JPWO2015019626A1 - 核酸増幅デバイス、核酸増幅装置及び核酸増幅方法 - Google Patents

核酸増幅デバイス、核酸増幅装置及び核酸増幅方法 Download PDF

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Abstract

核酸増幅デバイス（１）は、標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部（１２０）と、温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域が存在し、かつ、導入部（１２０）に導入された反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部（１１０）と、少なくとも２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように設けられ、かつ、反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路（１００）とを備える。

Description

本発明は、核酸増幅デバイス、これを用いた核酸増幅装置及び核酸増幅方法に関する。
核酸増幅デバイスは、試料である標的核酸を増幅させるためのデバイスであり、例えば、標的核酸を含む反応溶液（反応流体）に所望の温度変化を繰り返し与えることによって標的核酸を増幅させる。
また、反応溶液に与える温度変化を高速にする方法として、マイクロ流体デバイスを用いることが知られている。マイクロ流体デバイスは、極めて少量の試料や試薬を含む反応溶液を反応させることが可能なデバイスであり、微小反応デバイス（マイクロリアクタ）や集積型ＤＮＡデバイス、微小電気泳動デバイス等がある。
例えば、特許文献１及び非特許文献１には、デバイスを複数の異なる温度領域に分割しておき、反応溶液が各温度領域を繰り返して通過するように蛇行した流路（蛇行流路）を設けることが開示されている。この構成により、流路内の反応溶液に与える温度変化を高速化できるので、反応溶液として核酸を含む溶液を用いた場合に、高速に核酸増幅を行うことができる。
特開２００２−１８２７１号公報
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８２，ｐｐ．４８４（１９９８）
しかしながら、上記従来のマイクロ流体デバイスでは、反応溶液を流路内に進行させるためにシリンジポンプ等の外部ポンプを用いる必要がある。外部ポンプを用いると、ポンプと流路とをつなぎこむための手作業が生じたり、システムが大型化したり、コスト高になったりするという課題がある。
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる核酸増幅デバイス等を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様は、標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部と、温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域が存在し、かつ、前記導入部に導入された前記反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部と、少なくとも前記２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように設けられ、かつ、前記反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路とを備えることを特徴とする。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、さらに、増幅後の前記標的核酸を含む前記反応溶液を排出するための排出部を備え、前記流路は、前記反応溶液の送液方向に垂直な断面における壁面全周が閉じられており、かつ、前記導入部及び前記排出部においてのみ外部空間と繋がっていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記流路は、前記毛管力運搬機構として、接触角が鋭角である親水性表面の壁面を有していてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記反応溶液の送液方向に垂直な断面における前記流路の壁面全周が親水性表面であってもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記流路には、表面が前記親水性表面である親水膜が形成されていてもよい。
この場合、前記親水膜は、親水部と疎水部とを有する材料からによって形成されていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記親水膜は、界面活性剤によって形成されていてもよい。
この場合、前記界面活性剤は、非イオン性の界面活性剤であってもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、さらに、前記反応溶液を滞留させるための送液滞留部を備え、前記流路は、前記核酸増幅反応部に設けられた第１流路と、前記送液滞留部に設けられた第２流路とを有し、前記第２流路には、前記第１流路から送液される前記反応溶液が滞留するように構成されていてもよい。
この場合、前記第２流路の容積は、前記流路全体の容積の１０％以上であるとよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記核酸増幅反応部には、温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域が存在していてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記流路は、前記２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように構成されていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記２つ以上の温度領域における各温度領域の温度は、ヒータによって設定されていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記導入部は、複数設けられており、さらに、前記複数の導入部と前記核酸増幅反応部との間に設けられた混合部を備え、前記複数の導入部の各々は、前記複数の導入部の各々に対応する導入流路を通じて前記混合部において１つに接続されており、前記混合部では、前記複数の導入部の各々から導入された複数の溶液が混合されて前記反応溶液となってもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記複数の導入部の各々から導入された複数の溶液は、前記混合部において拡散により混合されていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記混合部における流路は、蛇行流路であってもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記混合部における流路には、断面積が部分的に小さい箇所が存在していてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記複数の導入部の各々から導入された複数の溶液は、前記混合部において螺旋流により混合されていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記混合部における流路は、環状流路であってもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、少なくとも前記核酸増幅反応部における前記流路には、前記送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記断面積が減少する領域における前記流路は、先細りテーパ構造であってもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記断面積が減少する領域における前記流路は、蛇行する複数のラインからなり、前記断面積が減少する領域における前記流路の断面積は、前記送液方向に沿って前記ラインごとに減少していてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記断面積が減少する領域における前記流路の断面積は、前記流路内に設けられたピラーにより調整されていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記流路の一部が分岐されていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記断面積が減少する領域において、前記流路の深さは一定であってもよい。
また、本発明に係る核酸増幅装置の一態様は、上記いずれかに記載の核酸増幅デバイスを備える核酸増幅装置であって、前記核酸増幅反応部の温度を制御するための温度制御部を備えることを特徴とする。
また、本発明に係る核酸増幅装置の一態様において、さらに、前記標的核酸の核酸増幅を検出するための検出部を備えていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅装置の一態様において、前記検出部は、前記核酸増幅デバイスに照射するための光を出力する光出力部と、前記核酸増幅デバイスに照射した前記光の反射光を受光する受光部とを備えていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅装置の一態様において、前記検出部は、さらに、前記光を前記核酸増幅デバイスの前記流路上を走査するための光学走査部を備えていてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様は、核酸増幅デバイスを用いて標的核酸を増幅させるための核酸増幅方法であって、前記標的核酸と前記標的核酸を増幅させるための反応試薬とを前記核酸増幅デバイスに導入する導入ステップと、前記標的核酸と前記反応試薬とを含む反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させる核酸増幅ステップとを含むことを特徴とする。
また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様において、前記導入ステップにおいて、前記標的核酸を含む溶液と前記反応試薬とを予め混合した溶液を前記反応溶液として前記核酸増幅デバイスに導入してもよい。
また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様において、前記導入ステップにおいて、前記標的核酸を含む第１溶液と前記反応試薬を含む第２溶液とを前記核酸増幅デバイスに別々に導入し、核酸増幅ステップでは、前記第１溶液と前記第２溶液とを前記核酸増幅デバイスにおいて混合した溶液を前記反応溶液として毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様において、前記核酸増幅ステップでは、前記反応溶液に周期的な温度変化を与えることにより前記反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させてもよい。
また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様において、前記核酸増幅デバイスは、増幅後の前記標的核酸を含む前記反応溶液を排出するための排出部を備え、前記毛管力によって送液される前記反応溶液の先端が前記排出部に到達したときに、標的核酸を含む溶液の前記導入部への導入を停止してもよい。
本発明によれば、ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる。
