JP6473977B2 - 核酸増幅デバイス - Google Patents

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Description

本発明は、核酸増幅デバイスに関する。
核酸増幅デバイスは、試料である標的核酸を増幅させるためのデバイスであり、例えば、標的核酸を含む反応溶液（反応流体）に所望の温度変化を繰り返し与えることによって標的核酸を増幅させる。
また、反応溶液に与える温度変化を高速にする方法として、マイクロ流体デバイスを用いることが知られている。マイクロ流体デバイスは、極めて少量の試料や試薬を含む反応溶液を反応させることが可能なデバイスであり、微小反応デバイス（マイクロリアクタ）や集積型ＤＮＡデバイス、微小電気泳動デバイス等がある。
例えば、特許文献１、２には、デバイスを複数の異なる温度領域に分割しておき、反応溶液が各温度領域を繰り返して通過するように蛇行した流路（蛇行流路）を設けることが開示されている。この構成により、流路内の反応溶液に与える温度変化を高速化できるので、反応溶液として核酸を含む溶液を用いた場合に、高速に核酸増幅を行うことができる。
特開２００２−１８２７１号公報 特許第４９９３２６０号公報
しかしながら、従来の核酸増幅デバイスでは、反応溶液の標的核酸を高精度に増幅させることが難しいという課題がある。
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、反応溶液を高精度に増幅できる核酸増幅デバイスを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様は、標的核酸を含む反応溶液を送液するための流路を備える核酸増幅デバイスであって、前記反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部と、前記反応溶液を滞留させるための送液滞留部とを備え、前記流路は、前記核酸増幅反応部に設けられた第１流路と、前記送液滞留部に設けられた第２流路とを有し、前記第２流路には、前記第１流路から送液される前記反応溶液が滞留することを特徴とする。
本発明によれば、反応溶液の標的核酸を高精度に増幅させることができる。
図１Ａは、実施の形態に係る核酸増幅デバイスの斜視図である。 図１Ｂは、実施の形態に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図２は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスの分解斜視図である。 図３は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスの断面図である。 図４は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスにおける温度サイクルを説明するための図である。 図５は、実施の形態に係る核酸増幅装置の構成を示す図である。 図６Ａは、比較例の核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図６Ｂは、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図７は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて反応溶液を送液した場合における送液時間と溶液先頭位置との関係を示す図である。 図８は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いてヒトゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図９は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いてヒトゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合におけるヒトゲノムＤＮＡの初期濃度に対する増幅前後の標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示す図である。 図１０は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いてヒトゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応試料（ヒトゲノムＤＮＡ）の濃度としきいサイクルとの関係を示す図である。 図１１は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて大腸菌ゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図１２は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて大腸菌ゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における大腸菌ゲノムＤＮＡの初期濃度に対する増幅前後の標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示す図である。 図１３は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて大腸菌ゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応試料（大腸菌ゲノムＤＮＡ）の濃度としきいサイクルとの関係を示す図である。 図１４は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図１５は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡの初期濃度に対する増幅前後の標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示す図である。 図１６は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応試料（腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡ）の濃度としきいサイクルとの関係を示す図である。 図１７は、タンパク質であるヒトＩｇＡを検出する際に予め構築される反応コンセプトを説明するための手順を示す図である。 図１８は、図１７における反応系を構築するための手順の一例を説明するための図である。 図１９は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いてヒトＩｇＡタンパク質を含む核酸タグを核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図２０は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いてヒトゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合におけるヒトＩｇＡタンパク質の初期濃度に対する増幅前後の標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示す図である。 図２１は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いてヒトＩｇＡタンパク質を含む核酸タグを核酸増幅させた場合における反応試料（ヒトＩｇＡタンパク質）の濃度としきいサイクルとの関係を示す図である。 図２２は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスの第１変形例の概略構成を示す図である。 図２３は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスの第２変形例の概略構成を示す図である。 図２４は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスの第３変形例の概略構成を示す図である。 図２５は、変形例１に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図２６は、変形例２に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図２７は、変形例３に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図２８は、変形例４に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図２９は、変形例５に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。 図３０は、変形例６に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本発明の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本発明を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。
