。
れ、ミラーを揺動した後、緑色励起光(543nm)の最大内部結合に調整される
。その後、アレイの測定領域(スポット)からの螢光の強度を、より短い波長の
ルミネセンスでの透過のためのフィルターホイールの位置で測定する(Cy3に
ついては、フィルター580DF40、Omega Optical, Bratlleborough,Vt)。
次の標本区画からのルミネセンス信号の読取りのための次の位置までデバイスを
搬送すると、他の標本区画内のアレイの読取りが逐次的に(つねに各々100個
の測定領域を有する標本区画が次々と)実施される。
時定量的測定のためのデバイス及び方法(多サイトカインプレート)。 a) デバイスとして、外形寸法101.6mm×101.6mm(4インチ×4イ
ンチ)×厚さ0.7mmの正方形のセンサープラットフォームが用いられ、これは
、分析体積(10μl〜100μl)を収容するための標本区画が設けられて、9
mmの(中心間)距離で各々直径7mmの円形開口部が内部に形成されている厚さ5
mmのPDMS層(ポリジメチルシロキサン、Sylgard 184Silicon Elastomer
Kit, Dow Corning)と接合されている。層内の開口部は、11行と11列の形状
をして(合計121ウェル)配置されている。散乱光を抑制すべく、重合体材料
には黒色顔料でインキ着けがほどこされている。
.52)から成る。周期360nm、格子深さ25+/−5nmの表面レリーフ格子
の連続構造を、センサープラットフォームの縁部に対し平行な格子ラインの配向
性を有する基板内に生成する。光透過層(b)上のTa2O5の導波性光透過層(
a)は、633nmで2.15の屈折率(層厚さ150nm)をもつ。被着プロセス
により、格子構造は、ほぼ1:1の縮尺で導波層の表面内に移送される。
ームの表面を清浄する。次いで、モノ−リン酸オクタデシルの単層を含む付着性
促進層を、自動組立てプロセスにより親水性導波路表面上に被着する。この表面
の修正により、非常に疎水性の高い表面に導く(水に対する接触角度100°〜
110°)。表面修正のプロセスは、文献内に詳述されている(D. Brorelli et
al., Langmuir15(1999)4324−4327)。
して異なる抗体を有する25スポットの121のアレイ(11行×11列で配置
)を、インクジェットプロッタNPIC型(GeSim GmbH,GroBerkma
nnsdorf, DE)の各々を用いて、付着性促進層でコーティングされたセンサー
プラットフォームの疎水性表面上に被着させ、ここでアレイは各々5行×5列の
形状をして配置されている。
100μg/mlの濃度で抗体を被着させ、2〜3時間飽和水蒸気雰囲気内で液体
状態でインキュベートさせ、次いで、洗浄し、窒素でブロー乾燥させる。1mmの
(中心間)距離でスポットの平均直径は、0.5mmである。サイトカインの認識
、特に異なるインターロイキンの認識のための常に5つの異なる抗体を、個々の
アレイの5つの列において使用する。各アレイ内には、供給された標本で既に行
われたあらゆる測定の各々から統計的分析の再現性についてのデータを生成すべ
く、生物学的認識要素と同じインターロイキン抗体を有する5つの測定領域が設
けられる。このため、(アレイ内の)生物学的認識要素としてのインターロイキ
ン−抗体の各々を有する測定領域の位置は、統計アルゴリズムによって決定され
、固定化工程の終りで25スポットアレイ内の5つの異なるインターロイキン抗
体の位置を、予め定められた純統計的手法で知ることができる。次いで、記述し
た既知の分析方法(例えばELISA)に比べて、分析時間及び必要とする標本
量を著しく減らすことにより後続する分析工程を達成し得、これらの知られた分
析方法は、一般に離散的な標本区画内で個々の複数の測定を行なうことと、必要
な個々の測定の数が多いことに起因して分析の再現性を決定するために複数のマ
イクロタイタープレートを使用することと、を必要とする。
