ES2304573T3 - Recipiente para llevar a cabo y controlar procesos biologicos. - Google Patents
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Abstract
Recipiente compuesto de plástico/cristal para contener una muestra biológica mientras se lleva a cabo la amplificación de ácido nucleico, comprendiendo dicho recipiente un material ópticamente claro, configurado para contener un máximo de 1 ml de muestra, comprendiendo además: a) una parte en forma de tubo capilar que está cerrada en un extremo, b) una parte de reservorio (450C) siendo la parte en forma de embudo unida al extremo abierto de la parte en forma de tubo capilar; y c) una estructura para sellar la parte en forma de tubo capilar en la que dicha parte en forma de embudo está fabricada de plástico.
Description
Recipiente para llevar a cabo y controlar
procesos biológicos.
La presente invención se refiere de modo general
a aparatos que se utilizan para llevar a cabo procesos biológicos,
tales como la reacción en cadena de la polimerasa. De manera más
específica, la presente invención se refiere a recipientes que
contienen material biológico mientras se realiza la amplificación de
ácidos nucleicos y sus usos.
En numerosas áreas industriales, de la
tecnología y de la investigación existe la necesidad de someter de
manera fiable y reproducible ciertas muestras a ciclos térmicos. La
necesidad de someter una muestra a ciclos térmicos repetidos es
particularmente aguda en aplicaciones de biotecnología. En el sector
de la biotecnología, es deseable frecuentemente calentar y enfriar
repetidamente pequeñas muestras de materiales a lo largo de un
corto período de tiempo. Uno de los procesos biológicos que es
llevado a cabo regularmente es la amplificación cíclica de ADN.
La amplificación cíclica de ADN utilizando
polimerasa de ADN termoestable permite una amplificación
automatizada de ADN de cebador específico, conocida ampliamente
como "reacción de la cadena de polimerasa" o "PCR". La
automatización de este procedimiento requiere ciclos térmicos
precisos y controlados de las mezclas de reacción usualmente
contenidas en una serie de contenedores. Con anterioridad, el
contenedor preferente ha sido un tubo micrófugo estándar de material
plástico.
Se han utilizado bloques térmicos, metálicos,
programables, de tipo comercial con anterioridad para llevar a cabo
los ciclos de temperatura de muestras en tubos micrófugos según la
variación deseada de temperatura con respecto al tiempo. No
obstante, la imposibilidad de ajustar de manera rápida y exacta la
temperatura de los bloques térmicos en una amplia gama de
temperaturas en un corto período de tiempo, ha hecho poco deseable
la utilización de dispositivos del tipo de bloques térmicos como
sistema de control térmico cuando se llevan a cabo procesos tales
como la reacción de la cadena de polimerasa.
Además, los tubos micrófugos que se han
utilizado de modo general tienen desventajas. El material de los
tubos micrófugos, su grosor de paredes y la geometría de los tubos
micrófugos es un inconveniente para el calentamiento y enfriamiento
rápidos de las muestras contenidas en los mismos. El material
plástico y el grosor de pared de los tubos micrófugos actúan como
aislante entre la muestra contenida y el medio circundante
dificultando por esta razón la transferencia de energía térmica.
Asimismo, la geometría del tubo micrófugo presenta una pequeña área
superficial a cualquiera de los medios utilizados para la
transferencia de la energía térmica. La utilización continuada de
tubos micrófugos en esta técnica, con su geometría que no es óptima,
indica que las ventajas de la transferencia térmica mejorada (que
se consiguen al aumentar el área superficial de un contenedor de
muestras para una muestra de volumen constante) no se han reconocido
hasta el momento.
Además, también se han utilizado dispositivos
que utilizan baños de agua con conmutación fluídica (o transferencia
mecánica) como dispositivo de ciclo térmico para la reacción de la
cadena de polimerasa. Si bien se han utilizado baños de agua en el
ciclo de la mezcla de reacción de la cadena de polimerasa de acuerdo
con una variación deseada de temperatura con respecto al tiempo
necesario para que tenga lugar la reacción, la elevada masa térmica
del agua (y la baja conductividad térmica de los tubos micrófugos de
plástico) ha sido un aspecto significativamente limitativo en cuanto
al comportamiento del aparato y a la especificidad de la
reacción.
Los dispositivos que utilizan baños de agua
tienen un rendimiento limitado. La causa de ello es que la masa
térmica del agua restringe significativamente el gradiente máximo de
la temperatura con respecto al tiempo que se puede alcanzar.
Asimismo, el aparato con baño de agua se ha observado que es muy
engorroso debido a las dimensiones y número de tubos portadores de
agua y dispositivos externos de control de temperatura del agua.
Además, la necesidad de excesivo mantenimiento periódico e
inspección de los racores para el agua a efectos de detectar fugas
en aparatos con baño de agua es dificultosa y requiere mucho tiempo.
Finalmente, es difícil con aparatos con baño de agua controlar la
temperatura en los tubos de muestra con la exactitud que sería de
desear.
La Patente U.S.A. Nº 3.616.264 de Ray muestra un
aparato térmico de aire forzado destinado a efectuar ciclos con
aire para calentar o enfriar muestras biológicas a una temperatura
constante. Si bien el dispositivo de Ray es más o menos eficaz en
el mantenimiento de una temperatura constante dentro de la cámara de
aire, no se adapta a la necesidad de ajustar rápidamente la
temperatura de forma cíclica de acuerdo con la variación de
temperatura con respecto al tiempo requerida para procesos
biológicos, tales como la reacción de la cadena de polimerasa.
Las Patentes U.S.A. Nº 4.420.679 de Howe y Nº
4.286.456 de Sisti y otros dan a conocer estufas cromatográficas de
gas. Los dispositivos que se dan a conocer en dichas patentes Howe y
Sisti y otros son adecuados para llevar a cabo procedimientos de
cromatografía gaseosa pero no proporcionan capacidad de realización
de ciclos térmicos que sea significativamente más rápida que lo que
se consigue por cualquiera de los dispositivos que se han descrito.
La realización de ciclos térmicos rápidos es útil para llevar a cabo
muchos procedimientos. Dispositivos tales como los que se describen
en dichas patentes Howe y Sisti y otros no son adecuados para llevar
a cabo de manera rápida y eficaz las mencionadas reacciones.
La Patente U.S.A. Nº 5.455.175 da a conocer un
aparato para realizar ciclos térmicos en el que se utiliza un tubo
capilar de paredes delgadas. Los tubos capilares no comprenden una
parte en forma de embudo.
La Patente U.S.A. Nº 3.219.412 da a conocer un
aparato para el tratamiento químico secuencial automatizado. Los
tubos capilares dados a conocer en el documento pueden comprender un
embudo y están abiertos por ambos extremos del tubo capilar. El
tubo capilar es utilizado en el aparato para transportar la muestra
hasta el recipiente de recepción.
En particular, la reacción de la cadena de
polimerasa (PCR) es una técnica de amplificación fundamental de ADN
esencial en la biología molecular moderna. A pesar de su carácter
útil y su popularidad, el conocimiento actual de PCR no ha avanzado
mucho. Se deben optimizar las amplificaciones por pruebas sucesivas
y los protocolos son seguidos frecuentemente de forma ciega. La
comprensión limitada de PCR de la técnica actual es un buen ejemplo
de la forma en la que los actuales técnicos en la materia se
conforman en utilizar una técnica potente sin reflexión ni
comprensión.
Los procesos biológicos tales como PCR requieren
la realización de ciclos de temperatura con la muestra. La técnica
anterior, tal como se ha explicado anteriormente, no solamente lleva
a cabo los ciclos de temperatura lentamente, sino que ignora los
principios que subyacen y que permiten el funcionamiento de PCR y
que se podrían utilizar para hacer el PCR incluso más potente. Así
por ejemplo, sería un gran progreso en esta técnica el dar a
conocer métodos y aparatos particularmente adaptables para llevar a
cabo rápidamente PCR y para el análisis de la reacción que está
teniendo lugar, especialmente si dicha reacción es analizada
mientras está teniendo lugar, es decir, en tiempo
real.
real.
Teniendo en cuenta el estado de la técnica
anteriormente descrita, la presente invención está destinada a
conseguir los siguientes objetivos.
Es un objetivo de la presente invención dar a
conocer un aparato para controlar de manera precisa la temperatura
de muestras biológicas.
Es otro objetivo de la presente invención dar a
conocer un aparato con el que se pueda someter a muestras biológicas
a ciclos térmicos rápidos utilizando aire como medio de
transferencia térmica.
Es un objetivo de la presente invención dar a
conocer un sistema y un método para llevar a cabo de forma rápida
PCR rápidamente y para supervisar simultáneamente la reacción.
Es otro objetivo de la presente invención dar a
conocer un sistema y método para llevar a cabo PCR de forma rápida y
supervisar simultáneamente la reacción mientras está teniendo
lugar.
Otro objetivo de la presente invención es dar a
conocer un sistema y método para llevar a cabo PCR de forma rápida
mientras también se ajustan los parámetros de reacción mientras está
teniendo lugar la reacción.
Éstos y otros objetivos y ventajas de la
invención quedarán más evidentes en la descripción y
reivindicaciones siguientes, o se podrán captar por la práctica de
la invención.
De acuerdo con un aspecto de la invención se
prevé un aparato que está particularmente adecuado para someter
muestras biológicas a ciclos térmicos rápidos a efectos de llevar a
cabo uno o varios procesos o procedimientos.
La invención da a conocer:
un recipiente de plástico/cristal para contener
una muestra de fluido biológico mientras se lleva a cabo la
amplificación del ácido nucleico, comprendiendo dicho recipiente un
material ópticamente claro, configurado para contener un máximo de 1
ml de muestra, comprendiendo además:
- a)
- una parte en forma de tubo capilar que está cerrada en un extremo,
- b)
- una parte de recipiente (450C) estando la parte en forma de embudo unida al extremo abierto de la parte en forma de tubo capilar; y
- c)
- una estructura para sellar la parte en forma de tubo capilar
en la que la parte en forma de tubo capilar está
fabricada de plástico.
\newpage
Otro aspecto de la presente invención da a
conocer:
una serie de recipientes de plástico/cristal
como se definen en la reivindicación 5.
La invención también da a conocer:
el uso de un recipiente de plástico/cristal,
según la presente invención, para PCR en Tiempo Real caracterizado
porque dicho recipiente está destinado a contener una muestra de
fluido biológico mientras se lleva a cabo la amplificación del
ácido nucleico, comprendiendo dicho recipiente un material
ópticamente transparente, configurado para contener como máximo 1
ml de una muestra, según la reivindicación 8.
Según otro aspecto, la presente invención da a
conocer métodos y aparatos para la supervisión continua de la
amplificación de ADN, así como realizar el seguimiento del avance de
dichos procedimientos. En particular, da a conocer métodos y
aparatos para la supervisión continua de la fluorescencia del
procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa,
preferiblemente componentes ópticos combinados con estructuras para
proporcionar unos ciclos rápidos de temperatura a efectos de
controlar continuamente la amplificación de ADN por una serie de
diferentes técnicas de fluorescencia. Los contenedores de muestras
de cristal capilar permiten una rápida transferencia de calor desde
el medio de transferencia térmica preferente (permitiendo 30 ciclos
de amplificación en menos de 15 minutos cuando un gas tal como aire
es utilizado como medio de transferencia térmica) y supervisando
simultáneamente la reacción.
Se utilizan técnicas ópticas para controlar el
avance de la reacción mientras se produce la misma. En algunas
realizaciones preferentes de la invención, se añaden sondas
fluorescentes a la mezcla de reacción. Entonces, la presente
invención supervisa la fluorescencia, como mínimo, una vez durante
una transición de temperatura, y preferentemente la fluorescencia
es captada dos o más veces durante una transición de temperatura,
desde una muestra única o desde múltiples muestras. Se incluye un
carrusel rotativo para desplazar secuencialmente las muestras, una
a una, a un lugar de supervisión o control, siendo sometidas la
totalidad de las muestras simultáneamente a ciclos térmicos
rápidos. De modo deseable, realizaciones de la presente invención
prevén la supervisión de la fluorescencia una vez por ciclo de
amplificación o supervisión de la temperatura, tiempo y
fluorescencia de modo continuo en la totalidad de cada ciclo de
amplificación.
Utilizando la presente invención, se puede
obtener un gráfico tridimensional de temperatura, tiempo y
fluorescencia. Los gráficos de fluorescencia con respecto a la
temperatura de las sondas de hibridación discriminan entre la señal
acumulativa, irreversible, de fraccionamiento de exonucleasa y la
hibridación reversible, dependiente de la temperatura, de las
sondas adyacentes. Las sondas de hibridación son más útiles que las
sondas de hidrólisis porque la dependencia de temperatura de la
fluorescencia se puede seguir y utilizar para detectar alteraciones
en secuencia del producto, es decir, polimorfismos y mutaciones.
Utilizando colorantes que muestran fluorescencia en presencia de
DNA de doble hilera, se pueden seguir dentro de cada ciclo la
desnaturalización del producto, la reasociación y extensión. La
presente invención da a conocer un aparato y métodos para llevar a
cabo de manera rápida las reacciones de amplificación de ADN que
combinan amplificación y análisis de la reacción en menos de quince
minutos, y más preferentemente en menos de quince minutos, y de modo
más preferente en menos de diez minutos.
Para apreciar mejor la forma en la que se
obtienen los objetivos y ventajas de la invención que se han
indicado y otros, se realizará una descripción más específica de la
invención que se ha descrito brevemente en lo anterior haciendo
referencia a los dibujos adjuntos. Teniendo en cuenta que estos
dibujos no se deben considerar como limitativos de su alcance, la
invención se describirá y se explicará con especificidad adicional y
detalle mediante la utilización de los dibujos adjuntos en los
que
La figura 1 muestra una vista en perspectiva de
un aparato de ciclos térmicos adaptado para realizar ciclos térmicos
con muestras biológicas y adaptado especialmente para su utilización
en la amplificación de ADN con los recipientes de la presente
invención.
La figura 2 es una vista lateral en alzado de la
parte de la cámara de fluido del aparato de la figura 1.
La figura 3 es una vista en planta interior de
la cámara de fluido del aparato mostrado en la figura 1.
La figura 4 muestra una vista en planta interior
de otra cámara de fluido de otra realización de la presente
invención.
La figura 5 muestra la curva optimizada de la
temperatura con respecto al tiempo para una reacción de cadena de
polimerasa utilizando el dispositivo de ciclos térmicos de la
presente invención.
La figura 6 muestra gráficamente el efecto de un
tiempo de desnaturalización sobre los rendimientos de la reacción de
cadena de polimerasa utilizando el dispositivo de ciclos térmicos de
la presente invención.
La figura 7 muestra gráficamente el efecto del
tiempo de reasociación en la especificidad de la reacción de cadena
de polimerasa y rendimientos utilizando el dispositivo de ciclos
térmicos.
Las figuras 8A-B, son vistas en
sección transversal en perspectiva y en alzado, respectivamente, de
otra realización preferente del uso de la presente invención.
La figura 8C es una representación esquemática
de la relación del elemento productor de calor y los tubos capilares
que mantienen las muestras biológicas 10 en el ejemplo comparativo
mostrado en las figuras 8A-B.
La figura 9A es un ejemplo comparativo y muestra
los resultados de cuatro perfiles de temperatura/tiempo distintos
(A-D) y sus productos de amplificación resultantes
después de treinta ciclos (A-D).
La figura 9B es un ejemplo comparativo y muestra
un ciclo de otro perfil preferente de temperatura/tiempo. Las
figuras 9C-G muestran ciclos a título de ejemplo de
otros perfiles preferentes de temperatura/tiempo.
La figura 10 se refiere a un diagrama de bloques
de un circuito de control de la pendiente de temperatura según la
presente invención.
La figura 10A es una representación gráfica del
efecto de la velocidad de transición de temperatura desde la
temperatura de desnaturalización del producto a la temperatura de
reasociación del cebador sobre la especificidad del producto de la
reacción.
La figura 11 es una vista esquemática de un
aparato de ciclos térmicos rápidos preferente, con detección de
fluorescencia.
La figura 11A es un diagrama de temperatura con
respecto al tiempo que muestra un funcionamiento preferente del
aparato de la figura 11.
La figura 12 es una representación de gráficos
tridimensionales de temperatura, tiempo y fluorescencia durante la
amplificación de un fragmento de ADN de hepatitis B en presencia de
SYBR Green I.
Las figuras 12A-C son
representaciones de gráficos bidimensionales de temperatura con
respecto al tiempo, fluorescencia con respecto al tiempo y
fluorescencia con respecto a la temperatura que se han mostrado en
conjunto en forma de gráfico tridimensional en la figura 12.
La figura 13 es un gráfico de fluorescencia con
respecto a temperatura durante la amplificación de un fragmento de
536 pares de bases del gen humano \beta-globina en
presencia de SYBR Green I.
La figura 14 es un gráfico de la fluorescencia
con respecto al número de ciclos obtenido.
La figura 14A muestra la leyenda para la figura
14, y subsiguientes figuras, indicando diferentes números de copias
de la plantilla inicial.
La figura 15 es un gráfico de fluorescencia con
respecto al número de ciclos.
La figura 16 es un gráfico de proporción de
fluorescencia con respecto a temperatura.
La figura 17 es un gráfico de relación de
fluorescencia con respecto a temperatura.
La figura 18A es un gráfico que representa un
paradigma de PCR en equilibrio.
La figura 18B es un gráfico que representa un
paradigma de PCR cinético.
La figura 18C es un gráfico que representa
diferentes perfiles de tiempo/temperatura cerca de la temperatura de
reasociación.
La figura 19 representa un ejemplo comparativo
configurado para control continuo de una muestra.
Las figuras 19A-19D son
representaciones de diferentes configuraciones de contenedores de
muestras.
La figura 19E es un gráfico que muestra el
efecto de las diferentes configuraciones de contenedores de muestras
de las figuras 19A-D sobre la respuesta de
temperatura de la propia muestra.
Las figuras 19F y 19G son vistas lateral y desde
un extremo, respectivamente, de un contenedor de muestras preferente
según la presente invención.
Las figuras 19H y 19I muestran, respectivamente,
dos posibles orientaciones de un tubo capilar rectangular cuando se
detecta la fluorescencia de la muestra.
La figura 20 muestra la disposición óptica
destinada a proporcionar un control continuo de una muestra sometida
a amplificación de ADN.
La figura 21 es una representación esquemática
de un aparato de ciclos térmicos rápidos con detección de
fluorescencia en la punta de los contenedores de muestras.
Las figuras 21A-D muestran
contenedores compuestos de plástico/cristal en los que se disponen
muestras biológicas.
La figura 22 muestra segmentos útiles de
temperatura con respecto al tiempo para control de hibridación con
fluorescencia.
La figura 22A es un gráfico que muestra la
eficacia de conductos de luz por el visionado de la punta en vez de
la parte lateral de un contenedor de muestras capilar.
La figura 22B muestra el rendimiento de los
conductos de luz mediante dos tamaños distintos de tubos de muestras
capilares.
La figura 22C es un diagrama de bloques de alto
nivel mostrando las tareas que son llevadas a cabo por una
realización preferente de la presente invención que comprende un
dispositivo de ciclos rápidos de temperatura con detección de
epifluorescencia.
La figura 22D es un gráfico de la temperatura
con respecto al tiempo para reacción PCR en la que se utiliza
realimentación de fluorescencia para controlar los parámetros de la
reacción.
La figura 22E es un gráfico de la fluorescencia
con respecto al tiempo para una reacción PCR en la que se utiliza
realimentación de fluorescencia para controlar los parámetros de la
reacción.
La figura 23 es un gráfico de la fluorescencia
con respecto al tiempo que muestra la relación inversa entre la
temperatura y la fluorescencia.
La figura 24 es un gráfico de la temperatura con
respecto al tiempo que muestra la relación inversa entre temperatura
y fluorescencia.
La figura 25 es un gráfico de fluorescencia con
respecto a temperatura para tres productos PCR distintos en
presencia de SYBR Green 1 conseguido durante una transición de
temperatura de 0,2 grados por segundo a través de las temperaturas
de fusión del producto.
La figura 26 es un gráfico de fluorescencia con
respecto al tiempo que muestra la reasociación del producto para
diferentes concentraciones de producto PCR en presencia de SYBR
Green I.
Las figuras 27A y 27B son esquemas en sección de
la realización mostrada en la figura 28 en modalidad de trabajo y
modalidad de carga, respectivamente.
La figura 28 es una representación esquemática
de un dispositivo de ciclos de temperatura de tipo rápido con
detección de fluorescencia en la punta de los contenedores de
muestras y que incluye el posicionado para detección de
fluorescencia en dos dimensiones para optimizar la detección.
La figura 29 es una vista en perspectiva del
exterior de la realización mostrada en la representación esquemática
de la figura 28.
Las figuras 30A-30V son
diagramas esquemáticos detallados de los componentes eléctricos.
Las figuras 31A y 31B son vistas en perspectiva
y en sección transversal, respectivamente, de un sistema de
manipulación de muestras.
La figura 32 es una representación esquemática
de otra realización que recibe múltiples bandejas de manipulación de
muestras.
A continuación, se hará referencia al dibujo en
el que iguales partes recibirán las mismas designaciones de
referencia.
Tal como se ha mostrado en la figura 1, un
dispositivo (10) de ciclos térmicos preferente comprende una cámara
de fluido en bucle cerrado (preferentemente aire), indicada de
manera general con el numeral (11), que está adaptada para aceptar
muestras que deben someterse a ciclos a través de una puerta de
comunicación (14). La cámara (11) de fluido en circuito cerrado
comprende una serie de compartimientos cada uno de los cuales se
describirá brevemente. El dispositivo (10) incluye también un
controlador (12) que puede ser programado por medio de teclas de
entrada (25) y la pantalla (26) para provocar que la cámara (11)
quede sometida a ciclos en una serie de temperaturas durante un
período de tiempo predeterminado. Los ciclos térmicos aplicados a la
cámara (11) pueden ser utilizados para llevar a cabo numerosos
procesos y son especialmente adecuados para amplificaciones del ADN
específico del cebador a partir de muestras que contienen mezclas de
reacción, tal como se explicará más adelante.
La cámara (11) de fluido en circuito cerrado
está comprendida en una configuración en forma general de caja por
el cuerpo envolvente (13). Unos paneles (16) de montaje del
ventilador, en caso deseado, pueden quedar situados a efectos de
separar una sección rectangular más pequeña de la cámara (11),
funcionando para soportar y fijar un cuerpo de forma general
cilíndrica (15) inferior a aquél. De manera alternativa, el
ventilador del dispositivo soplante (28) puede quedar alojado
integralmente dentro del cuerpo envolvente (13) de la cámara.
El interior del cuerpo envolvente (15) del
dispositivo soplante contiene las paletas y eje del dispositivo. El
motor del dispositivo soplante (no mostrado) está situado
exteriormente del cuerpo envolvente (15) del dispositivo soplante,
y por lo tanto por el exterior de la cámara cerrada (11). Con esta
configuración, las paletas y eje son las únicas piezas del
dispositivo soplante que quedan expuestas a la circulación de
fluido caliente dentro de la cámara (11). Sería desventajoso montar
el motor dentro de la cámara que sometería al motor a variaciones
de temperatura y que aumentaría también la masa térmica del motor a
la que está sujeta a calentamiento y enfriamiento. La reducción de
la masa térmica expuesta al fluido en la cámara (11) es deseable
con respecto al rendimiento global del dispositivo (10) en su
función de someter las muestras situadas en su interior a un
desarrollo deseado de la temperatura con respecto al tiempo,
utilizando perfiles predeterminados o alterando uno o varios
parámetros de la reacción al continuar la reacción, tal como se
explicará de manera más completa más adelante.