（実施の形態）
まず、本発明の実施の形態に係る核酸増幅デバイス１００の構成について、図１Ａ、図１Ｂ、図２及び図３を用いて説明する。図１Ａは、実施の形態に係る核酸増幅デバイスの斜視図であり、図１Ｂは、同核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。図２は、同核酸増幅デバイスの分解斜視図であり、図３は、同核酸増幅デバイスの断面図である。
図１Ａ〜図３に示すように、本実施の形態に係る核酸増幅デバイス１００は、試料となる標的核酸を増幅させるためのデバイス（デバイスチップ）であって、導入部１と、核酸増幅反応部２と、送液滞留部３と、排出部４とを備える。
導入部１は、試料となる標的核酸を含む反応溶液が導入される試料導入口（インレット）である。
核酸増幅反応部２は、導入部１に導入された反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応領域である。
送液滞留部３は、反応溶液を滞留させるための送液滞留領域である。つまり、送液滞留部３は、反応溶液の先頭部分を核酸増幅反応部２に滞留させることなく核酸増幅反応部２の先に推進させるための送液推進部である。送液滞留部３は、一定の容量の反応溶液が滞留できるように構成されている。なお、送液滞留部３に滞留する反応溶液は、流れが止まった状態でもよいが、流れが止まっておらず進行している状態でもよい。
排出部４は、核酸増幅反応部２で増幅された標的核酸を含む反応溶液を排出するための試料排出口（ドレイン）である。なお、反応溶液は、排出部４から排出しなくてもよい。
また、核酸増幅デバイス１００は、標的核酸を含む反応溶液を送液するための流路１１０を備える。流路１１０は、反応溶液が一方通行的に流れる反応流路であって、少なくとも核酸増幅反応部（核酸増幅反応領域）２と送液滞留部（送液滞留領域）３とを通るように設けられている。本実施の形態における流路１１０は、１本で構成されており、一方の端部が導入部１に、他方の端部が排出部４に繋がっている。
流路１１０は、核酸増幅反応部２に設けられた第１流路１１１と、送液滞留部３に設けられた第２流路１１２とを有する。第２流路１１２は、送液滞留部３において反応溶液を滞留させるための流路であり、送液滞留部３（第２流路１１２）に送液される反応溶液の先頭部分を含む所定の容量の反応溶液が滞留できるように構成されている。送液滞留部３は核酸増幅反応部２の後段に設けられているので、第２流路１１２には第１流路１１１（核酸増幅反応部２）から送液される反応溶液が滞留する。
第２流路１１２の容積（体積）は、流路１１０全体の容積（体積）の１０％以上であり、好ましくは、流路１１０全体の容積（体積）の３０％以上である。本実施の形態において、第２流路１１２の容積は、流路１１０全体の容積の約３０％である。
本実施の形態において、導入部１を介して流路１１０に導入された反応溶液は、流路１１０内を毛管力（キャピラリ力）により送液される。例えば、流路１１０の内面を、接触角が鋭角である親水性表面とすることによって、反応溶液を毛管力によって送液することができる。
反応溶液（反応流体）は、少なくとも試料となる標的核酸を含む溶液であり、本実施の形態では、標的核酸と標的核酸を増幅させるための反応試薬とを含む水溶液である。なお、反応溶液には、ある種のアルコールや界面活性剤等が含まれていてもよい。
本実施の形態では、核酸増幅デバイス１００を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を実施する場合について説明する。
ＰＣＲ法は、ターゲットＤＮＡを温度サイクルにより増幅させる技術である。反応溶液には、ターゲットＤＮＡの他に、ＰＣＲプライマやポリメラーゼ酵素、バッファー等が含まれている。このような反応溶液に温度サイクルを付与することで、ターゲットＤＮＡを増幅することができる。増幅したＤＮＡの増幅量は、反応検出機構によって検出することができる。
また、本実施の形態における核酸増幅デバイス１００は、マイクロ流路として流路１１０を有するマイクロ流体デバイスである。具体的には、核酸増幅デバイス１００は、第１基板１０と、第２基板２０と、ヒータ部３０とによって構成されている。
ヒータ部３０は、設定温度が異なる第１ヒータブロック３１と第２ヒータブロック３２とを備える。なお、核酸増幅デバイス１００の外形は、例えば縦の長さが４０ｍｍで横の長さが２０ｍｍの略矩形状である。
以下、核酸増幅デバイス１００の各構成部材の詳細構成について、図１Ａ〜図３を用いて詳述する。
［第１基板］
図２に示すように、第１基板１０は、導入部１の一部を構成する第１凹部１１と、排出部４の一部を構成する第２凹部１２と、流路１１０を構成する溝部１３とを備える。第１基板１０は、例えばシリコン基板である。
溝部１３（流路１１０）は、第１凹部１１と第２凹部１２とをつなぐように形成されている。溝部１３（流路１１０）には反応溶液が流れる。具体的には、第１凹部１１（導入部１）に反応溶液が導入されると、当該反応溶液は、第２凹部１２（排出部４）に向かって溝部１３（流路１１０）内を進行する。
図２に示すように、核酸増幅反応部２における流路１１０（第１流路１１１）は、蛇行するように形成された蛇行流路であり、第１ヒータブロック３１（第１温度領域）と第２ヒータブロック３２（第２温度領域）とを交互に繰り返して通過するように構成されている。
具体的に、第１流路１１１は、ライン状の流路を所定間隔毎に折り曲げながら連続的に折り返すように（往復するように）形成されている。第１流路１１１の折り返し回数は、例えば２０〜７０サイクル程度であるが、これに限るものではない。一例として、１サイクルあたりの第１流路１１１の長さは３２ｍｍである。
また、本実施の形態において、送液滞留部３における流路１１０（第２流路１１２）には、蛇行する部分（蛇行流路）が含まれている。具体的に、第２流路１１２は、ライン状の流路を所定間隔毎に折り曲げながら連続的に折り返すように（往復するように）形成されている。第２流路１１２の折り返し回数や流路の向きは、スペースに応じて適宜設計すればよい。なお、本実施の形態において、第２流路１１２は、ヒータ部３０の上に位置しないように設けられている。
図３に示すように、流路１１０を構成する溝部１３の内表面には、シリコン酸化膜１４が形成されている。シリコン酸化膜１４を形成することによって、流路１１０（溝部１３）の壁面（内面）を親水化できる。
このように構成される流路１１０はマイクロ流路であり、例えば断面形状は矩形状である。この場合、流路１１０を構成する溝部１３の流路幅（溝幅）は、例えば２０〜３００μｍ程度であり、溝部１３の深さは５０〜１５０μｍ程度である。
なお、溝部１３の断面形状は、矩形に限らず、半円形又は逆三角形とすることができる。また、第１凹部１１及び第２凹部１２は、例えば円形開口の凹部とすることができる。第１基板１０は、透明基板等の透光性基板及び不透光性基板のいずれであってもよく、また、シリコン基板に限らず、樹脂基板又はガラス基板等であってもよい。
［第２基板］
図１Ａに示すように、第２基板２０は、第１基板１０を覆う蓋部であり、第１基板１０上に配置される。第２基板２０は、例えば、透明樹脂基板又はガラス基板等である。
図２に示すように、第２基板２０には、導入部１の一部として、第２基板２０を貫通する第１貫通孔２１が設けられている。また、第２基板２０には、排出部４の一部として、第２基板２０を貫通する第２貫通孔２２が設けられている。第１貫通孔２１及び第２貫通孔２２は、例えば円形開口を有する貫通孔である。
