KR20220105173A - 핵산 분석 및 정량화를 위한 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은, 핵산을 증폭 및 정량화하고, 샘플 중의 표적의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본원에 제공된 방법 및 시스템은 기체 투과성 배리어에 의해 외부 환경으로부터 분리된 복수의 구획을 포함하는 디바이스를 사용할 수 있다. 본원에 개시된 특정한 방법은 복수의 구획 내의 핵산 분자를 핵산 증폭 반응을 수행하기에 충분한 조건에 처하게 하는 것을 포함한다. 핵산 분자는 복수의 구획 내에서 제어된 가열에 처하게 하여 핵산 분자의 융점(들)을 나타내는 데이터를 생성할 수 있다.
Description
교차 참조
본원은 2016년 11월 17일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/423,601호를 우선권주장하며, 이는 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
정부 소유권 성명
본 발명은 미국 국립보건원이 수여한 중소기업 혁신 연구 허가 번호 1R43OD023028-01 및 1R43HG009640 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.
마이크로유체 디바이스는 유체를 소규모로 취급하는 구조체를 포함하는 디바이스이다. 통상적으로, 마이크로유체 디바이스는 밀리미터 이하 규모로 작동되며, 마이크로리터, 나노리터 또는 더 작은 양의 유체를 취급한다. 마이크로유체 디바이스에서, 주요 오염 메카니즘은 마이크로구조체 내부에서의 포획된 공기 또는 기포이다. 열가소성 수지의 기체 투과성이 매우 낮아서, 이는 마이크로유체 구조체를 생성하기 위해 열가소성 물질의 사용시 특히 문제가 될 수 있다.
포획된 공기에 의한 오염을 피하기 위해, 종래의 마이크로유체 구조체는 열가소성 물질을 사용한 단순 직선 채널 또는 분지 채널 설계를 사용하거나 또는 높은 기체 투과성 물질, 예컨대 엘라스토머를 사용하여 디바이스를 제조한다. 그러나, 단순 설계는 마이크로유체 디바이스의 가능한 작용성을 제한하며, 엘라스토머 물질은 특히 대규모로 제조하기에 어려우며, 비용이 많이 든다.
마이크로유체 구조체의 한 적용예는 디지털 폴리머라제 연쇄 반응(dPCR)에 있다. dPCR은 다수의 구획의 어레이를 제공하는 마이크로유체 구조체의 각각의 구획에서 핵산 샘플을 하나 이하의 핵산 템플레이트로 희석시키며, 어레이 전체에 걸쳐 PCR 반응을 수행한다. 템플레이트가 성공적으로 PCR 증폭된 구획을 계수하고, 푸아송(Poisson) 통계학을 결과에 적용하여 표적 핵산을 정량화한다. 미지의 샘플의 PCR 증폭 속도와 공지의 qPCR 표준 세트에 대한 속도를 비교하여 템플레이트를 정량화하는 일반적인 정량적 실시간 PCR(qPCR)과 달리, dPCR은 더 높은 감도, 더 우수한 정밀도 및 더 큰 재현 가능성을 나타내는 것으로 입증되었다.
게놈 연구자 및 임상의의 경우, dPCR은 희소 돌연변이 검출, 복제 수 변이 정량화 및 차세대 서열결정 라이브러리 정량화에서 특히 강력하다. 무세포 DNA 및 바이러스 부하 정량화를 사용한 액체 생검을 위한 임상적 설정에서의 잠재적 사용은 dPCR 기술의 가치를 추가로 증가시킨다. 기존의 dPCR 해결책은 엘라스토머 밸브 어레이, 실리콘 관통공 접근법 및 오일 중의 액적의 마이크로유체 캡슐화를 사용하였다. 이용 가능한 dPCR 플랫폼의 증가되는 수에도 불구하고, dPCR은 PCR 증폭 주기 개수의 계수에 의존하는 종래의 qPCR 기술에 비하여 단점이 되었다. 처리량, 사용 용이성, 성능 및 비용의 조합은 dPCR에 대한 시장에서의 채택을 얻기 위한 주요한 장벽이 된다.
본원에는 핵산을 증폭 및 정량화하며, 표적(예, 실제의 또는 의심되는 표적), 예컨대 병원체(예, 박테리아)의 존재 또는 부재를 검출하는데 유용할 수 있는 방법 및 시스템이 제공된다. 본 개시내용은, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응(dPCR)의 사용에 의해 샘플 제조, 샘플 증폭 및 샘플 분석을 가능하게 할 수 있는 방법, 시스템 및 디바이스를 제공한다. 이는 다른 시스템 및 방법에 비하여 핵산을 감소된 비용 및 복잡성으로 증폭 및 정량화시킬 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 시스템은 핵산(예, 데옥시리보핵산, DNA) 서열 변이체의 검출을 위한 고 해상 용융(HRM) 분석을 사용할 수 있다. 본 개시내용의 HRM 방법은 단일 뉴클레오티드 분해능으로 서열 의존성 용융 곡선을 생성할 수 있으며, 임의의 후 증폭 프로세싱 단계가 없는 일부 사례에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 핵산 증폭과의 완벽한 통합을 통해 모두 완료된다. 본 개시내용의 광범위 PCR, HRM 방법 및 시스템과 합하여, 확인될 수 있는 서열 변이체의 폭을 크게 확대시킬 수 있다.
본원은 현재 이용 가능한 용융 곡선 접근법과 관련된 다양한 제한점을 인지한다. 통상의 벌크 PCR/HRM 분석 설계는 유전적 및 후성적 분석에서 수개의 결정적인 요구를 해결하는데 있어서 제한될 수 있다. 결정적인 제한 하나는 PCR 억제제 또는 과잉의 배경 사람 DNA로부터의 간섭으로 인한 부적절한 감도이다. 또 다른 결정적인 제한은 이질 모집단에서 복수의 서열 변이체를 해부하고, 각각의 변이체를 정확하게 정량화시킬 수 없다는 점이다.
본원은 희소 대립유전자 변이체 및 상대적 대립유전자 비의 절대적 양을 결정하는 필요성을 인지한다. 감염 질환에서, 미세한 병원체 부하의 정확한 검출 및 확인 및, 감염을 콜로니화 또는 오염으로부터 구별하기 위한 혼합된 미생물 모집단의 정량적 분해능은 샘플에 공존하는 변이체를 정량적으로 구별하는데 있어서의 중요성을 추가로 강조한다.
본 개시내용은, 디지털 PCR(dPCR)에서의 절대 정량화를 HRM 분석과 통합하는 디지털 HRM 분석 플랫폼을 제공한다. 이는 단일 분자 수준에서 및 고 처리량 방식으로 심층 분석을 제공할 수 있다.
한 구체예에서, 본 개시내용은, 복수의 구획을 포함하며, 복수의 구획의 적어도 하나의 서브세트가 복수의 핵산 분자를 포함하며, 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각의 구획이, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 복수의 구획의 적어도 상기 서브세트 외부의 환경으로, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 외부 환경으로부터 분리하는 적어도 하나의 배리어를 통해, 기체 흐름을 허용하도록 설정되는 디바이스를 제공하는 단계; 복수의 구획의 적어도 서브세트를 제어된 가열에 처하게 하면서, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 신호를 수집하는 단계; 및 수집된 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 적어도 서브세트 내의 복수의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트의 융점을 나타내는 데이터를 수득하는 단계를 포함하는, 복수의 핵산 분자의 분석 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 핵산 분자를 포함하는 디바이스를 제공하기 이전에, 핵산 샘플의 증폭 생성물로서 복수의 핵산 분자를 수득하기에 충분한 조건 하에서, 핵산 샘플 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 핵산 증폭 반응을 수행하기 이전에, 핵산 샘플을 복수의 구획의 적어도 서브세트에 로딩하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 복수의 구획의 적어도 서브세트에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 핵산 샘플 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하는 것은, 핵산 샘플의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트의 내부 전사된 스페이서 영역의 적어도 일부를 증폭시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 프라이머, 데옥시리보뉴클레오티드, 완충제, 보조인자, 삽입 염료 및 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약을 사용한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 시약은 형광체 또는 형광 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 핵산 샘플 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하기 이전에, 핵산 샘플의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트를 삽입 염료와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 제어된 가열에 처하게 하면서, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 신호를 수집하는 것은, 복수의 시점에 걸쳐 수행한다.
일부 실시양태에서, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 제어된 가열에 처하게 하면서, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 신호를 수집하는 것은, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 영상화하여 신호를 수집하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수집된 신호의 프로세싱은 신호를 사용하여 복수의 구획의 적어도 서브세트 내의 복수의 핵산 분자의 적어도 서브세트에 대한 신호 대 온도 데이터를 생성하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 핵산 분자는 병원체를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 병원체는 1종 이상의 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 박테리아는 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실루스 미코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 폴리멕사(Bacillus polymexa), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 투린겐시스(Bacillus thuringensis), 스타필로코쿠스 카피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코쿠스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코쿠스 하에몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코쿠스 호미니스(Staphylococcus hominis), 스타필로코쿠스 렌투스(Staphylococcus lentus), 스타필로코쿠스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스타필로코쿠스 크실로수스(Staphylococcus xylosus), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 악티노박테리아(Actinobacteria), 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 클라미디아에스(Chlamydiaes), 엡실론프로테오박테리아(Epsilonproteobacteria), 피르미쿠테스(Firmicutes), 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 스피로카에탈레스(Spirochaetales) 및 테네리쿠테스(Tenericutes)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 핵산 분자를 포함하는 디바이스를 제공하기 이전에, 복수의 핵산 분자 또는 그의 서브세트를 1종 이상의 박테리아로부터 단리 또는 추출시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 융점을 나타내는 데이터를 사용하여, 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각의 구획 내의 병원체의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 핵산 분자가 유래하는 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 소변, 정액, 점액 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 체액을 포함한다. 다른 실시양태에서, 복수의 핵산 분자가 유래하는 샘플은 환경 샘플이다.
일부 실시양태에서, 디바이스를 제공하는 것은 복수의 핵산 분자를 복수의 구획에 로딩하는 것을 추가로 포함하며, 로딩 중에, 복수의 구획의 적어도 서브세트 내의 기체는 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 복수의 구획의 적어도 서브세트 외부의 환경으로 유동되도록 된다.
일부 실시양태에서, 배리어는 중합체 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 물질은 열가소성 물질이다. 일부 실시양태에서, 배리어는 배리어 전체에 걸쳐 가한 압력차 하에서 기체에 대하여 적어도 부분적으로 투과성이다. 일부 실시양태에서, 배리어는 실질적으로 광학적으로 투명하다. 일부 실시양태에서, 배리어는 약 50 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 두께를 갖는다.
일부 실시양태에서, 디바이스는 적어도 하나의 주입구, 적어도 하나의 유출구 및 복수의 사이폰 어퍼쳐를 포함하는 적어도 하나의 마이크로채널을 포함하며, 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각은 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 적어도 하나의 마이크로채널과 유체 연통한다.
일부 실시양태에서, 복수의 구획은 약 1,000 내지 약 20,000개의 구획을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 핵산 분자는 데옥시리보핵산 분자이다. 다른 실시양태에서, 복수의 핵산 분자는 리보핵산 분자이다.
또 다른 구체예에서, 본 개시내용은, 복수의 구획을 포함하며, 복수의 구획의 적어도 서브세트가 복수의 핵산 분자를 포함하며, 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각의 구획이, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 복수의 구획의 적어도 서브세트 외부의 환경으로, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 외부 환경으로부터 분리시키는 적어도 하나의 배리어를 통해, 기체 흐름을 허용하도록 설정된 디바이스를 제공하는 단계; 복수의 핵산 분자를 사용하여 핵산 증폭 반응을 수행하기에 충분한 조건에 복수의 구획의 적어도 서브세트를 처하게 하여, 복수의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트로부터 증폭 생성물을 생성하는 단계; 복수의 구획의 적어도 서브세트를 상기 조건에 처하게 하면서, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터의 신호를 복수의 시점에 걸쳐 수집하는 단계; 및 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 적어도 서브세트 내의 핵산 분자의 개수를 측정하는 단계를 포함하는, 복수의 핵산 분자의 분석 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 핵산 증폭 반응을 실시하기에 충분한 조건에 처하게 하는 것은 열순환을 포함하며, 신호의 수집은 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각의 구획으로부터의 신호를 열주기당 1회 초과로 수집하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 열순환은 변성 상, 신장 상 및 어닐링 상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 열순환은 플랫 블록 열순환기를 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 프라이머, 데옥시리보뉴클레오티드, 완충제, 보조인자, 삽입 염료 및 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약을 사용한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 시약은 형광체 또는 형광 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터의 신호를 복수의 시점에 걸쳐 수집하는 것은, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 영상화하여 신호를 수집하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 구획의 적어도 서브세트는 동시에 영상화된다. 일부 실시양태에서, 영상화는 2개 이상의 파장에서 형광 방출을 검출하는 검출기를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 적어도 서브세트 내의 핵산 분자의 개수를 측정하는 것은, 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각의 구획에 대한 광학 강도를 측정하는 것을 포함하며, 광학 강도는 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각 내의 증폭 생성물의 양에 비례한다.
일부 실시양태에서, 복수의 핵산 분자를 포함하는 디바이스를 제공하는 것은 복수의 핵산 분자를 복수의 구획에 로딩하는 것을 추가로 포함하며, 로딩 중에, 복수의 구획의 적어도 서브세트 내의 기체는 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 복수의 구획의 적어도 서브세트 외부의 환경으로 유동되도록 된다.
일부 실시양태에서, 배리어는 중합체 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 물질은 열가소성 물질이다. 일부 실시양태에서, 배리어는 배리어 전체에 걸쳐 가한 압력차 하에서 기체에 대하여 적어도 부분적으로 투과성이다. 일부 실시양태에서, 배리어는 실질적으로 광학적으로 투명하다. 일부 실시양태에서, 배리어는 약 50 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 두께를 갖는다.
일부 실시양태에서, 디바이스는 적어도 하나의 주입구 및 적어도 하나의 유출구를 포함하는 적어도 하나의 마이크로채널, 및 복수의 사이폰 어퍼쳐를 포함하며, 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각은 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 적어도 하나의 마이크로채널과 유체 연통한다.
일부 실시양태에서, 복수의 구획은 약 1,000 내지 약 20,000개의 구획을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 핵산 분자는 데옥시리보핵산 분자이다. 다른 실시양태에서, 복수의 핵산 분자는 리보핵산 분자이다.
추가의 구체예에서, 본 개시내용은, 복수의 구획을 포함하며, 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각의 구획이, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 복수의 구획의 적어도 서브세트 외부의 환경으로, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 외부 환경으로부터 분리시키는 적어도 하나의 배리어를 통해, 기체 흐름을 허용하도록 설정되는 디바이스를 수용하도록 설정된 지지 유닛; 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터의 신호를 복수의 시점에 걸쳐 수집하도록 설정된 검출기; 및 검출기에 작동적으로 커플링되며, (i) 복수의 핵산 분자를 사용하여 핵산 증폭 반응을 수행하기에 충분한 조건에, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 처하게 하여, 복수의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트로부터 증폭 생성물을 생성하며; (ii) 복수의 구획의 적어도 서브세트를 (i)에서의 조건에 처하게 하면서, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 수집된 신호를 복수의 시점에 걸쳐 검출기에 의해 수신하며; (iii) 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 적어도 서브세트 내의 핵산 분자의 개수를 측정하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍된 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 포함하는 복수의 핵산 분자의 분석용 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 복수의 핵산 분자를 복수의 구획으로 유도하도록 설정된 유체 흐름 유닛을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 복수의 핵산 분자를 복수의 구획에 로딩하게 유체 흐름 유닛을 유도하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍된다.