面は、その後の分析工程の間の2次的抗体の非特異的結合を抑制すべく、10mg
/mlの血清アルブミン(インキュベーション時間は10分)で遮られる。抗体の
固定化の終了後、準備されたセンサープラットフォームは、つねに1つのアレイ
がPDMS層の121の開口部の各々の中に位置づけられるようにして、PDM
S層に接合される。
られており、例3a)に挙げられているセンサープラットフォーム内への内部結
合のため格子構造(I)上に発射された励起光ビームによって照射された領域の
主軸に運動の中心がある状態で、格子ラインに対し平行な軸を中心とした回転及
び格子ラインに対し平行かつ垂直な並進運動を可能にする。レーザーが励起光源
として作用した直後に、測定データが収集されない場合に光路を遮断するための
シャッターが光路内に存在する。さらに、励起光強度を段階的に又は連続的に変
動させるため、センサープラットフォームに向かって励起光の光路においてこの
位置や他の位置にも、ニュートラルフィルタ又は偏光子を取付けることができる
。
レンズを用いて、断面が直径25mmの円形の平行光束にまで拡張される。この励
起光束の中心部分から、長さ16mm×幅16mmの正方形の領域(格子構造の用語
に基づく)を選択し、ダイクロイックミラー(650DRLP、Omega Optical,
Brattle borough, VT, USA)を通過した後、励起光スポットの中心部分内に位
置する121のアレイのうちの4つの群に光透過層(a)を介して向けられる。
センサープラットフォームは、最大の内部結合となるように調整され、これはセ
ンサープラットフォームを介しての励起光の透過の最小値によって確定され、及
び測定精度内で反射光と同じ角度で内部結合した後、連続格子構造(c)により
外部結合された励起光と反射した励起光の総和の最大値によって確定される。最
適な内部結合の角度は、目視により、又は、コンピュータ制御の下では、増幅器
に接続されたフォトダイオードの信号から決定され得、このフォトダイオードは
、関連した光路に位置づけられている。このようにして、内部結合のための共鳴
角度として3.5°という角度が決定される。
trocam, Cambridge, UK)を、横方向の分解検出器として使用する。信号収集及
びCCDチップ上への集光は、Heligon Tandem対物レンズ(Rodenstock, 2×Ci
ne-Heligon 2.1/100mm)を用いて実施される。中心波長680nmで帯域幅
40nmの2つの干渉フィルター(Omega Optical, Brattleborough, Vermont)と
、(減衰された散乱励起光と、測定領域からのはるかに弱いルミネセンス光と、
の透過のための)ニュートラルフィルタ又は(測定領域からの減衰励起光の透過
のための)干渉フィルターと組合わせたニュートラルフィルタのいずれかと、が
、Heligon Tandem 対物レンズの2つの部分の間で、フィルターホイール上に取
付けられる。励起波長と発出波長との信号を交互に測定する。市販の画像分析ソ
フトウェア(Image Pro Plus)を用いてデータ分析を実施する。
選択される。選択されたインターロイキン(インターロイキンIL#1〜IL#
5)の各々について、0.1%の血清アルブミン及び0.05%のTween20を
有するリン酸緩衝溶液中の11の検量用溶液を調製する(インターロイキン濃度
;0、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、300pg/ml
)。さらに、5つのインターロイキンの各々を同じ濃度で含み、5つのインター
ロイキンの全ての11の混合型検量用溶液が調製され、統計的(混合)方法で、
未知の濃度のインターロイキンを含有する55の標本溶液を生成した。次に、対
応する特異的ビオチニル化2次インターロイキン抗体(つねに200ピコモル)
で個々の検量用溶液を、1時間予備インキュベートした。同様にして、5つの異
なるビオチニル化2次インターロイキン抗体(各々200ピコモル)の混合物で
