JP2005295877A - 核酸分析方法、分析装置及び分析用ディスク - Google Patents

核酸分析方法、分析装置及び分析用ディスク Download PDF

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Abstract

【課題】 移動のための経過時間にともなって反応が進行するフロー系反応において、反応試料の状態の変化を、流路の複数の測定点において同時連続的に、且つ継続的に光学的測定を行うことができる方法又は構造体を提供する。
【解決手段】 核酸を含む分析用試料を、通過領域の温度を制御する温度制御手段によって温度が繰り返しパターンで変化する流路に流し、流路を流れる核酸を含む分析用試料の状態の変化を、流路の複数箇所で光学的検出手段によって検出する。その流路は、回転駆動されるディスク上の試料分析領域に配置することができ、その核酸分析用ディスクに対峙して設けられる光情報検出手段によって、流路内の反応試料液の情報を同時連続的、且つ継続的に検知することができる。その構造体の構成は、核酸を含む分析用試料のフロー系反応管と光学的検出手段とを具備するコンパクトな核酸分析用装置を提供することを可能にする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、核酸を含む分析用試料を、温度が繰り返しパターンで変化する流路に流し、ＰＣＲによって試料中で増幅された核酸濃度等を光学的に検出するようにした核酸分析方法、分析装置及び分析用ディスクに関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法は、試料中に微量に存在する特定のＤＮＡを選択的に増幅する方法であり、それによって増幅するＤＮＡは、化学的に単一な物質として分析し、また、利用することができる。このように単離されたＤＮＡを分析・利用する技術は科学研究や医療の分野にとどまらず、産業界全体で幅広く応用されている。
ＰＣＲ法を応用した分析方法として知られるリアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによって定量目的とするＤＮＡを選択的に増幅し、得られる増幅曲線に基づいて試料中に含まれるＤＮＡの初期量を間接的に測定する方法である。この方法は、特定配列を有するＲＮＡから相補ＤＮＡを定量的に合成する逆転写酵素による反応を伴うことによって、試料中のＲＮＡ量を測定する方法としても利用されている。
リアルタイムＰＣＲ法は、再現性のある、定量性の向上した測定法として、且つまた、煩雑な操作を必要としない簡便なＤＮＡやＲＮＡの定量法として汎用されている。その応用分野は核酸濃度測定法にとどまらず、ヒト遺伝子上の一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）として知られ、疾患に関係する遺伝子機能に個人差を与える遺伝子多型を、効率よく検出・同定する方法としても応用されている。
ＰＣＲに限らず比較的遅い反応は初歩的な方法でその進行過程を経時的に追跡することができる。即ち、反応の途中で反応容器内から一部サンプリングし、該サンプリングされた試料を逐一分析することによって該反応の進行過程を追跡する方法、あるいは、複数の反応容器に同一の反応溶液を分注し、該複数の反応容器をそれぞれ同一の反応条件下におき、所定の時間で個々の反応容器の反応を逐一止めることによって同一反応の時間系列試料を得て、該時間系列試料を各個分析することによって該反応の進行過程を追跡する方法である。しかしながら、前者の方法ではサンプリングが必要であり、後者の方法では同一容器内での分析ができず、どちらも初期から終期にいたる全反応過程を閉じた系とすることはできない。また、サンプリングされ測定された試料はその後の反応に寄与することはなく無駄となる。
リアルタイムＰＣＲ法において定量に必要なＤＮＡ増幅曲線を得るためには、反応の進行過程を経時的に追跡し反応試料液中のＤＮＡ量に関する情報を得なければならないが、その場合、定量性や、反応系の安定性、測定機構の簡易性等を向上するためには、全反応過程において反応系の同一性・同質性を保つことが好ましく、また、必要となる反応試料溶液の量も少量であることが好ましい。
したがって、上記の初歩的な方法によらずに初期から終期にいたる全反応過程を閉じた系とすることが望ましいが、こうした問題に関しては、例えば、特許文献１及び２において、ＤＮＡ増幅を蛍光でモニタリングするためのシステムと方法として、反応の進行をモニタリングしながらＰＣＲ試料の迅速なコントロールを行う装置が開示されている。
また、ＰＣＲ法の原理によれば、ＰＣＲ全反応の１過程を３段階に分けて説明することができる。すなわち、目的となる鋳型ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの解離過程、その１本鎖ＤＮＡと鋳型ＤＮＡ上に選択される特定配列に二重鎖形成能を有するオリゴヌクレオチド（プライマーＤＮＡ）との二重鎖形成過程、更に二重鎖形成したプライマーＤＮＡの末端部分を開始点とするＤＮＡ伸長反応過程である。この３段階の順次反応は、反応試料溶液をそれぞれの反応過程の至適温度にさらすことによってなされ、その温度サイクルをＰＣＲ温度サイクルと定義することもできる。ＰＣＲ温度サイクルを繰り返すことによってＤＮＡの複製的な合成が進行し、目的とするＤＮＡが指数関数的に増幅する。そこで、ＰＣＲ産物の増幅傾向特性が試料中に含まれるＤＮＡの初期量とよく相関するためには、上記ＰＣＲ温度サイクル毎に反応のプラトーに達してからの測定が好ましい。
こうした問題に関しては、例えば、特許文献１及び２の他、特許文献３において、空気を熱伝導媒体として使用する迅速熱サイクリングに生物学的試料を付すことができる装置が開示されている。
一方、特許文献４では、フロー系ＰＣＲの手法および装置について開示されている。
通常の手法のＰＣＲにおいては、反応試料液は１つの反応容器中に固定され経時的なＰＣＲ温度サイクルにさらされる。これに対し、フロー系ＰＣＲの手法においては、反応試料液は毛細管内を流路に沿って移動し、一方、その毛細管は流路に沿って繰り返し異なる温度の熱伝導作用体に物理的に接するように配置される。すなわち、毛細管が流路に沿って繰り返し異なる温度の熱伝導作用体に物理的に接することによって、限られた流速をもって毛細管内を空間的に移動する反応試料液には、移動のための経過時間にともなってＰＣＲに必要な温度サイクルが与えられる。
このように、フロー系ＰＣＲにおいては反応試料液にＰＣＲ温度サイクルを付与する手法が従来のものとは異なるため、従来ＰＣＲの装置を応用することによってはその装置の基本構造を構築することはできない。したがって、産業上安価に利用でき、且つ信頼性の高いフロー系ＰＣＲ装置の提供が期待されている。
前記フロー系ＰＣＲのように毛細管を反応管とする反応測定装置をコンパクトな構造とするためには、反応管は何らかの基板に固定されることが好ましく、また、そのような毛細管内反応系は、光学的な検出機構によって反応試料液中に含まれる物質量の変化を直接観察できる検出系とともに構成されることが望ましい。
そのような構造として、特許文献５では、ディスク状基板に複数の流路が該ディスクの中心から放射状に形成され、該ディスクを回転させることによって該放射状に形成された複数の流路を順に一つの検出系で測定するための構造を開示している。
更にまた、特許文献６では、機内に搭載された情報科学を備えた超微量液体素子工学システムにおいて液体移動を推進するために求心性加速を使用するための装置及び方法が開示されている。
特表２０００−５１２１３８号公報 特表２０００−５０９６０８号公報 特表２０００−５１１４３５号公報 特開平６−３０７７６号公報 特表２００３−１４９２５３号公報 特表２００２−５０３３３１号公報
上記に説明したとおり、従来のＰＣＲ法においては、反応試料液は１つの反応容器中に固定され、経時的に繰り返されるＰＣＲ温度サイクルにさらされる。その場合、逐次経時的に進行する反応過程において、反応の初期段階に観察される情報を反応の後期段階に至った同反応系を観察することによっては得ることはできない。そこで従来のリアルタイムＰＣＲ法においては、反応進行途中における反応試料液中のＤＮＡ量に関する情報を、その反応系の進行に同期して機能する検出系によって測定する方法がとられている。
通常、そのような検出系のためには、二重鎖DNAとの結合によって蛍光強度が増大する蛍光色素が予め反応試料溶液中に混合され、ＰＣＲの進行途中において直接的あるいは迅速な応答を示す検出用試薬として用いられているが、逆に、応答が間接的あるいは緩慢な該検出用試薬を利用することは難しい。
また、ＰＣＲ法においては、上記に説明したＰＣＲ温度サイクル毎にＤＮＡが複製されるが、その増幅効率を忠実に反映した測定を行うためには、ＰＣＲ温度サイクルで動力学的に形成される二重鎖DNA―蛍光色素複合体を好適なタイミングで検出することが重要となる。至適タイミングは、試料、鋳型ＤＮＡ量、プライマー、温度サイクル等のＰＣＲ設定条件によって、また、ＰＣＲ温度サイクル毎に異なることも考えられるが、従来のＰＣＲでは、上記のとおり、逐次経時的に進行する反応系であることから、得られる情報を反応系や検出系にフィードバックして利用することは出来ない。また、反応の進行後にいくつかの異なる性質を測定することもできない。