El dispositivo soplante (28) es un dispositivo
soplante de tipo bien conocido identificado como del tipo "en
línea" que utiliza preferentemente un ventilador del tipo hélice,
debido a su masa térmica general baja, o en caso deseado, un
ventilador del tipo de jaula de ardilla, poseyendo el ventilador
preferentemente una capacidad mínima de 75 pies cúbicos por
minuto.
La plataforma (17) del solenoide lleva fijado un
solenoide (18). La armadura (19) del solenoide está fijada al
extremo superior (21) de la varilla (20) que está fijada
rígidamente a la puerta de evacuación (14) y fijada con capacidad de
rotación al cuerpo envolvente (13) en puntos situados por encima y
por debajo de dicha puerta (14). La varilla (20) permite, por lo
tanto, que dicha puerta de evacuación (14) gire libremente con
respecto al cuerpo envolvente (13) alrededor del eje longitudinal
de la varilla.
Un resorte (22) está fijado en uno de sus
extremos al cuerpo envolvente (13) por el pie de soporte (23). El
extremo opuesto del resorte (22) está fijado al extremo superior
(21) de la varilla (20) directamente adyacente al acoplamiento de la
armadura (19) del solenoide. El resorte (22) está dispuesto entre
estos dos puntos de fijación de manera que quede tensado. El
resorte (22) tiende, por lo tanto, a tirar del extremo superior (21)
hacia el pie de soporte (23), que a su vez tiende a hacer girar la
puerta de evacuación (14) hacia su posición de cierre. Cuando se ha
accionado el solenoide (18), la armadura (19) tiende a tirar del
extremo superior (21) de la varilla (20) en la dirección del
solenoide (18), lo cual es la dirección opuesta de tracción del
resorte (22), y que tiende a abrir la puerta de evacuación
(14).
El controlador, indicado de manera general con
un numeral (12), está unido eléctricamente a la cámara (11) por
medio del cable de transmisión (24). El cable (24) suministra
potencia asimismo al motor del dispositivo soplante (no mostrado) y
a la bobina de calentamiento (31). Además, el controlador (12) está
también conectado al sensor (35) del termopar para recibir señales
correspondientes a datos de temperatura y al solenoide (18) para
activar la armadura del solenoide.
El controlador (12) puede consistir en cualquier
tipo bien conocido de unidad de control de temperatura programable
para controlar la bobina de calentamiento (31), puerta de evacuación
(14) y dispositivo soplante a efectos de conseguir determinadas
temperaturas como función del tiempo dentro de la cámara (11), y
que también es capaz de ser programado para accionar una salida de
relevador para activar un solenoide en períodos de tiempo
predeterminados y determinados niveles de temperatura de la cámara.
Un controlador preferente de temperatura (12) a utilizar en la
realización de las figuras 1-3 es un controlador de
temperatura de tipo proporcional Partlow MIC-6000,
que se puede conseguir de la firma Omega Engineering Inc, de
Stanford, Connecticut, como controlador de proceso modelo Nº
CNB600.
Tal como se ha mostrado en las figuras 2 y 3, el
interior de la cámara (11) está dividido en cuatro compartimientos
principales. El compartimiento del dispositivo soplante (28) está
formado por el cuerpo envolvente (15) del dispositivo soplante y de
las placas (16) para el montaje de dicho dispositivo soplante. La
totalidad del compartimiento (289 del dispositivo soplante está
llenada con el ventilador y partes del eje de un dispositivo
soplante, tal como se ha descrito anteriormente. El dispositivo
soplante puede ser correspondiente a cualquier tipo de diseños
conocidos, tal como se ha descrito anteriormente, y se ha omitido
por lo tanto, de la figura 3 a efectos de mayor claridad. Es
suficiente, a efectos de la presente invención, comprender que el
ventilador situado en el compartimiento soplante (28) hace pasar
fluido hacia dentro del compartimiento (28) del dispositivo soplante
a través de la abertura de entrada (36) y empuja al fluido hacia
afuera de la abertura de salida (37).
Es preferible que el fluido sea impulsado por el
dispositivo soplante con un caudal mínimo de 75 pies cúbicos por
minuto. No obstante, es importante, a efectos de la presente
invención, observar que el fluido situado en la cámara (11)
establece contacto solamente con el ventilador y una parte del eje
de impulsión del dispositivo soplante, estando situado el motor del
dispositivo soplante fuera del cuerpo envolvente (15) de dicho
dispositivo soplante a efectos de evitar cualquier contacto del
mismo con el fluido de la cámara (11). Esta consideración
contribuye a que la velocidad de funcionamiento de la presente
invención haga mínimo el material que establece contacto con el
fluido dentro de la cámara (11) a efectos de minimizar la masa
térmica de material que se debe calentar y/o enfriar durante el
proceso de ciclos. Al hacer mínima la masa térmica que se debe
calentar o enfriar por el fluido, el tiempo de respuesta necesario
para llevar el contenido de la cámara (11) a una temperatura
uniforme disminuye de modo notable.
El fluido que sale del compartimiento (28) del
dispositivo soplante a través de la abertura de salida (37) se
introduce en el compartimiento de calentamiento (29). El fluido que
pasa hacia adentro del compartimiento de calentamiento (29) debe
pasar por las bobinas de calentamiento (31). Si las bobinas de
calentamiento (31) se calientan más que el fluido que pasa hacia el
compartimiento de calentamiento (29), el fluido se calentará al ser
obligado a pasar por dicho compartimiento. La bobina de
calentamiento es preferentemente una bobina de conductor nicrom de
1000 vatios (125 voltios en CA) arrollado alrededor de un
microsoporte. No obstante, se podría utilizar cualquier unidad de
calentamiento adecuada para el calentamiento del tipo de fluido
presente en la cámara. La realización específica de bobina de
calentamiento mostrada en las figuras 1-3 está
fabricada por Johnstone Supply, de Portland, Oregon.
La bobina de calentamiento es activada por un
relevador de salida incluido en el controlador (12). El relevador
preferente es un relevador de estado sólido de 125 voltios en CA, 25
A, fabricado por Omega Engineering Inc. de Stanford, Connecticut,
como modelo Nº Omega SSR 240 D25.
El fluido que pasa por el compartimiento de
calentamiento (29) choca sobre los deflectores (32) y (33) antes de
pasar al compartimiento de reacción (30). Los deflectores (32) y
(33) tienden a interrumpir el flujo de fluido laminar y generan
turbulencia para mezclar de manera efectiva el fluido de manera que
éste llega al compartimiento de reacción (30) a una temperatura
homogénea.
El detector del termopar (35) proporciona una
señal de entrada eléctrica al controlador (12) que corresponde a la
temperatura del fluido en el compartimiento de reacción (30). El
control de la temperatura durante el funcionamiento del dispositivo
(10) de ciclos térmicos se consigue preferentemente mediante un
termopar de tipo "J" de hierro-constantan de
capacidad 30. El controlador utiliza esta información para regular
la bobina de calentamiento (31) de acuerdo con los perfiles de
temperatura con respecto al tiempo programados y para activar el
solenoide (18), tal como se explicará en su momento.
El fluido que pasa por el compartimiento de
reacción (30) al compartimiento de retorno de aire (34) debe pasar
a través del compartimiento de muestra (27) (tal como se han
mostrado en líneas de trazos). El compartimiento de muestra (27) se
explicará también en su momento.
El fluido del compartimiento de retorno (34) ha
sido enfriado ligeramente debido a la transferencia de calor del
mismo a las muestras situadas en el compartimiento de muestras (27).
El fluido que retorna al compartimiento (34) es llevado a través de
la abertura de entrada (36) hacia adentro del compartimiento (28)
del soplante donde es obligado nuevamente, por acción del
ventilador, a salir por la abertura de salida (37) pasando al
compartimiento de calentamiento (39). De este modo, la cámara de
fluido (11), cuando funciona con la puerta de salida (14) cerrada,
es una cámara de fluido en circuito cerrado que hace recircular de
manera continuada el fluido según una trayectoria de bucle cerrado
por cada uno de sus compartimientos a efectos de llevar su
contenido a una temperatura uniforme. La circulación continua del
aire en la cámara (11) permite que las muestras del compartimiento
de muestras (27) sean llevadas a una temperatura predeterminada lo
más rápidamente posible, y que luego queden mantenidas a dicha
temperatura, en caso deseado.
Cuando el dispositivo (10) debe ser utilizado no
solamente para calentar material situado en el compartimiento de
reacción (27), sino también para enfriar a continuación estos
materiales lo más rápidamente posible a una temperatura igual o
superior a la temperatura del fluido ambiente (aire), el controlador
(12) puede ser programado para activar el solenoide (18) para
provocar que la puerta (14) se abra, permitiendo que grandes
cantidades de fluido ambiente barran de forma inmediata el
compartimiento (11) mientras que el fluido caliente de su interior
escapa simultáneamente.
La desactivación de la bobina de calentamiento
(31) mientras continúa la activación del dispositivo soplante con
la puerta (14) abierta, impulsará el fluido ambiente hacia adentro
del compartimiento de retorno (34) y desde allí al compartimiento
(26) del dispositivo soplante. El dispositivo soplante empujará a
continuación este fluido ambiente a través del compartimiento de
calentamiento (29) donde pasará directamente al compartimiento de
reacción (30) sin ser calentado por la bobina (31). El fluido
ambiente pasa a continuación a través del compartimiento de muestras
(27) y escapa hacia afuera de la cámara (11) a través de la puerta
(14). Debido a la masa térmica mínima del material situado en la
cámara (11) y a la acción del ventilador de un dispositivo soplante,
grandes cantidades de fluido ambiente serán forzadas a pasar por el
compartimiento de muestras (27), y desde allí hacia afuera de la
cámara (11). De este modo, se obtiene una refrigeración rápida de
las muestras o del material situado en el compartimiento de reacción
(27).
El compartimiento de muestras (27) está
dimensionado a efectos de permitir que una serie de muestras, tal
como los tubos de cristal alargados y huecos que contienen una
muestra en su interior, queden fácilmente situadas en una
orientación separada de manera que el fluido pueda ser distribuido
de manera regular alrededor de cada muestra. En caso deseado, el
compartimiento de muestras (27) puede ser dimensionado y
configurado a efectos de permitir la inserción de estantes, cestas o
similares que han sido configurados a efectos de aceptar una serie
de muestras en dispo-
sición de separación uniforme entre sí, a efectos de simplificar la carga de las muestras en la cámara de muestras (27).
sición de separación uniforme entre sí, a efectos de simplificar la carga de las muestras en la cámara de muestras (27).
El acceso al compartimiento de muestras (27) se
consigue por rotación de la puerta (14) a su posición abierta. Una
vez que la puerta (14) se ha hecho girar aproximadamente 90 grados
desde su posición cerrada, el compartimiento de muestras (27) es
fácilmente accesible a través de la misma. Asimismo, tal como se
puede apreciar en las figuras 1-3, la rotación de la
puerta de evacuación (14) en 90 grados aproximadamente desde su
posición cerrada provoca que el compartimiento (34) de retorno de
fluido quede substancialmente cerrado con respecto al compartimiento
de reacción (30). De este modo, cuando el dispositivo (10) se
encuentre en modalidad de "refrigeración", el fluido ambiente
entra directamente en el compartimiento de retorno de fluido (34) y
es obligado a través del compartimiento (28) del dispositivo
soplante, compartimiento de calentamiento (29), compartimiento de
reacción (30),y compartimiento de muestras (27) substancialmente a
lo largo de la misma trayectoria que la trayectoria de flujo de
fluido en circuito cerrado que se ha descrito anteriormente. El
fluido es obligado a continuación hacia afuera de la cámara de aire
(11) y se ve impedido de retroceder hacia adentro del
compartimiento de retorno de aire (34) por el posicionado de la
puerta de evacuación (14) entre el compartimiento de muestras (27) y
el compartimiento (34) de retorno de fluido.
Por lo tanto, la puerta de evacuación (14) no
solamente permite que el fluido ambiente entre en la cámara
(11),sino que también puede impedir que el fluido recircule en forma
de bucle a través de la cámara (11). En vez de ello, el fluido es
obligado a pasar a través del compartimiento de muestras (27) y a
continuación hacia afuera de la cámara (11) para ayudar en la
refrigeración rápida del contenido de las muestras y de la cámara
(11).
Cuando el dispositivo (10) es utilizado para
amplificación cíclica de ADN, se requiere un efecto cíclico
repetitivo por las diferentes temperaturas. Las muestras que
contienen una mezcla de reacción para la reacción de cadena de
polimerasa, deben ser sometidas a ciclos aproximadamente 30 veces
pasando por los cambios de temperatura que corresponden a la
desnaturalización, reasociación y alargamiento del proceso de
amplificación.
El dispositivo (10) debido a sus nuevas
características que se han descrito, es capaz de someter muestras a
ciclos con periodos significativamente más cortos en comparación con
lo conocido en la técnica anterior. Por ejemplo, la aplicación de
amplificación de ADN representada en las figuras puede pasar por un
perfil de ciclos de temperatura con respecto al tiempo en
30-60 segundos (ver figura 5). Este mismo ciclo
utilizando dispositivos de la técnica anterior requeriría
aproximadamente 5-10 veces más tiempo. Estos bajos
tiempos de ciclo se han demostrado también que incrementan el
rendimiento y especificidad de la reacción de cadena de polimerasa
con respecto a los ciclos conocidos en la técnica anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de cadena de polimerasa fue
realizada en un volumen de 10 \mul con 50 ng de plantilla genómica
humana DNAes, 0,5 mM de cada desoxinucleótido, 500 nM de cada uno
de dos cebadores oligonucleótidos
G(ITT
GOCCAATCTACTCCCAGO (SEQ ID NO: 5) y GCTCACTCAGTCTSGCAAAG (SEQ ID NO: 6) en un tampón de reacción consistente en 50 mM Tris-HCl <pH 8,5 de 25ºC), 3,0 mM de cloruro magnésico, 20 mM KCl y 500 \mug/ml de albúmina de suero bovino. Se añadió polimerasa de ADN "Thermus aquatics" (0,4 \mu), las muestras se colocaron en tubos capilares de paredes delgadas de 8 cm de longitud, (fabricados por Kimble, Kimax 46485-1), y los extremos fueron fundidos con un quemador de gas de laboratorio de manera que se encontraba una burbuja de aire en ambos extremos de cada tubo.
GOCCAATCTACTCCCAGO (SEQ ID NO: 5) y GCTCACTCAGTCTSGCAAAG (SEQ ID NO: 6) en un tampón de reacción consistente en 50 mM Tris-HCl <pH 8,5 de 25ºC), 3,0 mM de cloruro magnésico, 20 mM KCl y 500 \mug/ml de albúmina de suero bovino. Se añadió polimerasa de ADN "Thermus aquatics" (0,4 \mu), las muestras se colocaron en tubos capilares de paredes delgadas de 8 cm de longitud, (fabricados por Kimble, Kimax 46485-1), y los extremos fueron fundidos con un quemador de gas de laboratorio de manera que se encontraba una burbuja de aire en ambos extremos de cada tubo.
Los tubos capilares fueron colocados a
continuación prácticamente en un soporte construido por un "panel
perforado prepunzonado" de 1 mm de espesor (fabricado por Radio
Shack). La mezcla fue sometida a ciclos 30 veces pasando por
desnaturalización (90-92ºC), reasociación
(50-55ºC) y alargamiento (72-75ºC)
consiguiendo el perfil de temperatura con respecto al tiempo de una
figura 5. Se realizó el control de temperatura de los tubos
capilares con un termopar miniatura (IT-23,
Sensortek, Clifton, NJ) colocado en 10 \mul de agua desionizada y
conectado a un monitor termopar (BAT-12, Sensortek).
Se fraccionaron los productos de amplificación por electroforesis
sobre 1,5% de gel de agarosa. Se obtuvieron productos de
amplificación específica con un buen rendimiento.
Debido al hecho de que el dispositivo (10)
utiliza aire como medio de transferencia térmica en vez de agua,
tiene la ventaja de que la transferencia de calor tiene lugar a
través de un medio de baja capacidad calorífica (aire) que se puede
calentar muy rápidamente.
El tiempo de respuesta para la refrigeración de
las muestras es muy rápido debido a la utilización de tubos
capilares de cristal de paredes delgadas para contener las muestras
en vez de tubos micrófugos de plástico tal como se ha realizado con
anterioridad en los procesos de la técnica anterior, y minimizando
la masa térmica del material situada en el interior de la cámara
(11) (ver figura 5). Estos tiempos de respuesta pueden permitir la
optimización de las exigencias de tiempo y temperatura para las
fases de desnaturalización, reasociación y alargamiento en la
reacción de cadena de polimerasa.
Además, se obtienen tiempos reducidos de
"rampa", es decir, el tiempo necesario para llevar la
temperatura de la muestra desde un nivel de temperatura a nivel de
temperatura siguiente que corresponde a fases del proceso de
amplificación se acorta. Esto disminuye el tiempo requerido para una
amplificación completa y permite asimismo, un estudio específico de
la reasociación, desnaturalización y cinética de la encima con un
protocolo de reacción de cadena de polimerasa.
Los deflectores (32) y (33) (tal como se muestra
en la figura 3) se pueden utilizar en caso deseado para conseguir
mejor homogeneidad de temperatura dentro del compartimiento de
muestra (27). Tal como se ha mostrado, los deflectores (32) y (33)
disminuyen la variación de temperatura en el compartimiento de
reacción (30) de unos 10ºC a unos 2ºC. En caso deseado, otros
deflectores (o deflectores más complicados) pueden ser utilizados
para disminuir adicionalmente la variación de temperatura en el
compartimiento de reacción (30). De modo alternativo, tal como se ha
mostrado en la figura 4, el ventilador puede quedar dispuesto más
abajo con respecto a la bobina de calentamiento (31), pero antes
del compartimiento de muestras (27) para conseguir una mezcla más
uniforme.
Los productos de amplificación obtenidos por la
utilización del aparato (10) son, como mínimo, cuantitativa y
cualitativamente tan deseables como los obtenidos por el método
manual de ciclos de baño de agua. No obstante, son posibles
ventajas en la especificidad y en el rendimiento con un control
térmico rápido de la mezcla de reacción.
La figura 6 muestra el efecto de la temperatura
con respecto al tiempo según el gráfico de la figura 5 utilizado
con el aparato de ciclos térmicos (10) en cuanto a especificidad (es
decir, rendimiento en un producto específico en oposición a una
serie de productos similares o "sombra"). Tal como se puede
apreciar, cuanto más corta es la rampa y el tiempo de reasociación,
mayor es la especificidad del producto. La respuesta rápida de
temperatura del aparato (10) permite mejor especificidad y
rendimiento, lo cual no es posible con sistemas de la técnica
anterior.
La figura 7 muestra el efecto de variación del
tiempo de desnaturalización de la temperatura con respecto al
tiempo en el gráfico de la figura 5 utilizado con el aparato de
ciclos térmicos (10) de la presente invención en los rendimientos
de la amplificación de ADN. Cada una de las líneas verticales más
brillantes corresponden a un tiempo y temperatura de
desnaturalización específicos. Tal como se puede observar, el
rendimiento es mayor para el tiempo de desnaturalización más corto
posible. Este resultado no es posible con los sistemas de la técnica
anterior.
Tal como está demostrado, al disminuir la
capacidad térmica (masa térmica) del aparato (10), ello puede
disminuir notablemente el tiempo total requerido para llevar a cabo
la reacción de cadena de polimerasa. Además, la utilización de
pequeños volúmenes de muestra acorta adicionalmente el tiempo total
requerido para la reacción y también reduce las cantidades de
reactivos de elevado precio que se deben utilizar hasta 90%
aproximadamente, reduciendo de este modo adicionalmente el coste de
llevar a cabo los procedimientos. Por ejemplo, en el ejemplo
comparativo representado en las figuras 1-3, se
pueden utilizar de modo deseable tubos capilares (108) que tienen
diámetros internos comprendidos en una gama de unos 0,25 mm hasta
1,0 mm. En algunas aplicaciones, los tubos capilares (108) que
tienen diámetros internos en una gama de unos 0,02 mm hasta 0,1 mm
pueden ser también utilizados.
El aparato (10) es útil para amplificar ADN de
cualquier fuente de procedencia. Si bien se han explicado
configuraciones y disposiciones específicas de la invención en
relación con realizaciones específicas del dispositivo de ciclos
térmicos (10), también se pueden utilizar otras disposiciones y
configuraciones. Por ejemplo, se pueden utilizar, de manera
alternativa, en el dispositivo (10), varios fluidos distintos del
aire, con una masa térmica generalmente
baja.
baja.
Otra realización se ha representado en las
figuras 8A-C. La figura 8A es una vista en
perspectiva y la figura 8B es una vista en alzado y sección
mostrando la realización adicional. Se comprenderá que muchos de
los componentes anteriormente explicados también se pueden aplicar
en el ejemplo mostrado en las figuras 8A-C. De este
modo, solamente la información adicional pertinente referente a este
ejemplo se explicará a continuación. De modo importante, en el
ejemplo de las figuras 8A-C, el elemento productor
de calor es adyacente a los contenedores de muestras biológicas
permitiendo un calentamiento y enfriamiento más rápidos de las
muestras biológicas, tal como se explica más adelante.
Tal como se apreciará brevemente, el aparato de
las figuras 8A-C proporciona mejoras adicionales con
respecto a la técnica anterior en lo que respecta a la velocidad a
la que se pueden llevar a cabo los ciclos térmicos, por ejemplo, 15
ó 30 ciclos de amplificación ADN en 30, 15, 10 minutos, o menos.
Además, el aparato (100) proporciona una mejor homogeneización
térmica en el conjunto de las muestras que lo que ha resultado
posible con anterioridad.
Se ha mostrado en la figura 8A la configuración
general del cuerpo envolvente (102) de este ejemplo. El cuerpo
envolvente (102) descansa sobre pies (104) (se aprecian mejor en la
figura 8B) y funciona de manera que retiene las otras estructuras
descritas en su lugar y aísla estas estructuras que se calientan
por el medio ambiente circundante. Se incluyen en la característica
(100) de la figura 8A las teclas de entrada (25) y una pantalla
(26) igual que en el aparato anteriormente descrito (10). Las
estructuras de control anteriormente descritas pueden ser fácilmente
modificadas o utilizadas como modelo para un medio de control para
su utilización en el ejemplo de las figuras
8A-C.
Tal como se aprecia mejor en la sección
transversal de la figura 8B, una cámara de muestra está designada
por el soporte (106). Una tapa (138) conectada al cuerpo envolvente
(102) por una charnela (131) puede ser abierta para permitir acceso
a la cámara de muestra (106). La cámara de muestra (106) es
preferentemente cilíndrica pero puede tener cualquier forma o
dimensiones requeridas por la aplicación específica.
La cámara de muestras (106) está preferentemente
alineada con un material esponjoso (110) de color negro cuya
superficie tiene características de absorción de la luz, poseyendo
el grueso del material esponjoso características aislantes. El
material esponjoso de color negro puede ser un material que se puede
conseguir fácilmente y un material fabricado a partir de un
material plástico. El material esponjoso (110) es preferentemente
un material que es enfriado fácilmente por el aire que pasa por
encima del mismo, es decir, el material tiene baja conductividad
térmica y una superficie porosa.