図１は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの斜視図である。 図２は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの分解斜視図である。 図３は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの平面図である。 図４は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの断面図である。 図５は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスにおける温度サイクルを説明するための図である。 図６は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅方法のフローチャートである。 図７Ａは、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路の構成を示す平面図である。 図７Ｂは、図７ＡのＸ−Ｘ’における本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路の断面図である。 図７Ｃは、図７ＡのＹ−Ｙ’における本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路の断面図である。 図８は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路の他の例の断面図である。 図９は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの製造方法のフロー断面図である。 図１０は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とについての時間と液先端の変位との関係を示す図である。 図１１は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とについての圧力損失の結果を示す図である。 図１２は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とに関して算出した粘度とキャピラリ力との値を示す表である。 図１３は、キャピラリ力で流路内を自送液するＰＣＲ試薬についての時間と液先端の変位との関係を示す図である。 図１４は、ＰＣＲ増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示す図である。 図１５は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅装置の構成を示す図である。 図１６は、反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図１７は、反応試料（ヒトゲノム）の濃度と立ち上げる時のしきいサイクルとの関係を示す図である。 図１８Ａは、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅デバイスの平面図である。 図１８Ｂは、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。 図１９は、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅方法のフローチャートである。 図２０は、本発明の実施の形態２の変形例１に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。 図２１は、本発明の実施の形態２の変形例２に係る核酸増幅デバイスの平面図である。 図２２は、本発明の実施の形態２の変形例３に係る核酸増幅デバイスの平面図である。 図２３は、本発明の実施の形態２の変形例４に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。 図２４Ａは、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスの斜視図である。 図２４Ｂは、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図２５は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスの分解斜視図である。 図２６は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスにおける温度サイクルを説明するための図である。 図２７Ａは、比較例の核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図２７Ｂは、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図２８は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスを用いて反応溶液を送液した場合における送液時間と溶液先頭位置との関係を示す図である。 図２９は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図３０は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合におけるヒトゲノムＤＮＡの初期濃度に対する増幅前後の標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示す図である。 図３１は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応試料（ヒトゲノムＤＮＡ）の濃度と立ち上がる時のしきいサイクルとの関係を示す図である。 図３２は、実施の形態３の変形例１に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図３３は、実施の形態３の変形例２に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図３４は、実施の形態３の変形例３に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図３５は、実施の形態３の変形例４に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図３６は、実施の形態３の変形例５に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図３７は、実施の形態３の変形例６に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図３８は、本発明の変形例１に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。 図３９は、本発明の変形例２に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。 図４０は、本発明の変形例３に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。 図４１は、本発明の変形例４に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本発明の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本発明を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。
（実施の形態１）
まず、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイス１の構成について、図１〜図４を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの斜視図であり、図２は、同核酸増幅デバイスの分解斜視図であり、図３は、同核酸増幅デバイスの平面図であり、図４は、同核酸増幅デバイスの断面図である。
図１〜図４に示すように、本実施の形態に係る核酸増幅デバイス１は、試料となる標的核酸を増幅させるためのデバイス（デバイスチップ）であって、少なくとも標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部（インレット）１２０と、導入部１２０に導入された反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部１１０と、核酸増幅反応部１１０で増幅された標的核酸を含む反応溶液を排出するための排出部（ドレイン）１３０と、標的核酸を含む反応溶液を加熱するためのヒータ部１４０とを備える。
核酸増幅反応部１１０は、さらに、導入された反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路１００を有する。流路１００は、反応溶液が一方通行的に流れる反応流路であって、少なくとも核酸増幅反応部１１０を通るように設けられている。本実施の形態における流路１００は、１本で構成されており、一方の端部が導入部１２０に、他方の端部が排出部１３０に繋がっている。
核酸増幅反応部１１０では、反応溶液が流路１００内を毛管力により送液されながら反応溶液に含まれる標的核酸が増幅する。反応溶液（反応流体）は、少なくとも試料となる標的核酸を含む溶液であり、本実施の形態では、標的核酸と標的核酸を増幅させるための反応試薬とを含む水溶液である。なお、反応溶液には、ある種のアルコールや界面活性剤等が含まれていてもよい。
本実施の形態では、核酸増幅デバイス１を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を実施する場合について説明する。ＰＣＲ法は、ターゲットＤＮＡを温度サイクルにより増幅させる技術である。反応溶液には、ターゲットＤＮＡの他に、ＰＣＲプライマやポリメラーゼ酵素、バッファー等が含まれている。このような反応溶液に温度サイクルを付与することで、ターゲットＤＮＡを増幅することができる。増幅したＤＮＡの増幅量は、反応検出機構によって検出することができる。
核酸増幅デバイス１は、具体的には、第１基板１０と、第２基板２０と、ヒータ部１４０とによって構成されている。また、ヒータ部１４０は、設定温度が異なる第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを備える。
本実施の形態における核酸増幅デバイス１は、マイクロ流路（流路１００）を有するマイクロ流体デバイスである。核酸増幅デバイス１の外形は、例えば縦の長さが４０ｍｍで横の長さが２０ｍｍの略矩形状である。
以下、核酸増幅デバイス１の各構成部材の詳細構成について、図１〜図４を用いて詳述する。
［第１基板］
図２に示すように、第１基板１０は、導入部１２０の一部を構成する第１凹部１１と、排出部１３０の一部を構成する第２凹部１２と、流路１００を構成する溝部１３とを備える。第１基板１０は、例えばシリコン基板である。
溝部１３（流路１００）は、第１凹部１１と第２凹部１２とをつなぐように形成されている。溝部１３（流路１００）には反応溶液が流れる。具体的には、第１凹部１１（導入部１２０）に反応溶液が導入されると、当該反応溶液は、第２凹部１２（排出部１３０）に向かって溝部１３（流路１００）内を進行する。
図３に示すように、核酸増幅反応部１１０における流路１００は、蛇行するように形成された蛇行流路であり、第１ヒータブロック１４１（第１温度領域）と第２ヒータブロック１４２（第２温度領域）とを交互に繰り返して通過するように構成されている。
具体的に、核酸増幅反応部１１０における流路１００は、ライン状の流路を所定間隔毎に折り曲げながら連続的に折り返すように（往復するように）形成されている。核酸増幅反応部１１０における流路１００の折り返し回数は、例えば２０〜７０サイクル程度である。一例として、１サイクルあたりの流路１００（主流路１００ａ）の長さは３２ｍｍとすることができる。
本実施の形態における流路１００は、所定長さのライン状の複数の主流路１００ａと、対向する各行の主流路１００ａの端部同士を接続する副流路１００ｂとを有する。主流路１００ａ及び副流路１００ｂは、核酸増幅反応部１１０に設けられる。
主流路１００ａは、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを跨ぐように、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の長手方向に略直交させて設けられている。副流路１００ｂは、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の長手方向に略平行するように設けられている。
なお、流路１００は、さらに、反応溶液を導入部１２０から核酸増幅反応部１１０に導くための流路である導入流路１００ｃと、反応溶液を核酸増幅反応部１１０から排出部１３０までに導くための排出流路１００ｄとを有する。