図３に示すように、第１基板１０上に第２基板２０を載置することによって、溝部１３の開口部分が塞がれて全方位が密閉された流路１１０が構成される。これにより、流路１１０は、反応溶液の送液方向（進行方向）に垂直な断面における壁面全周が閉じられた構成となり、かつ、導入部１及び排出部４においてのみ外部空間と繋がる構成となる。このように、流路１１０の全方位を閉じることによって、流路１１０における毛管力を増強させることができるとともに、送液中に反応溶液が揮発することを抑制できる。
なお、第２基板２０の材料は、樹脂やガラスに限らず、シリコン等であってもよい。
［ヒータ部］
ヒータ部３０は、標的核酸を含む反応溶液を加熱するための加熱装置である。図１Ａ〜図２に示すように、ヒータ部３０は少なくとも核酸増幅反応部２に対向するように配置されており、核酸増幅反応部２の流路１１０（第１流路１１１）に送液される反応溶液は、ヒータ部３０によって所定の温度が付与される。
本実施の形態において、核酸増幅反応部２には、ヒータ部３０として、所定の異なる温度に設定された第１ヒータブロック３１及び第２ヒータブロック３２が配置される。つまり、核酸増幅反応部２には、第１ヒータブロック３１及び第２ヒータブロック３２の２つのヒータブロックによって所定の異なる温度に設定された２つの温度領域が存在する。
なお、第１ヒータブロック３１及び第２ヒータブロック３２は、例えば直方体のアルミニウムやステンレス等の金属からなる金属ブロックを用いたヒータである。ヒータ部３０としては、ヒータブロック以外に、ガラス基板上に金属薄膜を印刷等により形成した金属薄膜ヒータ等を用いることもできる。
第１温度に設定された第１ヒータブロック３１が配置された領域は、第１温度領域である。また、第２温度に設定された第２ヒータブロック３２が配置された領域は、第１温度領域とは異なる温度領域である第２温度領域である。
本実施の形態では、第１ヒータブロック３１の温度が第２ヒータブロック３２の温度よりも高くなるように設定されている。つまり、第１ヒータブロック３１が配置された領域は高温領域であり、第２ヒータブロック３２が配置された領域は低温領域である。
高温領域である第１ヒータブロック３１の温度は、例えば９３℃〜９８℃であり、本実施の形態では、核酸増幅反応の変性反応温度である約９５℃としている。一方、低温領域である第２ヒータブロック３２の温度は、例えば５０℃〜７５℃であり、本実施の形態では、アニール・伸長反応温度である約６０℃としている。
ヒータ部３０は、温度制御部（不図示）に接続される。これにより、第１ヒータブロック３１及び第２ヒータブロック３２の各温度は、温度制御部によって制御することができる。
第１ヒータブロック３１と第２ヒータブロック３２は所定の隙間をあけて並べられている。第１ヒータブロック３１及び第２ヒータブロック３２の上には第１基板１０が配置される。具体的には、第１流路１１１が第１ヒータブロック３１と第２ヒータブロック３２とを跨ぐようにして第１基板１０がヒータ部３０に載置される。これにより、第１流路１１１は、２つの温度領域を複数サイクルで往復するように構成される。
なお、本実施の形態において、送液滞留部３（第２流路１１２）は、ヒータ部３０に対向しておらず、ヒータ部３０によって直接温度が付与されない。
［核酸増幅方法］
次に、核酸増幅デバイス１００を用いた核酸増幅方法について、図１Ａ〜図３を参照しながら、さらに図４を用いて説明する。図４は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスにおける温度サイクルを説明するための図であり、（ａ）は反応溶液の先端が核酸増幅反応部を通過する際、（ｂ）は反応溶液の先端が送液滞留部を通過する際の様子を示す図である。
まず、試料となる標的核酸と当該標的核酸を増幅させるための反応試薬とを核酸増幅デバイス１００の導入部１に導入する。具体的には、標的核酸を含む反応溶液と反応試薬とを予め混合しておいた溶液を反応溶液２００として核酸増幅デバイス１００の導入部１に導入する。例えば、図３に示すように、ピペットを用いて反応溶液２００を導入部１に注入する。
図１Ｂ及び図４（ａ）に示すように、導入部１に導入された反応溶液２００は、流路１１０を通って導入部１から核酸増幅反応部２に送液される。
核酸増幅反応部２では、反応溶液２００に周期的な温度変化を与えることにより反応溶液２００に含まれる標的核酸が増幅する。
具体的には、核酸増幅反応部２に到達した反応溶液２００は、図４（ａ）に示すように、第１ヒータブロック３１と第２ヒータブロック３２とを繰り返して往復するように流路１１０（第１流路１１１）を通ることになる。つまり、反応溶液２００は、核酸増幅反応部２における高温領域（第１ヒータブロック３１）と低温領域（第２ヒータブロック３２）との２つの温度領域を交互に繰り返して順次通過するように送液されるので、加熱と冷却とが交互に繰り返して付与されることになる。これにより、流路１１０（第１流路１１１）を流れる反応溶液２００に対してヒートサイクルを付与することができるので、反応溶液２００に含まれる標的核酸は、高温領域での変性反応と低温領域でのアニール・伸長反応との繰り返しにより増幅する。
このように、送液しながら反応溶液２００を昇降温させることができるので、非常に高速なフローＰＣＲを実現することができる。したがって、反応溶液２００に含まれる標的核酸を高速に増幅させることができる。
その後、図１Ｂ及び図４（ｂ）に示すように、反応溶液２００は、送液滞留部３に送液されて排出部４にまで送液される。つまり、反応溶液２００における先頭（先端）からの一定の部分は、送液滞留部３に滞留することになる。具体的には、反応溶液２００は、排出部４に存在する部分（先頭部分）から後方に向かった一定の長さの部分が送液滞留部３に滞留する。
本実施の形態では、導入部１に導入された反応溶液２００の先頭が排出部４に到達したときに、標的核酸を含む溶液（本実施形態では反応溶液）の導入部１への導入を停止させており、このときに流路１１０の全体に反応溶液２００が充填されることになる。
本実施の形態において、反応溶液２００は、流路１１０内を進行する際、上述のとおり、流路１１０内を毛管力により送液される。例えば、流路１１０（第１流路１１１、第２流路１１２）の内面を、接触角が鋭角である親水性表面とすることによって、反応溶液２００を毛管力によって送液することができる。本実施の形態では、流路１１０の溝部１３の底面部及び両側面の３つの壁面にシリコン酸化膜１４を形成することによって溝部１３の内表面を親水化させて、流路１１０の内壁面を親水性表面としている。
これにより、反応溶液２００は、気液界面に生じる毛管力によって流路１１０内を自送液（Ｓｅｌｆ−ｐｒｏｐｅｌｌｅｄ ｆｌｏｗ）されるので、流路１１０内を自動的に進行する。
したがって、核酸増幅反応部２では、反応溶液２００が流路１１０（第１流路１１１）内を毛管力により送液されながら反応溶液２００に含まれる標的核酸が増幅する。つまり、反応溶液２００は、自動搬送によって流路１１０内に送液されながら核酸増幅反応部２において周期的な温度変化が与えられて、標的核酸が増幅する。
なお、流路１１０の壁面の一部が親水性表面であればよいが、送液方向に垂直な断面における流路１１０の壁面全周が親水性表面である方がよい。この場合、第１基板１０の溝部１３の表面だけでなく、第２基板２０の表面（内面）も親水性表面にすればよい。流路１１０の断面における壁面の親水性表面の割合が大きいほど、反応溶液２００に対する毛管力を大きくすることができる。
［核酸増幅装置］
次に、実施の形態に係る核酸増幅装置３００について、図５を用いて説明する。図５は、実施の形態に係る核酸増幅装置の構成を示す図である。
本実施の形態における核酸増幅装置３００は、図５に示すように、上記の核酸増幅デバイス１００と、核酸増幅デバイス１００における核酸増幅反応部２の温度を制御するための温度制御部３１０とを備える。この構成により、簡便な方法で核酸増幅が可能となる。
図５（ａ）に示すように、本実施の形態における核酸増幅装置３００は、さらに、標的核酸の核酸増幅を検出するための検出部３２０を備える。
検出部３２０は、光学検出系であり、核酸増幅デバイス１００に照射するための光を出力する光出力部３２１と、核酸増幅デバイス１００に照射した光の反射光を受光する受光部３２２と、核酸増幅デバイス１００の流路１１０上に光を走査させるための光学走査部３２３とを備える。