上記特許文献１、特許文献２、特許文献３に開示されているリアルタイムＰＣＲに関する方法および装置は従来のＰＣＲ法を利用するものであり、本質的に上記の問題を解決する技術ではない。
これに対しフロー系ＰＣＲの手法においては、上記に説明したように、反応試料液は流路を空間的に移動し、移動のための経過時間にともなってＰＣＲ温度サイクルが与えられる。この場合、流路の始点から終点に至る各々異なる距離に位置する反応試料液は、その距離に対応して、ＰＣＲ全反応過程の初期から後期に至る各々異なる反応段階の反応試料液となっている。したがって、定常的に移動するＰＣＲ反応試料液を複数箇所において観察することで、流路内で進行するＰＣＲ反応過程を一時に観察することができる。
リアルタイムＰＣＲにこのような特徴のあるフロー系ＰＣＲの手法を組み入れたフロー系リアルタイムＰＣＲを利用することで、反応進行途中における反応試料液中のＤＮＡ量に関する情報をその反応系の進行に同期して機能する検出系によって測定する必要がなくなり、上記に説明したような不利益を解消することが出来る。
また、測定装置として使用する際に、反応系と検出系およびそれらを連結する制御系の何れかの機能が反応中に不具合を生じた場合、操作は中断せざるを得ず、また検出系に不具合が生じたまま温度サイクルが進行してしまった場合、その間の反応に関する情報はもはや失われているため取り戻すことは出来ない。また、一般的に検出系は時間と共に出力や感度が変化するため、装置の立ち上がり時は出力や感度の変化が顕著であるが、装置が安定してからも出力や感度の変動が全くないとは言えず、出力や感度のドリフト現象は往々にして起こりうる。
フロー系リアルタイムＰＣＲ法によれば、比較すべき測定を同時連続的に行うことが出来ることから、上記のような装置系のトラブルに起因する測定時間に関する無駄を省くことが出来る。
このようにフロー系ＰＣＲ法の原理をリアルタイムＰＣＲに利用する利点は大きいが、その技術に関する報告は少なく、特に、流路を移動する反応試料液中のＤＮＡ量に関する情報を、流路の複数箇所の正確な位置において効率的に測定する技術が望まれるが、そのための従来技術は乏しい。
上記特許文献４では、毛細管内での反応の進行を、紫外線照射等によって検出することができると記述されているが、毛細管のどの箇所で測定するのか、一点箇所を測定するのか複数箇所を測定するのかなど一切明記されておらず、反応の何を測定しようとしてどのように解決するのかが開示されていない。また、上記特許文献５では、複数の流路を一つの検出系によって検出する方法について記述されているが、同一の流路を複数箇所で測定する技術は開示されていない。また、フロー系ＰＣＲ法に適応するための構造にはなっていない。
また、フロー系反応のための装置では、定常的な反応試料液の流れを生み出すための送液系が不可欠であるが、測定装置のコンパクト化のためには送液ポンプなどの装置を用いないほうが有利である。
上記特許文献６では、回転するディスク基板上に毛細管を配し、液体移動を推進するために求心性加速を使用する超微量液体素子工学システムに関する技術が開示されている。しかしながら、求心性加速は主に反応液溜めへの液体移動を推進するために利用されており、反応試料液の定常的な流れを生み出すために求心性加速を利用する技術は開示されていない。また、フロー系反応の流路に沿って光学的測定を行う方法も記述されておらず、求心性加速を利用したフロー系ＰＣＲに適応するための構造は開示されていない。また、熱源は基板上に配されている。
したがって、本発明の目的は、移動のための経過時間にともなって反応が進行するフロー系反応において、反応試料液の状態の変化を、流路の複数の測定点において同時連続的に、且つ継続的に光学的測定を行うことができる方法又は構造体を提供し、反応の進行過程を追跡する分析作業を、より簡易にかつ短時間で行えるようにした核酸分析方法、分析装置及び分析用ディスクを提供することにある。
上記目的を達成するため、本発明の核酸分析方法は、核酸を含む分析用試料を、温度が繰り返しパターンで変化する流路に流し、前記流路の複数箇所で光学的な検出を行うことを特徴とする。
本発明の核酸分析方法によれば、限られた流速をもって流路内を移動する核酸を含む分析用試料には、移動のための経過時間にともなって温度変化が与えられ、反応試料溶液に必要な温度サイクルを付与することができる。
更に、本発明の核酸分析方法によれば、前記流路内において核酸を含む分析用試料によるＰＣＲ反応を行う際に、前記流路の複数箇所で光学的な検出を行うことにより、例えば流路の始めの部分はＰＣＲのサイクル数が少ない状態での増幅状態を示し、流路の終わりの部分はＰＣＲのサイクル数が多い状態での増幅状態を示しているので、これら各箇所の検出を一度に行い、これらの検出結果を、一のサンプルによるＰＣＲの経時的な過程での検出結果とみなすことにより、１つのサンプルでＤＮＡの増幅過程をほぼ同時に検出することが可能となる。
その結果、リアルタイムＰＣＲのように増幅傾向を正確に求める必要がある場合でも、反応の経過に沿って経時的に測定する必要がなく、多数のサンプリングも必要なくなる。また、検出を同時に行えるので、測定条件も一定となり、測定精度を高めることができる。更に、各サイクルでの測定点を一定にすることにより、プラトーに達していない状態でも、各サイクルでの条件を一定にすることができ、増幅傾向を正確に求めることができる。勿論、各サイクルでのプラトーに達する位置を予め求めておくことにより、各サイクルでの測定点をプラトーに達した状態にして測定することも可能であり、それによって増幅傾向をより正確に求めることができる。また、前記検出用試薬として応答が緩慢な試薬を用いてもよく、その場合は、ＰＣＲが終了し、更に該検出用試薬の応答時間が経過した後に光学的測定することでプラトー状態の結果を得ることができる。
本発明の分析方法においては、前記核酸を含む分析用試料は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含むものであることが好ましく、必要に応じて鋳型ＤＮＡ、検体を添加することもできる。これによれば、前記流路内を移動する該試料が所定の繰り返しパターンで温度が変化する流路を通過することによって、解離過程のための高温状態、二重鎖形成過程及びＤＮＡ伸長反応過程に好適な低温状態と、ＰＣＲの温度サイクルが順次与えられる。更に、微小な毛細管をＰＣＲの反応管とすることで、熱伝導作用体と反応液の熱容量比を十分大きくし、反応液に迅速な温度変化をもたらすことができる。
また、本発明の分析方法においては、上記流路の複数箇所で生成するＰＣＲ産物を光学的に検出することにより、移動の経過距離にともなって順次与えられる温度サイクル毎のＤＮＡ量に関する情報を得ることができる。これによって、ＰＣＲによって合成されるＤＮＡの増幅曲線を求めることができ、また、既知量の鋳型ＤＮＡを用いて作成した対照検量線に基づいて、試料中のＤＮＡ初期濃度を求めることができる。
また、前記光学的検出は、前記流路の検出すべき箇所に光を照射し、照射された光による透過光、反射光、又は発光を検出することにより行うことが好ましい。これによって、比較的簡易な手段で迅速な検出が可能である。
また、前記複数箇所での検出を、前記分析用試料が前記温度の高温でない部分を通る箇所で行うことが好ましい。これによれば、例えばインターカレーター等を用いた高温を至適温度としない検出も可能である。
更に、前記流路は、少なくとも部分的にジグザグパターンを有し、このジグザグパターンの折り返し部から次の折り返し部に至る流路が、異なる温度領域を通過するように形成されていることが好ましい。これによれば、所定の繰り返しパターンで前記核酸を含む分析用試料の温度が変化するように通過領域を形成することが容易になされる。
更に、前記流路は、回転駆動されるディスク上に形成され、このディスク上に高温領域と低温領域とが同心状に形成されており、前期ジグザグパターンは、折り返し部から次の折り返し部に至る流路が、同心状に形成された前記高温領域と前記低温領域とを通過すように形成されていることが好ましい。これによれば、ディスクの回転による遠心力を利用して流路に試料を流すことが可能となり、しかも該試料を低温領域と高温領域とを流路に沿って繰り返し通過させることが容易になされる。
更にまた、前記ディスクに、情報記録領域と、試料分析領域とを設け、前記情報記録領域を利用して、情報の読み取り又は書き込みを行い、前記試料分析領域には、前記流路を設けて光学的検出を行うことが好ましい。これによれば、情報記録領域に記載された情報を読み出して、分析条件等を制御することができ、また、分析結果等を情報記録領域に記録することができる。
更にまた、前記情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込みと、前記試料分析領域に対する光学的検出とを、前記ディスクを介して対向する方向からそれぞれ行うことが好ましい。これによれば、情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込み手段と、試料分析領域に対する光学的検出手段とを、ディスクを挟んで反対側に設置できるので、装置の構成が容易であり、しかも情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込み手段として既存の光情報記録媒体のドライブ構造を採用できるので、製造コストを低減することができる。