導入流路１００ｃの始端は、流路１００全体としての入口であり、導入流路１００ｃの終端は、核酸増幅反応部における流路１００の入り口である。また、排出流路１００ｄの始端は、核酸増幅反応部における流路１００の出口であり、排出流路１００ｄの終端は、流路１００全体としての出口である。
図４に示すように、流路１００を構成する溝部１３の内表面には、シリコン酸化膜等の親水膜１４が形成されている。親水膜１４を形成することによって、流路１００（溝部１３）の壁面を親水化することができる。本実施の形態では、主流路１００ａ、副流路１００ｂ、導入流路１００ｃ及び排出流路１００ｄの全てに、毛管力運搬機構として親水膜１４が形成されている。
このように構成される流路１００はマイクロ流路であり、例えば断面形状は矩形状である。この場合、流路１００を構成する溝部１３の流路幅（溝幅）は、例えば２０〜３００μｍ程度であり、溝部１３の深さは５０〜１５０μｍ程度である。
なお、溝部１３の断面形状は、矩形に限らず、半円形又は逆三角形とすることができる。また、第１凹部１１及び第２凹部１２は、例えば円形開口の凹部とすることができる。第１基板１０は、透明基板等の透光性基板及び不透光性基板のいずれであってもよく、また、シリコン基板に限らず、樹脂基板又はガラス基板等であってもよい。
［第２基板］
図１に示すように、第２基板２０は、第１基板１０を覆う蓋部であり、第１基板１０上に配置される。第２基板２０は、例えば、透明樹脂基板又はガラス基板等である。
図２に示すように、第２基板２０には、導入部１２０の一部として、第２基板２０を貫通する第１貫通孔２１が設けられている。また、第２基板２０には、排出部１３０の一部として、第２基板２０を貫通する第２貫通孔２２が設けられている。第１貫通孔２１及び第２貫通孔２２は、例えば円形開口を有する貫通孔である。
図４に示すように、第１基板１０上に第２基板２０を載置することによって、溝部１３の開口部分が塞がれて全方位が密閉された流路１００が構成される。これにより、流路１００は、反応溶液の送液方向（進行方向）に垂直な断面における壁面全周が閉じられた構成となり、かつ、導入部１２０及び排出部１３０においてのみ外部空間と繋がる構成となる。このように、流路１００の全方位を閉じることによって、流路１００における毛管力を増強させることができるとともに、送液中に反応溶液が揮発することを抑制できる。
なお、第２基板２０の材料は、樹脂やガラスに限らず、シリコン等であってもよい。
［ヒータ部］
図１〜図３に示すように、ヒータ部１４０は少なくとも核酸増幅反応部１１０に配置されており、核酸増幅反応部１１０の流路１００に送液される反応溶液は、ヒータ部１４０によって所定の温度が付与される。
本実施の形態において、核酸増幅反応部１１０には、ヒータ部１４０として、所定の異なる温度に設定された第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２が配置される。つまり、核酸増幅反応部１１０には、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の２つのヒータブロックによって所定の異なる温度に設定された２つの温度領域が存在する。
なお、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２は、例えば直方体のアルミニウムやステンレス等の金属からなる金属ブロックを用いたヒータである。ヒータ部１４０としては、ヒータブロック以外に、ガラス基板上に金属薄膜を印刷等により形成した金属薄膜ヒータ等を用いることもできる。
第１温度に設定された第１ヒータブロック１４１が配置された領域は、第１温度領域である。また、第２温度に設定された第２ヒータブロック１４２が配置された領域は、第１温度領域とは異なる温度領域である第２温度領域である。
本実施の形態では、第１ヒータブロック１４１の温度が第２ヒータブロック１４２の温度よりも高くなるように設定されている。つまり、第１ヒータブロック１４１が配置された領域は高温領域であり、第２ヒータブロック１４２が配置された領域は低温領域である。
高温領域である第１ヒータブロック１４１の温度は、例えば９３℃〜９８℃であり、本実施の形態では、核酸増幅反応の変性反応温度である約９５℃としている。一方、低温領域である第２ヒータブロック１４２の温度は、例えば５０℃〜７５℃であり、本実施の形態では、アニール・伸長反応温度である約６０℃としている。
図３に示すように、ヒータ部１４０は温度制御部２１０に接続されている。これにより、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の各温度は、温度制御部２１０によって制御することができる。
第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２は所定の隙間をあけて並べられている。第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の上には第１基板１０が配置される。具体的には、流路１００における主流路１００ａが第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを跨ぐようにして第１基板１０がヒータ部１４０に載置される。これにより、流路１００は、２つの温度領域を複数サイクルで往復するように構成される。
この構成により、図５に示すように、導入部１２０から反応溶液３００を導入したときに、反応溶液３００は、核酸増幅反応部１１０における２つの温度領域（第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２）を交互に繰り返して通過するように排出部１３０に送液される。つまり、流路１００を流れる反応溶液３００に対してヒートサイクルを付与することができる。
以上、本実施の形態における核酸増幅デバイス１によれば、流路１００の毛管力運搬機構による毛管力によって反応溶液を送液することができるので、シリンジポンプ等の外部ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる。したがって、標的核酸の核酸増幅を低コストかつ簡便に行うことができる。
［核酸増幅方法と核酸増幅デバイスの特徴構成］
次に、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅方法と核酸増幅デバイスの特徴構成について、図１〜図５を参照しながら、図６及び図７Ａ〜図７Ｃを用いて説明する。図６は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅方法のフローチャートである。図７Ａ〜図７Ｃは、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路を示す図であり、図７Ａは平面図、図７Ｂは図７ＡのＸ−Ｘ’における断面図、図７Ｃは図７ＡのＹ−Ｙ’における断面図である。
図６に示すように、本実施の形態に係る核酸増幅方法は、上記の核酸増幅デバイス１を用いて標的核酸を増幅させるための核酸増幅方法であって、試料となる標的核酸と当該標的核酸を増幅させるための反応試薬とを核酸増幅デバイス１の導入部１２０に導入する導入ステップ（ステップＳ１１）と、標的核酸と反応試薬とを含む反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる核酸増幅ステップ（ステップＳ１２）とを含む。
これにより、反応溶液を毛管力により送液することができるので、シリンジポンプ等の外部ポンプを用いることなく、簡便に反応溶液を送液することができる。したがって、低コストで標的核酸の核酸増幅を行うことができる。
また、本実施の形態では、上記導入ステップ（ステップＳ１１）において、標的核酸を含む反応溶液と反応試薬とを予め混合しておいた溶液を反応溶液として核酸増幅デバイス１の導入部１２０に導入している。例えば、図４に示すように、ピペットを用いて反応溶液３００を導入部１２０に注入する。
導入部１２０に導入された反応溶液は、流路１００（導入流路１００ｃ）を通って導入部１２０から核酸増幅反応部１１０に送液される。
また、本実施の形態では、上記核酸増幅ステップ（ステップＳ１２）において、反応溶液に周期的な温度変化を与えることにより反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させている。
具体的には、核酸増幅反応部１１０に到達した反応溶液は、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを繰り返して往復するように主流路１００ａ及び副流路１００ｂを通ることになる。つまり、反応溶液は、ヒータ部１４０の高温領域（第１ヒータブロック１４１）と低温領域（第２ヒータブロック１４２）とを往復しながら送液されるので、加熱と冷却とが交互に繰り返されることになる。これにより、流路１００を流れる反応溶液３００に対してヒートサイクルを付与することができるので、反応溶液に含まれる標的核酸は、高温領域での変性反応と低温領域でのアニール・伸長反応との繰り返しにより増幅する。このように、送液しながら反応溶液を昇降温させることができるので、非常に高速なフローＰＣＲを実現することができる。したがって、反応溶液に含まれる標的核酸を高速に増幅させることができる。
その後、反応溶液は、排出流路１００ｄを通って核酸増幅反応部１１０から排出部１３０へと送液される。本実施の形態では、導入部１２０に導入された反応溶液の先端が排出部１３０に到達したときに、標的核酸を含む溶液（本実施形態では反応溶液）の導入部１２０への導入を停止させており、このときに流路１００内に反応溶液が充填されることになる。つまり、本実施の形態では、反応溶液を毛管力によって送液しながら反応溶液に温度変化を与えており、反応溶液が排出部１３０に到達すると、反応溶液の反応が終了する。なお、排出部１３０に到達した反応溶液は、排出部１３０から排出せずに第１基板１０ごと交換してもよいが、排出部１３０から随時排出するように構成してもよい。
このようにして反応溶液は流路１００内を進行する。このとき、本実施の形態では、図７Ａ〜図７Ｃに示すように、流路１００は、反応溶液３００を毛管力（キャピラリ力）により送液する毛管力運搬機構として、接触角θが鋭角である親水性表面の壁面を有する。
具体的には、図７Ｃに示すように、反応溶液３００の送液方向に垂直な断面における溝部１３の底部及び両側部の３つの壁面に、表面が親水性表面である親水膜１４が形成されている。親水膜１４を形成することによって溝部１３の表面を親水化することができ、流路１００の内壁面を親水性表面とすることができる。親水膜１４は、溝部１３に対して表面処理を行うことによって溝部１３の表面に被膜形成することができる。
流路１００の内壁面を親水性表面にすることで反応溶液をスムーズに送液することができ、気泡が発生することを抑制できるとともに、反応溶液の標的核酸を高精度に増幅させることができる。
親水膜１４は、例えば、親水部と疎水部とを有する材料によって形成されているとよい。親水膜１４が疎水部を持つことによって、溝部１３の内壁面に容易に親水膜１４を形成することができる。具体的には、第１基板１０が樹脂基板等で溝部１３の露出面が疎水性表面であるような場合、親水膜１４の疎水部が溝部１３の疎水性表面に容易に結合するので、溝部１３の表面に容易に親水膜１４を被膜することができる。
このように、親水部と疎水部とを有する親水膜１４の材料としては、界面活性剤を用いるとよい。これにより、溝部１３の表面に親水膜１４を容易に形成することができる。
この場合、親水膜１４としては、特に、非イオン性の界面活性剤を用いるとよい。これにより、反応溶液の反応を阻害することを抑制できるので、反応溶液の標的核酸を高精度に増幅させることができる。
このような界面活性剤としては、以下の（化１）の組成式で表される「Ｔｗｅｅｎ２０」（ポリオキシエチエレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate））を用いることができる。
Figure 2015019626
その他に、親水膜１４の材料として、以下の（化２）又は（化３）の組成式で表される「Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ−４０」（オクチルフェニルポリエチレングリコール（Octylphenyl-polyethylene glycol））、又は、「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether）の界面活性剤を用いてもよい。