混合型検量用溶液及び標本溶液を、同じく1時間予備インキュベートした。
5列の標本区画内に充てんし、後続する螢光測定の分析工程において各列内のイ
ンターロイキンにつき1つの個々の検量曲線(用量応答曲線)の生成を可能にす
る。後に分析物混合物の存在下で対応する検量曲線を生成するべく、第6番目の
列の11個の標本区画の各々の中に50μlの混合型検量用溶液を充てんする。
対応するやり方で、55個の標本溶液を、標本区画の残りの列の全体にわたり分
配する。121個の測定溶液の全てのインキュベーション時間は30分である。
その後、緩衝液(0.1%の血清アルブミンと0.05%のTween20を添加し
たリン酸緩衝溶液)で標本区画を洗浄する。螢光測定による最終的分析工程では
、緩衝溶液(0.1%の血清アルブミン及び0.05%Tween20を付加したリ
ン酸緩衝溶液)中の50μlの1−ナノモルCy5−ストレプトアビジン(Amers
ham Pharmacia)を標本区画の各々に充てんし、121アレイ内の全ての測定領
域からの螢光信号を、15分間のインキュベーション時間の後に測定する。
を、開示した分析システム内に挿入し、上述した如く、励起波長の透過のために
フィルターホイールの位置において制御されて、96個の標本区画のうちの最初
の4つのアレイの中で励起光の最大内部結合に調整される。その後、測定領域(
スポット)からの螢光の強度を、ルミネセンス波長での透過のためのフィルター
位置で測定する。次の標本区画からのルミネセンス信号の読取りのための次の位
置までデバイスを搬送すると、他の標本区画内のアレイの読取りが逐次的に(つ
ねに各々25の離散的な測定領域を有する4つの標本区画の群について)実施さ
れる。
Claims (80)
- 【請求項1】 センサープラットフォームの一部としての平面型光導波路と
、前記プラットフォームに直接的に又は封止媒体によって接続された層(g)(
図1に従う)と、を含み、前記層は、緊密シールを直接的に形成し又は封止媒体
によって密封層を形成し、センサープラットフォームに向かって少なくとも開放
された複数の凹部を含み、対応する複数の標本区画を2次元配置で形成するデバ
イスであって、 前記標本区画の各々において、異なる分析物の特異的認識と結合とのための異
なる生物学的又は生化学的認識要素が、これらの標本区画内の前記平面型光導波
路上において2次元配列で5つ以上の離散的な測定領域(d)に固定化され、 前記測定領域は、前記標本区画の境界を形成するセンサープラットフォームの
一部として、光学的に相互作用して前記光導波路から励起光を発し、 前記標本区画は、収容した標本又は試薬溶液を除去し、かつ次いで、場合によ
っては洗浄工程を経ることなく、同じ前記標本区画に引き続いて供給される標本
又は試薬溶液を収容するように作動し得るデバイス。 - 【請求項2】 標本区画内の各々で、単一の標本区画における5つ以上の測
定領域のうちの1つ以上の測定領域が、基準のために使用される請求項1のデバ
イス。 - 【請求項3】 同じ化学的又は光学的パラメータを基準とするための測定領
域が、センサープラットフォームにわたって分布した複数の標本区画内で使用さ
れ、センサープラットフォームにわたって前記化学的又は光学的パラメータの横
方向の分布を測定することができる請求項2のデバイス。 - 【請求項4】 前記測定領域は、前記平面型光導波路内において光学的に相
互作用して励起光のエバネッセント場を誘導する請求項1〜3のいずれかのデバ
イス。 - 【請求項5】 センサープラットフォームの一部としての光導波路が、非有
機材料好ましくはガラス、又は有機材料、好ましくはポリメチルメタクリレート
、ポリカーボネート若しくはポリスチレンを含む群から選択されるプラスチック
を含む多重モード又は単一モードの導波路であり、これらの材料は、少なくとも
励起及びルミネセンス波長において光透過性を示す請求項1〜4のいずれかのデ
バイス。 - 【請求項6】 センサープラットフォームの一部としての光導波路は、自己