또 다른 구체예에서, 본 개시내용은, 복수의 구획을 포함하며, 복수의 구획의 적어도 서브세트의 각각의 구획이, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 복수의 구획의 적어도 서브세트 외부의 환경으로, 복수의 구획의 적어도 서브세트를 외부 환경으로부터 분리시키는 적어도 하나의 배리어를 통해, 기체 흐름을 허용하도록 설정된 디바이스를 수용하도록 설정된 지지 유닛; 복수의 구획의 적어도 서브세트를 제어된 가열에 처하게 하도록 설정된 열 유닛; 복수의 구획의 적어도 하나의 서브세트로부터의 신호를 수집하도록 설정된 검출기; 및 열 유닛 및 검출기에 작동적으로 커플링되며, (i) 복수의 구획의 적어도 서브세트를 제어된 가열에 처하게 하도록 열 유닛을 유도하며; (ii) 복수의 구획의 적어도 서브세트가 제어된 가열에 처하도록 하면서, 복수의 구획의 적어도 서브세트로부터 수집된 신호를 검출기에 의해 수신하며; (iii) (ii)에서 수집된 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 적어도 서브세트 내의 복수의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트의 융점을 나타내는 데이터를 수득하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍된 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 포함하는, 복수의 핵산 분자의 분석용 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 복수의 핵산 분자를 복수의 구획으로 유도하도록 설정된 유체 흐름 유닛을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 복수의 핵산 분자를 복수의 구획에 로딩하게 유체 흐름 유닛을 유도하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍된다.
본 개시내용의 또 다른 구체예는, 하나 이상의 컴퓨터 프로세서에 의해 실행시, 상기 방법 또는 본원의 그 밖의 방법 중 어느 것을 수행하는 기기 실행 가능한 코드를 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 구체예는, 하나 이상의 컴퓨터 프로세서 및 이에 커플링된 컴퓨터 메모리를 포함하는 시스템을 제공한다. 컴퓨터 메모리는 하나 이상의 컴퓨터 프로세서에 의해 실행시, 상기 방법 또는 본원의 그 밖의 방법 중 어느 것을 수행하는 기기 실행 가능한 코드를 포함한다.
본 개시내용의 추가의 구체예 및 잇점은 본 개시내용의 예시의 실시양태만이 제시 및 기재된 하기 상세한 설명으로부터 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 인식되는 바와 같이, 본 개시내용은 다른 및 상이한 실시양태가 가능하며, 그의 수개의 세부사항은 모두 본 개시내용으로부터 벗어남이 없이 다양한 명백한 사항으로 변형이 가능하다. 따라서, 도면 및 상세한 설명은 제한으로서가 아니라 본질적으로 예시로서 간주되어야 한다.
참조 문헌 인용
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개개의 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것을 나타내는 바와 동일한 정도로 참고로 본원에 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 상세하게 설명된다. 본 발명의 특징 및 잇점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 사용되는 예시의 실시양태 및 첨부되는 도면(또한 본원에서 "도면" 및 "도")을 설명하는 하기의 상세한 설명을 참조하면 얻게 될 것이다.
도 1A 및 1B는 마이크로유체 구조체의 예를 도시하며; 도 1A는 상부로부터 바라본 구조체를 도시하며, 도 1B는 구조체의 단면을 도시한다.
도 2A 및 2B는 마이크로유체 디바이스 내의 마이크로챔버, 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널의 예시의 배열을 개략적으로 도시하며; 도 2A는 평행한 서브-채널 및 하나 이상의 크로스채널을 사용하여 마이크로챔버의 그리드를 형성하는 실시양태를 도시하며; 도 2B는 서펜틴(serpentine) 패턴에서의 단일 마이크로채널이 마이크로챔버의 6각형 그리드를 형성하는 실시양태를 도시한다.
도 3A-3D는 예시의 마이크로유체 디바이스의 사용을 위한 방법을 도시하며; 도 3A는 시약을 저압에서 적용하는 단계를 도시하며; 도 3B는 마이크로유체 디바이스 전체에 걸쳐 압력차를 적용하여 구획화 및 탈기시키도록 하는 단계를 도시하며; 도 3C는 마이크로채널을 청소하기 위해 저압에서 유체를 적용하는 단계를 도시하며; 도 3D는 방법의 완료 후 시스템의 상태를 도시한다.
도 4는 마이크로유체 디바이스의 제조 방법을 개략적으로 도시한다.
도 5는 마이크로유체 디바이스와 함께 사용하고자 하는 예시의 디지털 PCR 프로세스를 개략적으로 도시한다.
도 6은 단일 기기에서 핵산 증폭 및 정량화 방법을 수행하기 위한 기기를 개략적으로 도시한다.
도 7은 본원에 제공된 방법을 수행하기 위해 프로그래밍되거나 또는 달리 설정된 예시의 컴퓨터 제어 시스템을 개략적으로 도시한다.
도 8A 및 8B는 마이크로유체 디바이스 및 샘플 구획화를 도시하며; 도 8A는 열가소성 수지를 마이크로성형시켜 형성된 마이크로유체 디바이스를 도시하며; 도 8B는 샘플 구획화 공정의 형광 화상을 도시한다.
도 9는 핵산 샘플을 프로세싱하기 위한 예시의 시스템을 도시한다.
도 10A-10D는 평균 대략 1개의 핵산 템플레이트 복제를 포함하는 구획 및, 0개의 핵산 템플레이트 복제(템플레이트 제어 없음 또는 NTC)를 포함하는 구획의 핵산 증폭의 2색(샘플 신호를 나타내는 1색 및 정규화 신호를 나타내는 다른 1색) 형광 검출을 나타내며; 도 10A는 증폭후 구획당 0개의 복제(NTC)를 나타내며; 도 10B는 구획당 대략 1개의 복제를 포함하는 구획의 핵산 증폭을 나타내며; 도 10C는 형광 색상 둘다의 NTC 형광 강도의 플롯을 나타내며; 도 10D는 증폭된 샘플의 형광 색상 둘다의 형광 강도의 플롯을 나타낸다.
도 11A-11C는 정량적 디지털 폴리머라제 연쇄 반응(qdPCR) 프로세스의 표현을 나타내며; 도 11A는 예시의 마이크로유체 디바이스의 구획의 표현을 나타내며; 도 11B는 예시의 디바이스의 각각의 구획에서의 샘플의 증폭 역학을 나타내며; 도 11C는 도 11B에 나타낸 증폭 역학에 적용된 qdPCR 프로세스의 결과를 나타낸다.
도 12A-12B는 샘플 프로세싱 및/또는 분석을 위한 디바이스를 도시하며; 도 12A는 디바이스를 도시하며; 도 12B는 디바이스의 하나의 반응 어레이 내의 구획의 일부의 배열을 도시한다.
도 13은 디바이스 유체 제어를 제공하는데 사용하기 위한 공압식 유닛과 함께, 샘플 프로세싱 및/또는 분석을 위한 디바이스의 개략적 표현을 도시한다.
도 14A-14B는 플랫 블록 열순환 유닛을 개략적으로 도시하며; 도 14A는 플랫 블록 열순환 유닛을 도시하며; 도 14B는 공압식 클램프가 추가된 도 14A의 플랫 블록 열순환 유닛을 도시하며, 디바이스, 예컨대 도 12A의 디바이스가 열순환 유닛에 로딩될 수 있도록 클램프는 개방되어 있다.
도 15는 열적, 광학적, 공압식 및 기계적 유닛을 포함한 샘플 프로세싱 및/또는 분석용 완전 qdPCR 시스템을 도시한다.
도 16은 샘플 프로세싱 및/또는 분석용 qdPCR을 수행하기 위한 방법을 도시한다.
도 17A-17B는 핵산 분자를 프로세싱하기 위한 예시의 시스템을 도시하며; 도 17A는 핵산 분자를 프로세싱하기 위한 전체 예시의 시스템을 도시하며; 도 17B는 샘플 프로세싱 및/또는 분석용 디바이스 및 영상화 부품을 포함한 에시의 시스템의 일부를 도시한다.
도 18은 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 디바이스에서 상이한 조건하에서 구획의 서브세트의 증폭후 촬영한 샘플 화상을 도시한다.
도 19는 도 17A-17B의 예시의 시스템을 사용하여 촬영하고, 도 18의 화상에 해당하는 샘플 qdPCR 데이터를 도시한다.
도 20A-20B는 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 디바이스의 차동 로딩을 도시하며; 도 20A는 상이한 개수의 핵산 분자를 포함하는 디바이스에서의 구획의 서브세트의 화상을 도시하며; 도 20B는 도 20A의 화상의 푸아송 분석을 도시한다.
도 21은 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 차동 로딩된 디바이스에 대한 화상 및 해당 밀도 및 구획 점유를 도시한다.
도 22A-22B는 고 해상 용융(HRM) 분석을 개략적으로 도시하며; 도 22A는 디지털 및 벌크 HRM 분석 사이의 차이를 도시하며; 도 22B는 구획의 점유를 결정하기 위한 상이한 박테리아 종에 대한 HRM 곡선 및 그의 용도를 도시한다.
도 23A-23E는 각종 박테리아 종에 대한 HRM 데이터를 도시하며; 도 23A는 각종 박테리아에 대한 16S 및 내부 전사 스페이서(ITS) 복합 유도체 HRM 곡선을 도시하며; 도 23B는 바실루스(Bacilus) 속의 상이한 종에 대한 HRM 곡선을 도시하며; 도 23C는 스타필로코쿠스 속의 상이한 종에 대한 HRM 곡선을 도시하며; 도 23D는 에스. 뉴모니아의 각종 종에 대한 ITS HRM 곡선을 도시하며; 도 23E는 문(phylum)에 의해 체계화된 상이한 박테리아 종에 대한 ITS 서열 상동성의 히트 맵(heat map)을 도시한다.
도 24A-24B는 HRM 분석을 개략적으로 도시하며; 도 24A는 복수의 DNA 분자를 포함한 샘플로부터 DNA의 구획화를 도시하며; 도 24B는 상이한 이론적 구획 모집단에 해당하는 온도 의존성 형광 신호를 도시한다.
도 25는 상이한 조건 하에서 실시한 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 디바이스에서 구획의 서브세트의 HRM 분석 중에 촬영한 샘플 화상을 도시한다.
도 26은 도 25의 화상에 해당하는 샘플 HRM 데이터를 도시한다.
도 1A 및 1B는 마이크로유체 구조체의 예를 도시하며; 도 1A는 상부로부터 바라본 구조체를 도시하며, 도 1B는 구조체의 단면을 도시한다.
도 2A 및 2B는 마이크로유체 디바이스 내의 마이크로챔버, 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널의 예시의 배열을 개략적으로 도시하며; 도 2A는 평행한 서브-채널 및 하나 이상의 크로스채널을 사용하여 마이크로챔버의 그리드를 형성하는 실시양태를 도시하며; 도 2B는 서펜틴(serpentine) 패턴에서의 단일 마이크로채널이 마이크로챔버의 6각형 그리드를 형성하는 실시양태를 도시한다.
도 3A-3D는 예시의 마이크로유체 디바이스의 사용을 위한 방법을 도시하며; 도 3A는 시약을 저압에서 적용하는 단계를 도시하며; 도 3B는 마이크로유체 디바이스 전체에 걸쳐 압력차를 적용하여 구획화 및 탈기시키도록 하는 단계를 도시하며; 도 3C는 마이크로채널을 청소하기 위해 저압에서 유체를 적용하는 단계를 도시하며; 도 3D는 방법의 완료 후 시스템의 상태를 도시한다.
도 4는 마이크로유체 디바이스의 제조 방법을 개략적으로 도시한다.
도 5는 마이크로유체 디바이스와 함께 사용하고자 하는 예시의 디지털 PCR 프로세스를 개략적으로 도시한다.
도 6은 단일 기기에서 핵산 증폭 및 정량화 방법을 수행하기 위한 기기를 개략적으로 도시한다.
도 7은 본원에 제공된 방법을 수행하기 위해 프로그래밍되거나 또는 달리 설정된 예시의 컴퓨터 제어 시스템을 개략적으로 도시한다.
도 8A 및 8B는 마이크로유체 디바이스 및 샘플 구획화를 도시하며; 도 8A는 열가소성 수지를 마이크로성형시켜 형성된 마이크로유체 디바이스를 도시하며; 도 8B는 샘플 구획화 공정의 형광 화상을 도시한다.
도 9는 핵산 샘플을 프로세싱하기 위한 예시의 시스템을 도시한다.
도 10A-10D는 평균 대략 1개의 핵산 템플레이트 복제를 포함하는 구획 및, 0개의 핵산 템플레이트 복제(템플레이트 제어 없음 또는 NTC)를 포함하는 구획의 핵산 증폭의 2색(샘플 신호를 나타내는 1색 및 정규화 신호를 나타내는 다른 1색) 형광 검출을 나타내며; 도 10A는 증폭후 구획당 0개의 복제(NTC)를 나타내며; 도 10B는 구획당 대략 1개의 복제를 포함하는 구획의 핵산 증폭을 나타내며; 도 10C는 형광 색상 둘다의 NTC 형광 강도의 플롯을 나타내며; 도 10D는 증폭된 샘플의 형광 색상 둘다의 형광 강도의 플롯을 나타낸다.
도 11A-11C는 정량적 디지털 폴리머라제 연쇄 반응(qdPCR) 프로세스의 표현을 나타내며; 도 11A는 예시의 마이크로유체 디바이스의 구획의 표현을 나타내며; 도 11B는 예시의 디바이스의 각각의 구획에서의 샘플의 증폭 역학을 나타내며; 도 11C는 도 11B에 나타낸 증폭 역학에 적용된 qdPCR 프로세스의 결과를 나타낸다.
도 12A-12B는 샘플 프로세싱 및/또는 분석을 위한 디바이스를 도시하며; 도 12A는 디바이스를 도시하며; 도 12B는 디바이스의 하나의 반응 어레이 내의 구획의 일부의 배열을 도시한다.
도 13은 디바이스 유체 제어를 제공하는데 사용하기 위한 공압식 유닛과 함께, 샘플 프로세싱 및/또는 분석을 위한 디바이스의 개략적 표현을 도시한다.
도 14A-14B는 플랫 블록 열순환 유닛을 개략적으로 도시하며; 도 14A는 플랫 블록 열순환 유닛을 도시하며; 도 14B는 공압식 클램프가 추가된 도 14A의 플랫 블록 열순환 유닛을 도시하며, 디바이스, 예컨대 도 12A의 디바이스가 열순환 유닛에 로딩될 수 있도록 클램프는 개방되어 있다.
도 15는 열적, 광학적, 공압식 및 기계적 유닛을 포함한 샘플 프로세싱 및/또는 분석용 완전 qdPCR 시스템을 도시한다.
도 16은 샘플 프로세싱 및/또는 분석용 qdPCR을 수행하기 위한 방법을 도시한다.
도 17A-17B는 핵산 분자를 프로세싱하기 위한 예시의 시스템을 도시하며; 도 17A는 핵산 분자를 프로세싱하기 위한 전체 예시의 시스템을 도시하며; 도 17B는 샘플 프로세싱 및/또는 분석용 디바이스 및 영상화 부품을 포함한 에시의 시스템의 일부를 도시한다.
도 18은 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 디바이스에서 상이한 조건하에서 구획의 서브세트의 증폭후 촬영한 샘플 화상을 도시한다.
도 19는 도 17A-17B의 예시의 시스템을 사용하여 촬영하고, 도 18의 화상에 해당하는 샘플 qdPCR 데이터를 도시한다.
도 20A-20B는 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 디바이스의 차동 로딩을 도시하며; 도 20A는 상이한 개수의 핵산 분자를 포함하는 디바이스에서의 구획의 서브세트의 화상을 도시하며; 도 20B는 도 20A의 화상의 푸아송 분석을 도시한다.
도 21은 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 차동 로딩된 디바이스에 대한 화상 및 해당 밀도 및 구획 점유를 도시한다.
도 22A-22B는 고 해상 용융(HRM) 분석을 개략적으로 도시하며; 도 22A는 디지털 및 벌크 HRM 분석 사이의 차이를 도시하며; 도 22B는 구획의 점유를 결정하기 위한 상이한 박테리아 종에 대한 HRM 곡선 및 그의 용도를 도시한다.