Figure 2015019626
Figure 2015019626
「Ｔｗｅｅｎ２０」、「Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ−４０」及び「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」の界面活性剤は、いずれも常温で液体である。
親水膜１４の材料としてこれらの界面活性剤を用いる場合、以下の方法で溝部１３に親水膜１４を形成することができる。
例えば、上記の界面活性剤を溶媒に溶かした溶液を溝部１３（流路）内に充填し乾燥させる。より具体的には、上記の界面活性剤をエタノールや２−プロパノール（ＩＰＡ：Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）等のアルコールで希釈した溶液を導入部１２０から溝部１３（流路）内に流し、当該溶液を溝部１３全体に行き渡らせる。その後、溶液を乾燥させる。これにより、溝部１３の表面に、界面活性剤からなる親水膜１４を成膜することができる。
このように、溝部１３の内面に親水膜１４を形成することによって、流路１００の内壁面を親水性表面にすることができる。
なお、、流路１００の壁面の一部が親水性表面であればよいが、送液方向に垂直な断面における流路１００の壁面全周が親水性表面である方がよい。この場合、第１基板１０の溝部１３の表面に親水膜１４を形成するのではなく、図８に示すように、第２基板２０にも親水膜２４を形成しても第２基板２０の表面（内面）も膜親水性表面にすればよい。親水膜２４は、親水膜１４と同じ材料及び同じ方法で形成することができる。
また、親水膜１４の材料は、界面活性剤に限らず、酸化シリコン（ＳｉＯ２）であってもよい。この場合、親水膜１４（シリコン酸化膜）は、図９に示す方法で形成することができる。図９は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの製造方法のフロー断面図である。
図９（ａ）に示すように、第１基板１０として例えば厚み５２５μｍのシリコン基板（例えばシリコンウェハ）を用意し、このシリコン基板の全面に、後のエッチング工程においてハードマスクとなる熱酸化膜としてシリコン酸化膜１５を例えば６５０ｎｍの膜厚で形成する。
次に、図９（ｂ）に示すように、フォトリソグラフィ及びエッチングを行うことにより、シリコン酸化膜１５を所定形状にパターニングする。具体的には、溝部１３（流路１００）となる部分のシリコン酸化膜１５を選択的に除去して第１基板１０を露出させる。
次に、図９（ｃ）に示すように、パターニングされたシリコン酸化膜１５をハードマスクとして第１基板１０の露出させた部分をエッチングすることによって、所定の深さの溝部１３を形成する。
このとき、溝部１３の断面形状を矩形又は半円形とする場合は、深堀り反応性イオンエッチング（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ；ＤＲＩＥ）により溝部１３を形成することができる。また、溝部１３の断面形状を逆三角とする場合は、ＴＭＡＨ（Ｔｅｔｒａ Ｍｅｔｈｙｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）を用いた異方性エッチングにより溝部１３を形成することができる。
次に、フッ酸によるウェットエッチングによってハードマスクのシリコン酸化膜１５を除去した後（つまり、第１基板１０の表面のシリコン酸化膜を一旦全て除去した後）、図９（ｄ）に示すように、溝部１３（流路１００）の表面を親水化するために、第１基板１０の露出面に、親水膜１４として、１００ｎｍ程度の熱酸化膜であるシリコン酸化膜を形成する。
最後に、図９（ｅ）に示すように、第１貫通孔２１及び第２貫通孔２２が設けられたガラス基板である第２基板２０を、第１基板１０に接合する。これにより、溝部１３の開口部分が第２基板２０で封止された構成の流路１００が形成される。
このように、溝部１３の内面に表面が親水性表面である親水膜１４を形成することによって、流路１００の内壁面を親水性にすることができる。これにより、反応溶液３００は、気液界面に生じる毛管力によって流路１００内を自送液（Ｓｅｌｆ−ｐｒｏｐｅｌｌｅｄ ｆｌｏｗ）されるので、流路１００内を自動的に進行する。つまり、反応溶液３００は、自動搬送によって流路１００内に送液されながら、核酸増幅反応部１１０において周期的な温度変化が与えられる。
具体的には、導入部１２０に導入された反応溶液は、導入流路１００ｃを自動的に進行して核酸増幅反応部１１０に送液され、核酸増幅反応部１１０において主流路１００ａ及び副流路１００ｂを自動的に進行して高温領域と低温領域とを往復し、その後、排出流路１００ｄを自動的に進行して排出部１３０に送液される。
なお、流路１００の断面における壁面の親水性表面の割合が大きいほど、反応溶液に対する毛管力を大きくすることができる。
ここで、本実施の形態における核酸増幅デバイス１の流路１００について、好ましい流路サイズ、溶液粘性及び毛管力（キャピラリ力）について詳細に説明する。
まず、流路１００におけるキャピラリ力を用いた送液の理論について説明する。
キャピラリ力を用いた溶液の送液は、駆動力であるキャピラリ力と、抵抗成分である圧力損失とのつりあいにより決定される。ここで、圧力損失Ｐｄは、以下の（式１）で表すことができる。
Figure 2015019626
（式１）において、Ｑは流量、ηは溶液の粘性、ｌは流路長である。また、（式１）におけるＤｈは、以下の（式２）で定義される水力直径であり、流路サイズや形状を反映するパラメータである。
Figure 2015019626
（式２）において、Ｓは流路断面積であり、Ｕは流路断面の外周長である。
（式１）を、送液速度ｖ及び流路断面積Ｓを用いて、さらに圧力損失係数αを導入して書き換えると、以下の（式３）で表すことができる。
Figure 2015019626
この（式３）は、ある流路に溶液を送液した場合、その圧力損失Ｐｄは、流路長ｌ及び送液速度ｖに比例することを表している。
ここで、圧力損失Ｐｄを示す式（３）とキャピラリ力Ｐｃとの力のつりあい（Ｐｄ＝Ｐｃ）より、キャピラリ力Ｐｃによる送液速度ｖは、以下の（式４）で表すことができる。
Figure 2015019626
（式４）において、Ｐｃ／αは、流路のサイズや形状及び溶液種により決まる定数であり、ここで送液係数と定義して、キャピラリ力送液特性の指標として用いる。
キャピラリ力Ｐｃによる送液速度ｖは、この送液係数を比例定数とし、流路長ｌ、つまり送液距離に反比例することになる。
また、（式４）は、時間ｔと送液距離（流路長ｌ）の微分方程式であるので、これを解くことにより、時間ｔに対する送液距離ｌは、以下の（式５）で表され、時間ｔの平方根に比例することになる。
Figure 2015019626
この送液特性を決定づける（式５）において、圧力損失係数αは、非常に大きな意味を持つパラメータである。
ここで、キャピラリ力Ｐｃについて詳述する。キャピラリ力Ｐｃは、流路断面を構成する各辺における界面張力の足し合わせにより表現ですることができ、以下の（式６）で表すことができる。
Figure 2015019626
（式６）において、σは溶液の表面張力、Ｓは流路断面積、αｎ及びθｎはそれぞれ、流路断面を構成する辺の長さ及び接触角である。例えば、流路の断面形状が矩形である場合のキャピラリ力Ｐｃは、以下の（式７）となる。
Figure 2015019626
ここで、ｗ及びｄは、それぞれ流路の幅及び深さであり、θｌ、θｒ、θｔ、θｂは、それぞれ流路の左側壁面（左側面）、右側壁面（右側面）、上側壁面（上面）、下側壁面（底面）における接触角である。
本実施の形態における核酸増幅デバイス１のように、フローＰＣＲによる流路の場合、反応溶液が、温度の異なる領域及び形状の異なる領域を連続的に流れる。そのため、任意の温度や形状に対応できる送液理論を構築する必要がある。
そこで、溶液（流体）が、ある流路をキャピラリ力Ｐｃによって送液されるとし、液先端がｘ＝ｌの地点にある場合を考える。キャピラリ力Ｐｃは、送液される溶液の液先端のみが関与するので（式６）により表され、ｘ＝ｌにおける流路形状や温度により決定される。
一方の圧力損失Ｐｄは、ｘ＝０の地点からからｘ＝ｌまでの地点の全ての領域が関与するので、（式３）を拡張し、以下の（式８）として考える必要がある。（式８）において、圧力損失係数αは、任意の地点ｘにおける温度や形状により決まる定数である。
Figure 2015019626
ここで、圧力損失Ｐｄを示す（式８）とキャピラリ力Ｐｃとの力のつりあい（Ｐｄ＝Ｐｃ）より、フローＰＣＲによる流路における送液速度ｖは、以下の（式９）により決定されると考えることができる。
Figure 2015019626
この（式９）は、右辺の分母が積分になっていることを除けば、（式４）と同じである。
以上により、（式９）よって送液速度ｖ（流速）を求めるためには、キャピラリ力Ｐｃ及び圧力損失係数αの形状・温度依存性が重要となる。
まず、圧力損失係数αの形状依存性及び温度依存性について見当する。
圧力損失Ｐｄは、上記のとおり（式３）で表されるので、圧力損失係数αは、以下の（式１０）で表される。
Figure 2015019626
形状の因子は、Ｓ及びＤｈに集約されているので、圧力損失係数αが形状に依存することが明らかである。
一方、圧力損失係数αの温度依存性は、（式１０）の粘性ηの温度依存性そのものであり、表面張力や接触角がキーパラメータであるが、これまで、ＰＣＲ試薬における粘性の温度依存性については不明であった。
そこで、本願発明者らは、断面形状が幅１００μｍで深さ５０μｍの矩形である流路における圧力損失を実際に評価して、圧力損失に大きく関わる粘性の温度依存性の実測に成功した。また、本願発明者らは、送液係数Ｐｃ／αに着目し、送液係数を実測することによりキャピラリ力を求めた。具体的には、ＰＣＲ試薬の送液係数を２５℃、６０℃、９５℃で実測した。この送液係数と上記で求めた粘性とからキャピラリ力を求めた。以下、送液係数と粘性を求める実験について説明する。
これらのデータと（式６）及び（式１０）を用いることによって、任意の流路における送液特性を設計することができる。
まず、流路における毛管力送液特性についての実験を行ったので、その実験について説明する。
この実験では、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬における粘性及びキャピラリ力を得るために、キャピラリ力による送液（つまり、時間と圧力損失に関するマイクロ流路の液先端の変位）を測定した。なお、核酸増幅デバイス１における流路１００は、幅１００μｍで深さ５０μｍであり、２５℃の純水（ＤＷ：ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ）と、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬を用いた。
この実験結果を図１０に示す。図１０は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とについての時間と液先端の変位との関係を示す図である。この実験結果により、反応溶液の温度に応じて、キャピラリ力に関する一定の近似曲線（毛管力送液特性）が得られることが分かる。
次に、流路における圧力損失評価についての実験を行ったので、その実験について説明する。
キャピラリ力による送液では、流路による圧力損失は、送液速度を決定する主要因のうちの１つである。図１１は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とについての圧力損失の結果を示す図である。なお、圧力損失の値は、ロードセル力及びシリンジの断面積によって算出した。全ての圧力損失は、（式１）の中で示されるような送液速度に比例する。
図１１に示されるように、送液速度に対する圧力の割合（傾き＝圧力／送液速度）によってＰＣＲ試薬の粘度を算出することができる。
これらの実験結果を踏まえると、図１０に示す毛管力送液特性（近似曲線）と圧力損失とにより、粘度とキャピラリ力を求めることができる。これにより、核酸増幅における送液を予測することができる。