支持する請求項1〜5のいずれかのデバイス。 - 【請求項7】 センサープラットフォームの一部としてのフィルム光導波路
が、層(a)よりも低い屈折率を有する第2の光透過層(b)(図1に従う)の
上の第1の光透過層(a)(図1に従う)を有するフィルム光導波路である請求
項1〜4のいずれかのデバイス。 - 【請求項8】 第2の光透過層(b)の材料が、ガラス、石英又は好ましく
はポリカーボネート、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート若しくはポリスチ
レンを含む群の透明な熱可塑性プラスチックを含む請求項7のデバイス。 - 【請求項9】 第1の光透過層(a)の屈折率が、1.8より大きい請求項
7又は8のデバイス。 - 【請求項10】 第1の光透過層(a)が、TiO2、ZnO、Nb2O5、
Ta2O5、HfO2、又はZrO2、好ましくはTa2O5又はNb2O5を含む請求
項7〜9のいずれかのデバイス。 - 【請求項11】 第1の光透過層(a)の厚さが、40〜300nm、好まし
くは100〜200nmである請求項7〜10のいずれかのデバイス。 - 【請求項12】 光透過層(a)と(b)との間に、層(a)よりも低い屈
折率を有しかつ層(a)に接触し、かつ、厚さが5nm〜10000nm、好ましく
は10nm〜1000nmである付加的な光透過層(b′)(図1に従う)が位置づ
けられている請求項7〜11のいずれかのデバイス。 - 【請求項13】 中間層の目的は、下側に位置づけられた層に対し層(a)
における微細孔を密封することにより、表面粗度を層(a)よりも小さく減少さ
せること、下側に位置づけられた1以上の層へ層(a)内で誘導された光のエバ
ネッセント場が進入することを減少させること、又は下側に位置づけられた1以
上の層に対する層(a)の付着性を改善すること、又は光センサープラットフォ
ーム内で熱により誘発された応力を低減すること、又は下側に位置づけられた層
から光透過層(a)を化学的に分離することにある請求項12のデバイス。 - 【請求項14】 生物学的、生化学的又は合成の認識要素の固定化のために
、付着促進層(f)が、光透過層(a)上に被着されている請求項7〜13のい
ずれかのデバイス。 - 【請求項15】 付着促進層(f)(図1に従う)が、200nm未満、好ま
しくは20nm未満の厚さを有する請求項14のデバイス。 - 【請求項16】 付着促進層が、シラン、エポキシド及び「自己組織化した
機能化単層」を含む群の化合物を含む請求項14〜15のいずれかのデバイス。 - 【請求項17】 横方向に分離された測定領域(d)が、前記センサープラ
ットフォーム上の生物学的、生化学的又は合成の認識要素を横方向に選択的に被
着させることによって生成される請求項1〜16のいずれかのデバイス。 - 【請求項18】 インクジェットスポッティング、ピン若しくはペンを用い
た機械的スポッティング、マイクロ接触印刷、又は平行若しくは交差微細流路内
に供給された時点、圧力差の適用時点又は電気若しくは電磁ポテンシャルの印加
時点での生物学的、生化学的又は合成の認識要素と測定領域との流動的接触、を
含む方法の群のうちの1以上の方法が、生物学的、生化学的又は合成の認識要素
の被着のために適用される請求項17のデバイス。 - 【請求項19】 生物学的、生化学的又は合成の認識要素として、分子イン
プリントを提供すべく、核酸(DNA、RNA)、抗体、アプタマー、膜に結合
した及び単離されたレセプター、それらのリガンド、抗体に対する抗原、「ヒス
チジンタグ成分」、化学合成によって生成されたキャビティなどを含む群の成分
が被着させられる請求項17のデバイス。 - 【請求項20】 細胞の全体又は細胞の断片が、生物学的、生化学的又は合
成の認識要素として被着される請求項17のデバイス。 - 【請求項21】 分析物に関して「化学的に中性」である化合物が、非特異
的結合又は吸着を最小限にすべく、横方向に分離された測定領域(d)の間に被