光出力部３２１は、青色光を発するレーザ素子を備えており、例えば中心波長が４８８ｎｍのレーザ光を出力する。受光部３２２は、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）である。なお、検出部３２０は、その他に、励起カットフィルタ３２４及びダイクロイックミラー３２５等の光学素子を備える。
このように、本実施の形態に係る核酸増幅装置３００は、加熱・冷却系（温度制御部３１０）と光学検出系（検出部３２０）との一体評価系としている。このように検出系を一体化することで、簡便な検出装置を実現できる。また、光学検出系とすることにより非接触で核酸の増幅量を検出することができる。
そして、核酸増幅デバイス１００に導入した反応溶液（反応試料、反応試薬）における標的核酸の増幅量を検出する場合、図５（ｂ）に示すように、核酸増幅反応部２における流路１１０（第１流路１１１）と交差する方向にレーザ光をスキャンするとともに反射光を受光する。そして、受光した反射光に基づいて第１流路１１１内の反応溶液中における標的核酸の増幅量を算出する。
これにより、第１ヒータブロック３１と第２ヒータブロック３２とを往復する第１流路１１１のサイクルに応じた核酸の増幅曲線を取得することができる。つまり、第１流路１１１上をレーザ光でスキャンすることによって、第１流路１１１のサイクル毎の核酸の増幅量を、増幅曲線として検出することができる。具体的には、ＰＣＲサイクルの増加に従って核酸の増幅量が増加する増幅曲線が得られる。
本実施の形態では、青色光のレーザ光を反応溶液に照射することによって、青色光を励起光として蛍光発光した緑色光が反射光として戻ってくるように構成されている。この緑色光（反射光）の蛍光量は、核酸の増幅量に応じて変化する。したがって、緑色光の蛍光量を測定することで核酸の増幅量を算出することができる。
［効果及び実験例］
次に、図６Ａ及び図６Ｂを用いて、本実施の形態における核酸増幅デバイス１００の効果について、本発明に至った経緯及び実験例も含めて説明する。
図６Ａは、比較例の核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。図６Ｂは、図１Ａに示される実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。
比較例の核酸増幅デバイスは、図１Ａにおける核酸増幅デバイス１００において送液滞留部３（第２流路１１２）が設けられていない構造のものである。また、図６Ａ及び図６Ｂでは、いずれも反応試料（ＰＣＲ試薬）としてヒトゲノムのβ−ａｃｔｉｎ（ベータアクチン）を含む反応溶液を用いており、上述のように図５に示される核酸増幅装置を用いて蛍光量をもとに核酸の増幅量を算出した。
図６Ａに示すように、比較例の核酸増幅デバイスを用いた場合、ＰＣＲサイクルの増加に従って蛍光量が増加している（つまり核酸の量が増加している）が、ＰＣＲサイクルが一定数を超えると、蛍光量が減少している（つまり核酸の量が減少している）ことが分かる。具体的には、ＰＣＲサイクルが全部で５０サイクルの場合において、３５サイクル以降で蛍光量が減少していることが分かる。
これは、流路内に送液される反応溶液の先頭部分は、反応試薬の流路壁面への吸着や反応溶液の蒸発による濃度変化等によって反応効率が低下したからであると考えられる。
このように比較例の核酸増幅デバイスに示すように、これまでの核酸増幅デバイスでは、反応溶液を高精度に増幅させることが難しいという課題があった。
そこで、本願発明者は、反応効率が低い反応溶液の先頭部分と所望の効率が得られる反応溶液とを分離することで、反応溶液の標的核酸を高精度に増幅させることができるのではないかと考えた。
具体的には、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、核酸増幅反応部２の後段に送液滞留部３を設けて、この送液滞留部３に、反応効率が低い反応溶液の先頭部分を滞留させることを見出した。これにより、流路１１０に送液される反応溶液の先頭部分を、核酸増幅反応部２に滞留させることなく送液滞留部３に進行させて当該送液滞留部３で滞留させることができる。
この結果、反応効率が低い反応溶液の先頭部分と所望の効率が得られる反応溶液とを分離することができる。つまり、反応効率が低い反応溶液の先頭部分を送液滞留部３に滞留させることで、核酸増幅反応部２では、反応効率が低下しておらず所望の効率が得られる反応溶液の後段部分を滞留させることができる。
このように、送液滞留部３を設けることによって、反応効率が低い反応溶液の先頭部分を核酸増幅反応部２から除外することができるので、ＰＣＲサイクルが増加し続けても所望の蛍光量（信号値）を確保することができる。
実際に、送液滞留部３が設けられた核酸増幅デバイス１００を用いた場合は、図６Ｂに示すように、ＰＣＲサイクルの増加に従って蛍光量が減少することなく増加し続けていることが分かる。つまり、ＰＣＲサイクルの増加に従って核酸の量が増加し続けていることが分かる。
また、図６Ａに示すように、送液滞留部３を設けていない場合は、全てのＰＣＲサイクル（５０サイクル）のうちの最後の１５サイクル（１５／５０＝３０％）において反応効率が低下している。そこで、反応溶液の標的核酸としてヒトゲノムを用いる場合は、第２流路１１２の容積は、流路１１０全体の容積の３０％以上にするとよい。
なお、図６Ａでは、５０サイクルが最大となっているが、実験結果によれば、最大サイクルが６０サイクルの場合も７０サイクルの場合も、反応効率が低下するのは、先頭部分から１５サイクルの部分であることが分かった。この傾向は、少なくとも最大サイクルが１５０サイクルの場合にまで見られると考えられる。
したがって、反応効率が低い反応溶液の先頭部分を適切に排除するには、送液滞留部３における流路１１０（第２流路１１２）の容積を、流路１１０全体の容積の少なくとも１０％以上にするとよい。つまり、送液滞留部３に滞留させる反応溶液の体積（滞留体積）は、流路１１０全体に充填される反応溶液の全体の体積の１０％以上にするとよい。これにより、図６Ｂに示すように、反応効率を低下させることなく、標的核酸を高精度に増幅させることができる。
ここで、本実施の形態における核酸増幅デバイス１００の送液特性について、図７を用いて説明する。図７は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて反応溶液を送液した場合における送液時間と溶液先頭位置との関係を示す図である。なお、送液時間は、送液を開始してからの時間であり、溶液先頭位置は、流路における反応溶液の先頭（溶液先頭）の位置である。また、反応試料としては、β−ａｃｔｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）及びヒトゲノムＤＮＡを含む溶液を用いた。
図７に示すように、０ｍｍから７６０ｍｍまでの領域（（ｉ）の領域）においては、反応溶液の先頭は核酸増幅反応部２に位置し、７６０ｍｍから１２６０ｍｍまでの領域（（ｉｉ）の領域）において、反応溶液の先頭は送液滞留部３に位置することが分かる。
また、反応溶液は、６分間で核酸増幅反応部２に充填され、その後、１２分間で送液滞留部３に充填されることも分かる。
この結果、送液滞留部３での平均送液速度は、約０．６８ｍｍ／ｓであった。本実施の形態では、このような送液滞留部３による後続の反応溶液の送液制御によって、効率のよい核酸増幅反応を実現することができた。
（実験結果）
本実施の形態における核酸増幅デバイス１００の増幅特性を評価するための実験結果について、以下説明する。
（実施例１）
まず、ヒトゲノムＤＮＡを検出する例である実施例１について、図８、図９及び図１０を用いて説明する。
図８は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いてヒトゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応溶液ＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図であり、図５の核酸増幅装置を用いて測定したときの光学検出結果を示している。