도 23A-23E는 각종 박테리아 종에 대한 HRM 데이터를 도시하며; 도 23A는 각종 박테리아에 대한 16S 및 내부 전사 스페이서(ITS) 복합 유도체 HRM 곡선을 도시하며; 도 23B는 바실루스(Bacilus) 속의 상이한 종에 대한 HRM 곡선을 도시하며; 도 23C는 스타필로코쿠스 속의 상이한 종에 대한 HRM 곡선을 도시하며; 도 23D는 에스. 뉴모니아의 각종 종에 대한 ITS HRM 곡선을 도시하며; 도 23E는 문(phylum)에 의해 체계화된 상이한 박테리아 종에 대한 ITS 서열 상동성의 히트 맵(heat map)을 도시한다.
도 24A-24B는 HRM 분석을 개략적으로 도시하며; 도 24A는 복수의 DNA 분자를 포함한 샘플로부터 DNA의 구획화를 도시하며; 도 24B는 상이한 이론적 구획 모집단에 해당하는 온도 의존성 형광 신호를 도시한다.
도 25는 상이한 조건 하에서 실시한 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 디바이스에서 구획의 서브세트의 HRM 분석 중에 촬영한 샘플 화상을 도시한다.
도 26은 도 25의 화상에 해당하는 샘플 HRM 데이터를 도시한다.
본 발명의 다양한 실시양태가 본원에 제시 및 기재되어 있으나, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 점은 당업계의 기술자에게 명백할 것이다. 다양한 수정예, 변경예 및 치환예는 본 발명으로부터 벗어남이 없이 당업계의 기술자에게 발생될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명에 대한 다양한 대안예를 사용할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭" 및 "증폭하다"는 번갈아 사용되며, 일반적으로 핵산의 하나 이상의 복제물 또는 "증폭된 생성물"을 생성하는 것을 지칭한다. 그러한 증폭은 예를 들면 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 등온 증폭을 사용하는 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 일반적으로 임의의 길이의 뉴클레오티드(예, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 500 또는 1,000개의 뉴클레오티드)의 중합체 형태인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 유사체를 지칭한다. 핵산은 아데노신(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U) 또는 그의 변이체로부터 선택된 하나 이상의 소단위를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 A, C, G, T 또는 U 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 증가하는 핵산 가닥에 혼입될 수 있는 임의의 소단위를 포함할 수 있다. 그러한 소단위는 A, C, G, T 또는 U 또는, 하나 이상의 상보성 A, C, G, T 또는 U에 대하여 특이성이거나 또는 푸린(즉 A 또는 G 또는 그의 변이체) 또는 피리미딘(즉 C, T 또는 U 또는 그이 변이체)에 대하여 상보성인 임의의 다른 소단위일 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 일부 사례에서 핵산 분자는 원형이다. 핵산의 비제한적인 예는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한다. 핵산은 연관 분석, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 핵산, 가지상 핵산, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머로부터 정의된 부위들(부위)인 유전자 또는 유전자 분절의 코딩된 또는 미코딩된 부위를 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리머라제 연쇄 반응 시약" 또는 "PCR 시약"은 번갈아 사용되며, 핵산 증폭 반응(예, DNA 증폭)을 완료하는데 필요한 시약을 포함하는 조성물을 지칭하며, 상기 시약의 비제한적인 예는 표적 핵산, 폴리머라제, 적절한 완충제, 보조인자(예, 2가 및 1가 양이온), dNTP 및 다른 효소에 대한 특이성을 갖는 프라이머 세트 또는 프라이밍 부위(예, 닉)를 포함한다. PCR 시약은 또한 프로브, 지시약 및, 프로브와 지시약을 포함하는 분자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브"는 일반적으로 검출 가능한 모이어티를 포함하는 분자를 지칭하며, 그의 존재 또는 부재는 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 검출 가능한 모이어티의 비제한적인 예는 방사선표지, 안정한 동위원소 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 비색 표지 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "신장"은 일반적으로 뉴클레오티드를 핵산으로 템플레이트 지향된 방식으로 혼입하는 것을 지칭한다. 신장은 효소의 도움으로 발생될 수 있다. 예를 들면, 신장은 폴리머라제의 도움으로 발생될 수 있다. 신장이 발생될 수 있는 조건은 일반적으로 신장이 달성되는 온도를 지칭하는 "신장 온도" 및 일반적으로 신장이 발생하도록 할당된 시간의 양을 지칭하는 "신장 기간"을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지시약 분자"는 일반적으로 검출 가능한 모이어티를 포함하는 분자를 지칭하며, 그의 존재 또는 부재는 샘플 구획화를 나타내는데 사용될 수 있다. 검출 가능한 모이어티의 비제한적인 예는 방사성표지, 안정한 동위원소 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 비색 표지 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "샘플"은 본원에 사용된 바와 같이 일반적으로 핵산 분자를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플을 지칭한다. 핵산 분자는 세포 샘플 또는 유기체, 예컨대 박테리아 또는 박테리아들 중에 또는 그로부터 존재할 수 있다. 예를 들면, 샘플은 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액(예, 전혈), 혈장, 혈청, 소변, 타액, 점막 분비물, 가래, 대변 및 눈물로 이루어진 군으로부터 선택된 성분 하나 이상으로부터 얻거나(예, 추출 또는 단리시킴) 또는 이를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 유체 또는 조직 샘플(예, 피부 샘플)일 수 있다. 샘플은 무세포 체액, 예컨대 전혈로부터 얻을 수 있다. 무세포 체액으로부터의 샘플은 무세포 DNA 및/또는 무세포 RNA를 포함할 수 있다. 샘플은 순환중인 종양 세포를 포함할 수 있다. 샘플은 피험체로부터 채취할 수 있으며, 본원에 포함된 핵산의 분석은 진단 목적에 사용된다. 대안으로, 샘플은 환경 샘플(예, 토양, 폐기물, 주위 공기 등), 공업용 샘플(예, 임의의 공업적 프로세스로부터의 샘플) 또는 식품 샘플(예, 유제품, 채소 제품 및 육류 제품)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 유체"는 일반적으로 액체 또는 기체를 지칭한다. 유체는 규정된 형상을 유지할 수 없으며, 관측 가능한 시간 프레임 동안 유동되어 용기를 채울 것이다. 그래서, 유체는 유동을 허용하는 임의의 적절한 점도를 가질 수 있다. 2종 이상의 유체가 존재할 경우, 각각의 유체는 당업계의 통상의 기술자에 의해 본질적으로 임의의 유체(액체, 기체 등)로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "구획"은 일반적으로 부분 또는 몫으로의 분할 또는 분포를 지칭한다. 예를 들면, 구획화된 샘플은 다른 샘플로부터 단리된 샘플이다. 샘플 구획화가 가능한 구조체의 예는 벽면 및 마이크로챔버를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로유체"는 일반적으로 적어도 하나의 마이크로채널, 복수의 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로챔버의 어레이를 포함하는 칩, 부위(area), 디바이스, 물품 또는 시스템을 지칭한다. 마이크로채널은 약 10 밀리미터(㎜) 이하, 약 5 ㎜ 이하, 약 4 ㎜ 이하, 약 3 ㎜ 이하, 약 2 ㎜ 이하, 약 1.5 ㎜ 이하, 약 1 ㎜ 이하, 약 750 마이크로미터(㎛) 이하, 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 단면 치수를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "깊이"는 일반적으로 마이크로채널, 사이폰 어퍼쳐 또는 구획(예, 마이크로챔버)의 바닥으로부터 마이크로채널, 복수의 사이폰 어퍼쳐 및 구획의 어레이(예, 마이크로챔버)를 막는 박막까지 측정된 거리를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단면" 또는 "단면의"는 번갈아 사용될 수 있으며, 일반적으로 특징의 긴 치수에 실질적으로 수직인 마이크로채널 또는 사이폰 어퍼쳐의 치수 또는 면적을 지칭한다.
본 개시내용은, 중합체 물질, 예컨대 열가소성 물질로부터 형성된 마이크로유체 디바이스를 포함하며, 가압 탈기를 허용하면서 압력 해제시 기체 배리어로서 작용하는 박막을 혼입시키는 시스템 및 그의 사용을 포함한 방법을 기재한다. 마이크로유체 구조체를 형성하기 위한 열가소성 수지의 사용은 저렴하며, 확장성이 큰 사출 성형 프로세스의 사용을 허용할 수 있으면서 박막은 가압에 의한 탈기 가능성을 제공할 수 있어서 상기 박막을 혼입하지 않은 일부 마이크로유체 구조체에 존재할 수 있는 오염 문제를 피할 수 있다.
상기 구조체에 대한 하나의 용도는 예를 들면 열가소성 수지로부터 형성된 마이크로채널에 의해 연결된 사단말(dead-ended) 마이크로챔버의 어레이를 혼입한 마이크로유체 설계이다. 그러한 설계는 예를 들면 구획 시약을 마이크로챔버의 어레이로의 디지털 PCR(dPCR) 또는 정량적 dPCR(qdPCR) 적용에 사용되어 고 해상 용융(HRM) 분석에서의 핵산을 정량화하는데 사용되어 마이크로챔버의 어레이 중에서 구획화된 핵산의 양 및 특징을 분석할 수 있다.
샘플 분석용 마이크로유체 디바이스
한 구체예에서, 본 개시내용은, 샘플의 프로세싱 및/또는 분석용 마이크로유체 디바이스의 사용 방법 및 이를 포함하는 시스템을 제공한다. 디바이스는 주입구 및 유출구에 연결된 마이크로채널을 포함할 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 또한 복수의 마이크로챔버 및 복수의 사이폰 어퍼쳐를 포함할 수 있다. 복수의 마이크로챔버는 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 마이크로채널에 연결될 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 마이크로채널, 마이크로챔버 및 사이폰 어퍼쳐를 막아서 밀봉시키는(예, 밀폐 밀봉시키는) 열가소성 박막을 포함할 수 있다. 압력차가 열가소성 박막 전체에 적용될 때 열가소성 박막은 적어도 부분적으로 기체 투과성일 수 있다.
도 1A 및 1B는 본 개시내용의 특정한 실시양태에 따른 마이크로유체 구조체의 예를 도시한다. 도 1A는 상면도로부터의 예시의 마이크로유체 디바이스를 도시한다. 마이크로유체 디바이스는 주입구(120) 및 유출구(130)와 함께 마이크로채널(110)을 포함한다. 마이크로채널은 복수의 사이폰 어퍼쳐(101B-109B)에 연결된다. 복수의 사이폰 어퍼쳐는 마이크로채널을 복수의 마이크로챔버(101A-109A)에 연결한다. 도 1B는 A-A'로 표시한 점선을 따른 단일 마이크로챔버의 단면도를 도시한다. 단일 마이크로챔버(101A)는 사이폰 어퍼쳐(101B)에 의해 마이크로채널(110)에 연결된다. 마이크로유체 디바이스 바디(140)는 경질 플라스틱 물질(예, 열가소성 물질)로부터 형성될 수 있다. 마이크로유체 디바이스의 마이크로구조체는 필름(150)에 의해 막아서 밀봉된다. 필름(150)은 작은 압력차가 필름 전체에 적용시 기체 불투과성일 수 있으며, 커다란 압력차가 필름 전체에 적용될 때 기체 투과성이 된다. 이는 압력이 마이크로유체 디바이스의 내부 구조체에 적용시 필름(150)을 통한 탈기를 허용할 수 있다. 대안으로, 진공이 마이크로유체 디바이스의 외부에 적용될 때 탈기가 발생될 수 있다.
박막의 기체 투과성은 고압에 의해 유발될 수 있다. 압력 유발된 기체 투과성 박막은 마이크로챔버 또는 그의 서브세트의 어레이를 덮을 수 있으며, 마이크로채널 및 사이폰 어퍼쳐는 비-기체 투과성 필름에 의해 덮힐 수 있다. 대안으로, 압력 유발된 기체 투과성 박막은 마이크로챔버 또는 그의 서브세트의 어레이를 덮을 수 있으며, 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널은 비-기체 투과성 필름에 의해 덮힐 수 있다. 대안으로, 압력 유발된 기체 투과성 박막은 마이크로챔버 또는 그의 서브세트의 어레이, 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널을 덮을 수 있다. 박막의 두께는 약 500 마이크로미터(㎛) 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 200 ㎛ 이하, 약 150 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 75 ㎛ 이하, 약 50 ㎛ 이하, 약 25 ㎛ 이하 또는 그보다 작을 수 있다. 박막의 두께는 약 0.1 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 또는 약 0.5 ㎛ 내지 약 150 ㎛일 수 있다. 예를 들면, 박막의 두께는 약 50 ㎛ 내지 약 200 ㎛일 수 있다. 일부 예에서, 박막의 두께는 약 100 ㎛ 내지 약 200 ㎛일 수 있다. 예를 들면, 박막의 두께는 약 100 ㎛ 내지 약 150 ㎛이다. 한 예에서, 박막은 두께가 대략 100 ㎛이다. 박막의 두께는 다른 인자 중에서 박막의 제조 가능성, 박막의 통기성, 탈기되는 각각의 구획의 부피, 이용 가능한 압력 및/또는 사이포닝 과정을 완료하는데 요구되는 시간에 의해 선택될 수 있다.
마이크로유체 디바이스는 마이크로챔버의 단일 어레이를 포함할 수 있다. 대안으로, 마이크로유체 디바이스는 마이크로챔버의 복수의 어레이를 포함할 수 있으며, 마이크로챔버의 각각의 어레이는 서로 단리되어 있다. 마이크로챔버의 어레이는 연속적으로, 그리드 배치로, 교대 패턴으로 또는 임의의 다른 배치로 배열될 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 마이크로챔버의 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50개 또는 그보다 많은 어레이를 가질 수 있다. 마이크로챔버의 어레이는 동일할 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 동일하지 않은 마이크로챔버의 복수의 어레이를 포함할 수 있다. 마이크로챔버의 어레이는 모두 동일한 외부 치수(즉, 마이크로챔버의 어레이의 모든 특징을 포함하는 마이크로챔버의 어레이의 길이 및 폭)를 가질 수 있거나 또는 마이크로챔버의 어레이는 상이한 외부 치수를 가질 수 있다.
마이크로챔버의 어레이는 많아야 약 100 ㎜, 약 75 ㎜, 약 50 ㎜, 약 40 ㎜, 약 30 ㎜, 약 20 ㎜, 약 10 ㎜, 약 8 ㎜, 약 6 ㎜, 약 4 ㎜, 약 2 ㎜, 약 1 ㎜ 또는 그보다 작은 폭을 가질 수 있다. 마이크로챔버의 어레이는 많아야 약 50 ㎜, 약 40 ㎜, 약 30 ㎜, 약 20 ㎜, 약 10 ㎜, 약 8 ㎜, 약 6 ㎜, 약 4 ㎜, 약 2 ㎜, 1 ㎜ 또는 그보다 작은 길이를 가질 수 있다. 폭은 약 1 ㎜ 내지 100 ㎜ 또는 10 ㎜ 내지 50 ㎜일 수 있다. 길이는 약 1 ㎜ 내지 50 ㎜ 또는 5 ㎜ 내지 20 ㎜일 수 있다.
일부 예에서, 마이크로챔버의 어레이는 약 100 ㎜의 폭 및 약 40 ㎜의 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 어레이는 약 80 ㎜의 폭 및 약 30 ㎜의 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 어레이는 약 60 ㎜의 폭 및 약 25 ㎜의 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 어레이는 약 40 ㎜의 폭 및 약 15 ㎜의 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 어레이는 약 30 ㎜ 의 폭 및 약 10 ㎜의 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 어레이는 약 20 ㎜의 폭 및 약 8 ㎜의 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 어레이는 약 10 ㎜의 폭 및 약 4 ㎜의 길이를 가질 수 있다. 외부 치수는 제조 가능성을 위해 원하는 마이크로챔버의 총 개수, 각각의 마이크로챔버의 치수 및 각각의 마이크로챔버 사이의 최소의 길이에 의해 결정될 수 있다.