着されている請求項17〜20のいずれかのデバイス。 - 【請求項22】 分析物に関して「化学的に中性」である前記化合物が、例
えば、ウシ血清アルブミン、ニシンの精子又はポリエチレングリコールを含む群
の中から選択される請求項21のデバイス。 - 【請求項23】 測定領域(d)への励起光の内部結合が、光透過層(a)
に形成された1以上の格子構造(c)(図1に従う)によって実施される請求項
7〜22のいずれかのデバイス。 - 【請求項24】 光透過層(a)に誘導された光の外部結合が、光透過層(
a)内に形成された格子構造(c′)(図1に従う)によって実施される請求項
7〜23のいずれかのデバイス。 - 【請求項25】 光透過層(a)内に形成された格子構造(c)及び(c′
)が同じか又は異なる周期性を有し、かつ互いに平行にか又は非平行に配置され
ている請求項23及び24のデバイス。 - 【請求項26】 格子構造(c)及び(c′)が内部結合及び/又は外部結
合格子として互換性があるようにして使用することができる請求項25のデバイ
ス。 - 【請求項27】 格子構造(c)と、場合によっては付加的な格子構造(c
′)とが、200nm〜1000nmの周期、及び3nm〜100nm、好ましくは10
nm〜30nmの格子変調深度を有する請求項7〜26のいずれかのデバイス。 - 【請求項28】 第1の光透過層(a)の厚さに対する変調深度の比が、0
.2以下である請求項27のデバイス。 - 【請求項29】 格子構造(c)が、直角、三角又は半円形の断面形状を有
するレリーフ格子、又は実質的に平面の光透過層(a)内の屈折率の周期的変調
を有する位相格子又は体積格子である請求項7〜28のいずれかのデバイス。 - 【請求項30】 薄い金属層、好ましくは金又は銀の層は、場合によっては
層(a)、例えばシリカ又はフッ化マグネシウムの層よりも小さい屈折率の付加
的誘電層上において、光透過層(a)と固定化された生物学的又は生化学的認識
要素との間に被着されており、金属層と、場合によっては付加的中間層と、の厚
さは、励起波長及び/又はルミネセンス波長において表面プラズモンが励起され
うるように選択される請求項7〜29のいずれかのデバイス。 - 【請求項31】 格子構造(c)が、一定の周期を有する回折格子である請
求項7〜30のいずれかのデバイス。 - 【請求項32】 格子構造(c)が、多重回折格子である請求項7〜30の
いずれかのデバイス。 - 【請求項33】 格子構造(c)と、場合によっては付加的格子構造(c′
)とが、標本区画の領域の外側に位置づけられている請求項23〜32のいずれ
かのデバイス。 - 【請求項34】 格子構造(c)と、場合によっては付加的格子構造(c′
)とが、複数の又は全ての標本区画の範囲にわたって伸長している請求項23〜
32のいずれかのデバイス。 - 【請求項35】 上に重なる表面領域でセンサープラットフォームに接触す
る緊密封止層(g)の材料が、少なくともエバネッセント場の進入深度内の励起
されたルミネセンス放射及び励起放射の双方について光透過性である請求項1〜
33のいずれかのデバイス。 - 【請求項36】 層(g)が2層システムの形で設けられ、そのうちセンサ
ープラットフォームの表面に接触する状態となる第1の層は、励起放射及び励起
されたルミネセンス放射に対し透過性であり、一方センサープラットフォームか
らさらに離れて位置づけられる隣接層は、励起放射及び励起されたルミネセンス
放射のスペクトル範囲内で吸収性である請求項35のデバイス。 - 【請求項37】 センサープラットフォームに接触する緊密封止層(g)の
材料が、励起放射及び励起されたルミネセンス放射のスペクトル範囲内で吸収性
である請求項34のデバイス。 - 【請求項38】 センサープラットフォームに接触する緊密封止層(g)の
材料が、自己付着性である請求項1〜37のいずれかのデバイス。 - 【請求項39】 センサープラットフォームに接触する緊密封止層(g)の