La superficie porosa de color oscuro o negro del
material convierte la radiación con longitud de onda más corta que
choca con la superficie en radiaciones con longitud de onda más
larga, es decir, calor, que se radía a la cámara de muestra.
El material esponjoso (110) funciona aislando
térmicamente la cámara de muestra con respecto al espacio de aire
circundante en el cuerpo envolvente y también para convertir la luz
emitida por la lámpara (112) en energía térmica. El material
esponjoso (110) puede ser sustituido por otros cuerpos. Por
ejemplo, un material que tiene color negro, oscuro u otra superficie
no reflectante, tal como una placa delgada de policarbonato que
tiene una superficie pintada de negro, puede recibir un soporte de
un material aislante, tal como fibra de vidrio o un material
esponjoso. La superficie de color negro u oscura, que puede ser
pintada sobre una serie de sustancias distintas, convierte la
radiación con longitud de onda más corta que choca sobre la misma
en radiación térmica, mientras que el material aislante aísla
térmicamente la cámara de muestra con respecto al medio ambiente
circundante. Por esta razón, utilizando las explicaciones que se
han facilitado, los técnicos en la materia podrán utilizar muchos
materiales distintos y cuerpos distintos como recubrimiento para la
cámara de muestra.
La lámpara (112) es preferentemente una lámpara
halógena de 500 watios. Si se utilizan dispositivos de control
apropiados, se pueden utilizar lámparas de mayor potencia, o una
serie de lámparas, por ejemplo, cuatro lámparas halógenas de 500
watios. Una base de enchufe (112A) para la lámpara está fijada al
cuerpo envolvente (102) por el soporte (112B). La lámpara (112) es
capaz de calentar de manera rápida y uniforme la cámara de muestra
(106) a la temperatura deseada. También se pueden utilizar otras
fuentes de calor, por ejemplo, radiación de rayos infrarrojos, tal
como el elemento conductor de nicromo descrito anteriormente,
dentro del alcance de la presente invención.
Se han representado en la figura 8B dos tubos
capilares de paredes delgadas (108) tales como los que se han
descrito anteriormente. Si bien se han mostrado dos tubos capilares
de paredes delgadas (108), la cámara de muestra (106) puede
contener muchos de dichos tubos. Los tubos capilares de paredes
delgadas (108) tienen varias ventajas importantes con respecto a los
dispositivos anteriormente utilizados, tal como se ha descrito
anteriormente y, junto con la cámara de muestras (106), funcionan
como ejemplo actualmente preferente de medios para contener una
muestra biológica.
Se observará que también se pueden utilizar
otros muchos cuerpos o estructuras que llevan a cabo funciones
similares o equivalentes. Los tubos capilares de paredes delgadas
(108) se dejan preferentemente que se prolonguen parcialmente hacia
afuera de la cámara de muestra a través de las aberturas (140) para
mayor facilidad de acceso, pero pueden quedar completamente
contenidas dentro de la cámara de muestras (106) tal como muchas
otras estructuras de retención de fluidos que son apropiadas para
aplicaciones específicas. Los tubos capilares de paredes delgadas
preferentes (108) tienen una capacidad aproximada de 10 \mul. Tal
como se comprenderá, el volumen de la muestra se debe mantener
reducido, y el área superficial de la estructura de soporte de la
muestra relativamente grande, y conjuntamente presentan una base
térmica relativamente pequeña. También es preferible que la
estructura de soporte de la muestra contenga un volumen comprendido
entre 1 l hasta unos 10.000 \mul, pero los técnicos en la materia
observarán que también se pueden utilizar otros volúmenes de
muestras si se tiene en consideración la diferente masa térmica de
la estructura.
La lámpara (112) y el material esponjoso
aislante (110) proporcionan conjuntamente un calentamiento rápido y
uniforme de la muestra contenida en los tubos capilares de paredes
delgadas (108) y el aire contenido dentro de la cámara de muestra
(106). Un termopar (134) queda incluido dentro de la cámara de
muestra (106) para detectar la temperatura dentro de la cámara y se
utiliza para mantener la temperatura deseada dentro de la cámara de
muestra tal como se ha descrito anteriormente.
El termopar (134) es preferentemente un termopar
de tipo disponible en la técnica cuya respuesta térmica se adapta
sustancialmente a la respuesta térmica de la muestra biológica y del
contenedor que la contiene. Estos termopares pueden ser obtenidos
comercialmente de fuentes de suministro tales como Idaho Labs que
fabrica una línea de termopares designados como termopares con
funda metálica, de tipo J. La adecuación de la respuesta térmica
del termopar a la de la muestra biológica y al contenedor se puede
llevar a cabo preferentemente insertando un microtermopar, tal como
el termopar modelo IT-23 de la firma PhysiTemp
conocido en esta técnica, en una muestra biológica típica soportada
por el contenedor escogido y sometiendo la muestra y el termopar
objeto de pruebas a los mismos cambios de temperatura. El termopar
sometido a pruebas, u otros criterios externos, pueden ser
cambiados hasta que la respuesta térmica del termopar se adapta de
manera adecuada a la respuesta térmica de la muestra y de su
contenedor.
La disposición representada en la figura 18
proporciona calentamiento y enfriamiento más uniformes de la muestra
que los dispositivos anteriormente conocidos. En dispositivos
anteriormente conocidos, la transferencia de calor a la muestra es
llevada a cabo por convección a través de la misma. El movimiento
inducido por convección de la muestra dentro de cualquier
estructura se utiliza para mantener la muestra, siendo provocado por
gradientes de temperatura o diferencias de temperatura en las
muestras biológicas generalmente pequeñas (por ejemplo,
10-100 \mul).
El efecto de los gradientes de temperatura
dentro de la muestra resulta más pronunciado y más difícil de
controlar al disminuir el tiempo de ciclo para una muestra. La
existencia de temperaturas irregulares dentro de una muestra, y
particularmente el basarse en "mezcla por convección" dentro de
la muestra en lo que se basan los dispositivos de la técnica
anterior, aumentan de manera general el tiempo de ciclo para una
muestra y probablemente tienen efectos perjudiciales en la muestra
biológica. El aparato (100) es capaz de proporcionar calentamiento
y refrigeración de manera tal que se mantiene una diferencia térmica
dentro de una muestra de 10 \mul a un valor no superior a
\pm1ºC en todo momento durante un ciclo de 30 segundos.
A efectos de favorecer un calentamiento y
enfriamiento uniformes, es preferible que los tubos capilares de
paredes delgadas (108) se encuentren como mínimo uniformemente
separados con respecto a la fuente de calor, por ejemplo, la
lámpara (112) del aparato (100). La figura 8C proporciona una vista
superior esquemática de la lámpara (112) y la serie de tubos
capilares de paredes delgadas (108) dispuestos en el aparato (100)
representado en las
figuras 8A-B.
figuras 8A-B.
En la disposición mostrada en la figura 8C, los
tubos capilares de paredes delgadas (108) que están más alejados de
la lámpara (112) (indicado por la línea F) son preferentemente no
más de 40% aproximadamente, y más preferentemente no más de 25%
sustancialmente, más alejadas de la lámpara (112) que la distancia
existente entre dicha lámpara (112) y los tubos capilares de paredes
delgadas 108 que se encuentran más próximos a la lámpara (112)
(indicado por la línea N). Por ejemplo, la distancia indicada por
la línea N puede ser aproximadamente de 7,3 cm mientras que la
distancia indicada por la línea F puede ser de 8,5 cm
aproximadamente.
Se apreciará que la disposición de los tubos
capilares de paredes delgadas (108) puede ser distinta a la
representada en las figuras, por ejemplo, circular o semicircular.
Además, se observará que el punto desde el cual se medirá la
distancia entre el elemento productor de calor y los tubos capilares
variará al variar el tipo y dimensiones del elemento productor de
calor. Por ejemplo, el elemento productor de calor puede comprender
una serie de lámparas o de elementos de resistencia eléctrica que
varían en cuanto a forma y dimensiones. En algunas realizaciones,
también puede ser importante considerar la distancia con respecto a
la pared de la cámara de la muestra a la que están dispuestos los
contenedores. En el ejemplo mostrado, las aberturas (140) (ver
figura 8A) funcionan como medios para soportar los contenedores de
muestra pero también se podrían utilizar otras estructuras o
cuerpos que lleven a cabo funciones equivalentes de acuerdo con la
presente invención.
El aparato (100) enfría también las muestras
contenidas en los tubos capilares (109) de manera muy rápida y
uniforme. A efectos de enfriar la cámara de muestra (106), se
introduce aire desde el exterior del cuerpo envolvente (102) hacia
adentro del cuerpo envolvente pasando por una abertura inferior
(114) del cuerpo envolvente por la acción de un ventilador (116)
que está conectado a un eje de motor (122) impulsado por el motor
(110). Dado que se desea un enfriamiento rápido de la cámara de
muestra, es preferible que la combinación del motor (118) y el
ventilador (116) pueda desplazar suficientes volúmenes de aires
hacia adentro de la cámara de muestra (106), dispersando luego
dicho aire adentro de la cámara de muestra (106), tal como se
explicará en breve. Otras disposiciones del motor (118) y el
ventilador (116) ilustrados en la figura 8B pueden ser utilizadas
dentro del alcance de la presente
invención.
invención.
La utilización de aire como medio de
transferencia térmica, en contraste con otros gases y líquidos,
tiene la ventaja de su precio reducido, fácil disponibilidad,
facilidad de mezcla, y no crear problemas. En el caso de las
realizaciones descritas, la mayor proporción de área superficial con
respecto a volumen de los tubos capilares que contienen las
muestras proporciona una rápida transferencia térmica utilizando
aire como medio de transferencia térmica.
Durante las partes de refrigeración del ciclo
térmico, la acción del ventilador (116) lleva aire a temperatura
ambiente hacia adentro del cuerpo envolvente (102). Se dispone una
puerta de evacuación (128), articulada en la charnela (129). La
puerta de evacuación (128) se abre automáticamente por acción del
solenoide (132) de manera que el interior del cuerpo envolvente
(102) es aislado con respecto a la puerta (130) del cuerpo
envolvente superior. En algunas realizaciones, el solenoide (132)
es preferentemente substituido por un motor paso a paso, tal como
es conocido en esta técnica. La utilización de un motor paso a paso
permite que la puerta de evacuación (128) pueda ser abierta y
cerrada de manera precisa y por incrementos de acuerdo con las
necesidades de calentamiento y refrigeración de las muestras. Los
técnicos en la materia serán capaces de deducir un mecanismo de
control apropiado para su utilización con un motor paso a paso, por
ejemplo, un controlador SC-149 para motor paso a
paso (de la firma Alpha Products) tal como es conocida en esta
técnica, utilizando las informaciones que se facilitan en esta
descripción.
Debido a la disposición de la puerta (120) de la
cámara de muestras inferior y al área en sección transversal mayor
y a la posición de la puerta (126) de la cámara de muestras
superior, el aire a temperatura ambiente es desplazado hacia
adentro de la cámara de muestras (106) y es dispersado y mezclado
dentro de la cámara de muestras (106) por una paleta (124) que está
conectada al eje (122) del motor. La paleta (124) debe girar a una
velocidad relativamente elevada, por ejemplo, suficientemente
rápida para crear velocidades de aire de unos 250 metros por minuto,
de manera más preferente 500 metros por minuto, y de modo más
preferente 1.000 metros por minuto dentro de la cámara de muestra
(106). Con la paleta (124), que puede ser una paleta múltiple o
simple, girando a elevada velocidad, se desplaza el aire o se
impulsa el aire hacia adentro de la cámara de muestra (106) y se
obliga a salir al mismo de la cámara de muestra (106) siguiendo la
ruta indicada por la línea de trazos (136). La rotación de la
paleta (124) ayuda también a la mezcla del aire que entra en la
cámara de mezcla (106) y asegura la transferencia más eficaz de
energía térmica desde la superficie de los tubos capilares (100) de
paredes delgadas al aire que atraviesa la cámara de muestra (106).
Se observará que estructuras distintas a las mostradas pueden
llevar a cabo funciones equivalentes.
Al accionar el solenoide (132) para abrir la
puerta de evacuación (128), la totalidad del aire a temperatura
ambiente que se desplaza hacia adentro de la cámara de muestras
(106) es expulsado a través de la puerta superior (126) de la
cámara de muestras y a continuación por la puerta (130) del cuerpo
superior llevando el calor desde la cámara de muestras (106) a la
atmósfera circundante. La rápida mezcla del aire pasante, que
desemboca en la cámara de muestras (106), tiene como resultado un
enfriamiento rápido y uniforme de las muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 9A muestra los resultados de cuatro
perfiles distintos de temperatura/tiempo (A-D) y sus
productos de amplificación resultantes después de treinta ciclos
(A-D). Los perfiles A y B de la figura 9A fueron
obtenidos realizando un dispositivo de bloque de calentamiento de la
técnica anterior utilizando un tubo micrófugo del tipo
anteriormente conocido. Tal como se puede observar en la figura 9A,
las transiciones entre las temperaturas son lentas y muchas bandas
no específicas se encuentran presentes en los perfiles A y B. El
perfil B muestra mejoras en la eliminación de algunas de las bandas
no específicas (en contraste con el perfil A) limitando el tiempo
en que cada muestra permanece a cada temperatura indicando, de este
modo, qué tiempos más cortos producen resultados más deseables.
Los perfiles C y D fueron obtenidos utilizando
el aparato de las figuras 8A-B. Tal como se puede
apreciar en la figura 9A, la amplificación es específica y, de
manera deseable, aunque el rendimiento es máximo en C (alargamiento
de 60 segundos) es todavía completamente adecuado en D (alargamiento
de 10 segundos).
Los tiempos y temperaturas óptimos para la
amplificación de un fragmento de 536 bp de
\beta-globina procedente de ADN genómico humano
también se determinaron. El rendimiento de la amplificación y la
especificidad del producto eran óptimos cuando la desnaturalización
(93ºC) y la reagrupación (55ºC) eran menos de 1 segundo. No se
observó ventaja alguna en tiempos más largos de desnaturalización o
de reagrupación. El rendimiento aumentó con tiempos de alargamiento
más largos (77ºC) pero se produjeron pocos cambios con tiempos de
alargamiento superiores a 10-20 segundos. Estos
resultados inesperados indican que los dispositivos de los que se
disponía anteriormente para amplificación de ADN no hacen máximas
las condiciones necesarias para optimizar las exigencias físicas y
enzimáticas de la reacción.
Se puede conseguir información de: Wittwer, Carl
T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B., and Cherry, Joshua L.,
"Rapid cycle Allele-Specific Amplification with
Cystic Fibrosis \DeltaF908 Locus", 39 Clinical
Chemistry 804 (1993) and Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., and
Rire, Kirk M., "Rapid DNA Amplification", THE POLYMERASE CHAIN
REACTION 174 (1994).
Por la información conseguida en la figura 9A,
se puede observar que las muestras colocadas son sometidas a ciclos
térmicos rápidos de manera que la temperatura de la muestra aumente
y disminuya a una velocidad preferentemente, como mínimo, de
0,5ºC/segundo. En el caso de la presente invención llevando a cabo
la reacción de cadena de polimerasa, el cambio de temperatura se
lleva a cabo preferentemente en una gama aproximada comprendida
entre 30ºC y 50ºC. Es preferible que los ciclos térmicos sean
llevados a cabo con rapidez suficiente para terminar, como mínimo,
treinta ciclos térmicos en cuarenta minutos y más preferentemente
para terminar treinta ciclos térmicos en veinte minutos, y más
preferentemente para terminar treinta ciclos térmicos en diez
minutos.
El aparato (100) aumenta y disminuye más
preferentemente la temperatura de la muestra a una velocidad como
mínimo de 1,0ºC/segundo e incluso de modo más preferente a una
velocidad mínima de 4,0ºC/segundo y de modo todavía más preferente
a una velocidad mínima de 10,0ºC/segundo. De manera crítica, la
muestra biológica, no solamente el medio circundante y/o el
contenedor de muestras, deben sufrir los cambios térmicos
especificados. Los dispositivos de los que se disponía
anteriormente, si bien tenían el inconveniente de no poder llevar a
cabo los cambios térmicos tan rápidamente como la presente
invención, tampoco reconocieron el problema de cambiar la
temperatura de la muestra, no sólo la temperatura del medio
circundante y del contenedor, de manera rápida y uniforme.
Haciendo referencia a continuación al gráfico de
la figura 9B, el método puede conseguir de manera deseable ciclos
térmicos preferentemente a una velocidad mínima de 10ºC/seg., y más
preferentemente a una velocidad, como mínimo, de 20ºC/seg., en una
gama de temperaturas superior a unos 20ºC, más preferentemente en
una gama de temperaturas superior a unos 30ºC, y más
preferentemente en una gama de temperaturas de unos 40ºC. La figura
9B muestra la temperatura en ºC de la muestra biológica, no
solamente el aire circundante o el contenedor, al sufrir la muestra
biológica unos ciclos térmicos. En la figura 9B se puede observar
una muestra de PCR que se inicia a unos 74ºC y que se calienta a la
temperatura de desnaturalización, indicada en (D), a unos 92ºC
durante 2 segundos. La muestra es enfriada a continuación a una
temperatura de reagrupación, indicada en (A), de unos 55ºC durante
dos segundos. La transición entre la temperatura de
desnaturalización y la temperatura de reasociación cubre un campo
de 37ºC solamente en menos de 4 segundos proporcionando la
velocidad, como mínimo, de 10ºC/seg. A continuación, la muestra es
calentada a una temperatura ampliada de 74ºC durante 5 segundos,
tal como se indica con la letra (E) en la figura 9B. Los ciclos de
las muestras pasando por la temperatura de desnaturalización,
temperatura de reasociación y la temperatura de ampliación se
repiten treinta veces o las veces que sea necesario.
Las figuras 9C-G muestran ciclos
a título de ejemplo de otros perfiles preferentes de
temperatura/tiempo. Se comprenderá por los técnicos en la materia
que se pueden alterar los perfiles que se han representado de
temperatura/tiempo para llevar a cabo procesos específicos de
acuerdo con la presente invención. Los técnicos en la materia
apreciarán que los métodos y dispositivos anteriormente conocidos,
tales como dispositivos que conducen el calor hacia y desde la
muestra a través de un sólido o un líquido, no pueden proporcionar
los perfiles resultantes de temperatura/tiempo que se describen.
Además, los métodos y dispositivos anteriormente conocidos no
sugieren ni indican los perfiles de temperatura/tiempo descritos en
esta descripción. Además, se observará que los dispositivos y
métodos anteriormente conocidos que utilizan aire como medio de
transferencia, por ejemplo, estufas cromatográficas, de tipo
anteriormente conocido, no pueden proporcionar ni sugieren ni
muestran, los perfiles de temperatura/tiempo que se describen y que
son obtenidos en la práctica de la presente invención.
A efectos de conseguir el tiempo de ciclo
térmico más rápido, es preferible que la lámpara (-112- en las
figuras 8A y 8B) tenga una potencia nominal de 2000 watios o que se
incluya una serie de lámparas que proporcionen una potencia de
salida similar. También es preferible, asimismo, incluir un circuito
de control de la pendiente de temperatura que se ha representado en
la figura 10 en relación con un sistema de bus-A
controlador/captador utilizando un panel microcontrolador 8052 con
reloj y un interpretador de programa de alto nivel que se puede
conseguir de la firma Alpha Products (modelo nº.
SP-127) de Darian, Connecticut. Se incluye un
código de programación a título de ejemplo en relación con el
microcontrolador descrito en el Código de Programación de Apéndice
A que forma parte de la descripción. El código de programación que
se facilita en el apéndice A es un archivo BASIC52 para descarga en
serie en el microcontrolador y proporciona un control de la
pendiente de temperatura a título de ejemplo durante los ciclos
térmicos. La utilización del dispositivo productor de calor de 2000
watios y las estructuras de control descritas permiten conseguir de
modo deseable velocidades de ciclos térmicos de 20ºC/seg.
La disposición preferente para el circuito de
control de la pendiente de temperatura representado en la figura 10
se explicará con el entendimiento de que los componentes adicionales
necesarios no explícitamente ilustrados en la figura 10 podrán ser
previstos fácilmente por los técnicos en la materia.
El circuito de control de la pendiente de
temperatura de la figura 10 comprende un termopar (200) acoplado a
la respuesta de temperatura de la muestra tal como se ha explicado
anteriormente. El termopar (200) está conectado al circuito
integrado (206), que preferentemente es de tipo conocido con la
designación AD595, cuya salida es transportada al filtro de paso
bajo de 4º orden (208) con una frecuencia de corte de 100 Hz y a un
convertidor (210) analógico a digital de 12 bits cuya salida es
utilizada para proporcionar una pantalla digital de la
temperatura.
La salida del circuito (206) es transportada
también a un circuito de pendiente medida (212). El circuito de
pendiente medida (212) incluye preferentemente un amplificador
operativo (353) con la designación (219), un potenciómetro de 100
K\Omega (214), un potenciómetro de 1 M\Omega (230), y un
condensador de 22 \muF. El circuito de pendiente medida (212)
emite una señal a la entrada inversora de un amplificador operativo
353 designado (246).
Un circuito (222) de ajuste de la pendiente
incluye un convertidor de ajuste de pendiente positiva digital a
analógico (226) y un convertidor de ajuste de pendiente negativa
digital a analógico (224). Los convertidores digital a analógico
(224) y (226) son preferentemente convertidores digital a analógico
de 8 bits a los que se hace referencia en la técnica con la
designación DA167. El circuito de ajuste de pendiente puede recibir
preferentemente instrucciones de otro dispositivo digital (no
mostrado en la figura 10) tal como un ordenador personal. La salida
del circuito de ajuste de pendiente (228) es comunicada al circuito
sumador (240).
El circuito sumador (240) incluye
preferentemente resistencias de 100 K (236), (238) y (244) y un
amplificador operativo 353 designado con el numeral (242). La salida
del circuito sumador (240) es transportada a la entrada no
inversora del amplificador operativo (246) y representa la
pendiente deseada del cambio de temperatura. La salida del
amplificador operativo (246) es facilitada a un transistor (248)
contenido dentro del circuito (262) de conmutación de potencia.
El circuito de conmutación de potencia (262)
comprende un suministro de 5 VCC (250) que proporciona corriente al
transistor (248). El transistor (248) tiene su emisor conectado a
un circuito 3010 designado (254) mediante una resistencia (252) que
es preferentemente una resistencia de 330 \Omega. El circuito
3010 indicado con el numeral (254) comprende una salida conectada
en serie con una resistencia (256) que es preferentemente una
resistencia de 180 \Omega. Un triac (258) se utiliza
preferentemente para controlar la corriente suministrada a la
lámpara (262), o a otro dispositivo productor de calor, desde la
fuente de corriente alterna (260).
El circuito de control de la pendiente de
temperatura representado en la figura 10, en cooperación con los
componentes del otro sistema descrito, proporcionan ciclos térmicos
de muestras biológicas que llegan a 20ºC/seg en un campo de
temperatura de 30ºC, y más preferentemente en una gama de
temperatura de 40ºC, manteniéndose la homogeneidad en la totalidad
de la muestra biológica.