この実験では、反応試料（ＰＣＲ試薬）として、β−Ａｃｔｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）及びヒトゲノムＤＮＡを含む溶液を用いた。
また、ヒトゲノムＤＮＡの濃度としては、最終濃度が、３２００ｐｇ／ｕｌ、４００ｐｇ／ｕｌ、４０ｐｇ／ｕｌ、４ｐｇ／ｕｌのそれぞれの場合で増幅特性の評価を行った。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、ヒトゲノムＤＮＡを含まない溶液（ヒトゲノムＤＮＡの濃度が０ｐｇ／ｕｌ）での増幅特性の評価も行った。
図８に示すように、ヒトゲノムＤＮＡの濃度がいずれの場合でも、ＰＣＲサイクルの増加に伴って、蛍光量が増加していることが分かる。つまり、核酸の量が増加していることが分かる。
また、図９は、図８におけるヒトゲノムＤＮＡの初期濃度に対する増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示している。図９において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、それぞれヒトゲノムＤＮＡの最終濃度が、３２００ｐｇ／ｕｌ、４００ｐｇ／ｕｌ、４０ｐｇ／ｕｌ、４ｐｇ／ｕｌ、０ｐｇ／ｕｌ（ＮＣ）の増幅産物についての画像を示している。
図９に示すように、ＮＣの場合を除くすべての初期濃度についてＤＮＡ増幅を表す蛍光増幅が見られ、ヒトゲノムＤＮＡが所望に増幅していることが分かる。
また、図１０は、図８における反応試料（ヒトゲノムＤＮＡ）の濃度としきいサイクルとの関係を示している。
図８に示すように、ヒトゲノムＤＮＡの初期濃度に依存して、ＰＣＲが立ち上がる時のサイクルが異なっていることが分かる。ここで、最大値（飽和値）の例えば１０％程度となるサイクルをしきいサイクル（Ｃｔ ｖａｌｕｅ）と定義すれば、図１０に示すように、線形性の高い検量線を得ることができる。この検量線を用いることで、初期のヒトゲノムＤＮＡ濃度の定量が可能となる。
（実施例２）
次に、大腸菌ゲノムＤＮＡを検出する例である実施例２について、図１１、図１２及び図１３を用いて説明する。
図１１は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて大腸菌ゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応溶液ＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図であり、図５の核酸増幅装置を用いて測定したときの光学検出結果を示している。
この実験では、反応試料（ＰＣＲ試薬）のポリメラーゼ酵素として、タカラバイオ社製のSpeedSTAR HS DNA Polymerase kit を用いた。このキットには、ポリメラーゼ酵素のほかに、緩衝液や反応に必要なデオキシヌクレオチドミックス（dNTP Mix）が含まれる。具体的には、本キットの１０×Fast buffer I、０．２ｍＭ dNTP Mix、及び、０.１５Ｕ／μｌのSpeed STAR HS DNA Polymeraseを用い、１ｕｇ／ｕｌのウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin;BSA）と、３００ｎＭのフォワードプライマ（5’-CGGAAGCAACGCGTAAACTC-3’）、３００ｎＭのリバースプライマ(5’-TGAGCGTCGCAGAACATTACA-3’)、３００ｎＭのTaqManプローブ(5’-FAM-CGCGTCCGATCACCTGCGTC-BHQ1-3’)を加えた。なお、本プライマセットは、大腸菌のuidA遺伝子をターゲットとしており、参考文献１（S.S. Silkie, M.P. Tolcher, K.L. Nelson, J. Microbiol. Method., vol. 72, pp. 275-281 (2008)）に開示されている。なお、これらは一例であり、同様の機能を持つものであれば、他の試薬でもかまわない。
また、大腸菌ゲノムＤＮＡの濃度としては、最終濃度が、１．９ｐｇ／ｕｌ、０．１９ｐｇ／ｕｌ、０．０１９ｐｇ／ｕｌ、０．００１９ｐｇ／ｕｌのそれぞれの場合で増幅特性の評価を行った。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、大腸菌ゲノムＤＮＡを含まない溶液（大腸菌ゲノムＤＮＡの濃度が０ｐｇ／ｕｌ）での増幅特性の評価も行った。
図１１に示すように、大腸菌ゲノムＤＮＡの濃度がいずれの場合でも、ＰＣＲサイクルの増加に伴って、蛍光量が増加していることが分かる。つまり、核酸の量が増加していることが分かる。
また、図１２は、図１１における大腸菌ゲノムＤＮＡの初期濃度に対する増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示している。図１２では、代表として、大腸菌ゲノムＤＮＡの最終濃度が０．１９ｐｇ／ｕｌの増幅産物についての電気泳動の画像を示している。
ＮＣの場合を除くすべての初期濃度についてＤＮＡ増幅を表す蛍光増幅が見られ、大腸菌ゲノムＤＮＡが所望に増幅していることが分かった。また、増幅産物は７０ｂｐにみられ、これは所望するＤＮＡの長さであった。
また、図１３は、図１１における反応試料（大腸菌ゲノムＤＮＡ）の濃度と立ち上がる時のしきいサイクルとの関係を示している。
図１１に示すように、大腸菌ゲノムＤＮＡの初期濃度に依存して、ＰＣＲが立ち上がる時のサイクルが異なっていることが分かる。ここで、増幅前の蛍光値を１としたときに、その増加量が例えば１０％程度となるサイクルをしきいサイクル（Ｃｔ ｖａｌｕｅ）と定義すれば、図１３に示すように、線形性の高い検量線を得ることができる。この検量線を用いることで、初期の大腸菌ゲノム濃度の定量が可能となる。
（実施例３）
次に、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡを検出する例である実施例３について、図１４、図１５及び図１６を用いて説明する。
図１４は、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡを核酸増幅させた場合における反応溶液ＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図であり、図５の核酸増幅装置を用いて測定したときの光学検出結果を示している。
この実験では、反応試料（ＰＣＲ試薬）のポリメラーゼ酵素として、ポリメラーゼ酵素として、タカラバイオ社製のSpeedSTAR HS DNA Polymerase kit を用いた。このキットには、ポリメラーゼ酵素のほかに、緩衝液や反応に必要なデオキシヌクレオチドミックス（dNTP Mix）が含まれる。具体的には、本キットの１０×Fast buffer I、０．２ｍＭ dNTP Mix、及び、０.１５Ｕ／μｌのSpeed STAR HS DNA Polymeraseを用い、１ｕｇ／ｕｌのウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin;BSA）と、３００ｎＭのフォワードプライマ（5’-CAATTTTTCAGGGAATAACATTG-3’）、３００ｎＭのリバースプライマ(5’-AAAGTTCAGATCTTGATGACATTG-3’)、３００ｎＭのTaqManプローブ(5’-FAM-TCAAGAGTTGCCCATCCTGCAGCAA-BHQ1-3’)を加えた。なお、本プライマセットは、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７のeaeA遺伝子をターゲットとしており、参考文献２（D.R. Call, F.J. Brockman, D.P. Chandler, Int. J. Food Microbiol., vol. 67, pp. 71-80 (2001)）に開示されている。なお、これらは一例であり、同様の機能を持つものであれば、他の試薬でもかまわない。
また、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡの濃度としては、最終濃度が、３１ｐｇ／ｕｌ、３．１ｐｇ／ｕｌ、０．３１ｐｇ／ｕｌ、０．０３１ｐｇ／ｕｌのそれぞれの場合で増幅特性の評価を行った。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡを含まない溶液（腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡの濃度が０ｐｇ／ｕｌ）での増幅特性の評価も行った。