材料が、ポリシロキサンを含む請求項1〜38のいずれかのデバイス。 - 【請求項40】 5〜1000、好ましくは10〜400個の測定領域が、
1つの標本区画内に位置づけられる請求項1〜39のいずれかのデバイス。 - 【請求項41】 標本区画内の個々の測定領域が、0.001〜6mm2の面
積を占め、異なる測定領域が、類似の又は異なるサイズをもち得る請求項1〜4
0のいずれかのデバイス。 - 【請求項42】 標本区画の各々が、100nl〜1mlの容積を有する請求項
1〜41のいずれかのデバイス。 - 【請求項43】 光透過層(a)から離れて面した側で、標本区画は、標本
、又は場合によっては付加的な試薬の供給又は除去のための入口及び出口の開口
部を除いて閉じられており、標本、及び場合によっては付加的な試薬の供給又は
除去が、閉鎖型フロースルーシステム内で実施され、かつ共通の入口及び出口の
開口部を有する測定領域又はセグメントに液体を供給する場合には、前記入口及
び出口の開口部が、好ましくは行毎又は列毎に指定される請求項1〜42のいず
れかのデバイス。 - 【請求項44】 標本、及び場合によっては付加的な試薬の供給が、圧力差
、又は電気若しくは電磁ポテンシャルの影響を受ける平行又は交差型微細流路の
中で実施される請求項1〜43のいずれかのデバイス。 - 【請求項45】 標本区画が、光透過層(a)から離れる方に面する側で、
標本又はその他の試薬の供給又は除去を局所的に指定する開口部を有する請求項
1〜42のいずれかのデバイス。 - 【請求項46】 分析中に加湿されかつ測定領域に接触される試薬のための
区画が設けられている請求項1〜45のいずれかのデバイス。 - 【請求項47】 センサープラットフォーム上に光学的又は機械的に認識可
能なマークが設けられ、光学系内の調整が容易になり、かつ/又は標本区画の凹
部を含む層(g)にセンサープラットフォームを組合せることが容易になる請求
項1〜45のいずれかのデバイス。 - 【請求項48】 1以上のルミネセンスを測定するための分析システムであ
って、 a.少なくとも1つの励起光源、 b.請求項1〜47のいずれかのデバイス、 c.センサープラットフォーム上の少なくとも1つ以上の測定領域(d)から発
出する光を記録するための少なくとも1つの検出器、 を含む分析システム。 - 【請求項49】 少なくとも1つの光源によって放射される励起光が、コヒ
ーレント光であり、光透過層(a)内への内部結合のために、共鳴角度で1以上
の測定領域上に向けられている請求項7〜47のいずれかのデバイスを有する請
求項48の分析システム。 - 【請求項50】 少なくとも1つの光源の励起光が、拡大用光学部分により
実質的に平行な光束まで広げられ、光透過層(a)内に内部結合する共鳴角度で
1以上の測定領域上に向けられている請求項49の分析システム。 - 【請求項51】 少なくとも1つの光源からの励起光が、1つの光源の場合
には1つの又は複数の光源の場合には複数の回折光学素子好ましくはダマン格子
又は屈折光学素子好ましくはマイクロレンズアレイによって、共通の光源から発
せられた個別ビームは可能なかぎり同じ強度で複数の個別ビームへと分割され、
該個別ビームは、互いに実質的に平行に、横方向に分離された測定領域上へと向
けられる請求項49の分析システム。 - 【請求項52】 等しいか又は異なる放射波長を有する2つ以上のコヒーレ
ント光源が、励起光源として使用される請求項49の分析システム。 - 【請求項53】 少なくとも1つの横方向分解検出器が、検出のために用い
られる請求項48〜52のいずれかの分析システム。 - 【請求項54】 少なくとも1つの横方向分解検出器として、CCDカメラ
、CCDチップ、フォトダイオードアレイ、アバランシェダイオードアレイ、マ
ルチチャンネルプレート及びマルチチャンネル光電子増倍管で形成された群の中
の少なくとも1つの検出器が使用される請求項53の分析システム。 - 【請求項55】 透過された光束の整形のためのレンズ又はレンズ系、 光束を偏移させるため、及び場合によっては付加的に整形するための平面又は