一方、本発明の核酸分析装置は、前記核酸を含む分析用試料を流路に流す際、温度が繰り返しパターンで変化するように通過領域の温度を制御する温度制御手段と、前記流路を流れる前記核酸を含む分析用試料を光学的に検出する光検出手段とを備え、前記光検出手段による検出を前記流路の複数箇所で行うように構成したことを特徴とする。
本発明の核酸分析装置によれば、核酸を含む分析用試料を前記流路に流し、前記温度制御手段によって形成された温度制御領域を通過させ、前記流路の複数箇所で該流路を流れる核酸を含む分析用試料の分析を行うことができる。
本発明の核酸分析装置においては、前記光検出手段は、前記流路の検出すべき箇所に光を照射する出射手段と、照射された光による透過光、反射光、又は発光を検出する受光手段とを有していることが好ましい。これによれば、比較的簡易な手段で迅速な検出が可能である。
また、前記複数箇所での検出を、前記核酸を含む分析用試料が前記温度の高温でない部分を通る箇所で行うように構成することが好ましい。これによれば、例えばインターカレーター等を用いた高温を至適温度としない検出も可能である。
更に、前記流路は、少なくとも部分的にジグザグパターンを有し、前記温度制御手段により、このジグザグパターンの折り返し部から次の折り返し部に至る流路が、前記温度制御手段により形成された温度制御領域を通過するように構成されていることが好ましい。これによれば、所定の繰り返しパターンで温度が変化するように通過領域を形成することが容易になされる。
更に、前記流路は、回転駆動されるディスク上に形成され、このディスク上に高温領域と低温領域とが同心状に形成されており、前期ジグザグパターンは、折り返し部から次の折り返し部に至る流路が、同心状に形成された前記高温領域と前記低温領域とを通過するように形成されていることが好ましい。これによれば、ディスクの回転による遠心力を利用して流路に試料を流すことが可能となり、しかも低温領域と高温領域とを流路に沿って繰り返し形成することが容易になされる。
更にまた、前記ディスクには、情報記録領域と、試料分析領域とが設けられており、前記情報記録領域には、情報の読み取り又は書き込みを行う、光情報記録媒体の読み取り又は書き込み手段が対置され、前記試料分析領域には、前記流路の所定箇所に光を照射し、その透過光、反射光、又は発光を検出する前記光検出手段が対置されていることが好ましい。これによれば、情報記録領域に記載された情報を読み出して、分析条件等を制御することができ、また、分析結果を情報記録領域に記録することができる。
更にまた、前記情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込みと、前記試料分析領域に対する光検出とを、前記ディスクを介して対向して行うように構成されていることが好ましい。これによれば、装置の構成が容易であり、しかも情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込み手段として既存の光情報記録媒体のドライブ構造を採用できるので、製造コストを低減することができる。
また、本発明による核酸分析用ディスクは、回転駆動されるディスク上に、情報の読み取り又は書き込みを行う情報記録領域と、核酸を含む分析用試料を流す流路が形成された試料分析領域とが設けられた核酸分析用ディスクであって、前記情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込み方向と、前記試料分析領域に対する光検出方向とが、前記ディスクを挟んで対峙するように構成したことを特徴とする。
本発明の核酸分析用ディスクによれば、情報記録領域に記載された情報を読み出して、分析条件等を制御することができ、また、分析結果を情報記録領域に記録することができる。また、前記情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込み方向と、前記試料分析領域に対する光検出方向とが、前記ディスクを挟んで反対側になるように構成したことにより、分析装置の構成が容易となる。
本発明の核酸分析用ディスクにおいては、前記流路は、前記ディスクの周方向に沿って進行するジグザグパターンを少なくとも部分的に有し、ディスク外部に配置される温度制御手段により、前記ジグザグパターンの内周側に位置する折り返し部の列又は外周側に位置する折り返し部の列のいずれか一方に沿って高温領域が形成され、いずれか他方に沿って低温領域が形成されるように構成されていることが好ましい。これによれば、ディスクの回転による遠心力を利用して流路に試料を流すことが可能となり、しかも低温領域と高温領域とを流路に沿って繰り返し形成することが容易になされる。
また、前記流路の一部に供給用液溜め部と、受容用液溜め部とがそれぞれ形成されており、前記供給用液溜め部は、前記受容用液溜め部及び前記ジグザグパターンを有する流路よりも内周側に位置していることが好ましい。これによれば、ディスクを回転させたときの遠心力によって、注入口から前記供給部用液溜め部に注入した試料を流路に沿って流し、前記ジグザグパターンを有する流路を通過して前記受容用液溜め部に流入させることができる。
また、前記情報記録領域は、光情報記録媒体の記録構造を有していることが好ましい。これによれば、情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込み手段として既存の光情報記録媒体のドライブ構造を採用できるので、製造コストを低減することができる。
更に、前記情報記録領域は、記録層と、その背面側に位置する反射層とを有し、前記試料分析領域は、前記流路と、その背面側に位置する反射層とを有しており、対応する反射層に対して、前記記録層と、前記流路とが反対側に位置していることが好ましい。これによれば、読み取り又は書き込み手段と、前記光検出手段とからそれぞれ出射される光を対応する反射層によって反射し、それぞれの手段で受光することができるので、装置の構成を容易にすることができる。
更に、前記情報記録領域が内周側に設けられ、前記試料分析領域が外周側に設けられていることが好ましい。これによれば、現行の光情報記録媒体のドライブをそのまま使用することができる。
更に、前記情報記録領域のプリグルーブ形成面と同じ平面上に前記流路の凹部が形成されており、該凹部の開口部がシーリング部材で封止されて前記流路が形成されていることが好ましい。これによれば、ディスクにプリグルーブを形成する際に、流路の凹部を同時に形成することができるので、製造工程が簡略化される。
あるいは、前記ディスクは、前記情報記録領域のプリグルーブと、記録層と、反射層とが片面に形成された基板と、この基板の前記反射層形成面上に、直接又は保護層を介して形成されたシーリング部材とを有し、このシーリング部材の内面に前記流路の凹部が形成されていることが好ましい。これによれば、ディスク基板の形状が同じでも、シーリング部材の形状を変えるだけで、流路の形状を変更することができるので、用途に応じて多種類の分析用ディスクを作り易くなる。
あるいは、前記試料分析領域には、前記光検出手段によって読み取り可能な情報を記載したプレピット又はプリグルーブが設けられていることが好ましい。これによれば、プレピット又はプリグルーブを光検出手段等により読み取ることにより、例えば試料投入口や分析箇所の位置合わせや、複数の流路を設けた場合の流路番号の確認や、ディスク回転速度の検出などを行うことができる。
本発明によれば、フロー系反応の流路が反応履歴を保存する役割を果たし、流路内に保存された反応履歴を同時連続的、且つ継続的に光学的検出系でスキャンすることによって一時に測定することが出来る。したがって、反応系の進行に同期して機能する検出系によって測定する方法をとる必要がなく、複数回の光学的測定が可能となり精度の向上あるいは光学条件を変更した測定が可能となる。
本発明を核酸分析に利用すれば、ＰＣＲの動力学解析や反応開始時の鋳型ＤＮＡの濃度の定量を簡略化できる。即ち、光学的測定の開始から終了までの期間が短縮されることにより、光学的検出系の安定性要求が緩和される。更に、一つの光学的検出系で複数の条件の光学的測定を実行することが出来る。更にまた、ＰＣＲの進行に対する応答が緩慢な検出用試薬を用いることが可能となり、検出用試薬、光学的測定の選択がより柔軟になる。
また、本発明の核酸分析用ディスクを利用した場合には、基板の回転中心と中心を同じくする円の円周上に一つの連続する流路上の複数の測定点があることにより、基板の回転によって該光学的検出系を固定したまま一つの連続する流路上の複数の測定点を連続的に測定できる。更に、基板回転により光学的検出系を固定した定点観察が可能になる。
したがって本発明によれば、現行の光情報記録媒体のドライブや検出系の構造の一部をそのまま利用して、前記方法を実施するための核酸分析装置や核酸分析用ディスクの構造とすることができる。