以上の実験より、図１２に示すように、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とに関して、粘度（粘性）とキャピラリ力とを算出した。この場合、２５℃の純水の粘度は、η＝０．０００８９Ｐａ・ｓであることが広く知られているので、今回の実験による２５℃の純水の粘度の値がη＝０．０００９９Ｐａ・ｓであることを考えると、今回の実験が妥当であることが裏付けられる。また、２５°Ｃの純水の表面張力はσ＝０．０７３Ｎ／ｍであることが広く知られており、この値から算出される２５℃の純水のキャピラリ力が４．３ｋＰａであるので、今回の実験による２５℃の純水のキャピラリ力の値が４．４ｋＰａであることを考えると、この点からも今回の実験が妥当であることが裏付けられる。
次に、反応試薬としてＰＣＲ試薬を用いた核酸増幅について実験を行ったので、その実験結果について説明する。
この実験では、マイクロ流体デバイスとして上記の核酸増幅デバイス１を用いた。この場合、図７Ａ〜図７Ｃに示されるように、溝部１３に形成された親水膜（シリコン酸化膜）１４及びガラス基板である第２基板２０の表面における２５℃の純水の接触角θは、いずれも４９°であった。また、第１ヒータブロック１４１の温度を９５℃とし、第２ヒータブロック１４２の温度を６０℃とし、流路１００を流れる反応溶液が９５℃と６０℃との２つの温度領域を交互に周期的に通るようにした。
また、図１０の実験に対して流路１００のサイズを変更した場合の毛管力送液特性について、図１３を用いて説明する。図１３は、キャピラリ力で流路内を自送液するＰＣＲ試薬についての時間と液先端の変位との関係を示す図である。なお、図１３では、幅ｗが１００μｍで深さｄが１００μｍの矩形の流路の場合と、幅ｗが１５０μｍで深さｄが１５０μｍの矩形の流路の場合との結果を示している。
このように、流路１００のサイズを変更することで、所望の毛管力送液特性が得られることが分かる。
次に、ＰＣＲ試薬として、ヒトゲノムのβ−ａｃｔｉｎ（ベータアクチン）、インフルエンザウイルスＡＨ１ｐｄｍのＲＮＡから作製した相補的ＤＮＡ、及び、大腸菌ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＤＮＡを用いた場合の核酸増幅について説明する。
これらのＰＣＲ試薬を用いて、キャピラリ力による自送液で核酸増幅したときの結果を図１４に示す。図１４は、ＰＣＲ増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示しており、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれ、ヒトゲノムのβ−ａｃｔｉｎ、インフルエンザウイルスＡＨ１ｐｄｍ、大腸菌ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＤＮＡについての画像を示している。
図１４に示すように、ヒトゲノムのβ−ａｃｔｉｎの増幅は２９５ｂｐであり、インフルエンザウイルスＡＨ１ｐｄｍの増幅は２３２ｂｐであり、大腸菌ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＤＮＡの増幅は９５ｂｐであることが分かる。
このように、本実施の形態における核酸増幅デバイス１によれば、キャピラリ力によって標的核酸を含む反応溶液を送液して標的核酸の核酸増幅を行うことができる。
［核酸増幅装置］
次に、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅装置２００について、図３及び図１５を用いて説明する。図１５は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅装置の構成を示す図である。
本実施の形態における核酸増幅装置２００は、図３に示すように、上記の核酸増幅デバイス１と、核酸増幅デバイス１における核酸増幅反応部１１０の温度を制御するための温度制御部２１０とを備える。この構成により、簡便な方法で拡散増幅が可能となる。
図１５（ａ）に示すように、本実施の形態における核酸増幅装置２００は、さらに、標的核酸の核酸増幅を検出するための検出部２２０を備える。
検出部２２０は、光学検出系であり、核酸増幅デバイス１に照射するための光を出力する光出力部２２１と、核酸増幅デバイス１に照射した光の反射光を受光する受光部２２２と、核酸増幅デバイス１の流路１００上に光を走査させるための光学走査部２２３とを備える。
光出力部２２１は、青色光を発するレーザ素子を備えており、例えば中心波長が４８８ｎｍのレーザ光を出力する。受光部２２２は、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）である。なお、検出部２２０は、その他に、励起カットフィルタ２２４及びダイクロイックミラー２２５等の光学素子を備える。
このように、本実施の形態に係る核酸増幅装置２００は、加熱・冷却系（温度制御部２１０）と光学検出系（検出部２２０）との一体評価系としている。このように検出系を一体化することで、簡便な検出装置を実現できる。また、光学検出系とすることにより非接触で核酸の増幅量を検出することができる。
そして、核酸増幅デバイス１に導入した反応溶液（反応試料、反応試薬）における標的核酸の増幅量を検出する場合、図１５（ｂ）に示すように、流路１００の主流路１００ａと交差する方向にレーザ光をスキャンするとともに反射光を受光する。そして、受光した反射光に基づいて流路１００内の反応溶液中における標的核酸の増幅量を算出する。これにより、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを往復する流路１００のサイクルに応じた核酸の増幅曲線を取得することができる。
本実施の形態では、青色光のレーザ光を反応溶液に照射することによって、青色光を励起光として蛍光発光した緑色光が反射光として戻ってくるように構成されている。この緑色光（反射光）の蛍光量は、核酸の増幅量に応じて変化する。したがって、緑色光の蛍光量を測定することで核酸の増幅量を算出することができる。
ここで、反応試料としてヒトゲノムのβ−ａｃｔｉｎを含む反応溶液を用いた場合の光学検出結果の一例を、図１６及び図１７を用いて説明する。図１６は、反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。図１７は、反応試料（ヒトゲノム）の濃度と立ち上げる時のしきいサイクルとの関係を示す図である。
図１５（ａ）及び図１５（ｂ）に示すように、流路１００上をレーザ光でスキャンすることによって、流路１００のサイクル毎（主流路１００ａ毎）の核酸の増幅量を、増幅曲線として検出することができる。
この結果、図１６に示すように、ＰＣＲサイクルの増加に従って核酸の増幅量が増加することが分かる。また、反応試料（ヒトゲノム）の初期濃度に依存して、立ち上がる時のしきいサイクルが異なることも分かる。そこで、立ち上がる時のしきいサイクルを、最大値（飽和値）の例えば１０％程度となるサイクルと定義すれば、図１７に示すように、非常に線形性の高い検量線を得ることができ、初期濃度の定量が可能となる。
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅デバイス２の構成について、図１８Ａ及び図１８Ｂを用いて説明する。図１８Ａは、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅デバイスの平面図であり、図１８Ｂは、同核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。
図１８Ａ及び図１８Ｂに示すように、本実施の形態における核酸増幅デバイス２は、実施の形態１における核酸増幅デバイス１の導入部１２０が複数設けられた構成である。
具体的には、核酸増幅デバイス２は、第１導入部１２０ａと第２導入部１２０ｂとを備えており、さらに、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂと核酸増幅反応部１１０との間に設けられた混合部１５０を備える。
本実施の形態における導入流路１００ｃは、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂに分岐するようにＹ字状形成されている。第１導入部１２０ａと第２導入部１２０ｂとは、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂの各々に対応する導入流路１００ｃを通じて混合部１５０において１つに接続される。
このように、混合部１５０は、導入流路１００ｃの一部であり、混合部１５０では、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂの各々から導入された複数の溶液が混合される。つまり、混合部１５０は、第１導入部１２０ａから導入された第１溶液と第２導入部１２０ｂから挿入された第２溶液とが混合される箇所である。
なお、第１導入部１２０ａには、第１溶液として、例えば標的核酸を含む溶液が導入される。また、第２導入部１２０ｂには、第２溶液として、例えば反応試薬を含む溶液が導入される。
図１８Ｂに示すように、本実施の形態では、第１導入部１２０ａから導入された第１溶液と第２導入部１２０ｂから導入された第２溶液とは、混合部１５０において拡散により混合される。これにより、簡単な構成で混合することができる。
次に、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅方法について、図１９を用いて説明する。図１９は、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅方法のフローチャートである。
本実施の形態に係る核酸増幅方法は、上記の核酸増幅デバイス２を用いて標的核酸を増幅させるための核酸増幅方法であって、実施の形態１と同様に、試料となる標的核酸と当該標的核酸を増幅させるための反応試薬とを核酸増幅デバイス２の導入部１２０に導入する導入ステップと、標的核酸と反応試薬とを含む反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる核酸増幅ステップとを含む。
本実施の形態では、上記導入ステップにおいて、標的核酸を含む溶液（第１溶液）と反応試薬を含む溶液（第２溶液）とを核酸増幅デバイス２に別々に導入し、核酸増幅ステップでは、標的核酸を含む溶液（第１溶液）と反応試薬を含む溶液（第２溶液）とを核酸増幅デバイス２において混合して反応溶液とし、当該反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に周期的な温度変化を与えることにより反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる。
具体的には、図１９に示すように、まず、第１溶液として標的核酸を含む溶液を第１導入部１２０ａに導入するとともに、第２溶液として反応試薬を含む溶液を第２導入部１２０ｂに導入する（ステップＳ２１）。
第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂに別々に導入された第１溶液及び第２溶液は別々の導入流路１００ｃを通って混合部１５０で混合されて反応溶液となって核酸増幅反応部１１０に送液され、実施の形態１と同様に、当該反応溶液に周期的な温度変化を与えることで反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる（ステップＳ２２）。
その後、反応溶液は、排出流路１００ｄを通って核酸増幅反応部１１０から排出部１３０に送液され、排出部１３０で排出される。
以上、本実施の形態における核酸増幅デバイス２によれば、実施の形態１と同様に、キャピラリ力によって反応溶液を送液することができるので、外部ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる。したがって、標的核酸の核酸増幅を低コストかつ簡便に行うことができる。
さらに、本実施の形態によれば、標的核酸と反応試薬とをデバイス上で混合することができるので、標的核酸の核酸増幅をさらに簡便に行うことができる。
（実施の形態２の変形例１）
次に、本発明の実施の形態２の変形例１に係る核酸増幅デバイス２Ａの構成について、図２０を用いて説明する。図２０は、本発明の実施の形態２の変形例１に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。
図２０に示すように、本変形例における核酸増幅デバイス２Ａでは、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂから導入された第１溶液及び第２溶液は、混合部１５０において螺旋流により混合される。例えば、流路１００の内壁にネジ溝を切っておくことで、第１溶液及び第２溶液は螺旋流となって混合される。