曲面ミラー、 光束を偏移させるため、及び場合によってはスペクトル分離するためのプリズ
ム、 光束の一部分をスペクトル的に選択的に偏向するためのダイクロイックミラー
、 透過された光の強度を調節するためのニュートラルフィルタ、光束の一部分を
スペクトル的に選択的に透過させるための光学フィルター若しくはモノクロメー
タ、又は 励起光又はルミネセンス光の離散的な偏光方向を選択するための偏光選択的要
素、 を含む群の光学部品が、1以上の励起光源とセンサープラットフォームとの間、
及び/又は前記センサープラットフォームと1以上の検出器との間に位置づけら
れている請求項48〜54のいずれかの分析システム。 - 【請求項56】 励起光が、1fsec〜10minの持続時間のパルスの形で発
射される請求項48〜55のいずれかの分析システム。 - 【請求項57】 測定領域からの放射光が、時間分解測定される請求項48
〜56のいずれかの分析システム。 - 【請求項58】 光源の位置における励起光又は励起光の拡大の後における
励起光若しくは個別ビームへ多重化した後における励起光、 1以上の横方向に分離された測定領域の位置からの励起波長の散乱光、及び 格子構造(c)又は(c′)により外部結合された励起波長の光、 を含む群のうちの光の信号が、基準のために測定される請求項48〜57のい
ずれかの分析システム。 - 【請求項59】 放射光及び基準信号の測定のための測定領域が同一である
請求項58の分析システム。 - 【請求項60】 励起光の発射と、1以上の測定領域からの放射光の検出と
が、1以上の標本区画について逐次的に実施される請求項48〜59のいずれか
の分析システム。 - 【請求項61】 逐次的励起及び検出は、ミラー、偏向プリズム及びダイク
ロイックミラーを含む群の可動光学コンポーネントを用いて実施される請求項6
0の分析システム。 - 【請求項62】 逐次的励起及び検出が、実質的に焦点及び角度を保つスキ
ャナを用いて実施される請求項61の分析システム。 - 【請求項63】 センサープラットフォームが逐次励起及び検出工程の間で
移動する請求項60〜62のいずれかの分析システム。 - 【請求項64】 センサープラットフォームの一部としての平面型光導波路
と、前記プラットフォームに直接的に又は封止媒体によって接続された層(g)
と、を含み、前記層は、緊密シールを直接的に形成し又は封止媒体によって密封
層を形成し、センサープラットフォームに向かって少なくとも開放された複数の
凹部を含み、対応する複数の標本区画を2次元配置で形成するデバイスを用いて
、横方向に分離した少なくとも5つの測定領域上の1以上の標本におけるルミネ
センスにより1以上の分析物を測定する方法であって、 前記標本区画の各々において、異なる分析物の特異的認識と結合とのための異
なる生物学的又は生化学的認識要素が、これらの標本区画内において5つ以上の
離散的な測定領域(d)に固定化され、 前記測定領域は、前記標本区画の境界を形成するセンサープラットフォームの
一部として、光学的に相互作用して前記光導波路から励起光を発し、 前記標本区画は、収容した標本又は試薬溶液を除去し、かつ次いで、場合によ
っては洗浄工程を経ることなく、同じ前記標本区画に引き続いて供給される標本
又は試薬溶液を収容するように作動し得、 励起光が測定領域へと誘導され、標本中又は測定領域上の発光し得る物質を励
起してルミネセンスを放射せしめ、発せられたルミネセンスを測定する方法。 - 【請求項65】 前記測定領域が、平面型光導波路内で誘導される励起光の
エバネッセント場と光学的に相互作用する請求項64の方法。 - 【請求項66】 (1)等方的に放射されたルミネセンス、又は(2)光透
過層(a)内に内部結合された格子構造(c)により外部結合されるルミネセン
ス、又は(1)及び(2)の両方の部分を含むルミネセンスが同時に測定される
請求項65の方法。 - 【請求項67】 前記ルミネセンスを生成すべく、300nm〜1100nmの