마이크로채널은 마이크로유체 디바이스의 긴 치수에 실질적으로 평행하거나 또는 실질적으로 수직일 수 있다. 대안으로, 마이크로채널은 마이크로유체 디바이스의 긴 치수에 대하여 실질적으로 평행하지 않거나 또는 실질적으로 수직이 아닐 수 있다. 마이크로채널 사이의 각도 및 마이크로유체 디바이스의 긴 치수는 적어도 약 5°, 적어도 약 10°, 적어도 약 15°, 적어도 약 20°, 적어도 약 30°, 적어도 약 40°, 적어도 약 50°, 적어도 약 60°, 적어도 약 70°, 적어도 약 90°, 적어도 약 100°, 적어도 약 110°, 적어도 약 120°, 적어도 약 130°, 적어도 약 140°, 적어도 약 150°, 적어도 약 160° 또는 적어도 약 170°일 수 있다. 마이크로채널은 단일의 긴 채널일 수 있다. 마이크로채널은 굴곡부, 만곡부 또는 각도를 가질 수 있다. 마이크로채널은 100 ㎜ 이하, 약 75 ㎜ 이하, 약 50 ㎜ 이하, 약 40 ㎜ 이하, 약 30 ㎜ 이하, 약 20 ㎜ 이하, 약 10 ㎜ 이하, 약 8 ㎜ 이하, 약 6 ㎜ 이하, 약 4 ㎜ 이하, 약 2 ㎜ 이하 또는 그보다 작은 긴 치수를 가질 수 있다. 마이크로채널의 길이는 마이크로유체 디바이스의 외부 길이 또는 폭에 의해 경계를 이룰 수 있다. 마이크로채널은 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 80 ㎛ 이하, 약 60 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 20 ㎛ 이하, 약 10 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 깊이를 가질 수 있다. 마이크로채널은 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 75 ㎛ 이하, 약 50 ㎛ 이하, 약 40 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 20 ㎛ 이하, 약 10 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 단면 치수(예, 폭)를 가질 수 있다.
일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 80 ㎛ 길이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 60 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 40 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 20 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 10 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 80 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 60 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 40 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 20 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 10 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 80 ㎛ 폭, 약 80 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 60 ㎛ 폭, 약 60 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 40 ㎛ 폭, 약 40 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 20 ㎛ 폭, 약 20 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로채널의 단면 치수는 약 10 ㎛ 폭, 약 10 ㎛ 깊이일 수 있다. 마이크로채널의 단면 형상은 원형, 타원형, 삼각형, 사각형 또는 직사각형을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 단면 형상일 수 있다. 마이크로채널의 단면적은 마이크로채널의 길이를 따라 일정할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 마이크로채널의 단면적은 마이크로채널의 길이를 따라 변경될 수 있다. 마이크로채널의 단면적은 약 50% 및 150% 사이, 약 60% 및 125% 사이, 약 70% 및 120% 사이, 약 80% 및 115% 사이, 약 90% 및 110% 사이, 약 95% 및 100% 사이 또는 약 98% 및 102% 사이에서 변경될 수 있다. 마이크로채널의 단면적은 약 10,000 제곱 마이크로미터(㎛2) 이하, 약 7,500 ㎛2 이하, 약 5,000 ㎛2 이하, 약 2,500 ㎛2 이하, 약 1,000 ㎛2 이하, 약 750 ㎛2 이하, 약 500 ㎛2 이하, 약 400 ㎛2 이하, 약 300 ㎛2 이하, 약 200 ㎛2 이하, 약 100 ㎛2 이하 또는 그보다 작을 수 있다.
마이크로채널은 단일의 주입구 및 단일의 유출구를 가질 수 있다. 대안으로, 마이크로채널은 복수의 주입구, 복수의 유출구 또는 복수의 주입구 및 복수의 유출구를 가질 수 있다. 주입구 및 유출구는 동일한 직경을 가질 수 있거나 또는 이들은 상이한 직경을 가질 수 있다. 주입구 및 유출구는 약 2.5 밀리미터(㎜) 이하, 약 2 ㎜ 이하, 약 1.5 ㎜ 이하, 약 1 ㎜ 이하, 약 0.5 ㎜ 미만 또는 그보다 작은 직경을 가질 수 있다.
마이크로챔버의 어레이는 적어도 약 1,000개의 마이크로챔버, 적어도 약 5,000개의 마이크로챔버, 적어도 약 10,000개의 마이크로챔버, 적어도 약 20,000개의 마이크로챔버, 적어도 약 30,000개의 마이크로챔버, 적어도 약 40,000개의 마이크로챔버, 적어도 약 50,000개의 마이크로챔버, 적어도 약 100,000개의 마이크로챔버 또는 그보다 많은 것을 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로유체 디바이스는 약 10,000 내지 약 30,000개의 마이크로챔버를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로유체 디바이스는 약 15,000 내지 약 25,000개의 마이크로챔버를 가질 수 있다. 마이크로챔버는 원통형 형상, 반구형 형상 또는 원통형 및 반구형 형상의 조합일 수 있다. 마이크로챔버는 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 80 ㎛ 이하, 약 60 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 15 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 직경을 가질 수 있다. 마이크로챔버의 깊이는 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 80 ㎛ 이하, 약 60 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 15 ㎛ 이하 또는 그보다 작을 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버는 약 30 ㎛의 직경 및 약 100 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버는 약 35 ㎛의 직경 및 약 80 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버는 약 40 ㎛의 직경 및 약 70 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버는 약 50 ㎛의 직경 및 약 60 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버는 약 60 ㎛의 직경 및 약 40 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버는 약 80 ㎛의 직경 및 약 35 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버는 약 100 ㎛의 직경 및 약 30 ㎛를 가질 수 있다. 마이크로챔버 및 마이크로채널은 동일한 깊이를 가질 수 있다. 대안으로, 마이크로챔버 및 마이크로채널은 상이한 깊이를 가질 수 있다.
사이폰 어퍼쳐의 길이는 일정할 수 있다. 대안으로, 사이폰 어퍼쳐의 길이는 변경될 수 있다. 사이폰 어퍼쳐는 약 150 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 50 ㎛ 이하, 약 25 ㎛ 이하, 약 10 ㎛ 이하, 약 5 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 긴 치수를 가질 수 있다. 사이폰 어퍼쳐의 깊이는 약 50 ㎛ 이하, 약 25 ㎛ 이하, 약 10 ㎛ 이하, 약 5 ㎛ 이하 또는 그보다 작을 수 있다. 사이폰 어퍼쳐는 약 50 ㎛ 이하, 약 40 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 20 ㎛ 이하, 약 10 ㎛ 이하, 약 5 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 단면 폭을 가질 수 있다.
일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 50 ㎛ 폭, 약 50 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 50 ㎛ 폭, 약 40 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 50 ㎛ 폭, 약 30 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 50 ㎛ 폭, 약 20 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 50 ㎛ 폭, 약 10 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 50 ㎛ 폭, 약 5 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 40 ㎛ 폭, 약 50 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 30 ㎛ 폭, 약 50 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 20 ㎛ 폭, 약 50 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 10 ㎛ 폭, 약 50 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 5 ㎛ 폭, 약 50 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 40 ㎛ 폭, 약 40 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 30 ㎛ 폭, 약 30 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 20 ㎛ 폭, 약 20 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 10 ㎛ 폭, 약 10 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 사이폰 어퍼쳐의 단면 치수는 약 5 ㎛ 폭, 약 5 ㎛ 깊이일 수 있다. 사이폰 어퍼쳐의 단면 형상은 원형, 타원형, 삼각형, 사각형 또는 직사각형을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 단면 형상일 수 있다. 사이폰 어퍼쳐의 단면적은 사이폰 어퍼쳐의 길이를 따라 일정할 수 있다, 대안으로 또는 추가로, 사이폰 어퍼쳐의 단면적은 사이폰 어퍼쳐의 길이를 따라 변경될 수 있다, 사이폰 어퍼쳐의 단면적은 마이크로챔버로의 연결에서의 사이폰 어퍼쳐의 단면적보다 마이크로채널로의 연결에서 더 클 수 있다. 대안으로, 마이크로챔버로의 연결에서의 사이폰 어퍼쳐의 단면적은 마이크로채널로의 연결에서의 사이폰 어퍼쳐의 단면적보다 더 클 수 있다. 사이폰 어퍼쳐의 단면적은 약 50% 및 150% 사이, 약 60% 및 125% 사이, 약 70% 및 120% 사이, 약 80% 및 115% 사이, 약 90% 및 110% 사이, 약 95% 및 100% 사이 또는 약 98% 및 102% 사이에서 변동될 수 있다. 사이폰 어퍼쳐의 단면적은 약 2,500 ㎛2 이하, 약 1,000 ㎛2 이하, 약 750 ㎛2 이하, 약 500 ㎛2 이하, 약 250 ㎛2 이하, 약 100 ㎛2 이하, 약 75 ㎛2 이하, 약 50 ㎛2 이하, 약 25 ㎛2 이하 또는 그보다 작을 수 있다. 마이크로채널로의 연결에서의 사이폰 어퍼쳐의 단면적은 마이크로채널의 단면적 이하일 수 있다. 마이크로채널로의 연결에서의 사이폰 어퍼쳐의 단면적은 마이크로채널의 단면적의 약 98% 이하, 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 1% 이하 또는 약 0.5% 이하일 수 있다.
사이폰 어퍼쳐는 마이크로채널에 대하여 실질적으로 수직일 수 있다. 대안으로, 사이폰 어퍼쳐는 마이크로채널에 대하여 실질적으로 수직이 아닐 수 있다. 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널 사이의 각도는 적어도 약 5°, 적어도 약 10°, 적어도 약 15°, 적어도 약 20°, 적어도 약 30°, 적어도 약 40°, 적어도 약 50°, 적어도 약 60°, 적어도 약 70°, 적어도 약 90°, 적어도 약 100°, 적어도 약 110°, 적어도 약 120°, 적어도 약 130°, 적어도 약 140°, 적어도 약 150°, 적어도 약 160° 또는 적어도 약 170°일 수 있다.
마이크로챔버는 각종 패턴으로 배열될 수 있다. 도 2A 및 2B는 마이크로챔버, 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널 배치의 예시의 패턴을 도시한다. 복수의 마이크로채널이 사용될 수 있거나 또는 단일 마이크로채널을 사용할 수 있다. 마이크로채널은 서브채널의 그룹을 포함할 수 있다. 서브채널의 그룹은 하나 이상의 크로스채널에 의해 연결될 수 있다. 서브채널은 마이크로챔버의 어레이가 마이크로챔버의 그리드를 형성하도록 서로에 대하여 실질적으로 평행할 수 있다. 도 2A는 평행한 서브채널(230) 및 하나 이상의 크로스채널(220)이 마이크로챔버의 그리드를 형성하는데 사용되는 실시양태를 도시한다.
마이크로챔버는 마이크로챔버의 6각형 그리드를 형성하도록 구조될 수 있으며, 만곡된 또는 각진 서브채널은 마이크로챔버를 연결한다. 마이크로챔버의 6각형 그리드는 또한 단일 마이크로채널에 의해, 예컨대 마이크로유체 디바이스 전체에 걸쳐 서펜틴 패턴(240)을 형성하는 마이크로채널에 의해 형성 및 연결될 수 있다. 도 2B는 서펜틴 패턴의 단일 마이크로채널이 마이크로챔버의 6각형 그리드를 형성하는 실시양태를 도시한다. 서펜틴 배치로 배열된 마이크로챔버의 또 다른 예는 도 12B에 도시된다.
서브채널의 길이는 일정할 수 있다. 대안으로, 서브채널의 길이는 변동될 수 있다. 서브채널은 100 ㎜ 이하, 약 75 ㎜ 이하, 약 50 ㎜ 이하, 약 40 ㎜ 이하, 약 30 ㎜ 이하, 약 20 ㎜ 이하, 약 10 ㎜ 이하, 약 8 ㎜ 이하, 약 6 ㎜ 이하, 약 4 ㎜ 이하, 약 2 ㎜ 이하 또는 그보다 작은 긴 치수를 가질 수 있다. 서브채널의 길이는 마이크로유체 디바이스의 외부 길이 또는 폭에 의해 경계를 이룰 수 있다. 서브채널은 마이크로채널과 동일한 단면 치수를 가질 수 있다. 대안으로, 서브채널은 마이크로채널보다 상이한 단면 치수를 가질 수 있다. 서브채널은 마이크로채널과 동일한 깊이 및 상이한 단면 치수를 가질 수 있다. 대안으로, 서브채널은 마이크로채널과 동일한 단면 치수 및 상이한 깊이를 가질 수 있다. 예를 들면, 서브채널은 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 80 ㎛ 이하, 약 60 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 15 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 깊이를 가질 수 있다. 서브채널은 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 75 ㎛ 이하, 약 50 ㎛ 이하, 약 40 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 20 ㎛ 이하, 약 10 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 단면 깊이를 가질 수 있다.
일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 80 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 60 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 40 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 20 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 10 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 80 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 60 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 40 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 20 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 10 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 80 ㎛ 폭, 약 80 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 60 ㎛ 폭, 약 60 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 40 ㎛ 폭, 약 40 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 20 ㎛ 폭, 약 20 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 서브채널의 단면 치수는 약 10 ㎛ 폭, 약 10 ㎛ 깊이일 수 있다. 서브채널의 단면 형상은 원형, 타원형, 삼각형, 사각형 또는 직사각형을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 단면 형상일 수 있다. 서브채널의 단면 형상은 마이크로채널의 단면 형상과는 상이할 수 있다. 서브채널의 단면 형상은 마이크로채널의 단면 형상과 동일할 수 있다. 서브채널의 단면적은 서브채널의 길이를 따라 일정할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 서브채널의 단면적은 마이크로채널의 길이를 따라 변경될 수 있다. 서브채널의 단면적은 약 50% 및 150% 사이, 약 60% 및 125% 사이, 약 70% 및 120% 사이, 약 80% 및 115% 사이, 약 90% 및 110% 사이, 약 95% 및 100% 또는 약 98% 및 102% 사이에서 변경될 수 있다. 서브채널의 단면적은 약 10,000 ㎛2㎛2 이하, 약 7,500 ㎛2 이하, 약 5,000 ㎛2 이하, 약 2,500 ㎛2 이하, 약 1,000 ㎛2 이하, 약 750 ㎛2 이하, 약 500 ㎛2 이하, 약 400 ㎛2 이하, 약 300 ㎛2 이하, 약 200 ㎛2 이하, 약 100 ㎛2 이하 또는 그보다 작을 수 있다. 서브채널의 단면적은 마이크로채널의 단면적과 동일할 수 있다. 서브채널의 단면적은 마이크로채널의 단면적 이하일 수 있다. 예를 들면, 서브채널의 단면적은 마이크로채널의 단면적의 약 98% 이하, 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 20% 이하 또는 그보다 작을 수 있다.
크로스채널의 길이는 일정할 수 있다. 대안으로, 크로스채널의 길이는 변경될 수 있다. 크로스채널은 약 100 ㎜ 이하, 약 75 ㎜ 이하, 약 50 ㎜ 이하, 약 40 ㎜ 이하, 약 30 ㎜ 이하, 약 20 ㎜ 이하, 약 10 ㎜ 이하, 약 8 ㎜ 이하, 약 6 ㎜ 이하, 약 4 ㎜ 이하, 약 2 ㎜ 이하 또는 그보다 작은 긴 치수를 가질 수 있다. 크로스채널의 길이는 마이크로유체 디바이스의 외부 길이 또는 깊이에 의해 경계를 이룰 수 있다. 크로스채널은 마이크로채널과 동일한 단면 치수를 가질 수 있다. 대안으로, 크로스채널은 마이크로채널과 상이한 단면 치수를 가질 수 있다. 크로스채널은 마이크로채널과 동일한 깊이 및 상이한 단면 치수를 가질 수 있다. 대안으로, 크로스채널은 마이크로채널과 동일한 단면 치수 및 상이한 깊이를 가질 수 있다. 예를 들면, 크로스채널은 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 80 ㎛ 이하, 약 60 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 15 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 깊이를 가질 수 있다. 크로스채널은 약 500 ㎛ 이하, 약 250 ㎛ 이하, 약 100 ㎛ 이하, 약 75 ㎛ 이하, 약 50 ㎛ 이하, 약 40 ㎛ 이하, 약 30 ㎛ 이하, 약 20 ㎛ 이하, 약 10 ㎛ 이하 또는 그보다 작은 단면 폭을 가질 수 있다.