このように、混合部１５０で螺旋流を発生させることによって撹拌による混合が可能となり、複数の溶液を素早く均一に混合することができる。
（実施の形態２の変形例２）
次に、本発明の実施の形態２の変形例２に係る核酸増幅デバイス２Ｂの構成について、図２１を用いて説明する。図２１は、本発明の実施の形態２の変形例２に係る核酸増幅デバイスの平面図である。
図２１に示すように、本変形例における核酸増幅デバイス２Ｂでは、混合部１５０における流路（混合部流路）１００が蛇行流路となっている。
この構成により、複数の溶液を拡散して混合するのに必要な距離をかせぐことができるので、デバイス上で複数の溶液を混合して反応溶液を作製する場合でも、核酸増幅反応部１１０までに均等に混合させることが可能となる。
（実施の形態２の変形例３）
次に、本発明の実施の形態２の変形例３に係る核酸増幅デバイス２Ｃの構成について、図２２を用いて説明する。図２２は、本発明の実施の形態２の変形例３に係る核酸増幅デバイスの平面図である。
図２２に示すように、本変形例における核酸増幅デバイス２Ｃでは、混合部１５０における流路（混合部流路）１００が環状流路となっている。具体的には、複数のＣ字状の環状流路を交互に反転させながら繋いだ構成としている。
この構成により、螺旋流を簡単に発生させることができるので、複数の溶液を容易に均一に混合することができる。
（実施の形態２の変形例４）
次に、本発明の実施の形態２の変形例４に係る核酸増幅デバイス２Ｄの構成について、図２３を用いて説明する。図２３は、本発明の実施の形態２の変形例４に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。
図２３に示すように、本変形例における核酸増幅デバイス２Ｄでは、混合部１５０における流路（混合部流路）１００には、断面積が部分的に小さい箇所が存在する。例えば、混合部１５０における流路の一部の幅を狭くすることで、流路断面積を部分的に小さくすることができる。
この構成により、断面積が小さい箇所で複数の溶液を短時間で混合させることができるので、複数の溶液を拡散させる距離を短くすることができる。これにより、小型の核酸増幅デバイスを実現することができる。
（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイス３の構成について、図２４Ａ、図２４Ｂ及び図２５を用いて説明する。図２４Ａは、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスの斜視図であり、図２４Ｂは、同核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。図２５は、同核酸増幅デバイスの分解斜視図である。
図２４Ａ〜図２５に示すように、本実施の形態における核酸増幅デバイス３は、実施の形態１における核酸増幅デバイス１に、さらに、送液滞留部１６０を備える構成である。
送液滞留部１６０は、反応溶液を滞留させるための送液滞留領域である。つまり、送液滞留部１６０は、反応溶液の先頭部分を核酸増幅反応部１１０に滞留させることなく核酸増幅反応部１１０の先に推進させるための送液推進部である。送液滞留部１６０は、一定の容量の反応溶液が滞留できるように構成されている。なお、送液滞留部１６０に滞留する反応溶液は、流れが止まった状態でもよいが、流れが止まっておらず進行している状態でもよい。
本実施の形態における流路１００は、核酸増幅反応部だけではなく、送液滞留部（送液滞留領域）１６０も通るように設けられている。具体的には、流路１００は、核酸増幅反応部１１０に設けられた第１流路１０１と、送液滞留部１６０に設けられた第２流路１０２とを有する。
図２５に示すように、核酸増幅反応部１１０における流路１００（第１流路１０１）は、蛇行するように形成された蛇行流路であり、第１ヒータブロック１４１（第１温度領域）と第２ヒータブロック１４２（第２温度領域）とを交互に繰り返して通過するように構成されている。
送液滞留部１６０における流路１００（第２流路１０２）は、送液滞留部１６０において反応溶液を滞留させるための流路であり、送液滞留部１６０（第２流路１０２）に送液される反応溶液の先頭部分を含む所定の容量の反応溶液が滞留できるように構成されている。送液滞留部１６０は核酸増幅反応部１１０の後段に設けられているので、第２流路１０２には第１流路１０１（核酸増幅反応部１１０）から送液される反応溶液が滞留する。
本実施の形態において、第２流路１０２には、蛇行する部分（蛇行流路）が含まれている。具体的に、第２流路１０２は、ライン状の流路を所定間隔毎に折り曲げながら連続的に折り返すように（往復するように）形成されている。第２流路１０２の折り返し回数や流路の向きは、スペースに応じて適宜設計すればよい。
第２流路１０２の容積（体積）は、流路１００全体の容積（体積）の１０％以上であり、好ましくは、流路１００全体の容積（体積）の３０％以上である。本実施の形態において、第２流路１０２の容積は、流路１００全体の容積の約３０％である。
図２４Ａ〜図２５に示すように、ヒータ部１４０は少なくとも核酸増幅反応部１１０に対向するように配置されており、核酸増幅反応部１１０の流路１００（第１流路１０１）に送液される反応溶液は、ヒータ部１４０によって所定の温度が付与される。なお、本実施の形態において、送液滞留部１６０（第２流路１０２）は、ヒータ部１４０に対向しておらず、ヒータ部１４０によって直接温度が付与されない。つまり、第２流路１０２は、ヒータ部１４０の上に位置しないように設けられている。
本実施の形態でも、導入部１２０を介して流路１００に導入された反応溶液は、流路１００内を毛管力（キャピラリ力）により送液される。例えば、実施の形態１と同様に、流路１００の内面を、接触角が鋭角である親水性表面とすることによって、反応溶液を毛管力によって送液することができる。
［核酸増幅方法］
次に、本実施の形態における核酸増幅デバイス３を用いた核酸増幅方法について、図２４Ａ〜図２５を参照しながら、図２６を用いて説明する。図２６は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスにおける温度サイクルを説明するための図であり、（ａ）は反応溶液の先端が核酸増幅反応部を通過する際、（ｂ）は反応溶液の先端が送液滞留部を通過する際の様子を示す図である。
まず、試料となる標的核酸と当該標的核酸を増幅させるための反応試薬とを核酸増幅デバイス３の導入部１２０に導入する。具体的には、実施の形態１と同様に、標的核酸を含む反応溶液と反応試薬とを予め混合しておいた溶液を反応溶液３００として核酸増幅デバイス３の導入部１２０に導入する。
図２４Ｂ及び図２６（ａ）に示すように、導入部１２０に導入された反応溶液３００は、流路１００を通って導入部１２０から核酸増幅反応部１１０に送液される。
核酸増幅反応部１１０では、反応溶液３００に周期的な温度変化を与えることにより反応溶液３００に含まれる標的核酸が増幅する。
具体的には、核酸増幅反応部１１０に到達した反応溶液３００は、図２６（ａ）に示すように、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを繰り返して往復するように流路１００（第１流路１０１）を通ることになる。つまり、実施の形態１と同様に、反応溶液３００は、核酸増幅反応部１１０における高温領域（第１ヒータブロック１４１）と低温領域（第２ヒータブロック１４２）との２つの温度領域を交互に繰り返して順次通過するように送液される。これにより、流路１００（第１流路１０１）を流れる反応溶液３００に対してヒートサイクルを付与することができるので、非常に高速なフローＰＣＲを実現することができる。したがって、反応溶液３００に含まれる標的核酸を高速に増幅させることができる。
その後、図２４Ｂ及び図２６（ｂ）に示すように、反応溶液３００は、送液滞留部１６０に送液されて排出部１３０にまで送液される。つまり、反応溶液３００における先頭（先端）からの一定の部分は、送液滞留部１６０に滞留することになる。具体的には、反応溶液３００は、排出部１３０に存在する部分（先頭部分）から後方に向かった一定の長さの部分が送液滞留部１６０に滞留する。
本実施の形態では、導入部１２０に導入された反応溶液３００の先頭が排出部１３０に到達したときに、標的核酸を含む溶液（本実施形態では反応溶液）の導入部１２０への導入を停止させており、このときに流路１００の全体に反応溶液３００が充填されることになる。
本実施の形態でも、反応溶液３００は、流路１００内を毛管力により送液される。例えば、流路１００（第１流路１０１、第２流路１０２）の内面を、接触角が鋭角である親水性表面とすることによって、反応溶液３００を毛管力によって送液することができる。
［効果及び実験例］
次に、図２７Ａ及び図２７Ｂを用いて、本実施の形態における核酸増幅デバイス３の効果について、本発明に至った経緯及び実験例も含めて説明する。
図２７Ａは、比較例の核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。図２７Ｂは、図２４Ａに示される実施の形態３に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。
比較例の核酸増幅デバイスは、図２４Ａにおける核酸増幅デバイス３において送液滞留部１６０（第２流路１０２）が設けられていない構造のものである。また、図２７Ａ及び図２７Ｂでは、いずれも反応試料（ＰＣＲ試薬）としてヒトゲノムのβ−ａｃｔｉｎ（ベータアクチン）を含む反応溶液を用いており、上述の図１５に示される核酸増幅装置を用いて蛍光量をもとに核酸の増幅量を算出した。
図２７Ａに示すように、比較例の核酸増幅デバイスを用いた場合、ＰＣＲサイクルの増加に従って蛍光量が増加している（つまり核酸の量が増加している）が、ＰＣＲサイクルが一定数を超えると、蛍光量が減少している（つまり核酸の量が減少している）ことが分かる。具体的には、ＰＣＲサイクルが全部で５０サイクルの場合において、３５サイクル以降で蛍光量が減少していることが分かる。
これは、流路内に送液される反応溶液の先頭部分は、反応試薬の流路壁面への吸着や反応溶液の蒸発による濃度変化等によって反応効率が低下したからであると考えられる。
このように比較例の核酸増幅デバイスに示すように、これまでの核酸増幅デバイスでは、反応溶液を高精度に増幅させることが難しいという課題があった。
そこで、本願発明者は、反応効率が低い反応溶液の先頭部分と所望の効率が得られる反応溶液とを分離することで、反応溶液の標的核酸を高精度に増幅させることができるのではないかと考えた。
具体的には、図２４Ａ及び図２４Ｂに示すように、核酸増幅反応部１１０の後段に送液滞留部１６０を設けて、この送液滞留部１６０に、反応効率が低い反応溶液の先頭部分を滞留させることを見出した。これにより、流路１００に送液される反応溶液の先頭部分を、核酸増幅反応部１１０に滞留させることなく送液滞留部１６０に進行させて当該送液滞留部１６０で滞留させることができる。
この結果、反応効率が低い反応溶液の先頭部分と所望の効率が得られる反応溶液とを分離することができる。つまり、反応効率が低い反応溶液の先頭部分を送液滞留部１６０に滞留させることで、核酸増幅反応部１１０では、反応効率が低下しておらず所望の効率が得られる反応溶液の後段部分を滞留させることができる。
このように、送液滞留部１６０を設けることによって、反応効率が低い反応溶液の先頭部分を核酸増幅反応部１１０から除外することができるので、ＰＣＲサイクルが増加し続けても所望の蛍光量（信号値）を確保することができる。
実際に、送液滞留部１６０が設けられた核酸増幅デバイス３を用いた場合は、図２７Ｂに示すように、ＰＣＲサイクルの増加に従って蛍光量が減少することなく増加し続けていることが分かる。つまり、ＰＣＲサイクルの増加に従って核酸の量が増加し続けていることが分かる。
また、図２７Ａに示すように、送液滞留部１６０を設けていない場合は、全てのＰＣＲサイクル（５０サイクル）のうちの最後の１５サイクル（１５／５０＝３０％）において反応効率が低下している。そこで、反応溶液の標的核酸としてヒトゲノムを用いる場合は、第２流路１０２の容積は、流路１００全体の容積の３０％以上にするとよい。
なお、図２７Ａでは、５０サイクルが最大となっているが、実験結果によれば、最大サイクルが６０サイクルの場合も７０サイクルの場合も、反応効率が低下するのは、先頭部分から１５サイクルの部分であることが分かった。この傾向は、少なくとも最大サイクルが１５０サイクルの場合にまで見られると考えられる。