波長で励起されることができ放射する発光染料又は発光ナノ粒子が、ルミネセン
ス標識として使用される請求項64〜66のいずれかの方法。 - 【請求項68】 ルミネセンス標識が、分析物に結合されるか、又は競合分
析においては分析物類似体に結合されるか、多工程分析においては固定化された
生物学的、生化学的若しくは合成の認識要素の結合パートナーの1つに結合され
るか、又は生物学的、生化学的若しくは合成の認識要素に結合される請求項67
の方法。 - 【請求項69】 第1のルミネセンス標識と類似の又は異なる励起波長及び
類似の又は異なる放射波長の第2の又はそれ以上のルミネセンス標識が使用され
る、請求項67〜68のいずれか1項の方法。 - 【請求項70】 第2の又はそれ以上のルミネセンス標識が、第1のルミネ
センス標識と同じ波長で励起され、別の波長で放射する請求項69の方法。 - 【請求項71】 適用される発光染料の励起及び放射スペクトルが、重複し
ないか又は部分的にのみ重複する請求項69の方法。 - 【請求項72】 供与体として作用する第1の発光染料から受容体として作
用する第2の発光染料への電荷又は光学エネルギーの伝達が、分析物の検出のた
めに使用される請求項69の方法。 - 【請求項73】 1以上のルミネセンスの測定以外に、測定領域上の有効屈
折率の変化が、測定される請求項64〜72のいずれかの方法。 - 【請求項74】 1以上のルミネセンス、及び/又は励起波長での光信号の
測定が、偏光選択的に実施される請求項64〜73のいずれかの方法。 - 【請求項75】 1以上のルミネセンスが、励起光のものとは異なる偏光で
測定される請求項64〜74のいずれかの方法。 - 【請求項76】 抗体又は抗原、レセプター又はリガンド、キレート剤又は
「ヒスチジン−タグ成分」、オリゴヌクレオチド、DNA又はRNAストランド
、DNA又はRNA類似体、酵素、酵素コファクター又は阻害物質、レクチン、
及び炭水化物を含む群の中の1以上の分析物を同時に又は逐次的に、定量的に又
は定性的に測定する請求項64〜75のいずれかの方法。 - 【請求項77】 検査対象標本が、血液、血清、血漿、リンパ液、尿又は卵
黄の如き天然に生ずる体液である請求項64〜76のいずれかの方法。 - 【請求項78】 検査対象標本が、光学的に濁った液体、又は表面水、土壌
若しくは植物抽出物、又は生体ブロス若しくはプロセスブロスである請求項64
〜76のいずれかの方法。 - 【請求項79】 検査対象標本が、生物学的組織から採取される請求項64
〜76のいずれかの方法。 - 【請求項80】 薬学研究、コンビナトリアル化学、臨床及び前臨床開発に
おけるスクリーニング方法の化学的、生化学的又は生物学的分析物を定量的又は
定性的に測定するための、 親和性スクリーニング及び調査におけるリアルタイム結合性研究及び動態パラ
メータの測定のための、 分析物、特にDNA及びRNA分析物の定性的及び定量的測定のため、及び単
一ヌクレオチド多形現象の如きゲノム内のゲノミック又はプロテオミック差を測
定するための、 タンパク質−DNA相互作用を測定するための、 mRNA発現及びタンパク質(生)合成についての制御メカニズムを測定する
ための、 毒性研究の発生のため及び発現プロフィールの測定のため、特にmRNA、タ
ンパク質、ペプチド又は小分子有機(メッセンジャー)化合物の如き生物学的及
び化学的マーカー化合物を測定するための、及び医薬品の開発研究、人間及び獣
医学診断、農業化学製品の開発研究における抗体、抗原、病原体又は細菌を測定
するための、 症候性及び前症候性の植物診断のための、 医薬品開発における患者の層別化のため及び治療薬選択のための、 食品及び環境分析における病原体、有害物質及び有害細菌、特にサルモネラ、
プリオン及び細菌の測定のための請求項64〜79のいずれかの方法の使用。
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