本発明における核酸を含む分析用試料には一般的な核酸分析用試薬が混合されていればよい。よって、上記ＰＣＲによる核酸分析のためには、通常使用されるＰＣＲ用試薬が含まれていればよく、具体的には、増幅目的となる鋳型ＤＮＡ、至適温度が高温であることを特徴とし鋳型に相補的なＤＮＡを合成する酵素である熱抵抗性ＤＮＡポリメラーゼ、上記鋳型ＤＮＡ上に選択される２ヶ所の特定配列の各々に二重鎖形成能を有する２種類のプライマーＤＮＡ，及びＤＮＡポリメラーゼの基質となるヌクレオチド、が水溶液中で混合される。
また、本発明における核酸分析方法によってリアルタイムＰＣＲを行う場合には、核酸を含む分析用試料として更に、二重鎖DNAとの結合によって蛍光強度が増大する色素（蛍光色素）や、色素・クエンチャーが近傍に配置されDNAの伸長反応によって色素・クエンチャーの解離が起こるよう設計された核酸プローブやドナー色素とアクセプター色素がそれぞれ付加された二種類の核酸プローブが隣接する領域にハイブリダイゼーションすることによって色素間で蛍光共鳴エネルギー移動現象を起こすように設計された核酸プローブを含めることができる。核酸を含む分析用試料に混合される蛍光色素や核酸プローブには特に制限はなく、用途に合わせて選択することができる。例えば、蛍光色素としては、SYBR Green I（Molecular Probes）が好ましく例示できる。また、上記核酸プローブとしては、任意の配列を有するTaqManプローブ（Roche）、Hybridization Probes（Roche）等が好ましく例示できる。 本発明における核酸分析方法による定量の目的となる鋳型ＤＮＡの由来や塩基配列には特に制限はなく、ヒトの血液、尿、唾液、精液、乳汁などから採取されたものでもよく、また、ヒト以外の生物由来のものであってもよい。
本発明における核酸を含む分析用試料に混合される熱抵抗性DNAポリメラーゼには特に制限はなく、用途に合わせて様々な熱抵抗性DNAポリメラーゼを用いることができる。例えば増幅されるDNAが３k塩基未満の場合はスタンダードなpol I型Taq DNAポリメラーゼとしてTaKaRa Taq（TaKaRa）、Gene Taq（NIPPONGENE）などが好ましい。また、正確なPCRを行う場合にはα型DNAポリメラーゼのKOD plus、Pfu DNA ポリメラーゼ、Pfu Turbo DNA ポリメラーゼ（TOYOBO）、PLATINUM Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）、Pyrobest DNAポリメラーゼ（TaKaRa）、ProofStart DNAポリメラーゼ（Qiagen）、Pwo DNAポリメラーゼ（Roche）、Advantage HF2（Clontech）などが好ましく例示できる。更にまた、２０ｋ塩基を超える長いDNAを増幅する場合には、Taq DNAポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱抵抗性DNAポリメラーゼを一緒に用いたりバッファーをGCリッチな配列の増幅に至適化したりすることによって長いDNAの増幅を可能にしている製品を用いることができ、KOD Dash、EXL DNAポリメラーゼ（TOYOBO）、Expand 20kb PCR System（Roche）、PLATINUM Taq DNAポリメラーゼ High Fidelity、Elongase Enzyme Mix、ThermalAce DNAポリメラーゼ（Invitrogen）、Advantage Genomic and -GC Genomic（Clontech）、TaKaRa LA Taq with GC buffer（TaKaRa）等が好ましく例示できる。
ＤＮＡの光検出方法としては、下記のような方法が採用できる。
例１：二重鎖と結合することによって蛍光が増大する色素を用いる方法
PCR試薬は例えばロシュ・ダイアグノスティクス社のＰＣＲキット（商品名「LC DNA Master SYBR Green Iキット」）を用いることができる。該キットはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、ｄＮＴＰが含まれ、また検出試薬としＳＹＢＲＧｒｅｅｎIが含まれている。該キットは１０倍濃縮になっており、例えばＰＣＲ溶液の全量が２０μlのときは２μl加えればよい。鋳型DNAは、例えばＰＣＲ溶液の全量が２０μlのとき１０〜１００ng含まれていれば良く、プライマーＤＮＡは終濃度が０．１〜１μMとなるように調整すればよい。またプライマーＤＮＡは、ＰＣＲによる鋳型ＤＮＡ内の増幅領域が５０〜１０００塩基の間になるように設計されていればよい。さらに該キットの付属のMgCl2ストックを用いてMgCl2の濃度を１〜５mMに調整し、最終的に溶液の全量を純水で調整すればよい。
前記のように調整された反応溶液を流路へ送液手段を用いて送液する。流路と温度設定は、Koppらの文献（Science 280,1046-1048(1998)）に示されているような形式が好ましい。送液の最適流速は流路の内径等によって異なる場合があるが１つの温度サイクルを１０秒〜1分かけて通過することが好ましい。
前記高温領域の設定温度は、鋳型ＤＮＡの長さや配列によって異なるが一般的に数百塩基の鋳型ＤＮＡの場合９０〜９９℃、好ましくは９２〜９７℃となるように加熱すればよい。一方、前記二つの低温領域の内、一つの低温領域Ｂ１の設定温度は、プライマーＤＮＡとの解離温度によって異なり１５〜３０塩基のプライマーＤＮＡを用いた場合５５〜７０℃である。もう一つの低温領域Ｂ２の設定温度はポリメラーゼの至適温度である７０℃〜７５℃に設定されていることが好ましい。本発明においては、前記高温領域は、流路内を移動する反応液を上記のＤＮＡの解離温度以上に加熱できるように、該流路の外部に加熱手段を設けることによって形成することが好ましく、前記低温領域Ｂ１、Ｂ２は、流路内を移動する反応液を上記のＤＮＡの解離温度以下に制御できるように、該流路の外部に温度制御手段を設けることによって形成することが好ましい。そして、各設定温度の領域を通過する時間は、その比が高温領域：低温領域で１：２〜１：３になる事が好ましく、低温領域内でさらに二つの温度設定領域Ｂ１、Ｂ２の比Ｂ１：Ｂ２が１：２〜１：３になることが好ましい。
上記条件によりPCRを実行した後、蛍光測定により検出を行うことができる。励起波長はＳＹＢＲＧｒｅｅｎIが吸収を有する波長が好ましく、LED（４７０nm）を用いても良いし白色光源からプリズム等を用いて取り出しても良く、また検出波長は５１０〜５５０nmが好ましい。光源としては蛍光色素を選択することによってLEDだけではなく、青紫色ＬＤ（405nm）、赤色ＬＤ（６３５ｎｍ）等も使用することができる。
前記基板回転機構により基板を回転させながら、流路上の測定点に励起光を照射し、放射される蛍光を検出手段により検出することによって、流路上にあるPCRの反応履歴を測定できる。流路上の測定点は１サイクルの中の低温領域であれば何処でも良い。ただし測定は全サイクル終了後、送液を停止してから少なくとも反応溶液が高温領域-低温領域の1サイクルを通過するのと同じ時間インキュベートしてから行うことが好ましい。
例２：TaqMan法
試薬は、ＰＣＲ用キット（商品名「TaqMan Universal PCR Master MixHybridization Probesキット」；ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用い、検出試薬にはTaqMan Probeを用い、試薬の調整はキットに付属のプロトコールに従って行うことができる。反応条件は例１と同様である。検出は蛍光測定によって行うことができ、具体的には例1と同様の手法を用いて検出することができる。また、本例では配列と色素が異なるいくつかのTaqMan Probesを用いることによって複数の反応を同時に進行させ、検出することができる。TaqMan Probesに結合させる色素は、公知の例えばFAM、Cy3、Texas Red、Cy5から選ぶことができ、励起波長はそれぞれ４５０〜４９５、５００〜５５０、５６５〜５９０、６３０〜６５０nm、検出波長は５１０〜５２７、５６５〜５９０，６０６〜６５０、６７０〜７５０nmである。励起光はそれぞれの波長に対応するLEDを用いても良いし、白色光源からプリズム等を用いて取り出しても良い。励起、検出波長が異なる複数の測定を行う場合は、前記基板回転機構により基板を回転しながら、流路上の測定点に励起光を照射し、放射される蛍光を検出手段により検出する方法を、検出系の設定を変えながら数回行うことができる。
本発明の核酸分析方法においては、上記核酸を含む分析用試料を、高温領域と低温領域とを交互に繰り返し通過する流路に流す。この流路としては、例えば図１（ａ）に示すように、ジグザグ形状に折り返す流路１０と、この流路１０の一方の折り返し部１０ａの列に沿って設けた高温領域Ａと、他方の折り返し部１０ｂの列に沿って設けた低温領域Ｂとを設けたものが採用できる。ただし、図１（ｂ）に示すように、例えば直線状に伸びる流路１０に高温領域Ａと低温領域Ｂとを交互に形成することもできる。
この場合、流路の高温領域Ａは、９０〜９９℃に設定されることが好ましい。低温領域Ｂは、５０〜８０℃に設定されることが好ましく、更には５５〜６０℃と、６５℃〜７５℃との二つの温度に設定されることが好ましい。