図１４に示すように、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡの濃度がいずれの場合でも、ＰＣＲサイクルの増加に伴って、蛍光量が増加していることが分かる。つまり、核酸の量が増加していることが分かる。
また、図１５は、図１４における腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡの初期濃度に対する増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示している。図１５では、代表として、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡの最終濃度が０．３１ｐｇ／ｕｌの増幅産物についての電気泳動の画像を示している。
ＮＣの場合を除くすべての初期濃度についてＤＮＡ増幅を表す蛍光増幅が見られ、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡが所望に増幅していることが分かった。
また、図１６は、図１４における反応試料（腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡ）の濃度と立ち上がる時のしきいサイクルとの関係を示している。
図１４に示すように、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノムＤＮＡの初期濃度に依存して、ＰＣＲが立ち上がる時のサイクルが異なっていることが分かる。ここで、増幅前の蛍光値を１としたときに、その増加量が例えば１０％程度となるサイクルをしきいサイクル（Ｃｔ ｖａｌｕｅ）と定義すれば、図１６に示すように、線形性の高い検量線を得ることができる。この検量線を用いることで、初期の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ゲノム濃度の定量が可能となる。
（実施例４）
次に、タンパク質であるヒトＩｇＡを検出する例である実施例４について説明する。
タンパク質は核酸を持たないため、直接増幅することはできない。そのため、図１７に示す反応系を構築し、最終的にタグ核酸を回収し、増幅及び検出する必要がある。その反応コンセプトは次のとおりである。
まず、基板上に抗ヒトＩｇＡ抗体を固定化し、測定対象物である抗原のヒトＩｇＡと２次抗体である抗ヒトＩｇＡ抗体とを反応させると、図１７に示すように、これら２つの抗体が抗原を挟み込むサンドイッチ構造を形成することができる。このサンドイッチ構造は、ヒトＩｇＡが在しする場合にのみ形成される。２次抗体にはビオチンを修飾しておくことで、ストレプトアビジンと簡単に反応させることができる。さらにこの上に、ビオチンを修飾した核酸タグを反応させると、ビオチンとストレプトアビジンの反応により、この複合体に核酸タグが捕捉される。最後に制限酵素を用いて所望の位置で核酸を切断することによって核酸タグを分離し回収することで、ＰＣＲ増幅が可能になる。
なお、本反応系において、回収される核酸タグの数は、抗原の濃度に比例し、また、後のＰＣＲにおいては、核酸数個レベルからの増幅が可能であるため、本反応系を用いることで、タンパク質を高感度に検出することが可能である。
次に、上述の反応系を実現するための具体的な実験手順について、図１８を参照しながら説明する。図１８は、図１７における反応系を構築するための手順の一例を説明するための図である。
まず、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に抗ヒトＩｇＡ抗体を０．０１ｍｇ／ｍｌになるように調整し、それをプラスチック製のウェルに５０ｕｌ加え、室温で１ｈインキュベートした。これにより、図１８（ａ）に示すように、プラスチック製のウェルに、抗ヒトＩｇＡ抗体が固定化される。
インキュベート後、０．０５ｗｔ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」）で、上記のウェルを５回洗浄した。洗浄後のウェルに、１ｗｔ％のＢＳＡ（ｉｎ ＰＢＳ）を１００ｕｌ加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートした。これは、図１８（ｂ）に示すように、抗ヒトＩｇＡ抗体が固定化されずに露出したウェルの表面にＢＳＡを吸着させることで、後の抗原が非特異的に吸着することを防ぐブロッキングのために用いるものである。インキュベート後、再度ＰＢＳＴで５回洗浄した。
次に、測定対象物であるヒトＩｇＡタンパク質を１０４ｎｇ／ｍｌ、１０３ｎｇ／ｍｌ、１０２ｎｇ／ｍｌ、１０１ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌ（ｉｎ ＰＢＳ）に調整し、それぞれ別々のウェル５０ｕｌずつ加え、室温で１ｈインキュベートした（図１８（ｃ））。
インキュベート後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、ビオチンが修飾されたビオチン化抗ヒトＩｇＡ抗体１３ｎｇ／ｍｌ（ｉｎ ＰＢＳ）をそれぞれ５０ｕｌずつ加えた（図１８（ｄ））。
室温で１ｈインキュベート後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、０．１ｕｇ／ｍｌのストレプトアビジンを５０ｕｌ加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートした（図１８（ｅ））。
ＰＢＳＴで５回洗浄後、５ｐｇ／ｍｌ（ｉｎ ＰＢＳ）に調整したビオチン化核酸タグを５０ｕｌ加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートした（図１８（ｆ））。
ＰＢＳＴで５回、ＰＢＳで３回洗浄した後、制限酵素を加えた。制限酵素は、タカラバイオ社から市販されているＳｓｐＩを用いた。ＳｓｐＩを最終濃度が２Ｕ／ｕｌになるように、同キットに同封されている１０×バッファを用いて調整した後、５０ｕｌ加えた。３７℃で１ｈインキュベートすることで、核酸タグを抗原抗体複合体から分離し（図１８（ｇ））、最後に溶液を回収した。この回収溶液を用いてＰＣＲ増幅を行った（図１８（ｈ））。
今回の実験例では、ヒトＩｇＡタンパク質及び抗ヒトＩｇＡ抗体は、bethyl Laboratories社より入手したものを用いたが、この反応系は測定対象物に応じて適宜変更することができる。また、核酸タグは、以下の方法により作製した。
具体的には、大腸菌uidA遺伝子をターゲットとした、ビオチン化フォワードプライマ（5’-Biotin-GTGACAAAAACCACCCAAGC-3’）とリバースプライマ(5’-TGAGCGTCGCAGAACATTACA-3’)を用い、大腸菌ゲノムを増幅テンプレートとしてＰＣＲを行い、増幅産物を精製することで、核酸タグを作製した。なお、核酸タグは、本実施例に限るものではなく、適宜変更することができる。
図１９は、このようにして得られた核酸タグを増幅テンプレートとして、実施の形態に係る核酸増幅デバイスを用いて核酸増幅させた場合における反応溶液ＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図であり、図５の核酸増幅装置を用いて測定したときの光学検出結果を示している。
この実験では、反応試料（ＰＣＲ試薬）のポリメラーゼ酵素として、ポリメラーゼ酵素として、タカラバイオ社製のSpeedSTAR HS DNA Polymerase kit を用いた。このキットには、ポリメラーゼ酵素のほかに、緩衝液や反応に必要なデオキシヌクレオチドミックス（dNTP Mix）が含まれる。具体的には、本キットの１０×Fast buffer I、０．２ｍＭ dNTP Mix、及び、０.１５Ｕ／μｌのSpeed STAR HS DNA Polymeraseを用い、１ｕｇ／ｕｌのウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin;BSA）と、３００ｎＭのフォワードプライマ（5’-CGGAAGCAACGCGTAAACTC-3’）、３００ｎＭのリバースプライマ(5’-TGAGCGTCGCAGAACATTACA-3’)、３００ｎＭのTaqManプローブ(5’-FAM-CGCGTCCGATCACCTGCGTC-BHQ1-3’)を加えた。なお、本プライマセットは、大腸菌のuidA遺伝子をターゲットとしており、上述の参考文献１に開示されている。なお、これらは一例であり、同様の機能を持つものであれば、他の試薬でもかまわない。