일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 80 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 60 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 40 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 20 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 100 ㎛ 폭, 약 10 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 80 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 60 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 40 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 20 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 10 ㎛ 폭, 약 100 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 80 ㎛ 폭, 약 80 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 60 ㎛ 폭, 약 60 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 40 ㎛ 폭, 약 40 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 20 ㎛ 폭, 약 20 ㎛ 깊이일 수 있다. 일부 예에서, 크로스채널의 단면 치수는 약 10 ㎛ 폭, 약 10 ㎛ 깊이일 수 있다.
크로스채널의 단면 형상은 원형, 타원형, 삼각형, 사각형 또는 직사각형을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 단면 형상일 수 있다. 크로스채널의 단면 형상은 마이크로채널의 단면 형상과 상이할 수 있다. 크로스채널의 단면 형상은 마이크로채널의 단면 형상과 동일할 수 있다. 크로스채널의 단면적은 크로스채널의 길이를 따라 일정할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 크로스채널의 단면적은 마이크로채널의 길이를 따라 변경될 수 있다. 크로스채널의 단면적은 약 50% 및 150% 사이, 약 60% 및 125% 사이, 약 70% 및 120% 사이, 약 80% 및 115% 사이, 약 90% 및 110% 사이, 약 95% 및 100% 사이 또는 약 98% 및 102% 사이에서 변경될 수 있다. 크로스채널의 단면적은 약 10,000 ㎛2 이하, 약 7,500 ㎛2 이하, 약 5,000 ㎛2 이하, 약 2,500 ㎛2 이하, 약 1,000 ㎛2 이하, 약 750 ㎛2㎛2 이하, 약 500 ㎛2 이하, 약 400 ㎛2 이하, 약 300 ㎛2 이하, 약 200 ㎛2 이하, 약 100 ㎛2 이하 또는 그보다 작을 수 있다. 크로스채널의 단면적은 마이크로채널의 단면적과 동일할 수 있다. 대안으로, 크로스채널의 단면적은 마이크로채널의 단면적 미만일 수 있다. 크로스채널의 단면적은 마이크로채널의 단면적의 약 98% 이하, 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 20% 이하 또는 그보다 작을 수 있다.
마이크로유체 디바이스의 제조 방법
본 개시내용의 방법 및 시스템에 유용한 마이크로유체 디바이스는 임의의 유용한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 디바이스의 제조는 열가소성 수지를 사출 성형시켜 마이크로유체 구조체를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 마이크로유체 구조체는 마이크로채널, 복수의 마이크로챔버 및 복수의 사이폰 어퍼쳐를 포함할 수 있다. 복수의 마이크로챔버는 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 마이크로채널에 연결될 수 있다. 마이크로채널은 주입구 및 유출구를 포함할 수 있다. 열가소성 박막은 마이크로유체 구조체를 덮기 위해 적용될 수 있다. 열가소성 박막은 압력차가 열가소성 박막 전체에 걸쳐 적용될 때 적어도 부분적으로 기체 투과성일 수 있다.
열가소성 박막은 사출 성형에 의해 형성될 수 있다. 열가소성 박막은 열 접합에 의해 마이크로유체 구조체에 적용될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 박막은 화학적 접합에 의해 적용될 수 있다. 열가소성 박막은 사출 성형 프로세스의 일부로서 및 프로세스 중에 형성되어 마이크로유체 디바이스를 형성할 수 있다.
마이크로유체 디바이스의 바디 및 박막은 동일한 소재를 포함할 수 있다. 대안으로, 마이크로유체 디바이스의 바디 및 박막은 상이한 소재를 포함할 수 있다. 마이크로유체 디바이스의 바디 및 박막은 열가소성 수지를 포함할 수 있다. 열가소성 수지의 예는 시클로올레핀 중합체, 아크릴, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 나일론, 폴리락트산, 폴리벤즈이미다졸, 폴리카르보네이트, 폴리에테르 술폰, 폴리에테르 에테르 케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에틸렌, 폴리페닐렌 옥시드, 폴리페닐렌 술피드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에스테르, 폴리우레탄 또는 그의 임의의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 마이크로유체 디바이스는 단독중합체, 공중합체 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 비탄성 소재로 형성될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 마이크로유체 디바이스는 탄성 소재로 형성될 수 있다.
열가소성 수지 및 박막 둘다는 시클로올레핀 중합체로 이루어질 수 있다. 하나의 적절한 열가소성 수지는 제너(Zeonor) 1430R(제온 케미칼즈(Zeon Chemicals), 일본 소재)이며, 하나의 적절한 박막은 제오녹스(Zeonox) 1060R(제온 케미칼즈, 일본 소재)이다. 박막은 저압에서 기체 불투과성이며, 가압 하에서 적어도 부분적으로 기체 투과성인 소재를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 마이크로유체 디바이스의 주입구 및 유출구는 기계적 천공에 의해 형성될 수 있다. 대안으로, 주입구 및 유출구는 열가소성 수지를 용융, 용해 또는 에칭시켜 형성된다.
도 4는 샘플 프로세싱 및/또는 분석에 유용한 디바이스의 제조 방법을 도시한다. 도 4에서, 사출 성형 프로세스(401)를 사용하여 마이크로유체 구조체를 형성한다. 마이크로유체 구조체는 도 1A 및 1B에 도시한 바와 같이 사이폰 어퍼쳐를 경유하여 적어도 하나의 마이크로채널에 연결되는 마이크로챔버의 어레이를 포함한다. 마이크로유체 구조체는 박막에 의해 막는다. 막는 프로세스에서, 마이크로구조체의 적어도 하나의 면에서의 개구부를 덮어서 마이크로구조체를 닫아서 밀봉시킨다. 덮음은 박막을 사출 성형된 마이크로유체 구조체에 적용하는 프로세스(402)에 의해 수행될 수 있다. 대안으로, 막음은 사출 성형 프로세스(401)의 일부로서 박막을 형성하여 수행될 수 있다.
또 다른 예로서, 사출 성형에 의해 형성된 마이크로구조체의 문맥에서 기재되기는 하였으나, 마이크로제조 기술에 의해 형성된 마이크로유체 디바이스는 또한 상기 기재된 바와 같은 탈기를 허용하도록 상기 열가소성 박막의 사용으로부터 이득을 얻을 수 있다. 그러한 기술은 마이크로기계가공, 마이크로리토그래피 및 핫 엠보싱뿐 아니라, 다른 마이크로제조 기술을 포함한다.
본 개시내용의 디바이스는 소비재 디바이스(예, 단일 사용, 예컨대 단일 샘플의 분석 및/또는 프로세싱을 위해 설계됨) 또는 재사용 가능한 디바이스(예, 복수의 사용, 예컨대 복수의 샘플의 분석 및/또는 프로세싱을 위해 설계됨)일 수 있다. 디바이스에서의 포함을 위한 소재의 선택은 디바이스가 1회 이상 사용될 것인지의 여부를 반영할 수 있다. 예를 들면, 소비재 디바이스는 재사용 가능한 디바이스보다 저렴한 소재를 포함할 수 있다. 유사하게, 제조 프로세스는 디바이스의 사용에 대하여 조정될 수 있다. 예를 들면, 소비재 디바이스의 제조 프로세스는 더 적은 폐기물의 생성을 포함할 수 있으며 및/또는 더 적거나 또는 저렴한 단계를 포함할 수 있다. 재사용 가능한 디바이스는 동일한 디바이스를 사용한 복수의 샘플의 분석 및/또는 프로세싱을 용이하게 하기 위해 세척 가능하거나 및/또는 살균 가능할 수 있다. 예를 들면, 재사용 가능한 디바이스는 살균에 적절한 고온을 견딜 수 있는 소재를 포함할 수 있다. 소비재 디바이스는 상기 소재를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
샘플의 분석 방법
한 구체예에서, 본 개시내용은, 샘플, 예컨대 핵산 분자를 분석하기 위해 마이크로유체 디바이스를 사용하는 방법을 제공한다. 핵산 분자는 병원체, 예컨대 박테리아 또는 박테리아들을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내에 존재하거나 또는 샘플로부터 존재할 수 있다. 그러한 방법은 본원에 기재된 바와 같은 마이크로유체 디바이스를 제공하는 것을 포함한다. 디바이스는 마이크로채널을 포함할 수 있다. 마이크로채널은 주입구 및 유출구를 포함할 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 마이크로채널에 연결된 복수의 마이크로챔버를 추가로 포함할 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 박막이 마이크로채널을 막도록 마이크로유체 디바이스의 표면에 인접하게 배치된 박막(예, 열가소성 박막), 복수의 마이크로챔버 및 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 밀봉될 수 있다. 시약 및/또는 샘플은 주입구 또는 유출구에 적용될 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 시약 및/또는 샘플 및 마이크로유체 디바이스 사이의 제1의 압력차를 제공하여 시약 및/또는 샘플이 마이크로유체 디바이스로 유동하여 채워질 수 있다. 시약 및/또는 샘플은 마이크로채널 및 복수의 마이크로챔버 사이에 제2의 압력차를 적용하여 시약 및/또는 샘플을 복수의 마이크로챔버로 이동하게 하고, 복수의 마이크로챔버 내의 기체가 박막을 통과하도록 하여 마이크로챔버로 구획화될 수 있다. 제2의 압력차는 제1의 압력차보다 더 클 수 있다. 주입구 및 유출구 사이의 제3의 압력차가 적용되어 유체가 마이크로챔버로 투입되지 않으면서 유체가 마이크로채널로 투입되도록 할 수 있다. 제3의 압력차는 제2의 압력차보다 더 작을 수 있다. 시약은 샘플 이전에, 이후에 또는 동시에 첨가될 수 있다. 시약은 또한 디바이스의 하나 이상의 구획에 또 다른 방법에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 시약은 하나 이상의 구획을 박막으로 덮기 이전에 하나 이상의 구획 내에 넣을 수 있다
디바이스의 주입구 및 유출구는 공압식 펌프 또는 진공 시스템과 유체 연통될 수 있다. 공압식 펌프 또는 진공 시스템은 본 개시내용의 시스템의 부품일 수 있거나 또는 그로부터 별도의 것일 수 있다. 샘플 및/또는 시약의 충전 및 구획화는 마이크로유체 디바이스의 다양한 특징 전체에 걸쳐 압력차를 적용하여 수행될 수 있다. 샘플 및/또는 시약의 충전 및 구획화는 샘플 및/또는 시약을 단리시키기 위해 마이크로챔버 및 마이크로채널 사이에 밸브를 사용하지 않고 수행될 수 있다. 예를 들면, 마이크로채널의 충전은 로딩되는 샘플 및/또는 시약 및 마이크로채널 사이에 압력차를 적용하여 수행될 수 있다. 그러한 압력차는 샘플 및/또는 시약을 가압시키거나 또는 진공을 마이크로채널에 적용하여 달성될 수 있다. 마이크로챔버의 충전은 마이크로채널 및 마이크로챔버 사이에 압력차를 적용하여 수행될 수 있다. 이는 마이크로채널을 가압시키거나 또는 진공을 마이크로챔버에 적용하여 달성될 수 있다. 샘플 및/또는 시약의 구획화는 유체 및 마이크로채널 사이에 압력차를 적용하여 수행될 수 있다. 그러한 압력차는 유체를 가압시키거나 또는 진공을 마이크로채널에 적용하여 달성될 수 있다.
박막은 상이한 적용된 압력차 하에서 상이한 투과성 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 박막은 제1의 및 제3의 압력차(예, 저압)에서 기체 불투과성일 수 있으며, 이는 더 작은 규모의 압력차일 수 있다. 박막은 제2의 압력차(예, 고압)에서 적어도 부분적으로 기체 투과성일 수 있으며, 이는 더 큰 규모의 압력차일 수 있다. 제1의 및 제3의 압력차는 동일할 수 있거나 또는 이들은 상이할 수 있다. 제1의 압력차는 주입구 또는 유출구에서의 시약 및 마이크로유체 디바이스 사이에서 압력 차이가 존재할 수 있다. 마이크로유체 디바이스의 충전 중에, 시약의 압력은 마이크로유체 디바이스의 압력보다 더 클 수 있다. 마이크로유체 디바이스의 충전 중에, 시약 및 마이크로유체 디바이스 사이의 압력 차이(예, 저압)는 제곱인치당 약 8 파운드(psi) 이하, 약 6 psi 이하, 약 4 psi 이하, 약 2 psi 이하, 약 1 psi 이하 또는 그보다 낮을 수 있다. 일부 예에서, 마이크로유체 디바이스의 충전 중에, 시약 및 마이크로유체 디바이스 사이의 압력차는 약 1 psi 내지 약 8 psi일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로유체 디바이스의 충전 중에, 시약 및 마이크로유체 디바이스 사이의 압력차는 약 1 psi 내지 약 6 psi일 수 있다. 일부 예에서, 마이크로유체 디바이스의 충전 중에, 시약 및 마이크로유체 디바이스 사이의 압력차는 약 1 psi 내지 약 4 psi일 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 압력차를 시약 및 마이크로유체 디바이스 사이에서 약 20 분 이하, 약 15 분 이하, 약 10 분 이하, 약 5 분 이하, 약 3 분 이하, 약 2 분 이하, 약 1 분 이하 또는 그보다 짧은 시간 동안 적용하여 충전될 수 있다.
충전된 마이크로유체 디바이스는 마이크로채널, 사이폰 어퍼쳐, 마이크로챔버 또는 그의 임의의 조합에서 샘플 또는 1종 이상의 시약을 가질 수 있다. 샘플 또는 1종 이상의 시약을 마이크로챔버에 백필링(backfilling)시키는 것은 마이크로유체 디바이스의 충전시 발생될 수 있거나 또는 제2의 압력차의 적용 중에 발생될 수 있다. 제2의 압력차(예, 고압)는 마이크로채널 및 복수의 마이크로챔버 사이에서 압력의 차이에 해당할 수 있다. 제2의 압력차의 적용 중에 고압 도메인에서의 제1의 유체는 저압 도메인에서의 제2의 유체를 박막을 통해 마이크로유체 디바이스로부터 밀어낼 수 있다. 제1의 및 제2의 유체는 액체 또는 기체를 포함한다. 액체는 수성 혼합물 또는 오일 혼합물을 포함할 수 있다. 제2의 압력차는 마이크로채널을 가압시켜 달성될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 제2의 압력차는 진공을 마이크로챔버에 적용하여 달성될 수 있다. 제2의 압력차의 적용 중에, 마이크로채널 내의 샘플 및/또는 시약은 마이크로챔버로 유동될 수 있다. 추가로, 제2의 압력차의 적용 중에 사이폰 어퍼쳐, 마이크로챔버 및 마이크로채널 내에 포획된 기체는 박막을 통해 탈기될 수 있다. 마이크로챔버의 백필링 및 탈기 중에, 마이크로챔버 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 6 psi 이상, 약 8 psi 이상, 약 10 psi 이상, 약 12 psi 이상, 약 14 psi 이상, 약 16 psi 이상, 약 18 psi 이상, 약 20 psi 이상 또는 그보다 클 수 있다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 백필링 중에, 마이크로챔버 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 8 psi 내지 약 20 psi이다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 백필링 중에, 마이크로챔버 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 8 psi 내지 약 18 psi이다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 백필링 중에, 마이크로챔버 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 8 psi 내지 약 16 psi이다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 백필링 중에, 마이크로챔버 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 8 psi 내지 약 14 psi이다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 백필링 중에, 마이크로챔버 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 8 psi 내지 약 12 psi이다. 일부 예에서, 마이크로챔버의 백필링 중에, 마이크로챔버 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 8 psi 내지 약 10 psi이다. 마이크로챔버는 압력차를 약 5 분 초과, 약 10 분 초과, 약 15 분 초과, 약 20 분 초과, 약 25 분 초과, 약 30 분 초과 또는 그보다 긴 시간 동안 적용하여 백필링 및 탈기시킬 수 있다.