流路は、更に３つ又は４つ以上の温度領域に分けられていてもよい。
更にまた、流路は時間的に温度が昇降する領域を通過することによって温度サイクルを受けてもよい。
前記核酸を含む分析用試料を前記流路に通すことにより、高温領域においては、二重鎖ＤＮＡの解離が起こり、低温領域においては、一本鎖の鋳型ＤＮＡとプライマーの結合及び鋳型ＤＮＡとプライマーの複合体のプライマー３’末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起こる。
そして、上記流路の複数箇所、例えば図２における各サイクルの低温領域Ｂを通るラインＬ１に沿って、光検出手段２０によって検出することにより、上記流路内にある上記核酸を含む分析用試料の反応進行の過程を連続して検出することができる。
また、図２における上記流路の高温領域Ａから低温領域Ｂ、又は低温領域Ｂから高温領域Ａへ移動するラインＬ２に沿って、所定間隔で複数箇所を光検出手段２０によって検出してもよく、その場合には、流路内の上記核酸を含む分析用試料が高温になると共に、ＤＮＡが解離する様子を検出することができ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの温度プロファイルを調べることができる。
光学的検出系は、一般的な吸光光度計、蛍光光度計と同様の光学系による検出が好ましく、さらにレーザーピックアップによる検出も例示できる。光学系の光源としては、キセノンランプやハロゲンランプ、および半導体レーザーが例示できる。また光学系の受光器としては光電子増倍管やCCD、フォトダイオードなどが例示できる。分光手段は、プリズムやフィルター、グレーティング、スリット、ビームスプリッタ、レンズ、ミラー等で構成されている。吸光度の測定は、測定点に光を通過させても良いし、反射させても良い。蛍光の検出は任意の効率よい場所に受光器を配せば良い。濁度の測定は基本的に吸光度の測定と同じである。
なお、試料が、１サイクルの高温領域と低温領域とを通過する時間は、各サイクルにおける反応がプラトーに達するまでなされるように調整することが好ましい。この調整は、試料の流速や、流路の長さを変えることによって行うことができる。また、各サイクルでの反応状態をモニターして、上記試料の流速を制御してもよい。
光学的検出系の下を流路が通過することで複数点の測定を可能にするために、該流路を形成している毛細管や基板を移動させる方法と光学的検出系を移動させる方法が挙げられ、いずれかもしくは両方の方法を用いてもよい。
該流路の移動機構は、モーターとスクリューあるいはモーターとベルトを用いたごく一般的な搬送手段が例示できる。更に好ましくは流路を回転させることによって該複数点の測定を可能にすることができ、回転機構としてはステッピングモーターや、光ディスクドライブに用いられているスピンドルサーボ機構が例示できる。光ディスクドライブのスピンドルサーボ機構を用いる場合には、サーボをかけるためのトラッキングが形成された基板を用いる必要がある。該トラッキングが形成された基板は、流路が形成された基板と同一でもよいし、別でも良い。光学的検出系は一般的には移動させにくいが、非常に小さい場合には一般的な搬送機構で移動が可能であり、小さい光学的検出系としては、光ディスクドライブのレーザーピックアップが好ましく例示できる。
本発明の核酸分析方法は、例えば、環境検査、食物検査、農業検査、法医学、個人の識別検査、動物識別検査のような用途に利用できる。
図３は、本発明の核酸分析方法を実施するための分析装置の一例を示す概略構成図である。同図（ａ）に示すように、この分析装置３０は、回転手段４０と、この回転手段４０によって回転駆動されるディスク５０と、このディスク５０の上方に配置されて、高温領域及び低温領域を形成するための温度制御手段７０と、前記ディスク５０の下方の内周寄りに配置された光情報記録媒体の読み取り又は書き込み手段９０と、前記ディスク５０の上方の外周寄りに配置された光検出手段２０とで構成されている。
同図（ｂ）に示すように、温度制御手段７０は、高温加熱部７１と、低温加熱部７２とを有している。高温加熱部７１と、低温加熱部７２とは、高温加熱部７１が内周、低温加熱部７２が外周に位置するように同心状に配置されている。温度制御手段７０としては、例えば電熱線、ペルチェ素子、ランプヒーター等が好ましく用いられる。
図４には、ディスク５０の一例が示されている。このディスク５０は、中心に回転軸の挿通孔５１を有し、内周側に情報記録領域５２、外周側に試料分析領域５３が設けられている。試料分析領域５３には、複数の流路１０が形成されている。この実施形態では、合計１５個の流路１０が放射状に配列されて形成されており、各流路にＩＤ番号１〜１５が付されていて、このＩＤ番号１〜１５を視認して、それぞれの流路に対応して各試料を注入できるようになっている。なお、光検出手段２０が上記複数の流路のＩＤ番号を識別できるようにするため、ＩＤ番号１５との流路１０と、ＩＤ番号１の流路１０とは、他の流路同士の間隔よりも離されている。また、ディスク５０には、ディスクの識別番号５４が付されている。
図５に示すように、各流路１０は、その一端に設けられた試料の注入口１１、供給用液溜め部１２、ディスク５０の半径方向に沿って、内側と外側を複数回往復するジグザグ部１３、受容用液溜め部１４、他端に設けられた空気出口１５を有している。注入口１１及び供給用液溜め部１２は、受容用液溜め部１４よりも内周側に位置している。なお、図５では前記空気出口１５を、試料の注入口１１と同一円周上に設けたが、注入口１１より内側にあってもよい。
そして、ディスク５０が回転すると、注入口１１から供給用液溜め部１２に注入された試料が、遠心力の作用で流路１０のジグザグ部１３を流れ、受容用液溜め部１４に流れ込むようになっている。その流速は、ディスク５０の回転速度を制御したり、流路１０の形状を変形することによって調整することができる。例えば、流路１０のジグザグ部１３の折り返し部分の断面積を他の部分よりも広く設定することでスムーズな流れを実現したり、また一部を他の部分よりも狭くして流れ始めるスレッショールドを設けることもできる。そして、前記高温領域Ａ、低温領域Ｂは、上記ジグザグ部１３の流路を横切って、基板の回転中心に対して同心円状に形成されている。
図６に示すように、ディスク５０は、ポリカーボネート等の透明な基板５４を有している。この基板５４上の情報記録領域５２にはプリグルーブ５５が形成され、試料分析領域５３には流路１０の凹部５６が形成される。そして、プリグルーブ５５及び凹部５６を形成した基板５４表面に、有機色素を含む感光色素膜からなる光吸収層５７を形成する。更に、この光吸収層５７上に、Ａｕ等の金属膜からなる反射層５８を形成する。そして、情報記録領域５２の全面と、試料分析領域５３の凹部５６以外の部分に、紫外線硬化性樹脂等からなるトップコート層５９を形成する。最後に、ポリエチレンフィルム等からなるシーリング部材６０を被覆して、凹部５６を閉塞し、流路１０を形成する。
上記ディスク５０においては、情報記録領域５２が光情報記録媒体の記録構造を有し、ディスク５０の下方に配置された読み取り又は書き込み手段９０によって、情報の読み取り、書き込みが行われる。また、試料分析領域５３の流路１０に流される試料が光検出手段２０によって検出される。このように、情報記録領域５２の読み取り、書き込み方向と、試料分析領域５３の光検出方向とが、反射層５８を挟んで反対側になっているので、読み取り又は書き込み手段９０及び光検出手段２０の配置が容易であり、読み取り又は書き込み手段９０として、公知の光情報記録媒体のドライブ構造を利用できるので、製造コストを低減することができる。
図７には、光検出手段２０の各種の例が示されている。同図（ａ）の光検出手段２０ａでは、流路１０の測定点１６に対して、ディスク５０の片面から光源２１の光が分光手段２２を介して照射され、ディスク５０の反対面に透過した光を、分光手段２３を介して検出器２４で受光する構造をなしている。
同図（ｂ）の光検出手段２０ｂでは、ディスク５０の片面に配置された光源２１から、分光手段２２、ビームスプリッタ２５を通して、流路１０の測定点１６に光が照射され、流路１０の背面側に形成された反射層５８によって反射された光を、ビームスプリッタ２５によって直角方向に取出し、分光手段２３を通して検出器２４で受光する構造をなしている。
同図（ｃ）の光検出手段２０ｃでは、ディスク５０の片面に配置された光源２１から、分光手段２２を通して、流路１０の測定点１６に光が照射され、この光を受けて試料中の特定成分が発光し、この発光を分光手段２３を通して、検出器２４で受光する構造をなしている。
図８（a）には、流路の検出手段９０の一例が示されている。この流路の検出手段９０では、レーザー駆動回路 (図示せず)によって635nmの波長のレーザー光源９１からレーザー光を出射し、このレーザー光を、マルチレンズ９２、ハーフミラー９３、コリメータ (図示せず)を通し、更に対物レンズ９５を通して、流路 (図示せず)の測定点１６に照射する。流路には分析用試料溶液に蛍光色素Cy5を修飾したTaqManプローブが添加されているため、鋳型DNAが存在すると、635nmのレーザー光により670-750nmの蛍光が発生する。そして、流路の背面側に設けられた反射層 (図示せず)により反射した635nmのオリジナルのレーザー光と流路で発生した670-750nmの蛍光を、対物レンズ９５、コリメータ (図示せず)を通してハーフミラー９３に導き、ハーフミラー９３で９０度反射させた後、回折格子１０１で位相がそろっている635nmのオリジナルのレーザービームを複数に分岐し、これを集光レンズ９６により光検出素子９７に集光させる。