したがって、反応効率が低い反応溶液の先頭部分を適切に排除するには、送液滞留部１６０における流路１００（第２流路１０２）の容積を、流路１００全体の容積の少なくとも１０％以上にするとよい。つまり、送液滞留部１６０に滞留させる反応溶液の体積（滞留体積）は、流路１００全体に充填される反応溶液の全体の体積の１０％以上にするとよい。これにより、図２７Ｂに示すように、反応効率を低下させることなく、標的核酸を高精度に増幅させることができる。
ここで、本実施の形態における核酸増幅デバイス３の送液特性について、図２８を用いて説明する。図２８は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスを用いて反応溶液を送液した場合における送液時間と溶液先頭位置との関係を示す図である。なお、送液時間は、送液を開始してからの時間であり、溶液先頭位置は、流路における反応溶液の先頭（溶液先頭）の位置である。また、反応試料としては、β−ａｃｔｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）及びヒトゲノムＤＮＡを含む溶液を用いた。
図２８に示すように、０ｍｍから７６０ｍｍまでの領域（（i）の領域）においては、反応溶液の先頭は核酸増幅反応部１１０に位置し、７６０ｍｍから１２６０ｍｍまでの領域（（ii）の領域）において、反応溶液の先頭は送液滞留部１６０に位置することが分かる。
また、反応溶液は、６分間で核酸増幅反応部１１０に充填され、その後、１２分間で送液滞留部１６０に充填されることも分かる。
この結果、送液滞留部１６０での平均送液速度は、約０．６８ｍｍ／ｓであった。本実施の形態では、このような送液滞留部１６０による後続の反応溶液の送液制御によって、効率のよい核酸増幅反応を実現することができた。
また、本実施の形態における核酸増幅デバイス３の増幅特性を評価するための実験結果について、図２９、図３０及び図３１を用いて説明する。
図２９は、本発明の実施の形態３に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液ＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図であり、上述の図１５の核酸増幅装置を用いて測定したときの光学検出結果を示している。
この実験でも、反応試料として、β−Ａｃｔｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）及びヒトゲノムＤＮＡを含む溶液を用いた。
また、ヒトゲノムＤＮＡの濃度としては、最終濃度が、３２００ｐｇ／ｕｌ、４００ｐｇ／ｕｌ、４０ｐｇ／ｕｌ、４ｐｇ／ｕｌのそれぞれの場合で増幅特性の評価を行った。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、ヒトゲノムＤＮＡを含まない溶液での増幅特性の評価も行った。
図２９に示すように、ヒトゲノムＤＮＡの濃度がいずれの場合でも、ＰＣＲサイクルの増加に伴って、蛍光量が増加している、つまり核酸の量が増加していることが分かる。
また、図３０は、図２９におけるヒトゲノムＤＮＡの初期濃度に対する増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示している。図３０において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、それぞれヒトゲノムＤＮＡの最終濃度が、３２００ｐｇ／ｕｌ、４００ｐｇ／ｕｌ、４０ｐｇ／ｕｌ、４ｐｇ／ｕｌ、０ｐｇ／ｕｌ（ＮＣ）についての画像を示している。
図３０に示すように、すべての初期濃度について、ＤＮＡが所望に増幅していることが分かる。
また、図３１は、図２９における反応試料（ヒトゲノムＤＮＡ）の濃度と立ち上がる時のしきいサイクルとの関係を示している。
図３１に示すように、ヒトゲノムＤＮＡの初期濃度に依存して、ＰＣＲの立ち上がる時のサイクルが異なっていることが分かる。立ち上がる時のしきいサイクルを、最大値（飽和値）の例えば１０％程度となるサイクルと定義すれば、図３１に示すように、線形性の高い検量線を得ることができ、初期濃度の定量が可能となる。
以上、本実施の形態における核酸増幅デバイス３によれば、実施の形態１、２と同様に、キャピラリ力によって反応溶液を送液することができるので、外部ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる。したがって、標的核酸の核酸増幅を低コストかつ簡便に行うことができる。
さらに、本実施の形態における核酸増幅デバイス３では、核酸増幅反応部１１０の後段に、反応溶液を滞留させるための送液滞留部１６０が設けられている。具体的には、核酸増幅反応部１１０に設けられた第１流路１０１から送液される反応溶液を、送液滞留部１６０に設けられた第２流路１０２に滞留させている。
これにより、核酸増幅反応部１１０から反応効率が低い反応溶液の先頭部分を除外することができるので、反応溶液の標的核酸を高精度に増幅させることができる。
また、本実施の形態における核酸増幅デバイス３では、反応溶液が流路１００内を毛管力により送液される。
これにより、シリンジポンプ等の外部ポンプを用いることなく、簡便に反応溶液を送液することができる。したがって、低コストで標的核酸の核酸増幅を行うことができる。
また、本実施の形態における核酸増幅デバイス３では、核酸増幅反応部１１０には、温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域が存在し、流路１００がこの２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように構成されている。
これにより、フローＰＣＲを実現することができるので、高速で核酸を増幅させることができる。
また、本実施の形態における核酸増幅デバイス３では、送液滞留部１６０における流路１００（第２流路１０２）に、蛇行流路が含まれている。
これにより、小さなスペースであっても比較的に大きな容積で第２流路１０２を設けることができる。したがって、省スペースで反応溶液を滞留させることができる。
（変形例）
以下、本発明の実施の形態３の変形例に係る核酸増幅デバイスについて説明する。なお、以下に説明する核酸増幅デバイスは、上記の実施の形態３における核酸増幅デバイス３と同様の構造であり、各変形例において特徴となる構成のみを説明する。
（実施の形態３の変形例１）
図３２は、本発明の実施の形態３の変形例１に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図３２に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス３Ａでは、送液滞留部１６０Ａにおける流路１００（第２流路１０２）には、反応溶液の送液方向に向かって断面積が漸次大きくなる断面積拡大部（断面積拡大領域）が含まれている。
具体的には、送液滞留部１６０Ａの断面積拡大部における流路１００（第２流路１０２）は、上流から下流にかけて流路１００（第２流路１０２）の幅が漸次広がるテーパ状となっている。なお、本変形例において、送液滞留部１６０Ａの断面積拡大部における流路１００の深さは一定である。
このように、本変形例における核酸増幅デバイス３Ａでは、送液滞留部１６０Ａの流路１００（第２流路１０２）の断面積が漸次大きくなっている。これにより、大きな体積の反応溶液をスムーズに送液することができる。したがって、反応溶液を短時間で送液滞留部１６０Ａに滞留させることができる。
（実施の形態３の変形例２）
図３３は、本発明の実施の形態３の変形例２に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図３３に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス３Ｂにおける送液滞留部１６０Ｂは、変形例１における送液滞留部１６０Ａと同様に、断面積拡大部を有する。
さらに、本変形例では、送液滞留部１６０Ｂ（第２流路１０２）の断面積拡大部に複数のピラー１７０が設けられている。各ピラー１７０は、例えば平面視形状が円柱状であり、第２流路１０２内に立てられている
このように、本変形例における核酸増幅デバイス３Ｂでは、送液滞留部１６０Ｂ（第２流路１０２）の断面積拡大部に複数のピラー１７０を設けている。これにより、反応溶液の先頭の送液面を平面状に揃えることができる。したがって、第２流路１０２に気泡が発生することを抑制できるので、反応溶液の送液が安定する。
つまり、図３２のようにピラーが設けられていないと、第２流路１０２の親水性の壁面に近い反応溶液ほど壁面をつたって先に進むために、第２流路１０２の中央部分に空間（気泡）が発生しやすいが、複数のピラー１７０を設けることによって第２流路１０２の壁面に近い反応溶液が先行して送液されることを抑制できるので、反応溶液の先頭の送液面を揃えることができる。
（実施の形態３の変形例３）
図３４は、本発明の実施の形態３の変形例３に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図３４に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス３Ｃにおける送液滞留部１６０Ｃは、変形例２における送液滞留部１６０Ｂと同様に、断面積拡大部を有しており、かつ、複数のピラー１７０を有する。
さらに、本変形例では、複数のピラー１７０が規則的に並んでおり、かつ、複数のピラー１７０の各々の平面視形状は略菱形となっている。これにより、反応溶液の先頭の送液面を均一にすることができる。
なお、平面視形状が略菱形とは、菱形に限らず、菱形の角に丸みを帯びた形状のものも含まれる。
（実施の形態３の変形例４）
図３５は、本発明の実施の形態３の変形例４に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図３５に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス３Ｄにおける送液滞留部１６０Ｄは、上記変形例３における送液滞留部１６０Ｃと同様に、断面積拡大部を有しており、かつ、平面視形状が略菱形の複数のピラー１７０を有する。
さらに、本変形例では、複数のピラー１７０の各々の１つの辺が、送液滞留部１６０Ｄの断面積拡大部における第２流路１０２の側面と略平行である。これにより、反応溶液の先頭の送液面をさらに均一にすることができる。
また、本変形例では、複数のピラー１７０が等間隔で並んでいる。これにより、反応溶液の先頭の送液面を一層均一にすることができる。
（実施の形態３の変形例５）
図３６は、本発明の実施の形態３の変形例５に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図３６に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス３Ｅにおける送液滞留部１６０Ｅでは、第２流路１０２が核酸増幅反応部１１０の流路１００（第１流路）の断面積よりも大きい断面積を有する。これにより、省スペースで大きな容積の反応溶液を送液滞留部１６０（第２流路）で滞留させることができる。
（実施の形態３の変形例６）
図３７は、本発明の実施の形態３の変形例６に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図３７に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス３Ｆにおける送液滞留部１６０Ｆでは、第２流路１０２の一部が分岐されている。なお、本変形例では、第２流路１０２が６つに分岐されているが、これに限らない。例えば、第２流路１０２は、Ｙ字状の２つに分岐されていてもよいし、それ以外の本数に分岐されていてもよい。
このように、第２流路１０２の一部が分岐されて複数本の第２流路１０２とすることによって、スムーズに流路１００を連結するとともに、省スペースで大きな容積の反応溶液を送液滞留部１６０で滞留させることができる。
（その他の変形例）
以下、上記実施の形態における核酸増幅デバイスのその他の変形例について説明する。
（変形例１）
図３８は、本発明の変形例１に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
本変形例における核酸増幅デバイスでは、少なくとも核酸増幅反応部１１０における流路１００に、送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれている。この構成により、反応溶液３００の送液速度を一定にすることができる。