Se apreciará que los sistemas descritos en el
presente documento pueden ser utilizados fácilmente para diferentes
aplicaciones, entre las que se incluyen los procesos de la reacción
en cadena de la polimerasa; secuenciación cíclica, otros protocolos
de amplificación, tales como la reacción en cadena de la ligasa. La
presente invención da a conocer de manera ventajosa un aparato para
el control preciso de la temperatura de las muestras que se
encuentran en la cámara de muestras y que varía de manera rápida y
precisa la temperatura de las muestras que se encuentran en la
cámara según un perfil predeterminado de temperatura contra
tiempo.
Tal como se ha indicado anteriormente, y en
contraste con las indicaciones de la técnica anterior, la reacción
de cadena de polimerasa se puede llevar a cabo con rapidez.
Utilizando los métodos y aparatos descritos, se puede completar de
manera rutinaria el número necesario de ciclos de temperatura en
mucho menos tiempo que lo que es posible con los dispositivos de la
técnica conocida, por ejemplo, en menos de 15 minutos. Al hacer
mínimos los tiempos de desnaturalización y de reasociación, se
mejoran también la especificidad y rendimiento de amplificaciones
de ciclos rápidos en una medida que no había sido posible hasta el
momento. Además, aparte de facilitar una transferencia de calor
rápida, la utilización de contenedores de muestras ópticamente
transparentes, tales como tubos capilares transparentes, permite el
control continuo de fluorescencia de la amplificación de ADN de
acuerdo con la presente invención.
La figura 10A muestra gráficamente el efecto de
las velocidades de transición de temperatura sobre la especificidad
de la reacción PCR y rendimiento utilizando un aparato comparativo.
Los resultados de la figura 10A fueron obtenidos utilizando un
fragmento de 536 pares de bases del gen de betaglobina que fue
amplificado a partir de 50 ng de ADN genómico humano con 50 mM
Tris, pH 8,3, 2 mM MgCl2, 50 \mug/ml de albúmina de suero bovino,
0,5 \muM de cada cebador, 0,2 mM de cada dNTP, y 0,4 U de
polimerasa de Taq DNA nativa en una reacción de 10 \mul. Los
cebadores de betaglobina humana RS42 y KM29 (536 pares de bases) se
describen en C.T. Wittwer, G.C. Fillmore y D.R. Hillyard,
"Automated Polymerase Chain Reaction in Capillary Tubes with Hot
Air," ("reacción de cadena de polimerasa automatizada en tubos
capilares con aire caliente"), Nucl. Acids. Res.
17:4353-4357. Los parámetros de ciclos de
temperatura eran de 94ºC para 0 seg., 55ºC para 0 seg., y 72ºC para
10 seg. Se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación con las
velocidades indicadas entre todas las temperaturas. Las muestras
fueron sometidas a electroforesis sobre geles de agarosa 1,5% y se
efectuó su tintado con 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. La
especificidad y el rendimiento disminuyen al disminuir la velocidad
de transición de la temperatura.
Las probetas fluorescentes pueden ser utilizadas
para detectar y controlar la amplificación de ADN. Tal como es
conocido por los técnicos en la materia, las sondas útiles incluyen
colorantes específicos para ADN de doble hilera y sondas
específicas de secuencia. Con el bromuro de etidio intercalador, la
fluorescencia roja excitada por UV aumenta después de la
amplificación. Si bien se han utilizado tubos micrófugos como
contenedores de muestras para amplificación de ADN, los métodos y
aparatos que se describen utilizan ventajosamente contenedores de
muestras con muchas de las características de estructuras a las que
se hace referencia como tubos capilares.
La utilización de los contenedores de muestra
descritos permite la detección de fluorescencia mientras la muestra
es mantenida dentro del contenedor, tal como se explicará más
adelante de manera más completa. Los técnicos en la materia
apreciarán el número de diferentes esquemas de detección de
fluorescencia de la amplificación de ADN que se encuentran
actualmente a disposición. Por ejemplo, es posible fácilmente la
detección de fluorescencia específica de secuencia utilizando la
presente invención y sondas de hibridación de oligonucleótidos.
Según otro ejemplo, se pueden fragmentar sondas de
fluoresceína/rodamina con doble marcado durante la extensión de
polimerasa mediante actividad de 5'-exonucleasa,
separando los fluoróforos e incrementando la proporción de
fluorescencia fluoresceína/rodamina.
Utilizando las realizaciones de la presente
invención que se describirán a continuación, la fluorescencia puede
ser medida después de haber completado los ciclos de temperatura,
una vez por ciclo como control de acumulación de producto, dos o
más veces durante una transición de temperatura, o de manera
continua dentro de cada ciclo. Como contraste con la presente
invención, los métodos anteriormente conocidos muestran ciclos
relativamente lentos y no indican la captación y análisis de la
fluorescencia durante los cambios de temperatura.
La presente invención permite el control ciclo a
ciclo para la cuantificación del número de copias de la plantilla
inicial. Para llevar a cabo este control ciclo a ciclo se capta la
fluorescencia durante la fase de ampliación o fase combinada de
reasociación/extensión de cada ciclo y relativa a la concentración
de producto. Por ejemplo, se conoce un ensayo cuantitativo para ARN
de hepatitis C utilizando el intercalador
YO-PRO-1^{TM} y se puede utilizar
de acuerdo con la presente invención. Para más información consultar
el trabajo de Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S.
Iwasaki, y Y. Mitoma, 1995, "Homogeneous quantitative assay of
hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence
of a fluorescent intercalater," ("ensayo cuantitativo
homogéneo de ARN de virus de hepatitis C por reacción de cadena de
polimerasa en presencia de un intercalador fluorescente")
Anal. Biochem. 229:207-213. Antes de la
presente invención, no se había intentado el control continuo de la
fluorescencia dentro de cada ciclo durante las transiciones de
temperatura.
Se da a conocer una realización de un aparato de
ciclos de temperatura de tipo rápido integrado con óptica
fluorescente de dos colores para conseguir una supervisión continua
de la fluorescencia. Tal como se explicará más adelante de forma
más completa, se dan a conocer técnicas de fluorescencia preferentes
para controlar la amplificación de ADN como ejemplos específicos de
llevar a cabo este aspecto.
Los técnicos en la materia estarán
familiarizados con la utilización de bromuro de etidio en técnicas
de fluorescencia. En un ejemplo que se describe a continuación, es
preferible que se utilice como colorante específico de doble hilera
SYBR® Green I, bien conocido en esta técnica y que se puede
conseguir de la firma Molecular Probes de Eugene, Oregon.
En un ejemplo, se captan cada 200 mseg el
tiempo, temperatura y fluorescencia durante la reacción de
amplificación. Al captar datos regularmente durante la reacción, la
captación de dichos datos revela detalles finos de la
desnaturalización, reasociación y extensión del producto que no se
disponen en los aparatos y métodos anteriormente disponibles.
Tal como se apreciará por los técnicos en la
materia, el control de una vez por ciclo de múltiples muestras
sometidas a amplificación de ADN es una poderosa herramienta
cuantitativa. De modo importante, tal como se apreciará a través de
la presente descripción, la supervisión continua dentro del ciclo
puede identificar la naturaleza de la fluorescencia de la sonda,
puede proporcionar conocimiento de la mecánica de la amplificación
de ADN que no se conocían anteriormente en esta técnica, y puede
evaluar el producto de PCR y las curvas de fusión de la sonda para
identificar los productos de amplificación y las mutaciones.
Haciendo referencia a continuación a la figura
11, se facilita una vista esquemática de un dispositivo de ciclos
preferente de temperatura con detección de fluorescencia, que se ha
indicado de modo general con el numeral (300). Se dispone
preferentemente una fuente de aire caliente forzado (302). La
fuente de aire caliente forzado (302) es preferentemente un
dispositivo comercial que comprende una bobina de calentamiento de
1600 watios y un ventilador. Una fuente de aire de enfriamiento
(304) con aire forzado es asimismo preferible. La fuente de aire
frío forzado (304) es preferentemente un dispositivo soplante de
polos protegidos de 2200 rpm que se puede conseguir de la firma
Dayton de Niles, Illinois, modelo nº. 4C006B. Es preferible que la
fuente de aire frío (304) proporcione aire a la temperatura
ambiente, pero se encuentra dentro del ámbito de la presente
invención utilizar un medio para proporcionar fluido que se
encuentra a una temperatura más baja que la temperatura del aire
ambiente.
En la realización de la figura 11, los conductos
(306) y (308) conectan la fuente de aire caliente forzado (302) y
la fuente de aire frío forzado (304), respectivamente, a una cámara
de muestras (310). Los conductos (306) y (308) consisten
preferentemente en tubos de nylon negro ondulado que tienen un
diámetro de 2,5 cm. El conducto (306) está conectado a la cámara de
muestras (310) con intermedio de una abertura (306A) y el conducto
(308) está conectado a la cámara de muestra (310) con intermedio del
conducto (308A). Una abertura de ventilación (312) y un ventilador
extractor (314) funcionan extrayendo aire de la cámara de muestras
(310). Además, un dispositivo de protección del interior de la
cámara de muestras (310) contra la luz ambiente forma parte de la
cámara de muestras (310).
La temperatura de las muestras dentro de la
cámara de muestras (310) es supervisada preferentemente por un
termopar tubular, con funda metálica (316), de la firma Idaho
Technology de Idaho Falls, Idaho, modelo nº 1844, que es acoplado
en respuesta térmica a las muestras retenidas en los tubos
capilares. De forma importante, la homogeneidad de la temperatura
ambiente de la cámara de muestras (310) es conseguida por mezcla
del aire dentro de la cámara de muestra (310). Es preferible que
esta mezcla del aire dentro de la cámara de muestras (310) sea
llevada a cabo mediante el ventilador central de la cámara de
muestras (318). El ventilador de la cámara de muestras comprende
preferentemente un ventilador de paletas de 1,7 X 11 cm de la firma
Idaho Technology, modelo nº 1862, y un motor de la firma Idaho
Technology, modelo nº 1861, que crea velocidades de aire, como
mínimo, de 800 a 1000 metros por minuto dentro de la cámara de
muestras (310). Estas rápidas velocidades del aire pueden no ser
necesarias en todas las aplicaciones de la presente invención, pero
dichas velocidades rápidas del aire ayudan en una mezcla a fondo y
a la homogeneidad de la temperatura dentro de la cámara de muestras
(310).
Dentro de la cámara de muestras (310), una serie
de muestras son mantenidas en tubos capilares, algunas de las
cuales se han indicado con el numeral (320), y están situadas en una
orientación vertical sobre un carrusel rotativo (322). El carrusel
(322) tiene preferentemente catorce centímetros de diámetro y es
obligado a girar mediante un motor paso a paso (324) de 400 pasos
por revolución, controlado por un módulo de control paso a paso
(326). El motor paso a paso (324) es preferentemente un motor de la
firma New England Affiliated Technologies de Lawrence,
Massachusetts, modelo nº 2198364, y el módulo de control micro paso
a paso (326) es un módulo de control micro paso a paso New England
Affiliated Technologies, modelo nº MDM7, que facilita 22.800 pasos
por rotación del carrusel (322).
Haciendo referencia adicionalmente a la figura
11, se dispone una fuente de excitación de fluorescencia (328). Una
disposición preferente para la trayectoria de excitación se
describirá a continuación con una disposición preferente para la
ruta de recogida de acuerdo con la presente invención que se
describirá a continuación. La fuente de excitación de fluorescencia
(328) incluye preferentemente una fuente de arco de xenón de 75
vatios (328A) enfocado con un reflector elíptico (328B). La fuente
de arco de xenón (328A) es la que se puede adquirir preferentemente
de la firma Photon Technology International de South Brunswick,
Nueva Jersey, modelo nº A1010, con reflector elíptico f/2,5 (328B).
El suministro de potencia y otros componentes necesarios para hacer
funcionar la fuente de excitación de fluorescencia (328) son bien
conocidos por los técnicos en la materia. De manera alternativa, se
puede utilizar un diodo emisor de luz como fuente de excitación de
fluorescencia. Los técnicos en la materia apreciarán que se pueden
utilizar muchas fuentes de excitación distintas dentro del ámbito de
la presente invención.
La radiación emitida por la fuente de excitación
de fluorescencia (328), es enfocada aproximadamente unos 2 mm
utilizando un iris ajustable (334) tal como el disponible en la
industria de la firma Rolyn (Covina, California), modelo nº
75.0125. La luz emitida desde la fuente de excitación de
fluorescencia (328) choca sobre el espejo frío (330), que es
disponible preferentemente de la firma Rolyn, modelo nº 60.4400, y
pasa a través del cristal de absorción de calor (332), que es
preferentemente de la firma Rolyn, modelo nº 65.3130. Después de
colimación a través de lentes planoconvexas (336), preferentemente
una lente de la firma Rolyn, modelo nº 10.0260, se dispone de un
filtro de interferencia (338), con paso de banda
450-490 nm, de la firma Omega Optical de
Brattleboro, Vermont, modelo nº 470RDF40, una lente planoconvexa de
enfoque (340), preferentemente de la firma Rolyn, modelo nº 10.0260,
y una ventana de sílice (342) de 1 mm, preferentemente de la firma
Omega, para impedir condensación sobre los componentes ópticos que
se han descrito durante los ciclos de temperatura. Utilizando la
ruta de excitación descrita, se ilumina una sección de
5-7 mm de un tubo de muestra capilar (320A).
Haciendo referencia asimismo a la figura 11, la
ruta de recogida para captar la fluorescencia emitida desde la
muestra (320A) se describirá a continuación. El sistema óptico de la
ruta de recogida incluye la ventana (344) de sílice de 1 mm que
está colocada en la ruta óptica para impedir la condensación sobre
los otros componentes ópticos. Dos lentes asféricas opuestas
(346A\amp{1}B) preferentemente de la firma Rolyn, modelo nº
17.1175, funcionan para enfocar la fluorescencia emitida sobre una
ranura (348) de 2 X 10 mm. La ranura (348) puede ser realizada
preferentemente por corte de una película sometida a rayos X y la
ranura (348) funciona como filtro espacial. Después de la ranura
(348) (que actúa como filtro espacial), la fluorescencia emitida es
impuesta a un diafragma electrónico de 35 mm (350) que funciona con
intermedio de un control de diafragma electrónico (352). El
diafragma electrónico de 35 mm (350) es preferentemente un modelo de
diafragma Uniblitz nº VS35 y el control electrónico de diafragma
(352) es preferentemente el modelo de controlador nº D122, de la
firma Vincent Associates de Rochester, Nueva York. Una lente
asférica de colimación (354), preferentemente de la firma Rolyn,
modelo nº 17.1175, se dispone asimismo en el sistema.
Un filtro (356) queda también incluido cuando se
desea detección de emisiones SYBR® Green I. El filtro (356) es
preferentemente un filtro de paso de banda de
520-580 nm, de la firma Omega como modelo nº
550RDF60, que se utiliza preferentemente para captación de
longitudes de onda únicas. Para detección de otras emisiones, por
ejemplo, se puede utilizar una combinación de filtro dicroico (358)
y filtros (358A) y (358B) de longitud de onda. Por ejemplo, para
separación de las emisiones de fluoresceína y rodamina, el filtro
dicroico (358) consiste preferentemente en un filtro dicroico de
560 nm, preferentemente de la firma Omega, modelo nº 560 DRLP, y un
filtro de paso de banda de 520-550 nm (-358A-),
preferentemente de la firma Omega, modelo nº 535DF30, para detección
de la fluoresceína, y un filtro de paso de banda de
580-620 nm (-358B-), preferentemente de la firma
Omega, modelo nº 600DF40, para detección de la rodamina. Para
separación de las emisiones de fluoresceína y Cy5, el filtro
dicroico (358) es preferentemente un filtro dicroico de 590 nm de la
firma Omega, modelo nº 590 DRLP, y los filtros (358A\amp{1}B)
consisten preferentemente en un filtro de paso de banda
520-550 nm (-358A-), de la firma Omega, modelo nº
535DF30, para detección de fluoresceína y un filtro de paso de
banda de 660-690 nm (-358B-), de la firma Omega,
modelo nº 670DF20, para detección de Cy5. Los técnicos en la
materia observarán fácilmente que la utilización de otros
componentes se puede incrementar fácilmente utilizando la
información indicada a efectos de adaptarse a otras longitudes de
onda fluorescentes.
Con referencia a la figura 11, después de
someter al filtro respectivo (358A) o (358B), la fluorescencia
emitida es enfocada a través de dos lentes planoconvexas (360A) y
(360B), cada una de ellas preferentemente de la firma Edmund de
Barrington, Nueva Jersey, modelo nº 32970, y sobre tubos
fotomultiplicadores (362A) y (362B), respectivamente. Los tubos
fotomultiplicadores ("PMT") (362A) y (362B) se pueden adquirir
preferentemente de la firma Hamamatsu de Middlesex, Nueva Jersey,
modelo nº R928, y se encuentran encerrados cada uno de ellos en un
cuerpo envolvente adecuado incluyendo circuitos apropiados,
preferentemente de la firma Photon Technology International, modelo
nº 714, con capacidades de captación analógica. Se dispone también
preferentemente un módulo (364) de control de captación de datos y
PMT. También se disponen diafragmas PMT manuales (366A) y (366B),
tal como es conocido en esta técnica.
Los componentes ópticos que se han descrito son
preferentemente de cinco centímetros de diámetro y están montados
en montajes de lentes universales de cinco centímetros, tales como
los de la firma Rolyn, modelo nº 90.0190. Tal como se puede
realizar por los técnicos en la materia, muchos de los componentes
estructurales necesarios han sido mecanizados a partir de
Delrin^{TM} negro utilizando técnicas conocidas en la
industria.
Los técnicos en la materia apreciarán que el
dispositivo de ciclos rápidos de temperatura con detección de
fluorescencia (300) pueda ser construido de manera ventajosa
utilizando diodos de emisión de luz (LED) y fotodiodos en lugar de
componentes que funcionan de manera similar, representados en la
figura 11. De este modo, la función de la fuente de excitación de
fluorescencia (328) se puede llevar a cabo mediante diodos de
emisión de luz. Los tubos fotomultiplicadores (369A\amp{1}B)
pueden ser también substituidos por fotodiodos. Se proporcionará
más adelante en esta descripción información adicional con respecto
a diodos de emisión de luz y fotodiodos. Se observará que la
sensibilidad técnica está limitada por fluorescencia de fondo, la
mayor parte de la cual procede de las sondas, no del sistema de
detección. De manera significativa, la estabilidad es en general más
importante que la sensibilidad absoluta.
Los técnicos en la materia apreciarán que el
dispositivo rápido de ciclos de temperatura con detección de
fluorescencia (300) representado en la figura 11 comprende las
características ventajosas de un fluorímetro con control de
temperatura rápida, combinación que no se ha dado a conocer ni se ha
sugerido en la técnica actual. Se puede llevar a cabo PCR y se
puede analizar durante un tiempo de diez a veinte minutos de ciclos
de temperatura. La combinación de la presente invención de 1)
supervisión de fluorescencia dentro de cada ciclo de temperatura y
2) análisis de la temperatura y dependencia del tiempo de la
hibridización proporciona ventajas que no se pueden conseguir de
otro modo.
Es posible utilizar métodos de fluorescencia de
color único para controlar la pureza del producto y cuantificar la
matriz durante PCR. Se añaden colorantes que controlan el estado de
las hebras de ADN a las reacciones PCR para observación durante los
ciclos de temperatura utilizando realizaciones de la presente
invención.
A efectos de explicar algunas de las ventajas
que se consiguen con la presente invención, se facilitarán a
continuación ejemplos específicos utilizando el aparato representado
en la figura 11. La amplificación de ADN fue llevada a cabo en 50
mM Tris, pH 8,3 (25ºC), 3 mM MgCl2, 500 \mug/ml de albúmina de
suero bovino, 0,5\muM de cada cebador, 0,2 mM de cada trifosfato
deoxinucleósido y 0,2 U de Taq polimerasa por muestra de 5 \mul,
si no se dice lo contrario, en los ejemplos siguientes. Asimismo en
los ejemplos siguientes, se utilizó como molde de ADN, ADN genómico
humano (desnaturizado 1 min por ebullición) o producto de
amplificación purificada. El producto de amplificación purificada
fue obtenido por extracción de fenol/cloroformo y precipitación en
etanol (ver D.M. Wallace 1987, "Large- and
small-scale phenol extractions and precipitation of
nucleic acids" ("Extracciones de fenol en gran y pequeña
escala y precipitación de ácidos nucleicos") (tal como se
describe en las páginas 33-48, en S.L. Berger y A.R.
Kimmel (Eds.), "Guide to Molecular Cloning Techniques"
("Guía para las técnicas de clonado molecular")(Methods in
Enzymology, Vol. 152) Academic Press, Orlando), seguido de la
eliminación de cebadores por lavado repetido mediante un
concentrador Centricon 30 micro (de la firma Amicon de Danvers,
Massachusetts). Las concentraciones de la matriz fueron determinadas
por absorbencia a 260 nm. Las relaciones A260/A280 de las matrices
fueron superiores a 1,7.
En estos ejemplos, se sintetizaron cebadores por
química estándar fosforamidita, tal como es conocido en esta
técnica, es decir, utilizando Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus
(Piscataway, Nueva Jersey). El fragmento de 180 pares de bases del
gen del antígeno de superficie de hepatitis B fue amplificado
utilizando cebadores
5'-CGTGGTG
GACTTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1), y 5'-AGAAGATGAGGCATAGCGC-3' (SEQ ID NO:2) (secuencia Genbank HVHEPB). Se obtuvo el colorante SYBR® Green I de la firma Molecular Probes (Eugene, Oregon). Los cebadores de \beta-actina y la sonda dual de fluoresceína/rodamina fueron obtenidos de la firma Perkin Elmer (Poster City, California) (no. N808-0230,). Los cebadores de \beta-globina humanos RS42/KM29 (536 pares de bases) y PC03/PC04 (110 pares de bases) se describen en C.T. Wittwer, G.C. Fillmore y D.R. Hillyard, "Automated Polymerase Chain Reaction in Capillary Tubes with Hot Air" ("Reacción de cadena de polimerasa automatizada en tubos capilares con aire caliente"), Nucl. Acids. Res. 17:4353-4357, que se incorpora como referencia. Las sondas de etiquetado único:
GACTTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1), y 5'-AGAAGATGAGGCATAGCGC-3' (SEQ ID NO:2) (secuencia Genbank HVHEPB). Se obtuvo el colorante SYBR® Green I de la firma Molecular Probes (Eugene, Oregon). Los cebadores de \beta-actina y la sonda dual de fluoresceína/rodamina fueron obtenidos de la firma Perkin Elmer (Poster City, California) (no. N808-0230,). Los cebadores de \beta-globina humanos RS42/KM29 (536 pares de bases) y PC03/PC04 (110 pares de bases) se describen en C.T. Wittwer, G.C. Fillmore y D.R. Hillyard, "Automated Polymerase Chain Reaction in Capillary Tubes with Hot Air" ("Reacción de cadena de polimerasa automatizada en tubos capilares con aire caliente"), Nucl. Acids. Res. 17:4353-4357, que se incorpora como referencia. Las sondas de etiquetado único:
5' -CAAACACACACCATGCACCTGACTCCTGAGGA-fluoresceína-3' | (SEQ ID NO:3) |
y
5' -Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGCAAG-fosfato-3' | (SEQ ID NO:4) |
fueron sintetizados utilizando
fosforamidita de fluoresceína (de la firma Glen Research of
Sterling, Virginia, no. 10-1963), una fosforamidita
Cy5TM (de la firma Pharmacia no.