また、ヒトＩｇＡタンパク質の濃度としては、１０４ｎｇ／ｍｌ、１０３ｎｇ／ｍｌ、１０２ｎｇ／ｍｌ、１０１ｎｇ／ｍｌのそれぞれの場合で増幅特性の評価を行った。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、ヒトＩｇＡタンパク質を含まない溶液（ヒトＩｇＡタンパク質の濃度が０ｎｇ／ｍｌ）での増幅特性の評価も行った。
図１９に示すように、ヒトＩｇＡタンパク質の濃度がいずれの場合でも、ＰＣＲサイクルの増加に伴って、蛍光量が増加していることが分かる。つまり、核酸の量が増加していることが分かる。
また、図２０は、図１９におけるヒトＩｇＡタンパク質の初期濃度に対する増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示している。図２０では、代表として、ヒトＩｇＡタンパク質の最終濃度が１０２ｎｇ／ｍｌの増幅産物についての電気泳動の画像を示している。
すべての初期濃度についてＤＮＡ増幅を表す蛍光増幅が見られ、ヒトＩｇＡタンパク質が所望に増幅していることが分かった。なお、０ｎｇ／ｍｌのときにもわずかな増幅は見られるものの、１０１ｎｇ／ｍｌと比較して十分区別可能な増幅である。また、増幅産物は７０ｂｐにみられ、これは所望するＤＮＡの長さであった。
また、図２１は、図１９における反応試料（ヒトＩｇＡタンパク質）の濃度と立ち上がる時のしきいサイクルとの関係を示している。
図１９に示すように、ヒトＩｇＡタンパク質の初期濃度に依存して、ＰＣＲが立ち上がる時のサイクルが異なっていることが分かる。ここで、増幅前の蛍光値を１としたときに、その増加量が例えば１０％程度となるサイクルをしきいサイクル（Ｃｔ ｖａｌｕｅ）と定義すれば、図２１に示すような検量線を得ることができる。この検量線を用いることで、初期のヒトＩｇＡタンパク質濃度の定量が可能となる。
なお、図１８の（ａ）〜（ｈ）までの反応工程は、例えば、図２２に示される核酸増幅デバイス上で実施することができる。図２２に示される核酸増幅デバイスは、図１Ｂに示される核酸増幅デバイス１において、導入部１（試料導入部）と核酸増幅反応部２との間に抗原抗体反応部５が設けられた構成である。
抗原抗体反応部５には、予め測定対象物質と特異的に反応する抗体が固定化されている。導入部１からは図１８の工程で必要な溶液が随時滴下されて抗原抗体反応部５に送液され、反応が進められていく。そして、図１８の(ｇ)の制限酵素の導入と同時に、核酸増幅に必要なＰＣＲ試薬も導入する。これにより、分離した核酸タグと一緒にＰＣＲ試薬を核酸増幅反応部２へと送ることができる。
また、図２３は、図２２の核酸増幅デバイスの変形例である。図２３に示される核酸増幅デバイスでは、抗原抗体反応部５と核酸増幅反応部２との間で流路が分岐されている。分岐された２つの流路の一方は、核酸増幅反応部２及び第１送液滞留部３ａを介して第１排出部４ａに繋がっており、分岐された２つの流路の他方は、第２送液滞留部３ｂを介して第２排出部４ｂに繋がっている。
この場合、図１８の（ａ）から（ｆ）までの工程においては、第１排出部４ａは閉栓しておく。第１排出部４ａを閉栓する場合、例えば第１排出部４ａにシール等を貼付しておけばよい。また、図１８の（ｇ）の制限酵素及びＰＣＲ試薬導入時に、第１排出部４ａを開栓すると同時に第２排出部４ｂを閉栓し、ＰＣＲ試薬と核酸タグとを核酸増幅反応部２へと送液し、ＰＣＲ反応を実行する。
図２３に示すような構成にすることで、抗原抗体反応と核酸増幅反応とで送液経路を分けることができる。これにより、不必要な溶液で核酸増幅反応部２を汚染することがなくなるので、核酸増幅量を高精度に測定することが可能になる。
また、図２４は、図２３の核酸増幅デバイスをさらに変形した例である。図２４に示される核酸増幅デバイスでは、導入部１が２つ以上設けられており、図１８に必要な溶液を全て別々の導入部１から導入することができる。例えば、反応試料は、抗原抗体反応部５に近い導入部１から順次導入して送液される。
図２４に示すような構成にすることで、反応試料の導入を一度に完了することができる。これにより、ユーザの利便性を高めることができる。
（まとめ）
以上、本実施の形態における核酸増幅デバイス１００によれば、核酸増幅反応部２の後段に、反応溶液を滞留させるための送液滞留部３が設けられている。具体的には、核酸増幅反応部２に設けられた流路１１０（第１流路１１１）から送液される反応溶液を、送液滞留部１６０に設けられた流路１１０（第２流路１０２）に滞留させている。
これにより、核酸増幅反応部２から反応効率が低い反応溶液の先頭部分を除外することができるので、反応溶液の標的核酸を高精度に増幅させることができる。
また、本実施の形態における核酸増幅デバイス１００では、反応溶液が流路１１０内を毛管力により送液される。
これにより、シリンジポンプ等の外部ポンプを用いることなく、簡便に反応溶液を送液することができる。したがって、低コストで標的核酸の核酸増幅を行うことができる。
また、本実施の形態における核酸増幅デバイス１００では、核酸増幅反応部２には、温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域が存在し、流路１１０がこの２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように構成されている。
これにより、フローＰＣＲを実現することができるので、高速で核酸を増幅させることができる。
また、本実施の形態における核酸増幅デバイス１００では、送液滞留部３における流路１１０（第２流路１１２）に、蛇行流路が含まれている。
これにより、小さなスペースであっても比較的に大きな容積で第２流路１１２を設けることができる。したがって、省スペースで反応溶液を滞留させることができる。
（変形例）
以下、本発明の変形例に係る核酸増幅デバイスについて説明する。なお、以下に説明する核酸増幅デバイスは、上記の実施の形態における核酸増幅デバイス１００と同様の構造であり、各変形例において特徴となる構成のみを説明する。
（変形例１）
図２５は、変形例１に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図２５に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス１００Ａでは、送液滞留部３Ａにおける流路１１０（第２流路１１２）には、反応溶液の送液方向に向かって断面積が漸次大きくなる断面積拡大部（断面積拡大領域）が含まれている。
具体的には、送液滞留部３Ａの断面積拡大部における流路１１０（第２流路１１２）は、上流から下流にかけて流路１１０（第２流路１１２）の幅が漸次広がるテーパ状となっている。なお、本変形例において、送液滞留部３Ａの断面積拡大部における流路１１０の深さは一定である。
このように、本変形例における核酸増幅デバイス１００Ａでは、送液滞留部３Ａの流路１１０（第２流路１１２）の断面積が漸次大きくなっている。これにより、大きな体積の反応溶液をスムーズに送液することができる。したがって、反応溶液を短時間で送液滞留部３Ａに滞留させることができる。
（変形例２）
図２６は、変形例２に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図２６に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス１００Ｂにおける送液滞留部３Ｂは、変形例１における送液滞留部３Ａと同様に、断面積拡大部を有する。
さらに、本変形例では、送液滞留部３Ｂ（第２流路１１２）の断面積拡大部に複数のピラー３Ｐが設けられている。各ピラー３Ｐは、例えば平面視形状が円柱状であり、第２流路１１２内に立てられている。
このように、本変形例における核酸増幅デバイス１００Ｂでは、送液滞留部３Ｂ（第２流路１１２）の断面積拡大部に複数のピラー３Ｐを設けている。これにより、反応溶液の先頭の送液面を平面状に揃えることができる。したがって、第２流路１１２に気泡が発生することを抑制できるので、反応溶液の送液が安定する。