샘플 및/또는 시약은 과잉의 샘플 및/또는 시약을 마이크로채널로부터 제거하여 구획화될 수 있다. 과잉의 샘플 및/또는 시약을 마이크로채널로부터 제거하는 것은 하나의 마이크로챔버 내의 시약 및/또는 샘플이 사이폰 어퍼쳐를 통해 마이크로채널로 및 다른 마이크로챔버로 확산되는 것을 방지할 수 있다. 마이크로채널 내의 과잉의 샘플 및/또는 시약은 유체를 마이크로채널의 주입구 또는 유출구에 투입하여 제거될 수 있다. 유체의 압력은 마이크로채널의 압력보다 커서 유체 및 마이크로채널 사이의 압력차를 생성할 수 있다. 유체는 산소, 질소, 이산화탄소, 공기, 영족 기체 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 샘플의 구획화 중에, 유체 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 8 psi 이하, 약 6 psi 이하, 약 4 psi 이하, 약 2 psi 이하, 약 1 psi 이하 또는 그보다 낮을 수 있다. 일부 예에서, 샘플 및/또는 시약의 구획화 중에, 유체 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 1 psi 내지 약 8 psi일 수 있다. 일부 예에서, 샘플 및/또는 시약의 구획화 중에, 유체 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 1 psi 내지 약 6 psi일 수 있다. 일부 예에서, 샘플 및/또는 시약의 구획화 중에, 유체 및 마이크로채널 사이의 압력차는 약 1 psi 내지 약 4 psi일 수 있다. 샘플 및/또는 시약은 압력차를 유체 및 마이크로채널 사이에서 약 20 분 이하, 약 15 분 이하, 약 10 분 이하, 약 5 분 이하, 약 3 분 이하, 약 2 분 이하, 약 1 분 이하 또는 그보다 짧은 시간 동안 적용하여 구획화될 수 있다.
도 3A-3D는 도 1A에 도시된 마이크로유체 디바이스의 사용을 위한 방법을 도시한다. 도 3A에서, 저압은 주입구(120)에서의 시약에 공압식 펌프(300)를 경유하여 적용하여 시약이 마이크로채널(110)로 들어가게 하여 사이폰 어퍼쳐를 경유하여 마이크로챔버를 충전시킨다. 가압은 시약이 마이크로채널을 통해 유동하게 하여 사이폰 어퍼쳐를 경유하여 마이크로챔버로 유동하게 한다. 이 때, 기체 버블, 예컨대 버블(301)은 마이크로챔버, 사이폰 어퍼쳐 또는 마이크로채널 내에 남아있을 수 있다. 저압의 적용에 의한 충전은 마이크로챔버, 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널이 시약으로 실질적으로 충전될 때까지 지속될 수 있다. 시약은 폴리머라제 연쇄 반응에 사용하고자 하는 시약일 수 있다. 시약은 1개 이하의 PCR 템플레이트가 마이크로유체 디바이스의 마이크로챔버에 대하여 시약 중에 존재하도록 희석될 수 있다. 예를 들면, 디바이스의 복수의 구획의 적어도 하나의 서브세트의 각각의 구획은 1개 이하의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 디바이스의 복수의 구획의 서브세트의 각각의 구획은 단 1개의 핵산 분자만을 포함할 수 있다.
도 3B에서, 공압식 펌프(300)는 주입구(120) 및 유출구(130) 둘다에 연결되며, 고압이 적용된다. 고압은 시약을 경유하여 전달되며, 기체 버블, 예컨대 버블(301)에 적용된다. 상기 고압의 영향 하에서, 필름(150)은 기체 투과성이 되며, 버블(301)은 필름(150)을 통해 탈기될 수 있다. 상기 고압을 적용하여 마이크로챔버, 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널은 기체 버블이 실질적으로 없게 하여 오염을 방지할 수 있다.
도 3C에서, 기체에 주입구(120)에서 공압식 펌프(300)를 경유하여 저압을 적용하여 유체를 재투입한다. 공기압은 기체를 박막을 통해 탈기시키기에 충분하지 않을 수 있거나 또는 기체 버블을 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로챔버로 보내기에 충분히 높지 않을 수 있다. 그 대신, 기체는 마이크로채널에서 시약을 제거하여 시약을 각각의 마이크로챔버 및 사이폰 어퍼쳐에서 단리시킬 수 있다. 기체는 공기일 수 있다. 대안으로, 기체는 불활성 기체, 예컨대 질소, 이산화탄소 또는 영족 기체일 수 있다. 그러한 기체는 시약 및 공기의 성분 기체 사이의 반응을 방지하는데 사용될 수 있다.
도 3D는 도 3C에서 저압을 적용한 후 시스템의 상태를 도시한다. 저압 기체의 적용 후, 마이크로챔버 및 사이폰 어퍼쳐는 시약으로 충전된 상태를 유지할 수 있으면서 마이크로채널로부터 시약을 제거할 수 있다. 시약은 사이폰 어퍼쳐에 의해 생성된 모세관력 및 높은 표면 장력으로 인하여 마이크로챔버 내에서 정상 상태를 유지할 수 있다. 모세관력 및 높은 표면 장력은 시약이 마이크로채널로 유동되는 것을 방지하며, 시약 증발을 최소로 한다. 도 3A-3D와 관련하여 기재된 유사한 프로세스를 사용하여 디바이스 내에서 샘플을 구획화시킬 수 있다.
샘플의 구획화는 시약 내에서 지시약의 존재에 의해 입증될 수 있다. 지시약은 검출 가능한 모이어티를 포함하는 분자를 포함할 수 있다. 검출 가능한 모이어티는 방사성 종, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 비색 표지 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 방사성 종의 비제한적인 예는 3H, 14C, 22Na, 32P, 33P, 35S, 42K, 45Ca, 59Fe, 123I, 124I, 125I, 131I 또는 203Hg를 포함한다. 형광 표지의 비제한적인 예는 형광 단백질, 광학적 활성 염료(예, 형광 염료), 유기금속 형광체 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 화학발광 표지의 비제한적인 예는 루시페라제 강, 예컨대 시프리디나(Cypridina), 가우시아(Gaussia), 레닐라(Renilla) 및 파이어플라이(Firefly) 루시페라제의 효소를 포함한다. 효소 표지의 비제한적인 예는 호스래디시 퍼옥시다제(HRP), 알칼리 포스파타제(AP), 베타 갈락토시다제, 글루코스 옥시다제 또는 다른 널리 공지된 표지를 포함한다.
지시약 분자는 형광 분자일 수 있다. 형광 분자는 형광 단백질, 형광 염료 및 유기금속 형광체를 포함할 수 있다. 지시약 분자는 단백질 형광체일 수 있다. 단백질 형광체는 녹색 형광 단백질(GFP, 일반적으로 500-550 나노미터의 파장을 갖는 광을 발광하는 스펙트럼의 녹색 영역에서 형광을 띠는 형광 단백질), 시안-형광 단백질(CFP, 일반적으로 450-500 나노미터의 파장을 갖는 광을 발광하는 스펙트럼의 시안 영역에서 형광을 띠는 형광 단백질), 적색 형광 단백질(RFP, 일반적으로 600-650 나노미터의 파장을 갖는 광을 발광하는 스펙트럼의 적색 영역에서 형광을 띠는 형광 단백질)을 포함할 수 있다. 단백질 형광체의 비제한적인 예는 AcGFP, AcGFP1, AmCyan, AmCyan1, AQ143, AsRed2, Azami 그린, 아주라이트(Azurite), BFP, 세룰린(Cerulean), CFP, CGFP, 시트린(Citrine), copGFP, CyPet, dKeima-Tandem, DsRed, dsRed-Express, DsRed-Monomer, DsRed2, dTomato, dTomato-Tandem, EBFP, EBFP2, ECFP, EGFP, 에머랄드(Emerald), EosFP, EYFP, GFP, HcRed-Tandem, HcRed1, JRed, 카투스카(Katuska), 쿠사비라 오렌지(Kusabira Orange), 쿠사비라 오렌지2, mApple, mBanana, mCerulean, mCFP, mCherry, mCitrine, mECFP, mEmerald, mGrape1, mGrape2, mHoneydew, 미도리-이시 시안(Midori-Ishi Cyan), mKeima, mKO, mOrange, mOrange2, mPlum, mRaspberry, mRFP1, mRuby, mStrawberry, mTagBFP, mTangerine, mTeal, mTomato, mTurquoise, mWasabi, PhiYFP, ReAsH, 사파이어(Sapphire), Superfolder GFP, T-Sapphire, TagCFP, TagGFP, TagRFP, TagRFP-T, TagYFP, tdTomato, 토파즈(Topaz), TurboGFP, 베누스(Venus), YFP, YPet, ZsGreen 및 ZsYellow1의 돌연 변이체 및 특수 변이체를 포함한다.
지시약 분자는 형광 염료일 수 있다. 형광 염료의 비제한적인 예는 SYBR 그린; SYBR 블루; DAPI; 프로피듐 아이오딘; 훼스테(Hoeste); SYBR 골드; 에티듐 브로마이드; 아크리딘; 프로플라빈; 아크리딘 오렌지; 아크리플라빈; 플루오르쿠마닌; 엘립티신; 다우노마이신; 클로로퀸; 디스타마이신 D; 크로모마이신; 호미듐; 미트라마이신; 루테늄 폴리피리딜; 안트라마이신; 페난트리딘 및 아크리딘; 프로피듐 아이오다이드; 헥시듐 아이오다이드; 디히드로에티듐; 에티듐 모노아지드; ACMA; 훽스트(Hoechst) 33258; 훽스트 33342; 훽스트 34580; DAPI; 아크리딘 오렌지; 7-AAD; 악티노마이신 D; LDS751; 히드록시스틸바미딘; SYTOX 블루; SYTOX 그린; SYTOX 오렌지; POPO-1; POPO-3; YOYO-1; YOYO-3; TOTO-1; TOTO-3; JOJO-1; LOLO-1; BOBO-1; BOBO-3; PO-PRO-1; PO-PRO-3; BO-PRO-1; BO-PRO-3; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; JO-PRO-1; LO-PRO-1; YO-PRO-1; YO-PRO-3; 피코그린(Pico그린); 올리그린(OliGreen); 리보그린(RiboGreen); SYBR 골디; SYBR 그린 I; SYBR 그린 II; SYBR DX; SYTO-40, SYTO-41, SYTO-42, SYTO-43, SYTO-44 및 SYTO-45(블루); SYTO-13, SYTO-16, SYTO-24, SYTO-21, SYTO-23, SYTO-12, SYTO-11, SYTO-20, SYTO-22, SYTO-15, SYTO-14 및 SYTO-25(그린); SYTO-81, SYTO-80, SYTO-82, SYTO-83, SYTO-84 및 SYTO-85(오렌지); SYTO-64, SYTO-17, SYTO-59, SYTO-61, SYTO-62, SYTO-60 및 SYTO-63(적색); 플루오레세인; 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC); 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC); 로다민; 테트라메틸 로다민; R-피코에리틴; Cy-2; Cy-3; Cy-3.5; Cy-5; Cy5.5; Cy-7; 텍사스 레드(Texas Red); 파르-레드(Phar-Red); 알로피코시아닌(APC); Sybr 그린 I; Sybr 그린 II; Sybr 골드; CellTracker 그린; 7-AAD; 에티듐 호모이량체 I; 에티듐 호모이량체 II; 에티듐 호모이량체 III; 움벨리페론; 에오신; 그린 형광 단백질; 에리트로신; 쿠마린; 메틸 쿠마린; 피렌; 말라카이트 그린; 스틸벤; 루시퍼 옐로우; 카스케이드 블루; 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인; 단실 클로라이드; 형광 란탄족 착체, 예컨대 유로퓸 및 테르븀을 포함하는 것; 카르복시 테트라클로로 플루오레세인; 5 및/또는 6-카르복시 플루오레세인(FAM); 5-(또는 6-) 요오도아세트아미도플루오레세인; 5-{[2(및 3)-5-(아세틸머캅토)-숙시닐]아미노} 플루오레세인(SAMSA-플루오레세인); 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드; 5 및/또는 6 카르복시 로다민(ROX); 7-아미노-메틸-쿠마린; 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산(AMCA); 보디피(BODIPY) 형광체; 8-메톡시피렌-1;3;6-트리술폰산 트리나트륨 염; 3;6-디술포네이트-4-아미노-나프탈이미드; 피코빌리단백질; 알렉사플루오르(AlexaFluor) 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750 및 790 염료; 다이라이트(DyLight) 350, 405, 488, 550, 594, 633, 650, 680, 755 및 800 염료; 및 다른 형광체를 포함한다.
지시약 분자는 유기금속 형광체일 수 있다. 유기금속 형광체의 비제한적인 예는 란탄족 이온 킬레이트를 포함하며, 그의 비제한적인 예는 트리스(디벤조일메탄) 모노(1,10-페난트롤린)유로퓸(III), 트리스(디벤조일메탄) 모노(5-아미노-1,10-페난트롤린)유로퓸(III) 및 루미(Lumi)4-Tb 크립테이트를 포함한다.
신호는 마이크로유체 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트(예, 마이크로챔버)로부터 수집(예를 들면 화상 촬영)될 수 있다. 신호 수집은 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트의 화상을 촬영하는 것을 포함할 수 있다. 신호(예, 화상)는 단일 마이크로챔버, 마이크로챔버의 어레이 또는 마이크로챔버의 복수의 어레이로부터 동시에 수집될 수 있다. 신호는 마이크로유체 디바이스의 바디를 통해, 마이크로유체 디바이스의 박막을 통해 또는 둘다를 통해 수집될 수 있다. 마이크로유체 디바이스의 바디는 실질적으로 광학적으로 투명할 수 있다. 대안으로, 마이크로유체 디바이스의 바디는 실질적으로 광학적으로 불투명할 수 있다. 유사하게, 박막은 실질적으로 광학적으로 투명할 수 있다. 대안으로, 마이크로유체 디바이스의 바디는 실질적으로 광학적으로 불투명할 수 있다.
신호는 마이크로유체 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트로부터 임의의 유용한 시간에서 및 임의의 유용한 주파수로 수집될 수 있다. 예를 들면, 신호(예, 화상)는 마이크로유체 디바이스에 시약 또는 샘플을 충전시키기 전에 수집될 수 있다. 신호는 또한 마이크로유체 디바이스를 시약 또는 샘플로 충전시키는 도중에 수집될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 신호는 마이크로유체 디바이스를 시약 또는 샘플로 충전시킨 후 수집될 수 있다. 예를 들면, 신호는 시약 또는 샘플의 구획화를 입증하기 위해 수집될 수 있다. 신호는 또한 반응의 생성물(예, 증폭 생성물)을 모니터링하기 위해 반응(예, 핵산 증폭 반응) 중에 수집될 수 있다. 유사하게, 신호는 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트의 제어된 가열 중에(예, 고 해상 용융 분석 중에) 수집될 수 있다. 신호는 명시된 간격으로, 예컨대 명시된 시점에서 수집될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 마이크로유체 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트의 비디오를 촬영할 수 있다. 명시된 간격은 신호(예, 화상 촬영)를 반응 중에 적어도 300 초마다, 적어도 240 초마다, 적어도 180 초마다, 적어도 120 초마다, 적어도 90 초마다, 적어도 60 초마다, 적어도 30 초마다, 적어도 15 초마다, 적어도 10 초마다, 적어도 5 초마다, 적어도 4 초마다, 적어도 3 초마다, 적어도 2 초마다, 적어도 1 초마다 또는 더 자주 수집하는 것을 포함할 수 있다. 신호는 또한 본원에 기재된 바와 같이 프로세서로부터의 명령에 반응하여 수집될 수 있다.