図８（b）には、光検出素子９７上に結像しているメインビーム１０２及び回折格子１０１で回折されて作られた回折ビーム１０３の像が示されている。メインビームの像にはオリジナルの635nmのレーザー光と670-750nmの蛍光の混合光が結像している。一方の回折ビームにはオリジナルの635nmのレーザー光のみが結像している。メインビームが結像する位置には650nm以下を透過させないカットオフフィルター１０４が光検出素子の前に置かれているため、メインビームが結像する点では、蛍光のみの光量を検出することができる。
そして、光検出素子９７で得られたメインビーム・回折ビームの光量を電気信号に変換し、増幅回路 (図示せず)により増幅した後、メインビームからの信号で蛍光量を測定し、回折ビームからの信号を活用してフォーカス・トラッキング等のサーボを行う。
上記のような核酸分析装置３０によれば、ディスク５０の各流路１０の注入口１１に核酸を含む分析用試料を注入し、供給用液溜め部１２に貯留させた後、回転手段４０によりディスク５０を回転させると、供給用液溜め部１２から流路１０に試料が流され、試料はジグザグ部１３を通って流れていく。このとき、温度制御手段７０によって形成された高温領域Ａと、低温領域Ｂとを、試料は交互に通過することになり、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅がなされる。
そして、最初に流路１０に流入した試料が受容用液溜め部１４に到達したら、光検出手段２０により、ディスク５０の周縁のラインＣ（図４参照）に沿ってＤＮＡの検出を行う。光検出手段２０は、高温領域Ａと低温領域Ｂとを通過する各サイクル毎に、低温領域Ｂの所定箇所におけるＤＮＡの検出を行い、その値に基いて図示しないコンピュータが各測定点でのＤＮＡの濃度を求める。
その結果、高温領域Ａと低温領域Ｂとを通過するサイクルを重ねたときのＤＮＡの増幅曲線が求められる。この増幅曲線は、検出対象となっているＤＮＡの試料中の初期濃度が高いほど曲線の立ち上がりが早くなるので、上記増幅曲線を解析することによって、試料中の対象ＤＮＡの初期濃度を求めることができ、対象ＤＮＡの定量が可能となる。
なお、読み取り又は書き込み手段９０は、情報記録領域５２に記載された情報を読み取って、試料の注入口１１の位置を正確に割り出したり、光検出手段２０による検出値と対応する流路１０のＩＤ番号とを関連させたり、流路１０の各測定点における測定値をモニターして、ディスク５０の最適な回転数を計算して、回転手段４０に制御信号を送ったりするのに役立つ。また、各流路１０の試料毎にＤＮＡの定量が終了したら、その結果を情報記録領域５２に書き込んだりすることができる。
また、この分析装置によれば、試料が流路１０を流れて受容用液溜め部１４に流入した時点で検出を行うことにより、各サイクル毎のＤＮＡ濃度を一度に測定することができるので、測定作業を効率的に行うことができる。
図９には、本発明で用いられる核酸分析用ディスクの他の例が示されている。
このディスク５０ａは、ポリカーボネート等の透明な基板５４を有している。この基板５４上の情報記録領域５２にはプリグルーブ５５が形成され、試料分析領域５３には流路１０の凹部５６が形成される。そして、プリグルーブ５５及び凹部５６を形成した基板５４表面に、有機色素を含む感光色素膜からなる光吸収層５７を形成する。更に、情報記録領域５２においては、この光吸収層５７上に、Ａｕ等の金属膜からなる反射層５８を形成し、この反射層５８上にトップコート層５９を形成する。一方、試料分析領域５３においては、ポリエチレンフィルム等からなるシーリング部材６０を被覆して、凹部５６を閉塞し、流路１０を形成する。更に、試料分析領域５３の基板５４の反対面側には、反射層５８ａを形成する。
上記ディスク５０ａにおいては、情報記録領域５２が光情報記録媒体の記録構造を有し、ディスク５０ａの下方に配置された読み取り又は書き込み手段９０によって、情報の読み取り、書き込みが行われる。また、試料分析領域５３の流路１０に流される試料が光検出手段２０によって検出される。このように、情報記録領域５２の読み取り、書き込み方向と、試料分析領域５３の光検出方向とが、反射層５８を挟んで反対側になっているので、読み取り又は書き込み手段９０及び光検出手段２０の配置が容易である。
図１０には、本発明で用いられる核酸分析用ディスクの更に他の例が示されている。
このディスク５０ｂは、透明な基板５４のほぼ全面にプリグルーブ５５が形成され、このプリグルーブ５５形成された表面上に有機色素を含む感光色素膜からなる光吸収層５７を形成する。次に、光吸収層５７上に反射層５８を形成し、反射層５８上にトップコート層５９を形成する。一方、ラミネート転写やエンボス加工等で凹部５６が形成されたポリエチレンフィルム等からなるシーリング部材６０を用意する。このシーリング部材６０をトップコート層５９の上にヒートシールし、流路１０を形成する。
このディスク５０ｂによれば、反射層５８を挟んで下方が情報記録領域５２をなし、上方が試料分析領域５３をなすので、情報記録領域５２を広くとることができる。また、試料分析領域５３の流路１０は、シーリング部材６０の下面に形成する凹部５６を変えるだけで形状変更ができる。
図１１には、本発明で用いられる核酸分析用ディスクの更に他の例が示されている。
このディスク５０ｃは、透明な基板５４のほぼ全面にプリグルーブ５５が形成され、このプリグルーブ５５形成された表面上に有機色素を含む感光色素膜からなる光吸収層５７を形成する。次に、光吸収層５７上に反射層５８を形成する。この反射層５８上にスクリーン印刷で穴部５６ａを有するトップコート層５９を形成する。更にこの上にポリエチレンフィルム等からなるシーリング部材６０を被覆して、穴部５６ａを閉塞し流路１０を形成する。なお、反射層５８とトップコート層５９との間に反射層５８を保護する保護層（図示せず）をスピンコート法で成膜してもよい。
このディスク５０ｃによれば、反射層５８を挟んで下方が情報記録領域５２をなし、上方が試料分析領域５３をなすので、情報記録領域５２を広くとることができる。また、試料分析領域５３の流路１０は、スクリーンに形成される流路パターンを変更するだけで形状変更ができ、コストの低減化が可能である。
図１２には、本発明で用いられる核酸分析用ディスクの更に他の例がその製造工程と共に示されている。図中左側は製造工程、右側はディスクの断面模式図である。
まず、前述した図６に示した例と同様にして、基板５４の片面にプリグルーブ５５及び凹部３６を形成し、その上に光吸収層５７を形成する（ステップＳ１）。
次いで、Ａｕをスパッタリングして、反射層５８を形成する（ステップＳ２）。
そして、情報記録領域５２上に、トップコート層５９をスクリーン印刷し（ステップＳ３）、紫外線を照射して硬化させる（ステップＳ４）。
次に、ＰＥＴフィルムの内面にポリエチレン層がラミネートされたポリエチレン層ラミネートフィルム６１を被せ、ヒートシールする（ステップＳ５）。その結果、凹部５６の開口が閉塞されて流路１０が形成される。なお、ポリエチレン層ラミネートフィルム６１には、注入口等の孔６１ａが形成されている。なお、上記ラミネートフィルムとしては、ポリカーボネートフィルム等も使用することができる。
図１３には、本発明で用いられる核酸分析用ディスクの更に他の例がその製造工程と共に示されている。図中左側は製造工程、右側はディスクの断面模式図である。
まず、前述した図１０及び図１１に示した例と同様にして、基板５４の全面にプリグルーブ５５を形成し、その上に光吸収層５７を形成する（ステップＳ１）。
次いで、Ａｕをスパッタリングして、反射層５８を形成する（ステップＳ２）。
そして、トップコート層５９をスクリーン印刷し（ステップＳ３）、紫外線を照射して硬化させる（ステップＳ４）。このとき、トップコート層５９の塗布されていない部分によって流路１０の凹部５６を形成する。
次に、トップコート層５９上に前記と同様なポリエチレン層ラミネートフィルム６１を被せ、ヒートシールする（ステップＳ５）。その結果、凹部５６の開口が閉塞されて流路１０が形成される。なお、ポリエチレン層ラミネートフィルム６１には、注入口等の孔６１ａが形成されている。
図１４には、本発明で用いられる核酸分析用ディスクの更に他の例がその製造工程と共に示されている。図中左側は製造工程、右側はディスクの断面模式図である。
まず、前述した図１０及び図１１に示した例と同様にして、基板５４の全面にプリグルーブ５５を形成し、その上に光吸収層５７を形成する（ステップＳ１）。
次いで、Ａｕをスパッタリングして、反射層５８を形成する（ステップＳ２）。
そして、情報記録領域５２にトップコート層５９をスクリーン印刷し（ステップＳ３）、紫外線を照射して硬化させる（ステップＳ４）。