27-1002-02), y un agente de
fosforilación química (de la firma Glen Research no.
10-1900). Estas sondas adyacentes hibridizan
internamente con respecto al par cebador de
\beta-globina PC03/PC04 de la misma hebra de ADN y
están separadas por un par de bases. Las sondas fueron purificadas
por cromatografía líquida de alta presión C-18 de
fase inversa y la homogeneidad fue comprobada por electroforesis de
poliacrilamida y absorbancia (A260 y la absorbancia máxima del
fluoróforo). Se utilizaron sondas de hibridación
(\beta-actina y \beta-globina)
en 0,2 \mum en cada
caso.
En los ejemplos pertinentes que se han descrito,
se cargaron en tubos de muestras capilares muestras de amplificación
de 5 \mul, algunas de las cuales se han representado en la figura
11 con el numeral (320). Los tubos de muestras capilares
preferentes son los de la firma Idaho Technology, modelo no. 1705,
con dimensiones de 1,02 mm de diámetro externo y 0,56 mm de
diámetro interno. Una vez cargados, los tubos de muestras capilares
fueron sellados con llama de butano. La superficie del tubo de
muestra capilar fue limpiada con metanol de calidad óptica antes de
su carga en el carrusel (322) del dispositivo de ciclos rápidos de
temperatura con detección de fluorescencia (300).
El control de los componentes representados en
la figura 11 fue conseguido por utilización de un lenguaje de
programación gráfica conocido como LabView (de la firma National
Instruments, Austin, Texas) y una tarjeta multifunción de 12 bits
entrada/salida (368A) (de la firma National Instruments con la
designación AT-MIO-22) en un
ordenador PC compatible (368) utilizando un microprocesador Intel®
80486 funcionando a una velocidad de reloj de 120 MHZ. Se utilizaron
canales de salida analógicos en la tarjeta de entrada/salida (368A)
para controlar la sensibilidad, es decir, el voltaje PMT, de cada
uno de los tubos fotomultiplicadores (362A\amp{1}B). Canales de
entrada analógicos en la tarjeta de entrada/salida (368A) reciben
las señales de cada uno de los tubos fotomultiplicadores
(362A\amp{1}B). El ordenador PC compatible (369), a través de la
tarjeta de entrada/salida (368A), controla la posición, velocidad y
dirección de movimiento del carrusel (322). Por ejemplo, cuando se
cargan tubos de muestra capilares múltiples, el carrusel (322)
posiciona con rapidez cada uno de los tubos de muestras capilares
(320) secuencialmente en una localización de control (localización
representada por el tubo de muestras capilar -320A-) para un período
de captación de 10-100 mseg. Para la supervisión
continua de un único tubo de muestras capilar, el tubo de muestras
capilar es mantenido en la posición de supervisión mientras se
captan datos preferentemente cada 200 mseg. y se hace el promedio
de acuerdo con técnicas bien conocidas. El tiempo, temperatura, y
preferentemente dos canales de fluorescencia se muestran de manera
continuada a través del monitor (368B) asociado con el ordenador
(366) en forma de gráficos de fluorescencia con respecto a número
de ciclos y fluorescencia con respecto a temperatura.
El carrusel (322) debe ser posicionado donde se
captan al máximo la fluorescencia y las señales. Cuando se
supervisa un único tubo de muestras capilar, tal como el tubo de
muestras capilar (320A), las señales son captadas cada 200 mseg.
con una constante de tiempo de integración ajustada en el tubo
fotomultiplicador (362A) o (362B) o ambos, en 50 mseg. Para
múltiples tubos de muestras, la constante de tiempos se ajusta en
0,5 mseg. y el carrusel es obligado a girar una vez para localizar
la posición precisa en la que cada tubo de muestra capilar (320)
proporciona la fluorescencia máxima en cada uno de los dos canales.
Después del posicionado del tubo de muestras capilar (320A) en una
localización en la que se obtiene la fluorescencia máxima, la
sensibilidad de cada uno de los PMT (362A\amp{1}B) es ajustada y
el carrusel es obligado a girar nuevamente para contar y localizar
las posiciones de todos los tubos de muestras capilares (320) del
carrusel (322). Cuando se desea solamente una captación de señal de
fluorescencia una vez cada ciclo de amplificación durante la
extensión, cada tubo de muestras capilar (320) es posicionado de
forma secuencial en el carrusel (322) en la posición de supervisión
para 100 mseg. La captación continua para tubos múltiples puede ser
obtenida también por rotación continua del carrusel (322). La
programación de control de temperatura se basó en un dispositivo de
ciclos rápidos de temperatura de tipo comercial, con modificaciones,
de la firma Idaho Technology con la marca Rapidcycler® utilizando
un compilador cruzado 8051 de la firma Systronics, Salt Lake City,
Utah, designado BCI51 y un sistema de Dallas development (también
disponible de Systronics con la designación D882).
En la práctica, la respuesta de temperatura del
dispositivo de ciclos de temperatura rápidos con detección de
fluorescencia (300) es similar a la respuesta obtenida con el
aparato que se da a conocer en las figuras 8A&B, permitiendo
ciclos de 20-30 segundos (30 ciclos en
10-15 min) tal como se ha representado en el
gráfico de la temperatura con respecto al tiempo de la figura 11A
(que muestra unos ciclos de un perfil de temperatura preferente).
Cuando se encuentra presente durante la amplificación un colorante
fluorescente específico de doble hebra, la fluorescencia incrementa
de modo general al preparar mayor cantidad de producto de doble
hebra. Ver R. Higuchi, G. Dollinger, P.S. Walsh, y R. Griffith,
1992, "Simultaneous Amplification and Detection of Specific DNA
Sequences," ("Amplificación y detección simultáneas de
secuencias ADN específicas") Bio/Technology
10:413-417.
Además, también se observará que se pueden
utilizar como indicadores genéricos de amplificación colorantes
específicos de doble hilera tales como bromuro de etidio o SYBR®
Green I. El colorante SYBR® Green I es preferente con respecto al
bromuro de etidio en muchas aplicaciones porque tiene un máximo de
excitación cerca de la fluoresceína y proporciona frecuentemente
una señal más fuerte con ADN que la excitación visible del bromuro
de etidio.
La fluorescencia depende también de la
temperatura, un efecto de confusión durante los ciclos de
temperatura que se elimina usualmente considerando la fluorescencia
una vez por ciclo a una temperatura de extensión constante. No
obstante, si se captan la temperatura, tiempo y fluorescencia cada
200 mseg durante amplificación de ciclo rápido, se observa una
espiral tridimensional en el monitor (360B) tal como se ha
representado en la figura 12. El gráfico tridimensional
representado en la figura 12 es proyectado también en la figura 12A
como gráfico bidimensional de la temperatura con respecto al tiempo,
proyectado en la figura 12B como gráfico bidimensional de
fluorescencia con respecto al tiempo, y proyectado en la figura 12C
como fluorescencia con respecto a temperatura. La proyección de
temperatura con respecto al tiempo de la figura 12A repite cada
ciclo y proporciona esencialmente la misma información que se ha
indicado en la figura 11A. Dado que la fluorescencia varía
inversamente con la temperatura, la proyección de fluorescencia con
respecto al tiempo mostrada en la figura 12B para ciclos previos es
una imagen simétrica a escala del gráfico de temperatura con
respecto al tiempo. Al acumularse el producto, la fluorescencia
incrementa todas las temperaturas en las que se encuentra presente
el producto de doble hebra. No obstante, en las temperaturas de
desnaturalización, la fluorescencia vuelve a la línea base, puesto
que solamente se encuentra presente ADN de hebra única.
La proyección de fluorescencia con respecto a
temperatura de los colorantes de doble hebra mostrados en las
figuras 12C elimina el eje de tiempo y muestra la dependencia de la
temperatura de la situación de las hebras durante la amplificación
de ADN. La proyección de fluorescencia con respecto a temperatura
mostrada en la figura 12C es para un fragmento de 180 pares de
bases de ADN del virus de hepatitis B.
Otra proyección de fluorescencia con respecto a
la temperatura es la mostrada en la figura 13. La proyección
representada en la figura 13 es para un fragmento de 536 pares de
bases de \beta-globina de ADN humano. Los ciclos
previos representados en la figura 13 tienen aspecto idéntico, con
un incremento no lineal de la fluorescencia a bajas temperaturas.
Al proceder la amplificación, los ciclos posteriores aparecen como
bucles levantados entre las temperaturas de reasociación y
desnaturalización que muestran una histéresis significativa. Es
decir, la fluorescencia observada durante el calentamiento es mayor
que durante el enfriamiento. Al calentar la muestra, la
fluorescencia es elevada hasta que tiene lugar la desnaturalización
(visible como caída brusca de la fluorescencia). Tal como se puede
apreciar en la figura 13, al enfriarse la muestra desde las
temperaturas de desnaturalización a reasociación, la señal de doble
hebra aumenta con rapidez. Asimismo, tal como se puede apreciar en
la figura 13, la fluorescencia continúa incrementando durante la
extensión mientras la temperatura se mantiene constante.
También se pueden utilizar colorantes
específicos de doble hilera de acuerdo con varios aspectos de la
presente invención. La situación de hileras de los productos PCR
puede ser seguida con colorantes que tiene fluorescencia en
presencia de dsDNA. Cuando se encuentra presente SYBR® Green I
durante la amplificación, la fluorescencia aumenta al aumentar el
dsDNA. No obstante, los ciclos de temperatura introducen un efecto
de confusión porque la fluorescencia es inversamente proporcional a
la temperatura, tal como se ha mostrado en las figuras 26A y 26B.
Al acumularse el producto, la fluorescencia aumenta excepto en las
temperaturas de desnaturalización, en las que la fluorescencia
vuelve a la línea base tal como se ha mostrado en la figura 12C.
Cuando se controlan muestras múltiples,
utilizando el dispositivo de ciclos de temperatura rápidos con
detección de fluorescencia (300), una vez cada ciclo con SYBR®
Green I, se puede discriminar una gama de concentración de la
matriz inicial de 107-108 tal como se ha
representado en la figura 14. La figura 14A muestra la leyenda de
los indicadores dispuestos en los diferentes gráficos de la figura
14, y figuras subsiguientes para diferente número de copias de la
matriz inicial. Cuando los datos se normalizan como porcentaje
máximo de fluorescencia de cada tubo de muestras capilar (320), se
puede separar un centenar de copias iniciales de manera clara a
partir de diez copias. No obstante, la diferencia entre una y diez
copias es marginal, y no se observa diferencia entre cero y un
promedio de copias por tubo de muestras capilar (320).
Los colorantes de doble hebra dependen de la
especificidad inherente de los cebadores de amplificación. Tal como
se apreciará por los técnicos en la materia, la amplificación no
específica para elevados números de ciclos puede limitar la
sensibilidad de detección aproximadamente a cien copias iniciales de
la matriz (ver figura 14). Con los ciclos rápidos que se explican
en esta descripción, se obtienen otras mejoras adicionales en la
especificidad de la amplificación, mejorando de manera adicional el
comportamiento de la amplificación general de ADN.
La cuantificación con sondas específicas de
secuencia tiene una gama dinámica similar que los colorantes de ADN
de doble hilera pero, tal como se ha mostrado en los gráficos de las
figuras 15A y 15B, parecen discriminar incluso una copia única
inicial de la matriz a partir de controles negativos.
Cuando se requieren detección y cuantificación
de bajo número de copias, se consigue especificidad adicional por
sondas fluorescentes que requieren hibridación para generación de
señales. El fraccionamiento de una sonda de exonucleasa de doble
etiquetado es una técnica capaz de distinguir una copia de matriz
única de un control negativo tal como se ha mostrado en la figura
15. La figura 15 muestra gráficos de la proporción de fluorescencia
con respecto al número de ciclos para un diferente número de copias
de la matriz inicial distinto, de acuerdo con las leyendas
dispuestas en la figura 14A.
La generación de señal con sondas de
5'-exonucleasa depende no solamente de la síntesis
de ADN, sino que requiere hibridación e hidrólisis entre los
fluoróforos de la sonda de doble etiquetado. Esta hidrólisis reduce
el apagado y la proporción de fluorescencia de la fluoresceína con
respecto a los incrementos de emisión de rodamina. Para más
información sobre esta técnica, ver L.G. Lee, C.R. Connell y
W.Bloch, 1993, "Allelic Discrimination by
Nick-translation PCR with Fluorogenic Probes",
("Discriminación alélica por PCR con
Nick-traducción con sondas fluorogénicas")
Nucl. Acids Res. 21:3761-3766 & Livak,
K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti y K. Deetz, 1995,
"Oligonucleotides with Fluorescent Dyes at Opposite Ends Provide a
Quenched Probe System Useful for Detecting PCR Product and Nucleic
Acid Hybridization", ("Oligonucleótidos con tintas
fluorescentes en extremos opuestos proporcionan un sistema de sonda
apagada útil para detectar producto de PCR e hibridación de ácido
nucleico") PCR Meth. Appl. 4:351-362.
La figura 25 muestra resultados de PCR de
fluorescencia a partir de una sonda con cinco bases involucradas
entre etiquetas de fluorescencia y rodamina. La amplificación de
cuarenta y cinco ciclos fue completada en 20 minutos utilizando el
dispositivo de ciclos rápidos de temperatura con detección de
fluorescencia (300) de la figura 11. Controlando la proporción de
fluorescencia una vez por ciclo, se puede distinguir una gama de
109 veces la concentración de la matriz inicial. Las curvas de
amplificación se desplazan aproximadamente 3-4
ciclos para cada cambio de 10 veces en concentración de matriz
inicial.
Si bien la señal de fluorescencia final
disminuye cuando se amplifican números bajos de copias
(presumiblemente a causa de la disminución del rendimiento de la
amplificación), la cuantificación entre cero y cien copias es
fácilmente posible. La señal generada por sondas de exonucleasa es
acumulativa y solamente relacionada de forma indirecta a la
concentración de producto. Por lo tanto, la señal de fluorescencia
continúa aumentando incluso después de que la cantidad de producto
ha alcanzado un valor estable o plataforma. Utilizando la
información contenida en esta descripción, los técnicos en la
materia pueden formular normas apropiadas para controlar el
rendimiento de la amplificación y fraccionamiento a efectos de
llevar a cabo una cuantificación absoluta.
Los gráficos de fluorescencia con respecto a
temperatura de las sondas de 5'-exonucleasa
confirman que la hidrólisis de la sonda es el mecanismo de
generación de señal. En la figura 16, se ha mostrado un gráfico de
fluorescencia con respecto a temperatura de dos ciclos de
temperatura con una sonda de exonucleasa de
\beta-actina. En cada ciclo la proporción de
fluorescencia varía linealmente con la temperatura y existe poca, o
ninguna, histéresis. La señal aumenta a cada ciclo durante la fase
de reasociación/extensión cuando tiene lugar la hidrólisis de la
sonda. Si bien la fluorescencia de la fluoresceína y la rodamina
disminuye al aumentar la temperatura (no se muestran datos en las
figuras), la proporción de cambio es superior para la rodamina, con
el resultado de una proporción creciente al aumentar la temperatura.
No se observan efectos de hibridación dependientes de la temperatura
con la sonda de
5'-exonucleasa.
5'-exonucleasa.
Como contraste, cuando la señal de fluorescencia
depende solamente de la hibridación, los gráficos de la proporción
de fluorescencia con respecto a la temperatura muestran un modelo
distinto, durante la histéresis un ciclo de dos temperaturas, tal
como se ha mostrado en la figura 17. Los gráficos de la figura 17
representan los resultados obtenidos utilizando dos sondas
adyacentes de hibridación que se encuentran presentes, una en la
parte de arriba etiquetada 3' con fluoresceína y una sonda de la
parte de abajo etiquetada 5' con Cy5^{TM}. Las sondas están
separadas por un intersticio de 1 par de bases. Durante la fase de
reasociación/extensión de la reacción, las sondas hibridizan
teniendo como resultado acumulación de producto y el incremento de
la proporción de Cy5^{TM} con respecto a la fluorescencia de
fluoresceína. Durante el calentamiento a temperaturas de
desnaturalización del producto, las sondas se disocian entre 65ºC y
75ºC, volviendo la proporción de fluorescencia a los niveles de
fondo. El cambio en la proporción de fluorescencia durante la
hibridación es debido, principalmente, al incremento de
fluorescencia Cy5^{TM} a partir de la transferencia de energía con
resonancia. La dependencia de la hibridación con respecto a la
temperatura puede ser utilizada para detectar mutaciones por
desplazamiento en la curva de fusión. También son muy útiles las
sondas de hibridación adyacentes para cuantificación, tal como se ha
mostrado en la figura 15B.
\newpage
De la explicación anterior, se observará que la
supervisión de la fluorescencia durante la amplificación de ADN es
una técnica analítica extraordinariamente potente. Utilizando el
dispositivo de ciclos rápidos de temperatura con detección de
fluorescencia (300), se pueden conseguir un control en tiempo real
eficaz y con productividad en cuanto a costes, detección específica
de secuencia, y cuantificación en un tiempo de cinco a veinte
minutos, dependiendo del número de copias presentes de la matriz
inicial.
Además, el sistema y resultado presentados en
las figuras 11-17 son especialmente adecuados para
el control continuo de reacción biológica utilizando colorantes
fluorescentes. Por ejemplo, con control preciso de temperatura y
colorantes específicos de doble hilera, se puede estimar la pureza
de producto por las curvas de fusión. Con un control rápido de
temperatura, según la presente invención, se puede determinar la
concentración absoluta del producto por cinética de reasociación.
La presente invención proporciona de manera ventajosa cambios
rápidos de temperatura y homogeneidad estricta de la temperatura
interna de la muestra que no se puede conseguir en la técnica
anterior. Como contraste con respecto a la técnica anterior, la
presente invención utiliza contenedores de muestras con una elevada
proporción de área superficial con respecto al volumen (por
ejemplo, utilizando los tubos capilares preferentes para muestras
-320- de la figura 11) y utiliza el aire como medio de
transferencia térmica proporcionando un control rápido de la
temperatura de la muestra que no se puede conseguir de otra forma.
Por ejemplo, los gráficos de temperatura de la muestra con respecto
al tiempo obtenidos cuando se procesan muestras en los contenedores
de muestras de la presente invención muestran puntas bruscas para
las temperaturas de desnaturalización y reasociación (mostrando
respuesta rápida de temperatura) como contraste a los tubos de
plástico cónicos de la técnica anterior que requieren varios
segundos para que toda la muestra alcance el equilibrio térmico.
Además, los contenedores de muestras de la presente invención
proporcionan resultados mejorados con respecto a la utilización de
chips de silicio o cristal con ataque químico como contenedores de
muestras, dado que los tiempos de ciclo térmico y la homogeneidad
térmica de la presente invención son superiores que los tiempos de
ciclo térmico y la homogeneidad térmica posible utilizando otros
cuerpos o estructuras.
Utilizando la presente invención, se pueden
discriminar muchos aspectos de la amplificación de ADN que hasta el
momento habían sido poco comprendidos. Por ejemplo, la
desnaturalización del producto tiene lugar en menos de un segundo,
pero en la técnica anterior se requieren de diez segundos a un
minuto de desnaturalización. Observando la fusión de producto por
control de fluorescencia en tiempo real con colorantes de doble
hilera, de acuerdo con la presente invención, (ver figuras 12 y 13)
se demuestra que la utilización de tiempos de desnaturalización más
cortos es muy eficaz. Como otro ejemplo, se han propuesto muchas
causas del conocido "efecto plataforma", pero se dispone de
pocos datos para distinguir entre las alternativas. Tal como se ha
mostrado en la figura 13, la reasociación del producto es muy
rápida. En realidad, durante ciclos posteriores de amplificación,
la mayor parte del producto es reasociada cada ciclo durante el
enfriamiento antes de alcanzar la temperatura de reasociación del
cebador. Esto ocurre con velocidades de enfriamiento de
5-10ºC/segundo llevando a cabo la presente
invención. La reasociación del producto con dispositivos de ciclo de
temperatura más lentos, según la técnica anterior, será incluso más
elevada porque se requiere más tiempo para la transición entre la
temperatura de desnaturalización y la de reasociación. Este efecto
poco deseable limita el rendimiento del producto, y es una causa
importante del "efecto plataforma" conocido en esta
técnica.
Además, el dispositivo que se da a conocer
proporciona un instrumento económico que se puede utilizar en
aplicaciones comerciales y que controla de manera continuada la
fluorescencia durante la amplificación de ciclo rápido. El
dispositivo de ciclos térmicos de la presente invención es capaz de
llevar a cabo amplificación de ADN en un tiempo no superior a
10-20 minutos y los componentes ópticos y de
detección de la presente invención discriminan uno, dos, tres, o
más fluoróforos. Las realizaciones preferentes de la presente
invención controlarán un número de muestras individuales, por
ejemplo, 24 muestras (tubos capilares de muestras -320- de la
figura 11) desde una vez cada algunos segundos, preferentemente una
vez por segundo, y más preferentemente diez veces por segundo.
Se encuentra dentro del alcance de la presente
invención la preparación de muestras para procesar utilizando los
aparatos de 96 pocillos conocidos y los tubos capilares de muestra
(320), que son colocados entonces, en una de las realizaciones
preferentes, por ejemplo, en el dispositivo de ciclos térmicos
rápidos con detección de fluorescencia 1300 de la figura 11.
De manera ventajosa, las realizaciones
preferentes de la presente invención utilizan realimentación de
fluorescencia para control en tiempo real y optimización del
proceso biológico, por ejemplo amplificación de ADN, al continuar
el proceso. Por lo tanto, con las realizaciones preferentes que se
dan a conocer en esta descripción, la fluorescencia que se detecta
es utilizada para controlar los ciclos de temperatura. Utilizando
realizaciones de la presente invención, tal como se da a conocer, y
utilizando las técnicas de control continuo preferentes con tintes
específicos de dsDNA, la extensión se terminará en cada ciclo
térmico después de que la fluorescencia detectada termine de
aumentar. Además, de acuerdo con la presente invención, las
condiciones de desnaturalización son controladas asimismo por
incremento de la temperatura solamente hasta que el producto se ha
fundido por completo. Asimismo, de forma adicional, de acuerdo con
la presente invención, la reasociación de un cebador es controlada
con transferencia de energía de resonancia entre fluoresceína y
oligonucleóticos etiquetados Cy5. Además, utilizando la presente
invención, los ciclos de temperatura de la muestra se terminan de
manera automática después de que una cantidad predeterminada de
producto ha sido preparada.
Es posible, utilizando el aparato de la presente
invención, producir ciclos rápidos de temperatura con tiempos
mínimos de reasociación y desnaturalización que mejoran PCR
cuantitativa e incrementan la discriminación de la amplificación
específica de alelos. Los ciclos rápidos para el secuenciado de
ciclos reducen las ambigüedades de secuenciado y minimizan las
"bandas de sombra" en amplificaciones de repetición de
dinucleótidos. De acuerdo con la presente invención, para PCR largo
hasta 35 kb, se mejora el rendimiento cuando la muestra es expuesta
lo menos posible a elevadas temperaturas de desnaturalización.