마이크로유체 디바이스의 사용을 포함한 본원에 기재된 방법은 샘플로부터 복수의 핵산 분자의 증폭을 포함할 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 하나 이상의 증폭 시약, 예컨대 핵산 분자, 증폭 반응에 필요한 성분(예, 프라이머, 폴리머라제 및 데옥시리보뉴클레오티드), 지시약 분자 및 증폭 프로브로 충전될 수 있다. 증폭 반응은 본원에 기재된 바와 같이 복수의 마이크로챔버 또는 그의 서브세트의 열순환을 포함할 수 있다. 핵산 증폭의 검출은 마이크로유체 디바이스의 복수의 마이크로챔버 또는 그의 서브세트로부터 신호를 수집(예, 영상화)하여 수행될 수 있다. 핵산 분자는 핵산 분자가 성공적으로 증폭된 마이크로챔버를 계수하고, 푸아송 통계학을 적용하여 정량화할 수 있다. 핵산 분자는 또한 증폭 반응을 통해 상이한 시점에서 수집된 신호를 프로세싱하여 정량화될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 신호는 핵산 증폭 반응의 각각의 열주기(예, 각각의 증폭 주기) 중에 수집될 수 있으며, 신호는 예를 들면 실시간 또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(실시간 PCR 또는 qPCR)에서와 같은 증폭률을 측정하는데 사용될 수 있다. 핵산 증폭 및 정량화는 단일 통합 유닛 내에서, 예를 들면 디바이스의 주어진 구획 또는 복수의 구획의 서브세트 내에서 수행될 수 있다.
각종 핵산 증폭 반응은 증폭된 생성물을 생성하기 위해 샘플 중의 핵산 분자를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 핵산 표적의 증폭은 선형, 지수형 또는 그의 조합일 수 있다. 핵산 증폭 방법의 비제한적인 예는 프라이머 신장, 폴리머라제 연쇄 반응, 역전사, 등온 증폭, 리가아제 연쇄 반응, 헬리카제-의존성 증폭, 비대칭 증폭, 회전환 증폭 및 복수의 전위 증폭을 포함한다. 증폭 반응의 증폭 생성물은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA 분자를 포함하는 샘플의 경우, 임의의 DNA 증폭 방법을 사용할 수 있다. DNA 증폭 방법은 PCR, 실시간 PCR, 어셈블리 PCR, 비대칭 PCR, 디지털 PCR, 다이알-아웃 PCR, 헬리카제-의존성 PCR, 네스트된(nested) PCR, 핫 스타트 PCR, 역 PCR, 메틸화 특이성 PCR, 미니프라이머 PCR, 다중 PCR, 중복-신장 PCR, 열 비대칭 인터레이스 PCR, 터치다운 PCR 및 리가아제 연쇄 반응을 포함하나 이에 제한되지 않는다. DNA 증폭은 선형, 지수형 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. DNA 증폭은 또한 본원에 기재된 바와 같은 디지털 PCR(dPCR), 실시간 정량적 PCR(qPCR) 또는 정량적 디지털 PCR(qdPCR)로 달성될 수 있다.
핵산 증폭에 필요한 시약은 중합 효소, 역방향 프라이머, 정방향 프라이머 및 증폭 프로브를 포함할 수 있다. 중합 효소의 예는 핵산 폴리머라제, 트랜스크립타제 또는 리가아제(즉 결합 형성을 촉매화하는 효소)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 중합 효소는 자연 발생 또는 합성될 수 있다. 폴리머라제의 예는 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제, 열안정성 폴리머라제, 야생형 폴리머라제, 변형된 폴리머라제, 이. 콜리(E. coli) DNA 폴리머라제 I, T7 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제 Φ29(파이29) DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Tth 폴리머라제, Tli 폴리머라제, Pfu 폴리머라제 Pwo 폴리머라제, VENT 폴리머라제, DEEPVENT 폴리머라제, Ex-Taq 폴리머라제, LA-Taw 폴리머라제, Sso 폴리머라제, Poc 폴리머라제, Pab 폴리머라제, Mth 폴리머라제, ES4 폴리머라제, Tru 폴리머라제, Tac 폴리머라제, Tne 폴리머라제, Tma 폴리머라제, Tca 폴리머라제, Tih 폴리머라제, Tfi 폴리머라제, 플래티넘 Taq 폴리머라제, Tbr 폴리머라제, Tfl 폴리머라제, Pfutubo 폴리머라제, 파이로베스트(Pyrobest) 폴리머라제, KOD 폴리머라제, Bst 폴리머라제, Sac 폴리머라제, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 Klenow 절편 폴리머라제 및 그의 변이체, 변형된 생성물 및 유도체를 포함한다. 핫 스타트 폴리머라제의 경우, 약 92℃ 내지 95℃에서 약 2 분 내지 10 분의 시간 기간 동안의 변성 단계가 필요할 수 있다.
핵산 증폭 반응은 증폭 프로브를 포함할 수 있다. 증폭 프로브는 서열 특이성 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 증폭 프로브는 증폭 생성물로 하이브리드화될 때 광학적 활성일 수 있다. 증폭 프로브는 단지 핵산 증폭이 진행됨에 따라 검출 가능할 수 있다. 핵산 분자를 포함한 복수의 구획로부터 수집된 신호(예, 광학 신호)의 강도는 구획 내에 포함된 증폭 생성물의 양에 비례할 수 있다. 예를 들면, 특정한 구획으로부터 수집된 신호는 특정한 구획 내의 증폭된 생성물의 양에 비례할 수 있다. 프로브는 본원에 기재된 임의의 광학적 활성 검출 가능한 모이어티(예, 염료)에 연결될 수 있으며, 또한 관련된 염료의 광학적 활성을 차단시킬 수 있는 켄칭제를 포함할 수 있다. 검출 가능한 모이어티로서 유용할 수 있는 프로브의 비제한적인 예는 TaqMan 프로브, TaqMan 타마라(Tamara) 프로브, TaqMan MGB 프로브, 라이온(Lion) 프로브, 잠금 핵산 프로브 또는 분자 비컨(beacons)을 포함한다. 프로브의 광학 활성을 차단하는데 유용할 수 있는 켄칭제의 비제한적인 예는 블랙 홀(Black Hole) 켄칭제(BHQ), 아이오와 블랙(Iowa Black) FQ 및 RQ 켄칭제 또는 인터날(Internal) ZEN 켄칭제를 포함한다. 대안으로 또는 추가로, 프로브 또는 켄칭제는 본 개시내용의 방법의 문맥에서 유용한 임의의 공지의 프로브일 수 있다.
증폭 프로브는 이중 표지된 형광 프로브일 수 있다. 이중 표지된 프로브는 핵산과 연결된 형광 리포터 및 형광 켄칭제를 포함할 수 있다. 형광 리포터 및 형광 켄칭제는 서로에 대하여 인접하게 위치할 수 있다. 형광 리포터 및 형광 켄칭제의 인접성은 형광 리포터의 광학 활성을 차단할 수 있다. 이중 표지된 프로브는 증폭시키고자 하는 핵산 분자에 결합될 수 있다. 증폭 중에, 형광 리포터 및 형광 켄칭제는 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 분할될 수 있다. 증폭 프로브로부터 형광 리포터 및 켄칭제의 분할은 형광 리포터가 그의 광학 활성을 회복하게 하며, 검출을 가능케 할 수 있다. 이중 표지된 형광 프로브는 약 450 나노미터(㎚), 500 ㎚, 525 ㎚, 550 ㎚, 575 ㎚, 600 ㎚, 625 ㎚, 650 ㎚, 675 ㎚, 700 ㎚ 또는 그보다 큰 여기 파장 최대치 및 약 500 ㎚, 525 ㎚, 550 ㎚, 575 ㎚, 600 ㎚, 625 ㎚, 650 ㎚, 675 ㎚, 700 ㎚ 또는 그보다 큰 방출 파장 최대치를 갖는 5' 형광 리포터를 포함할 수 있다. 이중 표지된 형광 프로브는 또한 3' 형광 켄칭제를 포함할 수 있다. 형광 켄칭제는 약 380 ㎚ 및 550 ㎚, 390 ㎚ 및 625 ㎚, 470 ㎚ 및 560 ㎚, 480 ㎚ 및 580 ㎚, 550 ㎚ 및 650 ㎚, 550 ㎚ 및 750 ㎚ 또는 620 ㎚ 및 730 ㎚ 사이의 형광 발광 파장을 켄칭시킬 수 있다.
디바이스의 마이크로챔버 내에서 실시한 핵산 증폭 반응은 마이크로유체 디바이스의 마이크로챔버 또는 그의 서브세트를 열순환에 처하게 하는 것을 포함할 수 있다. 열순환은 마이크로유체 디바이스에 가열 또는 냉각을 적용하여 마이크로유체 디바이스의 온도를 제어하는 것을 포함할 수 있다. 가열 또는 냉각 방법은 저항 가열 또는 냉각, 방사성 가열 또는 냉각, 전도성 가열 또는 냉각, 대류성 가열 또는 냉각 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 열순환은 일정 기간 동안 핵산 분자를 변성시키기에 충분히 높은 온도에서 마이크로챔버의 인큐베이션에 이어서 신장 온도에서 신장 기간 동안 마이크로챔버의 인큐베이션의 주기를 포함할 수 있다. 열순환은 또한 어닐링 온도에서 어닐링 기간 동안 프라이머를 핵산 분자에 어닐링시키기에 충분한 온도에서 마이크로챔버 인큐베이션의 주기를 포함할 수 있다. 변성 온도는 예를 들면 특정한 핵산 샘플, 사용된 시약 및 원하는 반응 조건에 의존하여 변경될 수 있다. 변성 온도는 약 80℃ 내지 약 110℃일 수 있다. 변성 온도는 약 85℃ 내지 약 105℃일 수 있다. 변성 온도는 약 90℃ 내지 약 100℃일 수 있다. 변성 온도는 약 90℃ 내지 약 98℃일 수 있다. 변성 온도는 약 92℃ 내지 약 95℃일 수 있다. 변성 온도는 적어도 약 80℃, 적어도 약 81℃, 적어도 약 82℃, 적어도 약 83℃, 적어도 약 84℃, 적어도 약 85℃, 적어도 약 86℃, 적어도 약 87℃, 적어도 약 88℃, 적어도 약 89℃, 적어도 약 90℃, 적어도 약 91℃, 적어도 약 92℃, 적어도 약 93℃, 적어도 약 94℃, 적어도 약 95℃, 적어도 약 96℃, 적어도 약 97℃, 적어도 약 98℃, 적어도 약 99℃, 적어도 약 100℃ 또는 그보다 높을 수 있다.
변성을 위한 기간은 예를 들면 특정한 핵산 샘플, 사용된 시약 및 원하는 반응 조건에 의존하여 변경될 수 있다. 변성을 위한 기간은 약 300 초, 240 초, 180 초, 120 초, 90 초, 60 초, 55 초, 50 초, 45 초, 40 초, 35 초, 30 초, 25 초, 20 초, 15 초, 10 초, 5 초, 2 초 또는 1 초 이하일 수 있다. 대안으로, 변성을 위한 기간은 약 120 초, 90 초, 60 초, 55 초, 50 초, 45 초, 40 초, 35 초, 30 초, 25 초, 20 초, 15 초, 10 초, 5 초, 2 초 또는 1 초 이하일 수 있다.
신장 온도는 예를 들면 특정한 핵산 샘플, 사용된 시약 및 원하는 반응 조건에 의존하여 변경될 수 있다. 신장 온도는 약 30℃ 내지 약 80℃일 수 있다. 신장 온도는 약 35℃ 내지 약 75℃일 수 있다. 신장 온도는 약 45℃ 내지 약 65℃일 수 있다. 신장 온도는 약 55℃ 내지 약 65℃일 수 있다. 신장 온도는 약 40℃ 내지 약 60℃일 수 있다. 신장 온도는 적어도 약 35℃, 적어도 약 36℃, 적어도 약 37℃, 적어도 약 38℃, 적어도 약 39℃, 적어도 약 40℃, 적어도 약 41℃, 적어도 약 42℃, 적어도 약 43℃, 적어도 약 44℃, 적어도 약 45℃, 적어도 약 46℃, 적어도 약 47℃, 적어도 약 48℃, 적어도 약 49℃, 적어도 약 50℃, 적어도 약 51℃, 적어도 약 52℃, 적어도 약 53℃, 적어도 약 54℃, 적어도 약 55℃, 적어도 약 56℃, 적어도 약 57℃, 적어도 약 58℃, 적어도 약 59℃, 적어도 약 60℃, 적어도 약 61℃, 적어도 약 62℃, 적어도 약 63℃, 적어도 약 64℃, 적어도 약 65℃, 적어도 약 66℃, 적어도 약 67℃, 적어도 약 68℃, 적어도 약 69℃, 적어도 약 70℃, 적어도 약 71℃, 적어도 약 72℃, 적어도 약 73℃, 적어도 약 74℃, 적어도 약 75℃, 적어도 약 76℃, 적어도 약 77℃, 적어도 약 78℃, 적어도 약 79℃ 또는 적어도 약 80℃일 수 있다.
신장 시간은 예를 들면 특정한 핵산 샘플, 사용된 시약 및 원하는 반응 조건에 의존하여 변경될 수 있다. 신장을 위한 기간은 약 300 초, 240 초, 180 초, 120 초, 90 초, 60 초, 55 초, 50 초, 45 초, 40 초, 35 초, 30 초, 25 초, 20 초, 15 초, 10 초, 5 초, 2 초 또는 1 초 이하일 수 있다. 대안으로, 신장을 위한 기간은 약 120 초, 90 초, 60 초, 55 초, 50 초, 45 초, 40 초, 35 초, 30 초, 25 초, 20 초, 15 초, 10 초, 5 초, 2 초 또는 1 초 이하일 수 있다.
어닐링 온도는 예를 들면 특정한 핵산 샘플, 사용된 시약 및 원하는 반응 조건에 의존하여 변경될 수 있다. 어닐링 온도는 약 30℃ 내지 약 80℃일 수 있다. 어닐링 온도는 35℃ 내지 약 75℃일 수 있다. 어닐링 온도는 45℃ 내지 약 65℃일 수 있다. 어닐링 온도는 55℃ 내지 약 65℃일 수 있다. 어닐링 온도는 40℃ 내지 약 60℃일 수 있다. 어닐링 온도는 적어도 약 35℃, 적어도 약 36℃, 적어도 약 37℃, 적어도 약 38℃, 적어도 약 39℃, 적어도 약 40℃, 적어도 약 41℃, 적어도 약 42℃, 적어도 약 43℃, 적어도 약 44℃, 적어도 약 45℃, 적어도 약 46℃, 적어도 약 47℃, 적어도 약 48℃, 적어도 약 49℃, 적어도 약 50℃, 적어도 약 51℃, 적어도 약 52℃, 적어도 약 53℃, 적어도 약 54℃, 적어도 약 55℃, 적어도 약 56℃, 적어도 약 57℃, 적어도 약 58℃, 적어도 약 59℃, 적어도 약 60℃, 적어도 약 61℃, 적어도 약 62℃, 적어도 약 63℃, 적어도 약 64℃, 적어도 약 65℃, 적어도 약 66℃, 적어도 약 67℃, 적어도 약 68℃, 적어도 약 69℃, 적어도 약 70℃, 적어도 약 71℃, 적어도 약 72℃, 적어도 약 73℃, 적어도 약 74℃, 적어도 약 75℃, 적어도 약 76℃, 적어도 약 77℃, 적어도 약 78℃, 적어도 약 79℃ 또는 적어도 약 80℃일 수 있다.