次に、試料分析領域５３に前記と同様なポリエチレン層ラミネートフィルム６１を被せ、ヒートシールする（ステップＳ５）。このとき、ポリエチレン層ラミネートフィルム６１の内面側には、凹部５６が形成されており、ポリエチレン層ラミネートフィルム６１をヒートシールすることによって、流路１０が形成される。なお、ポリエチレン層ラミネートフィルム６１には、注入口等の孔６１ａが形成されている。
図１５には、本発明で用いられる核酸分析用ディスクの更に他の例として、流路１０が形成された試料分析領域５３に、プレピット情報を付与した例が示されている。このプレピット６２は、流路１０と重なっていても重ならなくてもよく、プレピット６２の列は螺旋ではなく、同心円状で同じ信号のトラックが複数個設けられている。
このようなプレピット情報を設けることにより、光検出手段２０によるピックアップのトラッキング・フォーカス等のサーボや、流路情報（流路毎の断面構造・折り返し回数・注入体積等の情報）や、注意事項等をドライブに伝えることができる。
また、流路が形成される工程でバーコード情報を同時に形成し、この流路情報との整合をとることにより、ダブルチェックを行うことも可能となる。
なお、プレピット６２の代わりにプリグルーブを設けてもよい。
図１６には、本発明で用いられる核酸分析用ディスクの更に他の例として、各流路１０毎に位置合わせ用サーボ信号６３を設けた例が示されている。この位置合わせ用サーボ信号６３は、流路１０を形成する工程で同時に形成することができる。そして、位置合わせ用サーボ信号６３は、フォトカプラー等で読み取ることができる。
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
[実施例１]
前記図４及び図６に示されるディスクを下記の条件で製造した。
ディスクの直径46mmから76mmまで、表面に幅０．８μｍ、深さ０．０８μｍ、ピッチ１．６μｍのスパイラル状のデータ記録用のプレグルーブ５５が形成されその外周部に、図４、図６に示す流路１０及び情報信号・視覚表示文字５４が形成された厚さ１．２ｍｍ、外径１２０ｍｍφ、内径１５ｍｍφのポリカーボネート基板１を射出成形法により成形した。このポリカーボネート基板１のロックウェル硬度ＡＳＴＭ Ｄ７８５は、Ｍ７５鉛筆硬度ＨＢと同等であり、熱変形温度ＡＳＴＭ Ｄ６４８は、４．６ｋｇ／ｃｍ2、１２１℃であった。
光吸収層５７を形成するための有機色素として、０．６５ｇの１，１’ジブチル３，３，３’，３’テトラメチル４，５，４’，５’ジベンゾインドジカーボシアニンパークロレート（日本感光色素研究所製、品番ＮＫ３２１９）を、ジアセトンアルコール溶剤１０ｃｃに溶解し、これを前記の基板１の表面に、スピンコート法により塗布し、膜厚１３０ｎｍの感光色素膜からなる光吸収層２を形成した。この光吸収層２の複素屈折率の実数部ｎabs とその膜厚ｄabs と再生光の波長λとで与えられるρ＝ｎabsｄabs／λは、０．４５であり、かつ前記複素屈折率の虚部ｋabs は０．０５であった。
次に、このディスクの直径４５〜１１８ｍｍφの領域の全面にスパッタリング法により、膜厚８０ｎｍのＡｕ膜を成膜し、反射層５８を形成した。この反射層５８の上に、ディスクの直径40mmから80mmまで紫外線硬化性樹脂をスクリーン印刷し、これに紫外線を照射して硬化させ、膜厚１０μｍのトップコート層５９を形成した。このトップコート層５９の硬化後のロックウェル硬度ＡＳＴＭ Ｄ７８５はＭ９０であり、熱変形温度ＡＳＴＭ Ｄ６４８は、４．６ｋｇ／ｃｍ2、１３５℃であった。さらに、このトップコート層５９と反射層５８の上に、ドーナッツ形状にカットした３０μmの層厚のポリエチレン層を付加した50μmの透明なPETフィルムからなるポリエチレン層ラミネートフィルム６１を140℃でヒートシールし、内周部にレーザーによる情報記録領域(CD-R領域)５２、外周部に流路１０等を有する試料分析領域５３を有するハイブリッドディスクを作成した。
次に、前記検査用流路１０の形状について示す。該検査用流路は、前記ディスクの射出成型時、金型に形成された高さ５０μmの凸部によって該ディスクの外周部に形成した。該凸部によって形成された該検査用流路は、試料の注入口１１、供給用液溜め部１２、ディスク５０の半径方向に沿って、内側と外側を複数回往復するジグザグ部（反応用蛇行流路）１３、受容用液溜め部１４、他端に設けられた空気出口１５を有している。該流路１０の幅及び深さはいずれも５０μmとした。試料の注入口１１及び空気出口１５はディスクの半径３３mmの同一円周上に形成し、直径４００μmの円形状に形成した。供給用液溜め部１２及び受容用液溜め部１４はいずれも直径１０mmの円形状に形成し、供給用液溜め部１２の中心は前記基板の半径４０mmの位置に形成し、一方該受容用液溜め部１４の中心は前記基板の半径５３mmの位置に形成した。またジグザグ部１３は、中心を前記基板の半径５３mmの位置にして縦１０mm（半径方向）、横６．５mm（円周方向）の長方形の範囲内に形成した。ジグザグ部１３の流路１０も前記同じ形状の溝からなり、該長方形の範囲内を縦方向に３０．５往復するよう形成した。上記流路１０は、直径１２０mmの前記ディスクの同一円周上に２２．５°ずつ回転させた位置に合計１５個形成した。ただし、流路１０どうしの１箇所は４５°離れており、これによって光検出手段２０により、流路１０のＩＤを認識できるようにした。
次に、前記検査用流路の前記反応用蛇行流路における温度分布について示す。前記基板と同心円である内径９８mm、外径１１０mmの環状赤外線ヒーターによって、該環状赤外線ヒーターの直下にある領域を６５℃に加熱した。更に、前記基板と同心円である内径１１０mm、外径１１６mmの環状赤外線ヒーターによって、該環状赤外線ヒーターの直下にある領域を９５℃に加熱した。該二つの環状赤外線ヒーターの直下のある領域には該反応用蛇行流路が形成された前記長方形の範囲が含まれる。
[実施例２]
本実施例において前記検査用流路中で反応を行うための試薬溶液について示す。
反応試薬：
ポリメラーゼ（0.05 unit /μlＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（商品名「ExTaqポリメラーゼ」、反応緩衝液（商品名「2×ExTaqバッファ」（いずれもTAKARA社製））、ＰＣＲ基質（1μM forwardプライマー（GENEST社製）、1μM reverseプライマー（GENEST社製）、0.4mM dNTP）、鋳型ＤＮＡ（10ng/μl プラスミドpUC（Promega社製））、蛍光色素溶液（0.05μg/mlSYBR Green Ｉ（モレキュラープローブス社製））
プライマー配列：
forwardプライマー：配列番号１
reverseプライマー：配列番号２
前記反応試薬4μl（鋳型ＤＮＡとして４０ｎｇ）を前記試料の注入口１１よりピペットを用いて注入し、該反応試薬を前記供給用液溜め部１２に充填した。次に、前記二つの環状赤外線ヒーターによって該二つの環状赤外線ヒーターの直下の領域を６５℃および９５℃にした。更にまた、供給用液溜め部１２に充填した該反応試薬を前記ジグザグ部１３に送液し通過させるため、前記基板を回転させ遠心力を印加した。前記基板の回転数は２５００rpmとし、これによりジグザグ部１３の１往復分を該反応試薬は２０秒かけて通過した（流速：約１mm毎秒）。
回転数２５００rpmで２０分回転させた後、該基板を30秒間停止させた。その後、該基板を５００rpmの回転数で回転させ、前記光学的検出系によってジグザグ部１３の流路１０の１往復ごとの蛍光強度を測定した。
また、比較のため、上記反応試薬から鋳型ＤＮＡを除いた場合、鋳型ＤＮＡ濃度を１００倍希釈した場合についても同様の測定を行った。
図１７は蛍光強度とジグザグ部の往復回数との関係曲線である。この結果、定量目的物である鋳型ＤＮＡの量（０、０．４、４０ｎｇ）によく相関したＤＮＡ増幅曲線が得られた。
なお、流体一般の流速と前記基板の回転数との関係式は下記数式１で示される。
Figure 2005295877
上記数式１中の符号の意味は下記の通りである。
ｕ：流速
ｄH：水力直径
ρ：密度
ω：角速度
ｒ：平均半径
Δｒ：流路始点と終点の半径差
η：粘度
L：流路全長
上記において、水力直径とは、矩形の流路に適応される流体パラメータであり、下記数式２で求められる。
Figure 2005295877
上記数式２中の符号の意味は下記の通りである。
w：流路幅
d：流路深さ
こうして測定した結果を図１７に示す。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：プラスミドｐＵＣ上の特定配列を増幅するためのＰＣＲ用ＤＮＡforwardプライマー。
配列番号２：プラスミドｐＵＣ上の特定配列を増幅するためのＰＣＲ用ＤＮＡreverseプライマー。
本発明によれば、フロー系反応の分析測定原理を利用し、反応の進行過程を追跡する分析作業を、より簡易にかつ短時間で行えるようにした核酸分析方法を提供することができ、また、検出系、反応系、出力系、駆動系をコンパクトに具備し、安価に製造できる核酸分析装置及び分析用ディスクを供給することができる。