具体的には、図３８に示すように、流路１００は、流路１００の断面積が単調減少するように、深さが一定で幅が漸次減少するような先細りテーパ構造である。なお、流路１００は、幅が一定で深さが漸次浅くなるようなテーパ構造としてもよい。
この構成により、圧力損失及びキャピラリ力を連続的に変化させることができるので、反応溶液の送液速度をより一定に保つことができる。
また、本変形例のように、流路１００の深さを一定にすることによって、エッチング等によって流路１００を一括して容易に作製することができる。さらに、流路１００の深さを一定にすることによって、上述のように流路１００の上方からレーザ光をスキャンして光学測定を行う際に測定光の光路長を一定に保つことができる。これにより、測定精度を向上させることができる。例えば、核酸の増幅量を精度よく算出することができる。
（変形例２）
図３９は、本発明の変形例２に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
本変形例における核酸増幅デバイスは、変形例１と同様に、少なくとも核酸増幅反応部１１０における流路１００に、送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれている。これにより、反応溶液の送液速度を一定にすることができる。
本変形例が変形例１と異なる点は、断面積が減少する領域における流路１００が、蛇行する複数のライン状の主流路１００ａによって構成されており、さらに、この主流路１００ａの断面積が送液方向に沿ってラインごとに減少している点である。本変形例では、送液方向に沿ってラインごとに主流路１００ａを細く（幅を狭く）することで、流路１００の断面積を減少させている。なお、各ラインにおける主流路１００ａの幅及び深さは一定である。
この構成より、流路１００を直線状とすることができるので、変形例１と比べて、流路１００の設計及び作製が容易である。また、流路１００の深さを一定にすることによって、エッチング等によって流路１００を一括して容易に作製することができるとともに、流路１００の上方からレーザ光をスキャンして光学測定を行う際に測定光の光路長を一定に保つことができるので、測定精度を向上させることができる。
（変形例３）
図４０は、本発明の変形例３に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
本変形例における核酸増幅デバイスは、変形例１と同様に、少なくとも核酸増幅反応部１１０における流路１００に、送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれている。これにより、反応溶液の送液速度を一定にすることができる。
本変形例が変形例１と異なる点は、図４０に示すように、断面積が減少する領域における流路１００の断面積が流路１００内に設けられたピラー１７０により調整されている点である。
具体的には、流路１００内に円柱状のピラー１７０を所定の間隔で複数本立てることによって、送液方向に沿って流路１００の断面積を部分的に減少させることができる。
この構成により、反応溶液の送液速度を調整することができる。また、ピラー１７０を設けることによって反応溶液中の試料及び試薬の拡散性を向上させることもできる。
（変形例４）
図４１は、本発明の変形例４に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
本変形例における核酸増幅デバイスは、流路１００の一部が分岐されている。具体的には、図４１に示すように、先細りテーパ構造の流路１００の先端が３つに分岐されている。
このように流路１００の一部を分岐させることによって、反応溶液３００の液先端（先頭部分）の送液速度を制御するだけではなく、反応溶液３００の液内部の送液速度も制御することができる。
（その他）
以上、本発明に係る核酸増幅デバイス及び核酸増幅方法等について、実施の形態及び変形例に基づいて説明したが、本発明は、上記実施の形態及び変形例に限定されるものではない。
例えば、上記実施の形態及び変形例では、核酸増幅反応部１１０における流路１００を蛇行流路として標的核酸を含む反応溶液に温度変化を繰り返し与えるフローＰＣＲとしたが、フローＰＣＲとせずに標的核酸を含む反応溶液に温度変化を繰り返し与えるようなＰＣＲとしてもよい。但し、上記実施の形態のようにフローとした方が効率良くＰＣＲを実施することができる。
また、上記実施の形態及び変形例では、流路１００を蛇行流路としたが、これに限らない。例えば、複数の高温領域（９５℃）と複数の低温領域（６０℃）とを交互にライン状に配列して、その上に直線状の流路が形成された基板を配置することによって、流路が高温領域と低温領域とを交互に通過するように構成してもよい。
また、上記実施の形態及び変形例では、ヒータ部１４０は２つの温度領域としたが、互いに温度が異なる３つ以上の温度領域としてもよい。この場合、流路は、反応溶液が異なる複数の温度領域を周期的に通過するように構成されていればよい。
また、上記実施の形態及び変形例では、複数の温度領域の各温度の設定は、ヒータブロックで行ったが、ペルチェ素子等の他の温度制御部材を用いて温度設定してもよい。
その他、各実施の形態及び変形例に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本発明に含まれる。
１、２、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、３、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ 核酸増幅デバイス
１０ 第１基板
１１ 第１凹部
１２ 第２凹部
１３ 溝部
１４、２４ 親水膜
１５ シリコン酸化膜
２０ 第２基板
２１ 第１貫通孔
２２ 第２貫通孔
１００ 流路
１００ａ 主流路
１００ｂ 副流路
１００ｃ 導入流路
１００ｄ 排出流路
１０１ 第１流路
１０２ 第２流路
１１０ 核酸増幅反応部
１２０ 導入部
１２０ａ 第１導入部
１２０ｂ 第２導入部
１３０ 排出部
１４０ ヒータ部
１４１ 第１ヒータブロック
１４２ 第２ヒータブロック
１５０ 混合部
１６０、１６０Ａ、１６０Ｂ、１６０Ｃ、１６０Ｄ、１６０Ｅ、１６０Ｆ 送液滞留部
１７０ ピラー
２００ 核酸増幅装置
２１０ 温度制御部
２２０ 検出部
２２１ 光出力部
２２２ 受光部
２２３ 光学走査部
２２４ 励起カットフィルタ
２２５ ダイクロイックミラー
３００ 反応溶液

Claims (21)

  1. 標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部と、
    温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域が存在し、かつ、前記導入部に導入された前記反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部と、
    少なくとも前記２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように設けられ、かつ、前記反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路とを備える
    核酸増幅デバイス。
  2. さらに、増幅後の前記標的核酸を含む前記反応溶液を排出するための排出部を備え、
    前記流路は、前記反応溶液の送液方向に垂直な断面における壁面全周が閉じられており、かつ、前記導入部及び前記排出部においてのみ外部空間と繋がっている
    請求項１に記載の核酸増幅デバイス。
  3. 前記流路は、前記毛管力運搬機構として、接触角が鋭角である親水性表面の壁面を有する
    請求項１又は２に記載の核酸増幅デバイス。
  4. 前記反応溶液の送液方向に垂直な断面における前記流路の壁面全周が親水性表面である
    請求項３に記載の核酸増幅デバイス。
  5. 前記流路には、表面が前記親水性表面である親水膜が形成されている
    請求項３又は４に記載の核酸増幅デバイス。
  6. 前記親水膜は、親水部と疎水部とを有する材料によって形成されている
    請求項５に記載の核酸増幅デバイス。
  7. 前記親水膜は、界面活性剤によって形成されている
    請求項６に記載の核酸増幅デバイス。
  8. 前記界面活性剤は、非イオン性の界面活性剤である
    請求項７に記載の核酸増幅デバイス。
  9. さらに、前記反応溶液を滞留させるための送液滞留部を備え、
    前記流路は、前記核酸増幅反応部に設けられた第１流路と、前記送液滞留部に設けられた第２流路とを有し、
    前記第２流路には、前記第１流路から送液される前記反応溶液が滞留する
    請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  10. 前記第２流路の容積は、前記流路全体の容積の１０％以上である
    請求項９に記載の核酸増幅デバイス。
  11. 前記導入部は、複数設けられており、
    さらに、前記複数の導入部と前記核酸増幅反応部との間に設けられた混合部を備え、
    前記複数の導入部の各々は、前記複数の導入部の各々に対応する導入流路を通じて前記混合部において１つに接続されており、
    前記混合部では、前記複数の導入部の各々から導入された複数の溶液が混合されて前記反応溶液となる
    請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  12. 少なくとも前記核酸増幅反応部における前記流路には、前記送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれている
    請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイスを備える核酸増幅装置であって、
    前記核酸増幅反応部の温度を制御するための温度制御部を備える
    核酸増幅装置。
  14. さらに、前記標的核酸の核酸増幅を検出するための検出部を備える
    請求項１３に記載の核酸増幅装置。
  15. 前記検出部は、
    前記核酸増幅デバイスに照射するための光を出力する光出力部と、
    前記核酸増幅デバイスに照射した前記光の反射光を受光する受光部とを備える
    請求項１４に記載の核酸増幅装置。
  16. 前記検出部は、さらに、前記光を前記核酸増幅デバイスの前記流路上を走査するための光学走査部を備える
    請求項１５に記載の核酸増幅装置。
  17. 核酸増幅デバイスを用いて標的核酸を増幅させるための核酸増幅方法であって、
    前記標的核酸と前記標的核酸を増幅させるための反応試薬とを前記核酸増幅デバイスに導入する導入ステップと、
    前記標的核酸と前記反応試薬とを含む反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させる核酸増幅ステップとを含む
    核酸増幅方法。
  18. 前記導入ステップにおいて、前記標的核酸を含む溶液と前記反応試薬とを予め混合した溶液を前記反応溶液として前記核酸増幅デバイスに導入する
    請求項１７に記載の核酸増幅方法。
  19. 前記導入ステップにおいて、前記標的核酸を含む第１溶液と前記反応試薬を含む第２溶液とを前記核酸増幅デバイスに別々に導入し、
    核酸増幅ステップでは、前記第１溶液と前記第２溶液とを前記核酸増幅デバイスにおいて混合した溶液を前記反応溶液として毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させる
    請求項１７に記載の核酸増幅方法。
  20. 前記核酸増幅ステップでは、前記反応溶液に周期的な温度変化を与えることにより前記反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる
    請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
  21. 前記核酸増幅デバイスは、増幅後の前記標的核酸を含む前記反応溶液を排出するための排出部を備え、
    前記毛管力によって送液される前記反応溶液の先端が前記排出部に到達したときに、標的核酸を含む溶液の前記導入部への導入を停止する
    請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
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