En contraste a los enfoques anteriores a PCR que
tratan PCR como tres reacciones, desnaturalización, reasociación,
extensión, cada una de las cuales tiene lugar a tres temperaturas
distintas (tal como se ha indicado en la figura 18A), un aspecto de
la presente invención prevé que un paradigma simétrico para PCR
consiga importantes mejoras. Utilizando un paradigma cinético para
PCR (tal como se ha representado en la figura 18B), la curva de
temperatura con respecto al tiempo consiste en transiciones
continuas entre reacciones solapadas. El método y aparato de la
presente invención son particularmente eficaces para llevar a cabo
PCR bajo paradigma cinético. La figura 18C es un gráfico que
representa diferentes perfiles de tiempo/temperatura próximos a una
temperatura de reasociación de 55ºC. En la figura 18C, las líneas
continuas muestran una "punta" situada centralmente que
representa la temperatura de respuesta de una muestra de 10 \mul.
Como contraste, las marcas indicadas en forma de segmentos con
líneas cortas y largas de la figura 18C representan la respuesta de
temperatura de muestras obtenidas utilizando instrumentos bloque de
calentamiento. Tal como se puede apreciar de la figura 18C, las
realizaciones de la presente invención producen "puntas" del
segmento de reasociación, con las ventajas que se han discutido en
contraste con las "plataformas" de temperaturas de acuerdo con
el criterio convencional en esta técnica.
La instrumentación anteriormente conocida
utilizada para la detección presentaba muchos inconvenientes. El
sistema de la presente invención tal como se ha descrito,
proporciona ciclos de temperatura rápidos y precisos en contraste
con instrumentación anteriormente conocida que es de cinco a diez
veces más lenta. Con el control de fluorescencia continua
conseguido asimismo con el sistema de la presente invención, se
puede seguir la dependencia de temperatura de la hibridación.
Siguiendo la hibridación durante los ciclos de temperatura, se
puede minimizar el número de sondas y/o colores espectrales
requeridos. Es decir, se pueden detectar diferentes productos y
mutaciones por sus características de fusión dinámica, en vez de
pasar al engorro de sintetizar diferentes sondas etiquetadas con
fluoróforos para cada especie de ADN que se desea detectar.
A efectos de dar a conocer una realización de
una gran eficacia en cuanto a costes, un diodo emisor de luz de
alta intensidad es utilizado en vez de una fuente de arco de xenón o
un láser para iluminación de la muestra, y fotodiodos para
detección. Las muestras son cargadas en tubos de muestras capilares
de cristal, o alternativamente en contenedores de muestra de tipo
compuesto cristal/plástico (ver figuras 21A-D) en un
formato de 96 pocillos que no requiere sellado térmico. Por lo
tanto, la presente invención da a conocer un análisis de
fluorescencia en tiempo real de una gran eficiencia en cuanto a
costes. El control de fluorescencia en tiempo real de los ciclos de
temperatura mejora la calidad de la amplificación. Por ejemplo, si
la temperatura de las muestras es incrementada solamente hasta que
tiene lugar la desnaturalización, se minimiza la exposición del
producto a temperaturas elevadas. Esto incrementa el rendimiento al
limitar el producto y la degradación de la encima e incrementa la
especificidad al limitar la amplificación de productos con una
elevada temperatura de fusión.
A continuación se hará referencia a la figura
19, que muestra una representación esquemática de otra realización
preferente de un ejemplo comparativo de la presente invención
configurada para control continuo de una muestra única. No
obstante, se comprenderá que las estructuras representadas en las
figuras 19 y 20 pueden ser también incorporadas en un sistema que
procesa de forma automática muestras múltiples, tales como el
aparato representado en la figura 11 y tal como se explicará
brevemente a continuación. En el ejemplo de la figura 19, un soporte
de muestras único (402) está situado en un soporte de retención
(404) dispuesto en la intersección de la corriente de aire con
temperatura controlada y una trayectoria óptica lineal. El soporte
de muestras (402) comprende un tubo (402A) que tiene muchas de las
características deseables de un tubo capilar de acuerdo con la
presente invención. Se pueden utilizar diferentes configuraciones
de tubos capilares y el tubo (402A) tiene preferentemente sección
transversal rectangular. La muestra biológica queda retenida
preferentemente en el extremo inferior o de fondo del tubo (402A)
tal como se ha indicado en (402B). Se dispone preferentemente una
caperuza (402C) sobre el soporte de muestras (402).
A continuación se hará referencia a las figuras
19A-19E en las que se compara el efecto de
diferentes configuraciones de contenedores de muestras sobre la
respuesta de temperatura de la propia muestra. Los gráficos de
temperatura-tiempo mostrados en la figura 19E
corresponden a las respuestas obtenidas utilizando las
configuraciones del contenedor de muestras que se han representado
en las figuras 19A-C, respectivamente. La figura
19D representa un contenedor de muestras que es menos preferible
para su utilización en la presente invención y que está incluido a
efectos comparativos. Utilizando la información que se acompaña, los
técnicos en la materia pueden llegar a conseguir configuraciones
óptimas de contenedores de muestras para aplicaciones específicas
de la presente invención. A continuación se indican otras
informaciones con respecto a cada una de las configuraciones y
contenedores de muestras representadas en las figuras
19A-D.
En el aparato de la figura 19, se dispone una
fuente de radiación de excitación (418), preferentemente un LED y
más preferentemente un LED azul, para iluminar el soporte de
muestras (402). La radiación emitida por la fuente de radiación de
excitación (418) pasa a través de las lentes de enfoque asféricas
(420) y un filtro de paso de banda de excitación (422) y la
radiación es enfocada sobre el soporte de muestras (402).
Los componentes ópticos mostrados en la figura
19 son mantenidos preferentemente en el cuerpo envolvente óptico
(412). También se dispone un cuerpo envolvente (406). Un ventilador
(409) queda dispuesto para desplazar aire por el conducto de aire
(414) y sobre el soporte de muestras (402) mantenido en el soporte
de muestras (404). Una unidad de temperatura (410) queda situada en
la trayectoria de flujo de aire proporcionando calentamiento o
calentamiento y enfriamiento para el aire que pasa sobre el soporte
de muestras (404). Una tobera (416) dirige de manera efectiva el
aire sobre el soporte de muestras (404).
Las emisiones facilitadas por la muestra pasan a
través de otras dos lentes asféricas (420) y un filtro de paso de
banda de emisión (424) y son recibidas por un fotodetector (426),
que preferentemente es un fotodiodo. Los técnicos en la materia
pueden disponer fácilmente los componentes de control necesarios
para el funcionamiento ventajoso del aparato representado en la
figura 19 utilizando la información que se indica en esta
descripción.
Las figuras 19F y 19G son vistas laterales y
extremas, respectivamente, de un contenedor de muestras preferente
(403) que utiliza un tubo capilar rectangular (403A). El tubo
capilar (403A) es preferentemente un tubo que se puede conseguir de
la firma Vitro Dynamics Inc. con dimensiones de 1 mm X 3 mm X 50
mm. Una primera caperuza (403B) y una segunda caperuza (403C) se
mantienen unidas mediante un tornillo (403D), cuyo tornillo (403D)
funciona también como soporte para el tubo capilar (403A).
Las figuras 19H y 19I muestran, respectivamente,
dos posibles orientaciones de un tubo capilar rectangular (403A) en
la detección de fluorescencia de la muestra contenida en el mismo.
La figura 19H muestra el tubo capilar rectangular (403A) orientado
de manera que sus bordes están alineados con el eje óptico de la
óptica de excitación y de detección ("excitación y detección del
borde"). La figura 19I muestra el tubo capilar rectangular
(403A) orientado de manera que sus caras se encuentran alineadas con
el eje óptico de la óptica de excitación y detección ("excitación
y detección en la cara"). De manera sorprendente, la señal de
fluorescencia obtenida de la orientación para la detección de borde
mostrada en la figura 19H es aproximadamente desde el triple a
cinco veces superior a la obtenida con la orientación de detección
de la cara que se ha mostrado en la figura 19I. Las características
deseables de utilizar la orientación de detección de borde mostrada
en la figura 19H son debidas como mínimo a reflexión interna total
que tiene lugar en el tubo capilar (403A) que concentra la señal de
fluorescencia a los extremos del tubo capilar (403A).
La figura 20 muestra los componentes ópticos de
otro ejemplo preferente de acuerdo con otro aspecto de la presente
invención. Los componentes ópticos representados en la figura 20 se
incorporan preferentemente en las estructuras de ciclos térmicos y
de manipulación de muestras que se han representado en la figura 21,
que se describirán brevemente de manera más completa, pero que
también se pueden utilizar con muchas disposiciones distintas para
proporcionar control (muy preferentemente control continuo) de una
muestra sometida a reacción de cadena de polimerasa.
En contraste con las disposiciones que
previamente se han dado a conocer, las trayectorias ópticas de
excitación y detección se combinan en el ejemplo de las figuras 20
y 21, a las que se hace referencia en esta descripción como
trayectoria epifluorescente, en vez de trayectoria lineal. En el
ejemplo de las figuras 20 y 21, la radiación de excitación y
emisión sigue la misma trayectoria óptica entre el tubo capilar y el
elemento dicroico utilizado en la trayectoria de excitación. Un
tubo capilar está particularmente adaptado para su utilización en
las realizaciones de las figuras 20 y 21 debido a la reflexión
interna total (a la que se hace referencia también como
"conductos de luz") a lo largo del tubo de muestra capilar, lo
que se explota para incrementar las intensidades de excitación y
emisión.
En la realización de las figuras 20 y 21, para
adaptarse a conductos de luz máximos, el eje óptico es paralelo a
la longitud del tubo capilar (paraxial) con la punta del tubo
capilar dispuesta en el punto focal. Suponiendo un índice de
refracción aproximado de 1,33 para la muestra objeto de detección,
aproximadamente 12,39 de la luz emitida es guiada a la punta. Se
comprende que se puede utilizar acción centrífuga para desplazar la
muestra a la punta del tubo capilar.
Los gráficos de la figura 22A muestran la
eficacia de los conductos de luz cuando se efectúa detección de
fluorescencia en la punta del tubo capilar y muestra un incremento
de 10 veces en la intensidad de la señal al observar la punta
(diamantes cerrados) en vez del lado (círculos abiertos) del
contenedor de muestras capilar. Asimismo, tal como se ha indicado
en la figura 22B, los resultados obtenidos utilizando tubos de
muestras capilares de dos tamaños distintos, que son llenados a
diferentes longitudes con dsDNA tintado con SYBR® Green I, se han
mostrado en forma de gráficos. Tal como se puede deducir de las
figuras 22A y 22B, la epifluorescencia observada aumenta al añadir
una cantidad mayor de muestra al tubo, si bien la eficacia de la
fluorescencia disminuye.
Las características ópticas de la emisión de un
capilar fueron investigadas por estimulación de fluorescencia en un
capilar lleno con una solución de fluorescencia a 470 nm. La emisión
desde el extremo romo del capilar se observó homogénea a través de
la cara del capilar en oposición a la concentración en el cristal
que se podría esperar si la emisión fuera el resultado de
fluorescencia en ondas evanescentes.
Los componentes ópticos representados en la
figura 20 llevan a cabo la iluminación epifluorescente paraxial de
la punta del capilar, lo que proporciona resultados ventajosos que
no se pueden conseguir de otro modo. En la figura 20, una fuente de
radiación de excitación (468) es preferentemente un LED azul, tal
como el conocido en la industria como LED super brillante que se
puede conseguir de la firma LEDtronics. Las señales de
fluorescencia emitidas son captadas por fotodetectores (466A) y
(466B). La fuente de radiación de excitación (468) y los
fotodetectores (466A) y (466B) están soportados sobre un panel de
montaje (468) que comprende también los necesarios circuitos y que
integra filtros con los fotodetectores (466A) y (466B). Un panel de
montaje preferente es el que se puede conseguir de la firma Ealing
Electrooptics que comprende filtros de interferencia de 0,5
pulgadas con fotodiodos de silicio de alto rendimiento en envases
TO5. Los componentes de excitación y detección están soportados
directamente sobre el panel de montaje (468) con la electrónica
asociada. Es preferente que los componentes ópticos sean
preferentemente de 1,0 pulgadas de diámetro. Una lente colimadora
(454), dos filtros dicroicos (456A) y (456B), un espejo (458),
filtros de interferencia (460A-C), y lentes de
enfoque asféricas (462A-C) dirigen la radiación
hacia y desde la muestra.
Mientras la realización de la presente invención
representada en la figura 20 utiliza solamente dos
colores/longitudes de onda cuando se lleva a cabo análisis, los
técnicos en la materia podrán adaptar fácilmente la realización
para conseguir tres, o más, análisis de color. Para conseguir tres o
más análisis de color, el aparato representado en la figura 20
puede recibir otros filtros dicroicos y fotodetectores. Además, se
encuentra dentro del ámbito de la presente invención el permitir
separación simultánea de longitudes de onda sobre un conjunto de
fotodetectores de tipo lineal, tal como se encuentra en la
industria, para captación multicolor. Cuando se utiliza un conjunto
detector fotolineal de acuerdo con la presente invención, es
preferible que se utilice un prisma o una rejilla de difracción en
cooperación con una lente y conjunto de fotodetector o CCD para
detección de longitudes de onda múltiples. Un fotodetector lineal
preferente que se encuentra a disposición en la industria recoge
15-30 sectores de longitud de onda de
10-20 nm cada uno de ellos entre 500 y 800 nm.
Diferentes configuraciones de componentes ópticos, como por ejemplo
la configuración autocolimadora Littrow para rejillas utilizadas en
la mayor parte de monocrómetros, se pueden conseguir utilizando la
información que se desprende de la presente descripción para
conseguir la mejor adecuación entre eficacia de captación,
resolución espectral y exigencias espaciales. El aparato de la
figura 20 se describirá a continuación incorporado a un aparato de
ciclos térmicos automático representado en la figura 21.
La figura 21 muestra una representación
esquemática de otro aparato (400) que incluye componentes de ciclo
rápido de temperatura, componentes de manipulación de muestras, y
los componentes ópticos representados en la figura 20, funcionando
todos ellos conjuntamente para conseguir detección de fluorescencia
en la punta de los contenedores de muestras (epifluorescencia). El
aparato de ciclos rápidos de temperatura con detección de
epifluorescencia (400) que se ha representado en la figura 21
proporciona ventajas específicas. Se comprenderá que esta
realización que se ha descrito muestra simplemente un ejemplo de la
presente invención y que los técnicos en la materia pueden idear
muchas disposiciones distintas para llevar a cabo la presente
invención tal como se reivindica.
En el ejemplo representado en la figura 21, se
toma aire a través de la abertura (470) y sigue en general la
trayectoria de flujo indicada por las líneas (472). La temperatura
del aire y por lo tanto la temperatura del tubo capilar (450) de
plástico/cristal, se ajusta preferentemente utilizando un cartucho
de calentamiento (474) de 400 watios que se puede conseguir
preferentemente de la firma Reheat, Inc. El cartucho de
calentamiento (474) está posicionado dentro de un conducto central
(476). Un ventilador (498) está dispuesto para desplazar el aire en
la trayectoria indicada (472). El ventilador es impulsado por el
eje (496) y el motor (494). El motor (494) es preferentemente un
motor de escobillas de tierras raras de corriente continua que se
puede conseguir preferentemente de la firma Escap AG. y que tiene un
máximo de régimen de 15.000 rpm. Cuando se efectúa el calentamiento
de los tubos (450) de plástico/cristal, el cartucho de calentamiento
es controlado de manera proporcional y el ventilador funciona a una
velocidad relativamente baja (12 voltios, 0,5 amperios) para
proporcionar homogeneidad de temperatura para la totalidad de
contenedores (450) de muestras de plástico/cristal. Cuando se
efectúa el enfriamiento de los tubos (450) de plástico/cristal, el
cartucho de calentamiento (474) es desactivado y el motor (494)
funciona a una velocidad rápida (por ejemplo, con el motor
preferente antes mencionado, la máxima velocidad se obtiene al
aplicar 27 voltios, 1,4 amperios). El ventilador (498) obliga al
aire hacia adentro de la abertura (470), saliendo por las aberturas
de salida (471).
En el dispositivo preferente de ciclos rápidos
de temperatura con detección de epifluorescencia (400), es
preferible que se dispongan simétricamente alrededor del cartucho de
calentamiento (474) y conducto central (476), veinticuatro tubos
capilares (450) de plástico/cristal (dos de los cuales se han
mostrado en la figura 21). Los tubos (450) de plástico/cristal
quedan alojados en manguitos (451) que (debido a su estructura
desplazada) permiten un ajuste preciso de la posición de los tubos
capilares (450) individuales de plástico/cristal en un carrusel
circular (480). Los manguitos (451) están fabricados
preferentemente a partir de latón. La estructura de eje desplazado
del manguito (451) permite que cada uno de dichos manguitos (451)
sea alineado, de manera que la punta del tubo (450) de
cristal/plástico puede ser ajustada de manera precisa para que se
encuentre en el punto focal óptico representado en la figura 21,
tanto lateralmente como longitudinalmente, en el momento en el que
se fabrica el dispositivo de ciclos de temperatura rápidos con
detección de epifluorescencia (400).
El carrusel (480) es soportado sobre un cojinete
(482) por encima de un cuerpo envolvente (490). El carrusel (460)
es posicionado por un motor paso a paso (488) dotado de un
dispositivo de impulsión (484) conectado al motor (488) por
intermedio del eje (486). El motor paso a paso (488) es accionado
(paso a paso mediante un controlador (no representado
explícitamente en la figura 21) de la firma New England Affiliated
Technologies) para proporcionar más de 10.000 pasos por revolución
del carrusel (480), proporcionando un posicionado preciso de cada
uno de los tubos (450) de plástico/cristal. El interior del cuerpo
envolvente (490) está dotado de material aislante (492),
preferentemente de acuerdo con el material aislante anteriormente
descrito. Los deflectores (476) funcionan formando la abertura de
salida (471) y bloquean la luz ambiente.
Las figuras 21A-D proporcionan
vistas detalladas adicionales de los tubos (450) de plástico/cristal
y se hará referencia a ellas para la explicación del método
preferente de utilización de los mismos. El tubo (450) de
plástico/cristal comprende una parte de tubo capilar (450B) cerrada
por un extremo. La parte de tubo capilar (450B) puede adoptar
muchas configuraciones y no está limitada solamente a la estructura
del tubo capilar. No obstante, es preferible que el volumen de
fluido retenido por los tubos (450) de plástico/cristal no sea
superior a 1 mililitro a efectos de favorecer la homogeneidad de la
temperatura de la muestra y los ciclos térmicos rápidos. Por
ejemplo, es preferible que el material del que se ha fabricado la
parte (450B) de tubo capilar tenga una conductividad térmica dentro
de una gama de valores de 20 a 35 de acuerdo con la fórmula
\left(\frac{cal \ cm}{cm^{2}s \ grados \ C}\right) x 10.
Otras informaciones referentes a conductividad térmica
{}\hskip17cm de diferentes cristales se puede conseguir de la publicación de R.C. Weast & M.J. Astle, HANDBOOK OF CHEMISTRY AND PHYSICS, página E-6 (1992) (CRC Press). Los tubos de plástico/cristal (450) están dotados también de una parte de contenedor (450C) fabricada preferentemente a partir de un material plástico apropiado y unida al extremo abierto de la parte (450B) del tubo capilar. Si bien se pueden utilizar muchos materiales distintos para la parte del recipiente (450C), es preferible que el material plástico sea conformado con una estructura en forma de embudo, siendo fijado a la parte de tubo capilar (450B).
{}\hskip17cm de diferentes cristales se puede conseguir de la publicación de R.C. Weast & M.J. Astle, HANDBOOK OF CHEMISTRY AND PHYSICS, página E-6 (1992) (CRC Press). Los tubos de plástico/cristal (450) están dotados también de una parte de contenedor (450C) fabricada preferentemente a partir de un material plástico apropiado y unida al extremo abierto de la parte (450B) del tubo capilar. Si bien se pueden utilizar muchos materiales distintos para la parte del recipiente (450C), es preferible que el material plástico sea conformado con una estructura en forma de embudo, siendo fijado a la parte de tubo capilar (450B).
La muestra (S) es cargada en el tubo (450) de
tipo combinado de plástico/cristal utilizando una pipeta (P), u
otro instrumento apropiado, manualmente o utilizando un proceso
automatizado. Es preferible que el volumen de la muestra se
encuentre en una gama de valores aproximadamente de 0,01 \mul a
10.000 \mul, más preferentemente en una gama aproximada de 0,01
\mul hasta 100 \mul, y de modo más preferente en una gama de
0,01 \mul hasta 10 \mul, siendo el volumen más preferente de
unos 5 \mul. Una vez que la muestra ha sido añadida a cada tubo
(450) de plástico/cristal, los tubos (450) de plástico/cristal son
centrifugados a baja velocidad para colocar las muestras en las
puntas del extremo cerrado de la parte capilar (450B), de manera
que la muestra forma una columna de fluido 0,2-2,0
cm indicada con el numeral (450A), tal como se ha representado en la
figura 21B. Un tapón (450D) (preferentemente configurado en forma
de tapón de plástico) es colocado a continuación en la parte del
recipiente (450C) para cerrar de forma estanca el tubo (450) de
plástico/cristal, tal como se ha mostrado en la figura 21C, y el
tubo (450) de plástico/cristal es colocado en el manguito (451) del
dispositivo de ciclos rápidos de temperatura con detección de
epifluorescencia (400). Se pueden utilizar diferentes estructuras
para sellar la parte de tubo capilar (450B).
La parte (450B) del tubo capilar del tubo (450)
de cristal/plástico es preferentemente un tubo capilar hecho de
cristal disponible en la industria, que tiene un diámetro interno de
0,8 mm y un diámetro externo de 1,0 mm, y que está cerrado/sellado
en un extremo y abocinado en el otro para recibir el recipiente de
plástico (450C). Los contenedores de muestras (450) de
cristal/plástico pueden ser fabricados de manera fácil y económica.
La forma de la punta (450E) de la parte (450B) del tubo capilar es
optimizada para conseguir eficiencia óptica. Se prevén dentro del
ámbito de la presente invención puntas planas y también puntas con
diferentes curvaturas exteriores e interiores. Los técnicos en la
materia podrán seleccionar la configuración más eficaz para dicha
punta.
Tal como se puede deducir de las figuras
21A-D, la adición de estructuras de carga de
plástico y de estanqueización a un tubo capilar proporciona grandes
ventajas y permite una utilización eficaz de los tubos capilares de
cristal conservando sus características térmicas deseables. Se
aprecia que está dentro del alcance de la presente invención añadir
las muestras a los recipientes de muestra de plástico/cristal (450)
y someter las muestras a centrifugación, en un formato de 96 celdas.
Además, se encuentra dentro del alcance de la presente invención
cargar individualmente los recipientes de muestra de
plástico/cristal en el aparato de ciclos rápidos de temperatura con
detección de epifluorescencia (400) y también se encuentra dentro
del alcance de la presente invención dar a conocer una realización
de la presente invención para cargar los recipientes de muestra de
plástico/cristal (450) en un formato de 96 celdas o en algún otro
formato.