本発明の核酸分析方法における流路の例を示す説明図である。 本発明の核酸分析方法における試料検出箇所の例を示す説明図である。 本発明の核酸分析装置の一実施形態における概略構成を示す説明図である。 本発明の核酸分析用ディスクの一実施形態を示す平面図である。 同核酸分析用ディスクにおける流路の拡大説明図である。 同核酸分析用ディスクの断面構造を示す模式図である。 本発明の核酸分析装置に用いられる光検出手段の例を示す説明図である。 本発明の核酸分析装置に用いられる流路の検出手段の一例を示す説明図（ａ）と光検出素子９７を正面から見た図（ｂ）である。 本発明の核酸分析用ディスクの他の例を示す断面模式図である。 本発明の核酸分析用ディスクの更に他の例を示す断面模式図である。 本発明の核酸分析用ディスクの更に他の例を示す断面模式図である。 本発明の核酸分析用ディスクの更に他の例を製造工程に従って示す説明図である。 本発明の核酸分析用ディスクの更に他の例を製造工程に従って示す説明図である。 本発明の核酸分析用ディスクの更に他の例を製造工程に従って示す説明図である。 本発明の核酸分析用ディスクにおいて、プレピット情報を設けた他の例を示す説明図である。 本発明の核酸分析用ディスクにおいて、サーボ信号を設けた他の例を示す説明図である。 本発明の実施例において、フロー系リアルタイムＰＣＲによってプラスミドＤＮＡの特定配列を増幅し、蛍光強度を測定した結果を示す図表である。
符号の説明
１０ 流路
１０ａ、１０ｂ折り返し部
１１ 注入口
１２ 供給用液溜め部
１３ ジグザグ部
１４ 受容用液溜め部
１５ 空気出口
１６ 測定点
２０、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ光検出手段
２１ 光源
２２、２３ 分光手段
２４ 検出器
２５ ビームスプリッタ
３０ 分析装置
３６ 凹部
４０ 回転手段
５０、５０ａ、５０ｂ、５０ｃディスク
５１ 挿通孔
５２ 情報記録領域
５３ 試料分析領域
５４ 基板
５５ プリグルーブ
５６ 凹部
５７ 光吸収層
５８、５８ａ 反射層
５９ トップコート層
６０ シーリング部材
６１ ポリエチレン層ラミネートフィルム
６２ プレピット
６３ 位置合わせ用サーボ信号
７０ 温度制御手段
７１ 高温加熱部
７２ 低温加熱部
９０ 流路の検出手段
９１ レーザー光源
９２ マルチレンズ
９３ ハーフミラー
９５ 対物レンズ
９６ 集光レンズ
９７ 光検出素子
１０１ 回折格子
１０２ メインビーム
１０３ 回折ビーム
１０４ カットオフフィルター
Ａ 高温領域
Ｂ 低温領域

Claims (24)

  1. 核酸を含む分析用試料を、温度が繰り返しパターンで変化する流路に流し、前記流路の複数箇所で光学的な検出を行うことを特徴とする核酸分析方法。
  2. 前記核酸を含む分析用試料は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＤＮＡ、及びｄＮＴＰを含むものであって、任意成分として鋳型ＤＮＡ又は検体を含むものである請求項１記載の核酸分析方法。
  3. 前記光学的検出は、前記流路の検出すべき箇所に光を照射し、照射された光による透過光、反射光、又は発光を検出することにより行う請求項１又は２記載の核酸分析方法。
  4. 前記複数箇所での検出を、前記核酸を含む分析用試料が温度の高温でない部分を通る箇所で行う請求項１〜３のいずれか１つに記載の核酸分析方法。
  5. 前記流路は、少なくとも部分的にジグザグパターンを有し、このジグザグパターンの折り返し部から次の折り返し部に至る流路が、温度が異なる領域を通過するように形成されている請求項１〜４のいずれか１つに記載の核酸分析方法。
  6. 前記流路は、回転駆動されるディスク上に形成され、このディスク上に高温領域と低温領域とが同心状に形成されており、前記ジグザグパターンは、折り返し部から次の折り返し部に至る流路が、同心状に形成された前記高温領域と前記低温領域とを通過するように形成されおり、前記ディスクの回転による遠心力で前記流路に流す核酸を含む分析用試料を送液する請求項５記載の核酸分析方法。
  7. 前記ディスクに、情報記録領域と、試料分析領域とを設け、前記情報記録領域を利用して、情報の読み取り又は書き込みを行い、前記試料分析領域には、前記流路を設けて光学的検出を行う請求項６記載の核酸分析方法。
  8. 前記情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込みと、前記試料分析領域に対する光学的検出とを、前記ディスクを介して対向する方向からそれぞれ行う請求項７記載の核酸分析方法。
  9. 核酸を含む分析用試料を流す流路と、前記核酸を含む分析用試料が前記流路を流れるとき、前記核酸を含む分析用試料の温度が繰り返しパターンで変化するように通過領域の温度を制御する温度制御手段と、前記流路を流れる前記核酸を含む分析用試料を光学的に検出する光検出手段とを備え、前記光検出手段による検出を前記流路の複数箇所で行うように構成したことを特徴とする核酸分析装置。
  10. 前記光検出手段は、前記流路の検出すべき箇所に光を照射する出射手段と、照射された光による透過光、反射光、又は発光を検出する受光手段とを有している請求項９記載の核酸分析装置。
  11. 前記複数箇所での検出を、前記核酸を含む分析用試料が前記温度の高温でない部分を通る箇所で行うように構成した請求項９又は１０記載の核酸分析装置。
  12. 前記流路は、少なくとも部分的にジグザグパターンを有し、このジグザグパターンの折り返し部から次の折り返し部に至る流路が、前記温度制御手段により形成された温度制御領域を通過するように構成されている請求項９〜１１のいずれか１つに記載の核酸分析装置。
  13. 前記流路は、回転駆動されるディスク上に形成され、このディスク上に高温領域と低温領域とが同心状に形成されており、前記ジグザグパターンは、折り返し部から次の折り返し部に至る流路が、同心状に形成された前記高温領域と前記低温領域とを通過するように形成されており、前記ディスクの回転による遠心力で前記流路に流す核酸を含む分析用試料を送液するように構成されている請求項１２記載の核酸分析装置。
  14. 前記ディスクには、情報記録領域と、試料分析領域とが設けられており、前記情報記録領域には、情報の読み取り又は書き込みを行う、光情報記録媒体用の読み取り又は書き込み手段が対置され、前記試料分析領域には、前記流路の所定箇所に光を照射し、その透過光、反射光、又は発光を検出する前記光検出手段が対置されている請求項１３記載の核酸分析装置。
  15. 前記情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込みと、前記試料分析領域に対する光検出とを、前記ディスクを介して対向して行うように構成された請求項１４記載の核酸分析装置。
  16. 回転駆動されるディスク上に、情報の読み取り又は書き込みを行う情報記録領域と、核酸を含む分析用試料を流す流路が形成された試料分析領域とが設けられた核酸分析用ディスクであって、前記情報記録領域に対する情報の読み取り又は書き込み方向と、前記試料分析領域に対する光検出方向とが、前記ディスクを挟んで対峙するように構成したことを特徴とする核酸分析用ディスク。
  17. 前記流路は、ジグザグ状に蛇行しながら前記ディスクの周方向に沿って進行するジグザグパターンを少なくとも部分的に有することを特徴とする請求項１６記載の核酸分析用ディスク。
  18. 前記流路の一部に供給用液溜め部と、受容用液溜め部とがそれぞれ形成されており、前記供給用液溜め部は、前記受容用液溜め部及び前記ジグザグパターンを有する流路よりも内周側に位置している請求項１６又は１７記載の核酸分析用ディスク。
  19. 前記情報記録領域は、光情報記録媒体の記録構造を有している請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の核酸分析用ディスク。
  20. 前記情報記録領域は、記録層と、その背面側に位置する反射層とを有し、前記試料分析領域は、前記流路と、その背面側に位置する反射層とを有しており、対応する反射層に対して、前記記録層と、前記流路とが反対側に位置している請求項１６〜１９のいずれか１つに記載の核酸分析用ディスク。
  21. 前記情報記録領域が内周側に設けられ、前記試料分析領域が外周側に設けられている請求項１６〜２０のいずれか１つに記載の核酸分析用ディスク。
  22. 前記情報記録領域のプリグルーブ形成面と同じ平面上に前記流路の凹部が形成されており、該凹部の開口部がシーリング部材で封止されて前記流路が形成されている請求項１６〜２１のいずれか１つに記載の核酸分析用ディスク。
  23. 前記ディスクは、前記情報記録領域のプリグルーブと、記録層と、反射層とが片面に形成された基板と、この基板の前記反射層形成面上に、直接又は保護層を介して形成されたシーリング部材とを有し、このシーリング部材の内面に前記流路の凹部が形成されている請求項１６〜２１のいずれか１つに記載の核酸分析用ディスク。
  24. 前記試料分析領域には、前記光検出手段によって読み取り可能な情報を記載したプレピット又はプリグルーブが設けられている請求項１６〜２３のいずれか１つに記載の核酸分析用ディスク。
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