つまり、図２６のようにピラーが設けられていないと、第２流路１１２の親水性の壁面に近い反応溶液ほど壁面をつたって先に進むために、第２流路１１２の中央部分に空間（気泡）が発生しやすいが、複数のピラー３Ｐを設けることによって第２流路１１２の壁面に近い反応溶液が先行して送液されることを抑制できるので、反応溶液の先頭の送液面を揃えることができる。
（変形例３）
図２７は、変形例３に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図２７に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス１００Ｃにおける送液滞留部３Ｃは、変形例２における送液滞留部３Ｂと同様に、断面積拡大部を有しており、かつ、複数のピラー３Ｐを有する。
さらに、本変形例では、複数のピラー３Ｐが規則的に並んでおり、かつ、複数のピラー３Ｐの各々の平面視形状は略菱形となっている。これにより、反応溶液の先頭の送液面を均一にすることができる。
なお、平面視形状が略菱形とは、菱形に限らず、菱形の角に丸みを帯びた形状のものも含まれる。
（変形例４）
図２８は、変形例４に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図２８に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス１００Ｄにおける送液滞留部３Ｄは、変形例３における送液滞留部３Ｃと同様に、断面積拡大部を有しており、かつ、平面視形状が略菱形の複数のピラー３Ｐを有する。
さらに、本変形例では、複数のピラー３Ｐの各々の１つの辺が、送液滞留部３Ｄの断面積拡大部における第２流路１１２の側面と略平行である。これにより、反応溶液の先頭の送液面をさらに均一にすることができる。
また、本変形例では、複数のピラー３Ｐが等間隔で並んでいる。これにより、反応溶液の先頭の送液面を一層均一にすることができる。
（変形例５）
図２９は、変形例５に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図２９に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス１００Ｅにおける送液滞留部３Ｅでは、第２流路１１２が核酸増幅反応部２の流路１１０（第１流路）の断面積よりも大きい断面積を有する。これにより、省スペースで大きな容積の反応溶液を送液滞留部３（第２流路）で滞留させることができる。
（変形例６）
図３０は、変形例６に係る核酸増幅デバイスの概略構成を示す図である。
図３０に示すように、本変形例に係る核酸増幅デバイス１００Ｆにおける送液滞留部３Ｆでは、第２流路１１２の一部が分岐されている。なお、本変形例では、第２流路１１２が６つに分岐されているが、これに限らない。例えば、第２流路１１２は、Ｙ字状の２つに分岐されていてもよいし、それ以外の本数に分岐されていてもよい。
このように、第２流路１１２の一部が分岐されて複数本の第２流路１１２とすることによって、スムーズに流路１１０を連結するとともに、省スペースで大きな容積の反応溶液を送液滞留部３で滞留させることができる。
（その他）
以上、本発明に係る核酸増幅デバイスについて、実施の形態及び変形例に基づいて説明したが、本発明は、上記実施の形態及び変形例に限定されるものではない。
例えば、上記実施の形態及び変形例では、核酸増幅反応部２における流路１１０を蛇行流路として標的核酸を含む反応溶液に温度変化を繰り返し与えるフローＰＣＲとしたが、フローＰＣＲとせずに標的核酸を含む反応溶液に温度変化を繰り返し与えるようなＰＣＲとしてもよい。但し、上記実施の形態のようにフローとした方が効率良くＰＣＲを実施することができる。
また、上記実施の形態及び変形例では、流路１１０を蛇行流路としたが、これに限らない。例えば、複数の高温領域（９５℃）と複数の低温領域（６０℃）とを交互にライン状に配列して、その上に直線状の流路が形成された基板を配置することによって、流路が高温領域と低温領域とを交互に通過するように構成してもよい。
また、上記実施の形態及び変形例では、ヒータ部３０は２つの温度領域としたが、互いに温度が異なる３つ以上の温度領域としてもよい。この場合、流路は、反応溶液が異なる複数の温度領域を周期的に通過するように構成されていればよい。
また、上記実施の形態及び変形例では、複数の温度領域の各温度の設定は、ヒータブロックで行ったが、ペルチェ素子等の他の温度制御部材を用いて温度設定してもよい。
その他、各実施の形態及び変形例に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本発明に含まれる。
２ 核酸増幅反応部
３、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ 送液滞留部
３Ｐ ピラー
１００、１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ、１００Ｄ、１００Ｅ、１００Ｆ 核酸増幅デバイス
１１０ 流路
１１１ 第１流路
１１２ 第２流路
２００ 反応溶液

Claims (10)

  1. 標的核酸を含む反応溶液を送液するための流路を備える核酸増幅デバイスであって、
    前記反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部と、
    前記核酸増幅反応部の後段に設けられ、前記反応溶液を滞留させるための送液滞留部と、
    前記核酸増幅反応部の前段に設けられ、前記反応溶液が導入される導入部と、
    前記送液滞留部の後段に設けられた排出部とを備え、
    前記流路の一方の端部は、前記導入部に繋がっており、
    前記流路の他方の端部は、前記排出部に繋がっており、
    前記流路は、前記核酸増幅反応部に設けられた第１流路と、前記送液滞留部に設けられた第２流路とを有し、
    前記第１流路及び前記第２流路は、蛇行流路を含み、
    前記第２流路は、前記第１流路から送液される前記反応溶液の先頭部分が滞留できるように構成され、
    前記第１流路は、温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過し、かつ、前記反応溶液の後段部分が滞留できるように構成され、
    前記第２流路の容積は、前記流路全体の容積の３０％以上である
    核酸増幅デバイス。
  2. 前記反応溶液は、前記流路内を毛管力により送液される
    請求項１に記載の核酸増幅デバイス。
  3. 前記流路の内面は、接触角が鋭角である親水性表面である
    請求項１又は２に記載の核酸増幅デバイス。
  4. 前記第２流路には、前記反応溶液の送液方向に向かって断面積が漸次大きくなる断面積拡大部が含まれる
    請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  5. 前記第２流路の前記断面積拡大部に、複数のピラーが設けられている
    請求項４に記載の核酸増幅デバイス。
  6. 前記複数のピラーは、規則的に並んでおり、
    前記複数のピラーの各々の平面視形状は、略菱形である
    請求項５に記載の核酸増幅デバイス。
  7. 前記断面積拡大部は、前記第２流路の幅が広がるように構成されており、
    前記複数のピラーの各々の１つの辺は、前記断面積拡大部における前記第２流路の側面と略平行である
    請求項６に記載の核酸増幅デバイス。
  8. 前記複数のピラーは、等間隔で並んでいる
    請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  9. 前記第２流路は、前記第１流路の断面積よりも大きい断面積を有する
    請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  10. 前記第２流路の一部が分岐されている
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
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