De manera ventajosa, el tubo (450) de tipo
combinado de plástico/cristal, proporciona un soporte de muestras
económico y conveniente. Con el ejemplo de la figura 21, es
preferible que se capte la fluorescencia a partir de muestras
únicas una a diez veces por segundo. Cuando se capta fluorescencia
de muestras múltiples a la velocidad preferente, es necesario que
las muestras sean desplazadas a su posición por rotación del
carrusel (460) de manera relativamente rápida. Con el motor paso a
paso preferente (480) y dispositivos de control apropiados (que se
pueden seleccionar utilizando la información contenida en esta
descripción), cada una de las veinticuatro muestras pueden ser
desplazadas de forma rápida y precisa a la posición de control
representada en la figura 21.
Cuando la señal fluorescente de cada muestra es
captada durante 100 mseg., la variación de señal (con reposicionado)
es <1%. Se observará que se encuentra dentro del alcance de la
presente invención disminuir el tiempo de captación de la señal,
incrementar las velocidades de tránsito, y asimismo observar el
coeficiente de variación a partir de muestreo repetido. Cuando se
procesan veinticuatro muestras, y el carrusel se hace girar sin
parar a una velocidad comprendida entre una y diez revoluciones por
segundo, cada una de las muestras tiene un período de excitación y
detección de 0,37-3,7 mseg.
Utilizando la información que se ha indicado,
los técnicos en la materia pueden seleccionar si la señal
fluorescente está integrada a través del software o del hardware.
En una realización preferente, se utiliza un lenguaje de
programación gráfica en relación con el dispositivo de ciclos
rápidos de temperatura con detección de epifluorescencia (400), tal
como el conocido en la industria como LabView (que se puede adquirir
de la firma National Instruments), que tiene subprogramas para
detección de máximos o picos y para integración. En otra realización
preferente, la integración se lleva a cabo en el hardware con
tiempo de integración variable (control de sensibilidad ajustable
por el usuario) de manera que las señales alcanzan un nivel óptimo
para conversión analógica a digital.
Utilizando el dispositivo de ciclos rápidos de
temperatura con detección de epifluorescencia (400) representado en
la figura 21, el control continuado de la muestra al proceder la
reacción, permite una determinación de las exigencias del ciclo de
temperatura durante la amplificación, basándose en la observación
continua de la reasociación, extensión y desnaturalización. Esto
contrasta con la técnica anterior en la que todos los parámetros
del ciclo son determinados y programados antes de empezar la
amplificación. De acuerdo con la técnica anterior, utilizando
oligonucleótidos complementarios equivalentes al cebador con punto
de fusión más bajo, la eficacia de la reasociación es controlada
incluso durante los primeros ciclos. En cualquier caso, la
extensión y desnaturalización pueden ser controlados solamente con
colorantes dsDNA durante ciclos posteriores cuando se ha preparado
suficiente producto. De modo significativo, esta exigencia no es
habitualmente un problema porque las condiciones de
desnaturalización y de extensión son suficientemente flexibles para
amplificar la mayor parte de productos, y los datos de la primera
amplificación pueden ser utilizados para optimizar pasadas
siguientes.
Haciendo referencia adicionalmente a la figura
21, se pueden preparar un interfaz de usuario y un control de
instrumentos (500) utilizando la información de la presente
descripción en relación con la realización de la figura 11. Como
ejemplo preferente de interfaz de usuario y de control de
instrumentos (500), un microordenador PENTIUMTM que trabaja con el
lenguaje de programación LabView con una tarjeta de entrada/salida
multifunción de 12 bits (de la firma National Instruments)
proporciona captación de datos y control. Es preferible que las
señales de salida analógica sean utilizadas para ajustar los
amplificadores asociados con los fotodetectores (466A) y (466B).
Los canales de entrada analógicos miden asimismo la temperatura de
las muestras mediante un termopar (499) así como el fluorescente
detectado desde la muestra por los fotodiodos. El interfaz de
usuario y control de instrumentos (500) representado en la figura
21 proporciona también control digital I/O de la fuente de radiación
de excitación (468), de la dirección del motor paso a paso (469),
del cartucho de calentamiento (474), y del ventilador (496).
Cuando se pueden utilizar supervisión de
fluorescencia continuada de muestras PCR conteniendo el colorante
dsDNA SYBR® Green I o sondas de oligonucleótidos etiquetadas de
forma fluorescente para controlar la hibridación y fusión durante
ciclos de amplificación individuales. Esta información puede ser
utilizada por dispositivos preferentes para el interfaz de usuario
y control de instrumento (500) para proporcionar condiciones de
ciclos térmicos mejoradas y adaptadas a cada caso. Las ventajas de
utilizar información de hibridación para ciclos de temperatura
incluyen:
- (A)
- Asegurar que tiene lugar una desnaturalización completa del producto PCR con cada ciclo y simultáneamente:
- Minimizar la exposición a temperaturas de desnaturalización excesivamente elevadas, evitando, de esta manera, daños inducidos por el calor en los productos de amplificación y en la polimerasa.
- Incrementar la especificidad de la reacción minimizando la temperatura de desnaturalización que selecciona contra productos con un valor T_{m} más elevado que el producto de amplificación deseada.
- (B)
- Hacer máxima la eficacia de amplificación asegurando el tiempo adecuado para la extensión del producto con cada ciclo y simultáneamente:
- Minimizar la cantidad de tiempo requerida para amplificación al no permitir más tiempo del necesario para completar la extensión del producto.
- Fomentar la especificidad de la reacción al seleccionar contra productos más largos que el producto de amplificación deseado.
- (C)
- Hacer máximo el rendimiento de amplificación al asegurar el tiempo adecuado para la extensión de producto de cada ciclo y simultáneamente:
- Minimizar la cantidad de tiempo requerido para amplificación al no permitir tiempos más largos de lo necesario para completar la extensión del producto.
- Fomentar la especificidad de la reacción al seleccionar contra productos con mayor longitud que el producto de amplificación deseado. Éstos requerirían más tiempo que el concedido para completar la extensión del producto.
- (D)
- Iniciar cambios de ciclo térmico dependientes del nivel de fluorescencia obtenido o de la eficiencia momentánea de la amplificación. Por ejemplo, se puede hacer mínima la sobreamplificación y productos de reacción no específicos al terminar los ciclos térmicos cuando el rendimiento desciende a un nivel determinado. Como otro ejemplo, los ciclos de temperatura se pueden modificar para iniciar rampas de temperatura más lentas para la captación de la curva de fusión cuando la fluorescencia resulta detectable. Esto ahorra tiempo porque las rampas más lentas no deben ser utilizadas en ciclos iniciales. Otros cambios deseables pueden resultar evidentes de la práctica continuada de la invención.
- (E)
- Minimizar los daños por sobreamplificación al producto PCR y/o iniciación de la captación de la curva de fusión antes de que la sobreamplificación ha incrementado el fondo de los productos de reacción no específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
El interfaz de usuario y control de instrumentos
(500) puede seguir los puntos de ajuste de tiempos/temperaturas
preprogramados y/o, de manera ventajosa, pueden detectar valores de
fluorescencia detectados y a continuación utilizar los valores de
fluorescencia detectados y captados para alterar o ajustar uno o
varios parámetros de reacción en tiempo real para optimizar los
resultados obtenidos. Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "parámetro de reacción" incluye, sin que ello sirva de
limitación, cualquier parámetro utilizado como base para controlar
una reacción. Estos parámetros de reacción comprenden, sin que ello
sirva de limitación, la temperatura y el tiempo de
desnaturalización, temperatura y tiempo de reasociación del cebador,
temperatura y tiempo de reasociación de la sonda, temperatura y
tiempo de extensión de la encima y número de ciclos. En general, el
control de la reacción se basa inicialmente en la estimación de
parámetros de reacción a partir de los datos de fluorescencia. Los
datos de fluorescencia originales son captados como cambio de la
fluorescencia a lo largo del tiempo (tasas específicas de
temperatura o desnaturalización, reasociación y extensión), cambio
en fluorescencia según la temperatura (T_{m} de producto o sonda),
o cambio de la extensión de amplificación (rendimiento de la
amplificación y eficiencia). Estos valores, T_{m}s, y sus primera
y segunda derivadas se utilizan para determinar los parámetros de
reacción óptimos tales como temperatura y tiempo de
desnaturalización, temperatura y tiempo de reasociación del
cebador, temperatura y tiempo de reasociación de la sonda,
temperatura y tiempo de extensión de la encima y número de
ciclos.
Tal como se ha mostrado en el bloque de alto
nivel de la figura 22C, las tareas se dividen entre las llevadas a
cabo por una parte del interfaz de usuario y control de instrumentos
(500) (que preferentemente puede ser un ordenador compatible con
IBM utilizando programación basada en las informaciones indicadas)
(bloques -500A-500E- de la figura 22C) y las
llevadas a cabo por los componentes restantes (bloques -500A-, y
-500G-500S- de la figura 22C) del dispositivo de
ciclos rápidos de temperatura con detección de epifluorescencia
(400). Se comprenderá que el diagrama de bloques de la figura 22C
es meramente a título de ejemplo.
Como ejemplo de las ventajas de la disposición
mostrada en la figura 22C, se explicará el control de fusión del
producto. Se capta un valor de fluorescencia máxima de fusión para
el producto PCR deseado y se capta una fluorescencia de línea base
para la muestra que contiene la mezcla de reacción y la temperatura
a la que se observa que el producto se ha fundido por completo.
Cada ciclo de la reacción utiliza este valor de fluorescencia como
objetivo. El enfoque que se describe en este ejemplo utiliza dos
etapas para proporcionar un retardo de tiempo para adaptarse a la
exigencia de envío de los valores de fluorescencia a un ordenador PC
separado. Con cada etapa de fusión del producto, la temperatura se
incrementa hasta que la fluorescencia alcanza un valor intermedio,
a continuación la potencia aplicada al dispositivo de calentamiento
se reduce de manera que se impone una rampa de temperatura de 3ºC
por segundo aproximadamente, de manera que el ordenador PC tiene el
tiempo adecuado para analizar la fluorescencia y comunicar a otros
componentes que ha tenido lugar la desnaturalización del producto.
El gráfico resultante de tiempo/temperatura se muestra en la figura
22D. La figura 22D muestra un incremento característico en la
temperatura de fusión después de veinte ciclos al aumentar la
concentración de producto de amplificación. Esto es debido al hecho
de que el producto T_{m} es una función de la concentración del
producto.
Como ejemplo de otras ventajas de la disposición
mostrada en la figura 22C, se explicará la reasociación/extensión
del producto. Durante una retención prolongada a una temperatura
combinada de reasociación/extensión, se controla la fluorescencia
de la muestra y esta información es utilizada para asegurar que se
ha permitido un tiempo adecuado, pero no excesivo, para la
extensión del producto. La fluorescencia es controlada a intervalos
de diez segundos, y si la fluorescencia incrementa en más de una
proporción predeterminada (típicamente de 1,00 a 1,05), entonces se
continúa la etapa de reasociación/extensión. De otro modo, se inicia
la siguiente etapa de fusión del producto. El intervalo de diez
segundos se escoge para conseguir un mínimo de veinte segundos a la
temperatura combinada de reasociación/extensión.
La figura 22B muestra un gráfico de
fluorescencia/tiempo que muestra un incremento característico en el
tiempo de permanencia a la temperatura combinada de
reasociación/extensión al aumentar la concentración de amplificación
del producto. Esto es debido al hecho de que al resultar limitadora
la concentración del cebador y la polimerasa, se requiere más
tiempo para completar la extensión del producto dentro de cada
ciclo.
Como otro ejemplo adicional de las ventajas de
la disposición mostrada en la figura 22C, se explicará la plataforma
de amplificación. Al final de cada etapa de reasociación/extensión,
se capta y se almacena el valor de la fluorescencia. Cuando este
valor aumenta a 1,2 veces el valor de la fluorescencia más bajo de
final de ciclo y se ha parado a continuación el incremento por
debajo de una proporción de usuario ajustable (típicamente
1,00-1,02), se termina el ciclo térmico. De manera
alternativa, se inicia una etapa de determinación de la curva de
fusión entrando en una rampa lenta de temperatura de 0,1ºC a
0,2ºC/segundo pasando para el T_{m} del producto y controlando la
fluorescencia de la muestra de manera continua. El gráfico
resultante de fluorescencia/tiempo mostrado en la figura 22D
muestra que después de veinticinco ciclos de amplificación, la
proporción de crecimiento de fluorescencia ciclo a ciclo disminuyó
por debajo de 1,00 y terminó la reacción. Se observará que este
enfoque puede ser utilizado para captar una curva de fusión de alta
resolución para cada muestra. Al alcanzar una muestra su plataforma
de amplificación, se puede captar una curva de fusión para dicha
muestra, a continuación los ciclos de temperatura regulares pueden
reanudarse hasta que otra reacción alcanza su plataforma de
amplificación.
La figura 22E muestra segmentos útiles de
temperatura con respecto al tiempo para control de la hibridación
de fluorescencia. Las curvas de fusión del producto se obtienen
durante un incremento lento de temperatura hasta la
desnaturalización. Al reducir de manera rápida la temperatura
después de la desnaturalización a una temperatura constante, se
pueden detectar el producto, sonda, o reasociación del cebador. Se
obtienen curvas de fusión de la sonda al calentar lentamente
pasando por temperaturas alrededor de T_{m} de la sonda. Los
técnicos en la materia podrán utilizar fácilmente el sistema
representado en la figura 21 para conseguir el análisis necesario
si se desea tiempo real, durante los ciclos de temperatura para
conseguir información que hasta el momento no era accesible sobre
las características del producto, sonda, y cebador utilizando el
hardware y el software que se han descrito.
También se lleva a cabo una cuantificación
absoluta del producto, de manera ventajosa, de acuerdo con la
presente invención. El control continuado de formación de ADN de
doble hilera, permite la cuantificación absoluta y directa de ADN
por cinética de reasociación. La temperatura de la muestra desciende
rápidamente desde la temperatura de desnaturalización y se mantiene
constante a una temperatura más baja que todavía es suficientemente
elevada para impedir la reasociación del cebador. La velocidad de
reasociación del producto sigue a continuación una cinética de
segundo orden. Cuando se comprueban diferentes concentraciones de
ADN, la forma de la curva de reasociación es característica de la
concentración de ADN (ver figura 26). Para cualquier producto PCR y
temperatura determinados, se puede medir una constante de segundo
orden. Una vez se conoce la constante de velocidad, se puede
determinar cualquier concentración desconocida de ADN a partir de
datos experimentales de reasociación. Las curvas pueden acoplarse a
una regresión no lineal de mínimos cuadrados durante ciclos de
temperatura en tiempo real utilizando programación LabView
(explicada anteriormente). La refrigeración no es instantánea, y
tiene lugar una cierta reasociación antes de alcanzar una
temperatura constante, pero el análisis de regresión permite este
efecto, de acuerdo con la presente invención. La técnica requiere
producto PCR puro, pero esto se puede verificar por las curvas de
fusión obtenidas también durante los ciclos de temperatura. La
cuantificación por cinética de reasociación es independiente del
nivel de señal y no está afectada por diferencias de volumen de
la
muestra.
muestra.
La figura 28 es una representación esquemática
de otro aparato que comprende muchas de las estructuras incluidas
en la realización de la figura 21. A efectos de proporcionar una
descripción sucinta de la realización de la figura 28, solamente se
explicarán las diferencias significativas entre los componentes
representados en la figura 21 y los componentes representados en la
figura 28 para el entendimiento de que un técnico en la materia
pueda utilizar fácilmente la información contenida para fabricar
realizaciones en la presente invención. Las figuras 27A y 27B son
vistas esquemáticas en sección de la realización representada en la
figura 26 en una modalidad de funcionamiento y modalidad de carga,
respectivamente.
La realización de la figura 28 es un dispositivo
de ciclos rápidos de temperatura, indicado de modo general con el
numeral (502), con detección de fluorescencia en la punta de los
tubos capilares con posicionado automático de los contenedores de
muestras en dos dimensiones, lo que mejora la señal de fluorescencia
que es obtenida a partir de la muestra. La figura 29 es una vista
en perspectiva del exterior de un aparato que incluye los
componentes ilustrados en la representación esquemática de la figura
28.
\newpage
Tal como se aprecia en las figuras 28 y 29, una
bandeja circular desmontable (483) para las muestras soporta
treinta y dos muestras. La bandeja de muestras circular desmontable
(483) es colocada en el dispositivo de ciclos de temperatura
rápidos (502) de manera que se acopla a un carrusel (481) que es
impulsado por el motor (488). Al girar el carrusel (481), se
utiliza un localizador de posición de efecto Hall para posicionar de
manera precisa el carrusel (481), de manera que cada muestra es
posicionada de manera precisa sobre el conjunto del fluorímetro
(459). El conjunto del fluorímetro (459) incluye preferentemente
una fuente (459A) del LED, tres fotodiodos (459B), lentes de
enfoque (459C), y un conjunto de filtro (459D). El conjunto del
fluorímetro (459) es similar en estructura y función al representado
en la figura 20.
De manera más ventajosa, el fluorímetro está
montado sobre un cojinete deslizante (493) que es desplazado por un
motor paso a paso lateral (491). Al girar el carrusel (481), los
tubos combinados de plástico/cristal (450) son posicionados de
manera precisa sobre el conjunto del fluorímetro (459) en la
dirección del carrusel y la posición es anotada por el aparato
mediante el localizador de posición de efecto Hall (495) mientras
el motor paso a paso lateral (491) ajusta el posicionado del
conjunto del fluorímetro (459) ajustado en una segunda dimensión y
se anota la posición. De este modo, el dispositivo (502) de ciclos
rápidos de temperatura proporciona una colocación mejorada de una
serie de muestras en el aparato utilizando una bandeja de muestras
desmontable (483) y proporciona la detección mejorada de la señal
de fluorescencia procedente de una muestra.
En las figuras 30A-30V se han
mostrado de manera esquemática diagramas que muestran la
configuración preferente de los componentes eléctricos del
dispositivo de ciclos rápidos de temperatura (502) representado en
las figuras 28 y 29. Se debe comprender que los diagramas de las
figuras 30A-30V son meramente una disposición
preferente para llevar a cabo aspectos particulares de la presente
invención y dichos diagramas no están destinados a limitar el
ámbito de la misma. Para mejorar la claridad de los diagramas, se
indicarán en la lista de piezas correspondiente que se adjunta las
anotaciones que se utilizan habitualmente en la industria.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se incluye un código de programación a título de
ejemplo en relación con los componentes de las figuras 28, 29, y
30A-30V en el código de programación, apéndice B,
adjunto a la descripción, e incorporado a título de referencia.
Según otra realización de la presente invención,
se dispone un sistema de manipulación para la carga de recipientes
de muestra de pequeño volumen con muestras de líquido,
particularmente muestras a analizar por detección de la
fluorescencia emitida. El recipiente de muestra tiene típicamente un
volumen menor de 1ml, y puede adoptar la forma de un tubo (es decir
un tubo capilar) o de un "capilar plano", en el que el espacio
capilar está definido por dos placas separadas o láminas selladas a
lo largo de sus bordes. El recipiente de muestra tiene de manera
típica una proporción de volumen a área superficial externa de 1 mm
aproximadamente, de manera más típica menos de 0,5 aproximadamente.
Los tubos capilares que tienen un diámetro interior menor de 1 mm
tienen una proporción de volumen respecto al área superficial menor
de 0,25 mm. El recipiente utilizado está formado preferentemente a
partir de un material ópticamente transparente. Los materiales
preferentes son ópticamente transmisibles para luz que tiene una
longitud de onda comprendida aproximadamente entre 400 y 800 nm. La
utilización de este material permitirá la detección de una señal
fluorescente generada en un líquido de muestras mantenido en el
recipiente. Además, la utilización de recipientes con una proporción
baja de volumen respecto a área superficial para analizar
fluorescencia a partir de una muestra fluorescente posibilita una
detección más eficaz de la fluorescencia debido a una reflexión
interna total.
Los recipientes que tienen una elevada
proporción de área superficial respecto al volumen (o inversamente,
una relación baja del volumen con respecto al área superficial)
pueden ser difíciles de cargar con muestras de líquido. De manera
ventajosa, el sistema de manipulación de muestras ayuda a superar
estas dificultades. De acuerdo con una realización, un recipiente
que tenga una elevada proporción de área superficial respecto a
volumen, y un extremo abierto está dotado de una caperuza de embudo
que se acopla sobre el extremo abierto del recipiente para
facilitar la carga de muestras de líquido en el recipiente. La
caperuza en forma de embudo comprende una primera abertura
receptora de la muestra y una segunda abertura de transferencia de
la muestra así como medios para fijar de manera liberable la
caperuza de embudo sobre el recipiente, de manera que la abertura
de transferencia de la muestra de la caperuza del embudo y el
extremo abierto del recipiente se encuentren alineados. En una
realización la caperuza de embudo puede ser una construcción de
plástico o de goma y está formada de manera tal que el diámetro
interno de la abertura de transferencia de la muestra se acopla por
rozamiento en el diámetro externo del recipiente en las proximidades
de su extremo abierto. No obstante, se conocen por parte de los
técnicos en la materia otros medios para el acoplamiento de la
caperuza de embudo al recipiente, incluyendo la utilización de
adhesivos, bridas, abrazaderas y similares. En una realización el
sistema de manipulación de muestras puede comprender además un tapón
para acoplamiento de estanqueización ajustado por fricción con la
abertura receptora de muestras de la caperuza de embudo. No
obstante, cualquier dispositivo o material que cierre de manera
efectiva la abertura del embudo para impedir contaminación o
evaporación de la muestra cargada es adecuado para su utilización
con la presente invención.
De manera ventajosa los recipientes pueden ser
utilizados en un método para favorecer la detección y la eficacia
de la captación de fluorescencia en una muestra que comprende un
fluoróforo. El método comprende las etapas de colocar una muestra
en un recipiente que tiene paredes compuestas por un material
ópticamente transparente y definiendo un volumen que tiene, como
mínimo, una primera y segunda dimensiones. La primera dimensión es
menor que la segunda dimensión y la proporción de volumen respecto
al área superficial externa del recipiente es menor de 1 mm. La
detección incrementada y eficacia de captación de fluorescencia
generadas por la muestra se consiguen por la detección de
fluorescencia a lo largo de un eje substancialmente paralelo a una
pared a lo largo de la segunda dimensión del recipiente. En una
realización, la fluorescencia de la muestra es inducida por
iluminación excitatoria del fluoróforo de la muestra, de manera que
ésta es iluminada a lo largo de un eje substancialmente paralelo a
una pared a lo largo de la segunda dimensión del recipiente. En una
realización preferente, se consigue una eficacia óptima de la
captación de fluorescencia por iluminación excitatoria de
fluoróforo de la muestra, a lo largo del eje de detección de
fluorescencia (detección epifluorescente), y la fluorescencia se
detecta a lo largo de un eje a través de una pared del recipiente
que tiene la menor área superficial, preferentemente a lo largo de
un eje que atraviesa el fondo del recipiente.
En una realización la fluorescencia de la
muestra biológica puede ser dependiente de la temperatura. Por
ejemplo, un recipiente puede contener una muestra que comprende
secuencias de ácido nucleico y la entidad fluorescente puede
comprender un colorante específico de doble hilera. Al aumentar la
temperatura de la muestra hasta la temperatura de
desnaturalización, la intensidad de la fluorescencia disminuye. De
manera alternativa, la entidad fluorescente puede comprender un par
de sondas de oligonucleótido que hibridizan regiones adyacentes de
una secuencia de ácido nucleico objetivo, de manera que una de
dichas sondas es etiquetada con un fluoróforo aceptador y la otra
sonda es etiquetada con un fluoróforo cedente o donante de un par de
transferencias de energía de fluorescencia. En esta realización el
recipiente y la muestra pueden ser calentados controlando
simultáneamente la fluorescencia de un fluoróforo, como mínimo, del
par de transferencia de energía de fluorescencia.
El recipiente adopta la forma de un tubo capilar
que puede ser utilizado de manera ventajosa en procedimientos que
requieren ciclos térmicos de una muestra, por ejemplo, amplificación
de una secuencia de ácido nucleico objetivo por una reacción de
cadena de polimerasa. En un ejemplo, el recipiente capilar queda
constituido para su inserción en un soporte de muestra de un
dispositivo utilizado para ciclos térmicos o un dispositivo
utilizado para detectar fluorescencia. El soporte de muestras del
dispositivo puede contener solamente un recipiente único, o bien el
soporte de muestras puede adoptar forma de un carrusel para mantener
una serie de recipientes de muestra.
Un carrusel adecuado para su utilización es el
mostrado en las figuras 31A\amp{1}B. El carrusel (1) adopta, en
general, la forma de un disco (2) que tiene una superficie superior
(3), una superficie de fondo (4) y un borde externo (5) que se
extiende entre ambas. El disco (2) tiene una serie de conjuntos de
aberturas receptoras de muestras alineadas radialmente (6A), (6B),
y (6C) en la superficie superior (3), una abertura para el
recipiente de muestras (7) en el borde externo (5) y un paso para
muestras (8) que comunica con las aberturas receptoras de muestras
(6A), (6B) y (6C) y la respectiva abertura (7) para el recipiente
de muestras. El carrusel (1) se ha mostrado con recipientes de
muestras fijos, algunos de los cuales se han indicado con el numeral
(9). La abertura (7) del recipiente de muestras y el paso para
muestras (8) se han formado para recibir y fijar el recipiente de
muestras (9) al disco (2). En una realización, el recipiente de
muestras (9) está fijado de forma liberable al carrusel (1) para
permitir la retirada del recipiente de muestras y su sustitución con
otro recipiente de muestras para permitir la utilización múltiple
del carrusel (1). En una realización alternativa, los recipientes de
muestras (9) están fijados permanentemente al disco (2), o se han
constituido en forma de un componente integral del mismo. En una
realización el recipiente de muestras (9) está fijado al disco (2)
por contacto y fricción entre el recipiente de muestras (9) y, como
mínimo, una parte del paso de muestras (8) próximo a dicha abertura
(7) para el recipiente de muestras. También pueden ser utilizados
otros medios convencionales para la fijación del recipiente de
muestras en comunicación con el recipiente de muestras. Por ejemplo,
se pueden formar cabezas de tornillo complementarias sobre la
superficie del paso de muestras (8) y en la superficie exterior del
recipiente de muestras (9). Además, se pueden utilizar adhesivos o
cualquier otro medio de fijación conocido por los técnicos en la
materia de acuerdo con la presente invención para fijar el
recipiente de muestras (9) al disco (2). Las superficies superior e
inferior del carrusel de la presente invención están formadas
preferentemente para permitir el apilamiento de múltiples carruseles
uno encima de otro, de manera que un apilamiento de múltiples
carruseles puede ser acoplado de manera desmontable con un eje de
impulsión de un motor y pueden girar simultáneamente como unidad,
tal como se ha mostrado en la figura 32.
La realización mostrada en la figura 32
comprende un motor paso a paso (504) y un eje de impulsión (506)
que funciona para retener y obligar a girar los carruseles indicados
de manera general con el numeral (1). Una cámara de ventilador
(508) es utilizada para generar el flujo de aire indicado por las
flechas (512). Un dispositivo de calentamiento (510) funciona
calentando el aire que pasa por los recipientes de muestras (9). Un
conjunto de fluorímetro (514) comprende una fuente de LED (514A),
fotodiodos (514B), lentes de enfoque (514C), y un conjunto de
filtros (514D). Un motor paso a paso (516) del fluorímetro funciona
desplazando el conjunto del fluorímetro (514) en la dirección de la
flecha (518). Los técnicos en la materia podrán construir
fácilmente las realizaciones según la presente invención,
conformadas de acuerdo con la figura 32 utilizando la información
que se facilita en esta descripción.
En otra realización (no mostrada) el carrusel
comprende un disco que tiene una superficie superior, una superficie
inferior, un borde externo que se extiende entre aquéllas, una
abertura receptora de la muestra en la superficie superior, una
abertura de recipiente de muestras en la superficie inferior y un
paso de muestras que comunica con dicha abertura receptora de
muestras y la abertura del recipiente de muestras. La abertura del
recipiente de muestras y el paso para las muestras están
constituidos para recibir y fijar un recipiente de muestras al
disco. Preferentemente los recipientes de muestras son retenidos
formando un ángulo agudo en disposición radial con respecto a la
superficie de fondo del disco.
En una realización el paso de muestras del disco
comprende una primera parte que tiene un eje central
substancialmente paralelo a las superficies superior y de fondo del
disco y una segunda parte que tiene un eje central que forma ángulo
agudo con las superficies superior y de fondo del disco. En esta
realización, la abertura del recipiente de muestras y el paso para
las muestras están constituidos para recibir y fijar un recipiente
de muestras al disco de manera tal que el recipiente de muestras se
extiende desde el disco formando ángulo agudo con respecto a la
superficie de fondo del mismo.
El carrusel (1) está dotado además de medios
para cerrar las aberturas receptoras de muestras (6A), (6B) y (6C).
Los medios de cierre pueden ser un tapón (no mostrado) que se
asienta en la abertura (6) para la recepción de muestras y que se
acopla por fricción con las paredes adyacentes del paso de
muestras, o, por ejemplo, una cinta con adhesivo en su cara
posterior, para aplicación a la superficie superior para sellar de
manera efectiva la boca de la abertura receptora de muestras para
impedir contaminación o evaporación de la muestra que se ha cargado.
El carrusel (1) está acoplado de manera desmontable con un eje de
impulsión para su rotación. Cualesquiera medios de acoplamiento
adecuados de tipo conocido por los técnicos en la materia pueden ser
utilizados incluyendo acoplamiento por fricción, o la utilización
de tornillos, pernos, pasadores de bloqueo o abrazaderas. En una
realización, el disco (2) está constituido como anillo dotado de un
orificio central formado para recibir un eje de impulsión (-506- en
la figura 32). El extremo del eje de impulsión está dotado
preferentemente de estructuras para retener los discos (2) en su
lugar.
El carrusel (1) de la presente invención puede
ser utilizado para suministrar una muestra de líquido a un
recipiente de muestras (9). En una realización el recipiente de
muestras (9) es un recipiente capilar que contiene una mezcla
predeterminada (por ejemplo, una mezcla de reactivos) que
interacciona con uno o varios componentes de la muestra introducida.
De acuerdo con una realización, la mezcla predeterminada es añadida
al recipiente de muestras antes de colocar un recipiente de muestras
capilar en la abertura de dicho recipiente de muestras. De manera
alternativa, el recipiente de muestras es preenvasado con una
mezcla predeterminada. La mezcla predeterminada puede comprender
reactivos que reaccionan o interaccionan con la muestra para
producir una señal detectable o para producir un producto
derivado.
El paso para muestras (8) del carrusel (1) está
dotado opcionalmente de una o varias barreras (10) que impiden que
la muestra de líquido suministrada a través de las aberturas
receptoras (6A), (6B) y (6C) de la muestra pueda pasar a la
abertura (7) del recipiente de muestras a falta de una fuerza
positiva que actúe sobre dicha muestra de líquido. El término
"barrera" se utiliza en esta descripción para incluir cualquier
estructura que dificulte el flujo libre de una muestra de líquido
suministrada a la abertura receptora de muestras hacia la abertura
del recipiente de muestras. Se incluyen como ejemplos de barreras
adecuadas para su utilización en el paso para muestras del
carrusel, unas depresiones o cubetas formadas en el paso de
muestras, salientes que estrechan el paso de muestras o nervios
anulares que se extienden desde la superficie del paso de muestras,
membranas porosas, válvulas direccionales o aletas que son forzadas
a la posición de cierre.
Las barreras son formadas de manera tal que la
muestra de líquido pueda superar la barrera por la aplicación de
una fuerza sobre una muestra de líquido que se encuentre en el paso
para las muestras y que está bloqueada por la barrera. La
aplicación de una fuerza sobre la muestra se consigue
preferentemente por la fuerza centrípeta generada por la rotación
del carrusel. Por lo tanto, en un carrusel que tenga una serie de
juegos de aberturas receptoras de muestras (6A), (6B) y (6C) en la
superficie superior, correspondiendo a cada uno de los juegos con
un paso para muestras y una abertura del recipiente de muestras, se
pueden añadir muestras individualmente a las diferentes aberturas
receptoras de muestras y la barrera localizará la muestra de
líquido e impedirá que las muestras pasen a las respectivas
aberturas del recipiente de muestras. Después de que la totalidad
de muestras han sido suministradas a las aberturas receptoras
correspondientes, se hace girar el carrusel para suministrar las
muestras a la correspondiente abertura de recipiente de muestras,
pasando al recipiente de muestras acoplado.
Según una realización, cada uno de los pasos de
muestras del carrusel comunica con una abertura única de recipiente
de muestras y una serie de aberturas receptoras de muestras. De
acuerdo con esta realización, el paso para las muestras puede
incluir opcionalmente un paso central que se ramifica para comunicar
con múltiples aberturas receptoras de muestras o de manera
alternativa, tal como es mostrado en las figuras 31A&B,
múltiples aberturas (6A), (6B) y (6C) receptoras de muestras están
alineadas según un eje común que se prolonga radialmente desde el
centro del disco, comunicando cada una de dichas aberturas a través
de un paso con un recipiente de muestras alojado en la abertura del
recipiente de muestras. El paso de las muestras puede quedar dotado
de una o varias barreras (9A) que impiden que una muestra añadida a
cualquiera de la serie de aberturas receptoras de muestras pueda
pasar hacia el recipiente de muestras sin fuerza que actúe sobre
dicha muestra de líquido. Además, cada paso de muestras puede quedar
dotado de múltiples barreras, cada una de las cuales requiere una
magnitud distinta de fuerza para producir la transferencia de una
muestra superando la barrera. De acuerdo con esta realización,
después del suministro de las muestras a las aberturas receptoras
respectivas, se pueden transferir selectivamente las muestras
individuales a las aberturas del recipiente de muestras, pasando al
recipiente de muestras al controlar la velocidad de rotación
del
carrusel.
carrusel.
Por ejemplo, una primera muestra puede ser
suministrada a una primera abertura receptora de muestras y una
segunda muestra puede ser suministrada a una segunda abertura
receptora de muestras de manera que la primera y segunda aberturas
receptoras de muestras comunican con un paso común y cada una de
dichas primera y segunda aberturas receptoras de muestras están
dotadas de una barrera que impide el flujo de las correspondientes
primera y segunda muestras. Las barreras permiten que el disco quede
dispuesto como parte de un juego de elementos o conjunto con
cantidades predeterminadas de reactivos, catalizadores, enzimas,
aceites, etc. previamente seleccionados que son cargados
previamente en el paso de las muestras mediante una o varias de las
aberturas receptoras de muestras.
En una realización la barrera para la segunda
abertura receptora de muestras está formada de manera que se debe
aplicar una fuerza mayor a la muestra suministrada a la segunda
abertura receptora de muestras para pasar su barrera asociada que
es requerida para que una muestra suministrada a la primera abertura
del receptor de muestras supere su barrera asociada. De acuerdo con
esta realización, la rotación del carrusel a una primera velocidad
suministra la primera muestra a la abertura del recipiente de
muestras, pasando al recipiente de muestras, mientras que la
segunda muestra no puede pasar hacia la abertura del recipiente de
muestras, entrando en el recipiente de muestras. La rotación a una
segunda velocidad incrementada favorecerá entonces la fuerza
centrípeta sobre la segunda muestra, con el resultado del suministro
de la segunda muestra a la abertura del recipiente de muestras y
pasando al recipiente de muestras. Basándose en este principio, se
pueden suministrar diferentes muestras a múltiples aberturas de
recipientes de muestras que comunican con un paso común y después
de haber cargado todas las muestras, las muestras individuales
pueden ser suministradas a la abertura del recipiente de muestras y
pasando hacia adentro del recipiente de muestras uno a uno o
simultáneamente por control de la velocidad de rotación del
carrusel. En una realización una primera muestra, que comprende un
fluoróforo, es añadida a una primera abertura de recipiente de
muestras y una segunda muestra, que comprende un aceite, es
suministrada a la segunda abertura de recipiente. El carrusel se
hace girar para suministrar la primera muestra al recipiente de
muestras seguido del aceite. El aceite (u otro líquido que sella de
manera efectiva la primera muestra dentro del recipiente de
muestras) funciona reduciendo la evaporación de la primera muestra y
reduciendo el riesgo de contaminación de la primera muestra.
En un ejemplo, un carrusel de muestras múltiple
es utilizado para manipular múltiples muestras simultáneamente. El
carrusel es una estructura en forma de disco que tiene multitud de
aberturas receptoras de muestras en la superficie superior de la
estructura de disco y que está en comunicación de fluido con
correspondientes recipientes de muestras fijados al disco. Las
muestras añadidas a las aberturas receptoras de muestras son
transferidas a sus correspondientes recipientes de muestras por
rotación del carrusel. El carrusel puede tener también múltiples
aberturas receptoras de muestras que comunican con cada recipiente
de muestras individual. Se pueden colocar reactivos por el usuario
en la segunda abertura receptora de muestras que comunica con el
recipiente de muestras para suministrar al recipiente otra muestra
que fue añadida a la primera abertura receptora de muestras o bien,
de modo alternativo, se pueden colocar reactivos predeterminados en
una segunda abertura receptora de muestras por el fabricante; es
decir, en el caso en el que el carrusel, los recipientes de muestras
y el reactivo predeterminado se encuentran en forma preenvasada.
Los reactivos, junto con la muestra, son suministrados al
recipiente de muestras por rotación del carrusel. Una capa superior
de aceite de una muestra acuosa puede ser colocada en una tercera
abertura receptora de muestras que se encuentra en comunicación de
líquido con el recipiente de muestras (y la primera y segunda
aberturas receptoras de muestras), o bien el aceite se puede añadir
al carrusel por el fabricante.
De forma alternativa, una muestra, reactivos y
aceite para superposición con las muestras se pueden suministrar a
una única abertura receptora de muestras. El carrusel puede ser
obligado a girar para suministrar cada uno de los compuestos o
muestras al respectivo recipiente antes de suministrar una segunda
muestra o muestra subsiguiente u otro compuesto a la abertura
receptora de muestras.
Un carrusel preferente para recipientes de
muestras según la invención comprende tres aberturas receptoras de
muestras de modo preferente, pero opcionalmente, dispuestas en
alineación radial y en comunicación de fluido con un recipiente de
muestras común. De acuerdo con esta realización, alrededor de 1 a 5
\mul de capa superpuesta de aceite, preferentemente con un tinte
de color negro, se encuentra presente en forma preenvasada o es
suministrado a la abertura receptora de muestras situada
radialmente en la parte más interna. La capa de aceite comprende
aceite mineral y aproximadamente de 0,01% a 1% de colorante negro
orgánico tal como Waxoline® Black OBP de la firma Zenica, Inc. de
Wilmington, DE. Aproximadamente de 1 a 9 \mul de una mezcla
principal de reactivo se encuentra presente en forma preenvasada o
se suministra a la abertura receptora de muestras situada
radialmente en la parte más externa. La mezcla principal de
reactivo comprende una parte o la totalidad de componentes de
reacción necesarios. Una muestra de líquido que contiene el ácido
nucleico matriz a comprobar es suministrada manualmente o
robóticamente en la abertura receptora de muestras radialmente
intermedia. El disco es obligado a girar a continuación a una
velocidad tal que transfiere la muestra al compartimiento de
reactivos, pero a una velocidad de rotación insuficiente para
suministrar la mezcla al recipiente de muestras. La muestra y
reactivo pueden ser opcionalmente mezclados por cambios rápidos en
la velocidad de rotación del disco. El disco es girado a
continuación a una velocidad superior que provoca que la muestra y
reactivo, pero no el aceite, se desplacen hacia adentro del
recipiente de muestras. El disco es girado a continuación a una
velocidad de rotación todavía más elevada para suministrar la capa
superpuesta de aceite al recipiente de muestras. El aceite quedará
dispuesto como capa superior en la muestra acuosa a causa de su
densidad más baja y bloqueará el paso de la luz a causa de su
contenido de colorante. La transferencia selectiva de aceite,
reactivos y muestra por alteración de la velocidad de rotación del
carrusel se consigue por una combinación de: 1) variación del
diámetro de los pasos de comunicación del fluido; 2) variación de
las dimensiones o tamaño de las barreras físicas presentes en los
pasos de comunicación de fluido; y 3) utilizando la dependencia de
la fuerza centrífuga en la distancia variable (radio) de cada
abertura receptora de muestras desde el centro del disco.
El carrusel de la presente invención puede ser
acoplado de manera desmontable con el eje de impulsión y un motor
(-506- y -504-, respectivamente en la figura 32) para la rotación
del carrusel. Además, carruseles individuales según la presente
invención se pueden apilar uno encima de otro y se pueden acoplar
con un eje de impulsión para la rotación simultánea (tal como se ha
mostrado en la figura 32). Se puede disponer de un dispositivo para
controlar la fluorescencia de una muestra retenida dentro de un
recipiente de muestras (ver -514- en la figura 32). El recipiente
de muestras comprende un material ópticamente transparente y tiene
paredes que definen un volumen que tiene como mínimo una primera y
segunda dimensiones, de manera que la primera dimensión es menor
que la segunda dimensión y de manera que la relación del volumen
respecto al área superficial externa del recipiente es menor de 1
mm. En una realización el dispositivo comprende una cámara, un
soporte de recipiente de muestras, una fuente de emisión de luz
montada en dicha cámara y dispuesta para iluminar el recipiente de
muestras a lo largo de un eje substancialmente paralelo a una pared
a lo largo de la segunda dimensión del recipiente y un detector de
luz montado en dicha cámara y dispuesto para medir la fluorescencia
desde el recipiente de muestras a lo largo de un eje
substancialmente paralelo a una pared según la segunda dimensión
del recipiente. La fuente de emisión de luz y el detector de luz de
acuerdo con una realización están montados en una plataforma que se
puede subir y bajar (tal como se ha indicado por la flecha -518- de
la figura 32). En esta realización, la fuente de emisión de luz y el
detector de luz se pueden posicionar para medir la fluorescencia
desde recipientes de muestras (a lo largo de un eje
substancialmente paralelo a una pared según la segunda dimensión del
recipiente) de múltiples carruseles cuando los carruseles
individuales son apilados uno sobre otro y acoplados con un eje de
impulsión para rotación simultánea (ver figura 32).
En una realización el soporte del recipiente de
muestras comprende un carrusel para soportar una serie de tubos
capilares, y el carrusel está montado con capacidad de rotación en
dicha cámara. La fuente de emisión de luz está dispuesta para
iluminar el tubo capilar a través de la parte inferior del tubo y el
detector de luz está montado para detectar fluorescencia a través
del fondo del tubo capilar. Además, el dispositivo está dotado de
un motor paso a paso para la rotación de dicho carrusel y medios
para el acoplamiento del carrusel al motor.
De acuerdo con una realización preferente, la
cámara del dispositivo detector de fluorescencia está dotado además
de un dispositivo de calentamiento (-510- en la figura 32) y un
ventilador (-508- en la figura 32) montados en dicho dispositivo y
en comunicación de flujo de aire con la cámara, y un controlador
para los mismos, para conseguir ciclos rápidos de temperatura de la
cámara utilizando, por lo menos inicialmente, parámetros
predeterminados de tiempo y temperatura. El dispositivo es capaz de
llevar a cabo reacciones de cadena de polimerasa en los recipientes
de muestra retenidos por el carrusel. En particular, el dispositivo
permite un método mejorado de realización de reacciones PCR dado que
el avance de la reacción se puede controlar en tiempo real, lo cual
permite el ajuste de los parámetros de temperatura y tiempo durante
el curso de la reacción para optimizar el rendimiento y pureza de la
secuencia amplificada del ácido nucleico objetivo.
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(Apéndice pasa a página
siguiente)
<110> university of Utah Research
Foundation
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<120> Sistema y método para llevar a
cabo y supervisar procesos biológicos
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 7475-73545
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 03025810.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-11 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 97929833.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-06-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US97/09856
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1997.06-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 08/658,993
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-06-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtggtggac ttctctcaat
\hfill20
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaagatgag gcatagcagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 35
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3'-fluorescein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc
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<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3'-fluorescein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaacagaca ccatggtgca cctgactcct gagga
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3'-phosphate
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtctgccg ttactgccct gtggggcaag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipggttggccaa tctactccca gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcactcag tgtggcaaag
\hfill20
Claims (9)
1. Recipiente compuesto de plástico/cristal para
contener una muestra biológica mientras se lleva a cabo la
amplificación de ácido nucleico, comprendiendo dicho recipiente un
material ópticamente claro, configurado para contener un máximo de 1
ml de muestra, comprendiendo además:
- a)
- una parte en forma de tubo capilar que está cerrada en un extremo,
- b)
- una parte de reservorio (450C) siendo la parte en forma de embudo unida al extremo abierto de la parte en forma de tubo capilar; y
- c)
- una estructura para sellar la parte en forma de tubo capilar
en la que dicha parte en forma de embudo está
fabricada de plástico.
2. Recipiente, según la reivindicación 1, en el
que dicha parte en forma de tubo capilar tiene una punta con una
curvatura exterior y/o una curvatura interior.
3. Recipiente, según la reivindicación 1, en el
que dicha estructura comprende un tapón que es colocado en la parte
en forma de embudo para cerrar el recipiente de
plástico/cristal.
4. Recipiente, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que una muestra cargada en la parte en
forma de tubo capilar es capaz de formar una columna de fluido de
0,2 a 2,0 cm.
5. Varios recipientes compuesto de
plástico/cristal colocados en un carrusel rotativo, siendo dichos
recipientes adecuados para contener una muestra biológica fluida
mientras se lleva a cabo la amplificación de ácido nucleico,
comprendiendo cada recipiente un material ópticamente claro,
configurados para contener un máximo de 1 ml de muestra,
comprendiendo cada recipiente además:
- a)
- una parte en forma de tubo capilar que está cerrada en un extremo; y
- b)
- una parte de reservorio (450C)siendo la parte en forma de embudo unida al extremo abierto de la parte en forma de tubo capilar. En el que dicha parte en forma de embudo está fabricada de plástico.
6. Varios recipientes de plástico/cristal, según
la reivindicación 5, en los que cada recipiente es capaz de formar
una excitación epifluorescente y una trayectoria de detección.
7. Varios recipientes de plástico/cristal, según
la reivindicación 6, en los que la trayectoria de detección es
enfocada en la punta de la parte en forma de tubo capilar.
8. Uso de un recipiente de plástico/cristal,
según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para PCR en Tiempo
Real, caracterizado porque dicho recipiente es para contener
una mezcla biológica fluida mientras se lleva a cabo la
amplificación de ácido nucleico.
9. Uso de un recipiente de plástico/cristal,
según la reivindicación 8, para una reacción termocíclica en la que
dicho termociclo es obtenido mediante un fluido de aire caliente y
ambiente.
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