어닐링 시간은 예를 들면 특정한 핵산 샘플, 사용된 시약 및 원하는 반응 조건에 의존하여 변경될 수 있다. 어닐링에 대한 기간은 약 300 초, 240 초, 180 초, 120 초, 90 초, 60 초, 55 초, 50 초, 45 초, 40 초, 35 초, 30 초, 25 초, 20 초, 15 초, 10 초, 5 초, 2 초 또는 1 초 이하일 수 있다. 대안으로, 어닐링에 대한 기간은 약 120 초, 90 초, 60 초, 55 초, 50 초, 45 초, 40 초, 35 초, 30 초, 25 초, 20 초, 15 초, 10 초, 5 초, 2 초 또는 1 초 이하일 수 있다.
핵산 증폭은 열순환의 복수의 주기(예, 복수의 증폭 주기)를 포함할 수 있다. 임의의 적절한 횟수의 주기를 수행할 수 있다. 수행된 주기의 횟수는 약 5회 초과, 약 10회 초과, 약 15회 초과, 약 20회 초과, 약 30회 초과, 약 40회 초과, 약 50회 초과, 약 60회 초과, 약 70회 초과, 약 80회 초과, 약 90회 초과, 약 100회 초과의 주기 또는 그보다 많을 수 있다. 수행된 주기의 횟수는 검출 가능한 증폭 생성물을 얻는데 필요한 주기의 횟수에 의존할 수 있다. 예를 들면, PCR(예, dPCR, qPCR 또는 qdPCR) 도중의 핵산 증폭을 검출하는데 필요한 주기의 횟수는 약 100회 이하, 약 90회 이하, 약 80회 이하, 약 70회 이하, 약 60회 이하, 약 50회 이하, 약 40회 이하, 약 30회 이하, 약 20회 이하, 약 15회 이하, 약 10회 이하, 약 5회 이하 또는 그보다 적은 주기일 수 있다.
증폭 생성물의 검출 가능한 양에 도달하는 시간은 예를 들면 특정한 핵산 샘플, 사용된 시약, 사용된 증폭 반응, 사용된 증폭 주기의 횟수 및 원하는 반응 조건에 의존하여 변경될 수 있다. 증폭 생성물의 검출 가능한 양에 도달하는 시간은 약 120 분 이하, 90 분 이하, 60 분 이하, 50 분 이하, 40 분 이하, 30 분 이하, 20 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하일 수 있다.
상승 속도(즉 마이크로챔버가 하나의 온도로부터 또 다른 온도로 전이되는 속도)가 증폭에 중요하다. 예를 들면, 증폭 반응이 검출 가능한 양의 증폭 생성물을 수득하는 온도 및 시간은 상승 속도에 의존하여 변경될 수 있다. 상승 속도는 증폭 중에 사용된 시간(들), 온도(들) 또는 시간(들)과 온도(들) 둘다에 영향을 미칠 수 있다. 상승 속도는 주기 사이에서 일정할 수 있거나 또는 주기 사이에서 변경될 수 있다. 상승 속도는 프로세싱되는 샘플에 기초하여 조절될 수 있다. 예를 들면, 최적의 상승 속도(들)는 강력하며 효과적인 증폭 방법을 제공하기 위해 선택될 수 있다.
도 5는 상기 기재된 마이크로유체 디바이스와 함께 사용하고자 하는 디지털 PCR 프로세스를 도시한다. 단계(501)에서, 시약은 도 3A-3D에 도시된 바와 같이 구획화된다. 단계(502)에서, 시약을 열순환에 처하게 하여, PCR 반응을 마이크로챔버 내의 시약에 작용하도록 한다. 그러한 단계는 예를 들면 플랫 블록 열순환기를 사용하여 수행될 수 있다. 단계(503)에서, 마이크로챔버가 PCR 반응을 성공적으로 실시하는지를 결정하기 위해 화상 획득을 수행한다. 화상 획득은 예를 들면 3색 프로브 검출 유닛을 사용하여 수행할 수 있다. 단계(504)에서, 푸아송 통계학은 단계(503)에서 결정된 마이크로챔버의 계수에 적용하여 양의 챔버의 미가공 수치를 핵산 농도로 전환시킨다.
복수의 핵산 분자의 분석 방법은 본원에 기재된 바와 같은 복수의 구획을 포함하는 디바이스를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 복수의 구획의 적어도 하나의 서브세트는 복수의 핵산 분자(예, 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 분자)를 포함할 수 있다. 복수의 구획의 서브세트의 각각의 구획은 구획으로부터 구획의 외부 환경으로 구획을 외부 환경으로부터 분리시키는 적어도 하나의 배리어를 통해, 기체 흐름을 허용하도록 설정될 수 있다. 그 후, 복수의 구획의 서브세트를, 복수의 핵산 분자를 사용하여 증폭 생성물을 복수의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트로부터 생성하는 핵산 증폭 반응을 수행하기에 충분한 조건으로 처하게 할 수 있다. 복수의 구획의 서브세트를 상기 조건에 처하게 하면서, 복수의 구획의 서브세트로부터 복수의 시점에 걸쳐 신호를 수집할 수 있다. 그 후, 복수의 구획으로부터 수집한 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 서브세트 내의 핵산 분자의 개수를 측정할 수 있다. 신호 프로세싱은 증폭 반응이 처리 중인 동안 또는 증폭 반응이 완료된 후 실시될 수 있다.
핵산 증폭 반응을 실시하기에 충분한 조건에 복수의 구획의 서브세트를 처하게 하는 것은 본원에 기재된 바와 같은 열순환을 포함할 수 있다. 열순환은 변성 상, 신장 상 및 어닐링 상을 포함할 수 있으며, 온도 및 기간의 임의의 유용한 조합을 포함할 수 있다. 임의의 유용한 횟수의 열주기를 수행할 수 있다. 예를 들면, 증폭 반응이 진행중이면서 신호를 프로세싱할 경우, 열순환이 중단되도록 프로그래밍한 후 열순환 프로세스를 제어하는 프로세서는 한계값에 도달할 수 있다. 대안으로, 유저는 증폭 및 신호 수집 프로세스를 실시하는 시스템과 함께 상호작용하며, 주어진 횟수의 주기 이후에 열순환을 종료하도록 선택될 수 있다. 열순환은 플랫 블록 열순환기 또는 임의의 다른 유용한 온도 제어 디바이스를 사용하여 수행될 수 있다.
복수의 구획의 서브세트로부터 신호를 수집하는 것은, 구획당 열주기당 1개 초과의 신호를 수집하는 것을 포함한다. 예를 들면, 신호는 각각의 어닐링 상 중에, 각각의 신장 상 중에, 각각의 변성 상 중에 또는 그의 임의의 조합 중에 수집될 수 있다. 대안으로, 상기 방법을 실시하는 시스템은 복수의 사전결정된 시점에서 신호를 수집하도록 프로그래밍될 수 있다. 그러한 시점은 균등하게 이격된(예, 5 초마다) 또는 사전결정된 패턴(예, 처음 100 초 동안 5 초마다, 그 후 20 초 마다 또는 임의의 다른 유용한 패턴)을 따를 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 신호 수집은 영상화를 포함할 수 있다. 검출기는 디바이스의 복수의 구획의 서브세트 전부를 동시에 영상화하도록 설정될 수 있다. 영상화를 위한 검출기는 2 이상의 파장에서 형광 방출을 검출할 수 있다. 그러한 검출기는 상이한 출발 핵산 분자(예, 템플레이트)에 해당하는 핵산 증폭 생성물을 측정할 수 있다. 예를 들면, 2종의 상이한 핵산 분자를 포함하는 샘플을 2종의 상이한 프라이머에 노출시킬 수 있으며, 각각의 프라이머는 상이한 검출 가능한 표지(예, 염료 또는 형광 프로브)를 포함하며, 상이한 핵산 분자에 대하여 특이성을 갖는다. 상이한 검출 가능한 표지는 상이한 파장에서 형광 신호를 방출할 수 있으며, 이들 각각은 동일한 검출기에 의해 검출 가능할 수 있다. 복수의 구획의 서브세트 내에서의 핵산 분자의 개수를 측정하는 것은, 각각의 구획 내의 증폭 생성물의 양에 비례하는 각각의 구획에 대한 광학 강도를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
핵산 증폭 반응은 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면, 시약, 예컨대 프라이머, 데옥시리보뉴클레오티드, 완충제, 보조인자, 삽입 염료 및 폴리머라제를 사용할 수 있다. 샘플을 디바이스로의 로딩 이전에, 이후에 또는 동시에 상기 시약을 디바이스에 로딩할 수 있다. 복수의 핵산 분자는 제어된 유체 흐름을 사용하여 디바이스의 복수의 구획에 로딩할 수 있다(예, 도 3A-3D에 관하여 기재한 바와 같음). 복수의 구획의 서브세트 내에서의 기체는 구획으로부터 외부 환경으로 유동되게 할 수 있다. 예를 들면, 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트에 핵산 분자를 포함하는 샘플을 로딩하는 것은 본원에 기재된 바와 같이 구획으로부터 배리어를 통해 탈기를 유발할 수 있다.
핵산 분자의 분석 방법에 사용되는 디바이스는 본원에 기재된 임의의 특징을 가질 수 있다. 디바이스의 배리어는 중합체 물질, 예컨대 열가소성 물질을 포함할 수 있으며, 박막일 수 있다. 배리어는 실질적으로 광학적으로 투명할 수 있다. 배리어는 약 50 ㎛ 내지 약 200 ㎛(예, 약 50 ㎛, 100 ㎛, 150 ㎛ 또는 200 ㎛)의 두께를 가질 수 있다. 디바이스는 적어도 하나의 주입구 및 적어도 하나의 유출구를 포함하는 적어도 하나의 마이크로채널, 및 복수의 사이폰 어퍼쳐를 포함할 수 있다. 복수의 구획의 서브세트는 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 마이크로채널과 유체 연통할 수 있다. 복수의 구획은 약 1,000 내지 약 20,000개의 구획(예, 적어도 약 1,000개, 1,500개, 2,000개, 2,500개, 3,000개, 3,500개, 4,000개, 4,500개, 5,000개, 10,000개, 15,000개 또는 20,000개의 구획)을 포함할 수 있다.
도 11은 상기 기재된 마이크로유체 디바이스와 함께 사용하고자 하는 정량적 디지털 PCR 프로세스를 도시한다. 도 11A는 예시의 마이크로유체 디바이스의 구획의 서브세트의 표시를 나타낸다. 특정한 구획에서, 핵산 템플레이트는 존재하지 않으며, 다른 구획에서는 하나 이상의 템플레이트가 존재한다. 도 11B는 예시의 디바이스의 각각의 구획에서 샘플의 증폭 역학을 도시한다. 도 11B에 도시한 바와 같이, 존재하는 상이한 개수의 핵산 템플레이트를 갖는 구획은 증폭 역학을 나타낸다. 템플레이트가 없는 구획은 증폭되지 않는다. 그렇지 않다면, 구획이 다른 구획에 비하여 존재하는 더 많은 템플레이트를 가질 경우 구획은 더 빠르게 증폭된다. 각각의 수직의 파선은 총 5개의 증폭 주기 동안 단일 증폭 주기를 나타낸다. 5개의 주기를 예시하지만, 임의의 개수의 주기는 방법 및/또는 시스템의 배치의 구체적인 특징에 의존하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 임의의 제시된 구획 내에 잠재적으로 존재할 수 있는 핵산 분자의 개수, 사용된 시약 및 다른 반응 조건은 주기의 필요한 개수에 영향을 미칠 수 있는데, 이는 더 넓은 범위의 개수의 템플레이트가 임의의 제시된 구획 내에 잠재적으로 존재할 때 절대 정량화를 제공하기 위해 더 많은 주기가 필요할 수 있기 때문이다. 도 11C는 도 11B에 도시된 증폭 역학에 적용된 qdPCR 프로세스의 결과를 도시한다. 구체적으로, 도 11C는 도 11B에 도시된 5개의 PCR 증폭 주기 중에 측정된 증폭 역학에 기초하여 각각의 구획 내에서 존재하는 계산된 핵산 템플레이트 개수를 도시한다.
도 16은 본원에 기재된 디바이스를 사용하여 qdPCR을 수행하는 방법을 도시한다. 단계(1601)에서, 디바이스의 복수의 구획 또는 그의 서브세트에 1종 이상의 시약을 로딩시킨다. 시약 및/또는 샘플의 로딩은 예를 들면 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 일부 사례에서, 시약은 박막을 구획 상에 배치(예, 디바이스의 밀봉) 이전에 디바이스의 구획 또는 또 다른 부분에(예, 자동화된 기계적 프로세스를 사용하여) 배치할 수 있다. 예를 들면, 디바이스를 밀봉시키기 이전에 시약 패킷, 블리스터 팩, 겔 또는 다른 상기 성분을 구획에 넣을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 복수의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 또한 첨가할 수 있다.
단계(1602)에서, qdPCR을 수행하기 위한 시스템에 디바이스를 로딩시킬 수 있다. 예를 들면, 디바이스는 열 유닛, 예컨대 가열 블록에 물리적으로 배치하거나 또는 공압식 클램핑 디바이스와 함께 적소에 클램핑시키거나 또는 분석 시스템의 하우징에서 슬롯, 그루브 또는 함몰부 내에 배치될 수 있다. 등록 마크 및/또는 기계적 키(key)는 디바이스의 배치를 촉진시킬 수 있다. 디바이스는 연속된 순서로 배치 및 분석을 위해 디바이스를 나열시키는 기계적 로딩 유닛에 로딩시킬 수 있다. 일부 사례에서, 단계(1602)는 단계(1601) 이전에 수행되며, 디바이스를 분석 시스템 내에 배치한 후 시약을 디바이스에 로딩시킨다. 상기 시스템은 디바이스에 시약을 로딩시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 저수조, 펌프, 밸브 및 계량기를 포함한 유체 흐름 유닛 및/또는 다른 기계적 및 유체 성분을 포함할 수 있다.
단계(1603)에서, 핵산 증폭 반응은 디바이스의 복수의 구획의 서브세트 또는 그의 서브세트에 로딩된 복수의 핵산을 사용하여 수행된다. 증폭 반응은 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 열주기를 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 증폭 반응은 변성 상, 어닐링 상 및 신장 상을 포함할 수 있다. 증폭 주기는 약 60 및 180 초 사이에서(예, 약 150 초, 변성 온도에서 30 초 및 어닐링/신장 온도에서 120 초) 지속될 수 있다. 추가의 단계 및/또는 상이한 기간도 또한 사용될 수 있다.
단계(1604)에서, 디바이스의 복수의 구획의 서브세트 내의 각각의 구획으로부터 신호를 수집한다. 예를 들면, 구획의 화상을 촬영하고, 광학적 신호를 측정할 수 있다. 영상화는 예를 들면 열 유닛을 스캐닝하기 위해 광학 유닛을 이동시키고, 광학 유닛을 스캐닝하기 위해 열 유닛을 이동시키거나 또는 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트를 영상화시키기 위해 광학 및 열 유닛 둘다를 이동시켜 수행될 수 있다. 전체 디바이스의 신호는 한꺼번에(예, 하나 이상의 검출기, 예컨대 하나 이상의 카메라를 사용하거나 또는 전체 디바이스로부터 신호를 한꺼번에 수집하도록 설정된 단일 검출기를 사용하여) 수집할 수 있거나 또는 신호를 단지 디바이스의 부분으로부터(예, 디바이스의 복수의 구획의 서브세트에 해당함) 동시에 수집할 수 있다. 전자의 사례에서, 열 유닛 및/또는 검출기의 스캐닝은 필요하지 않을 수 있다. 신호는 증폭 중에 1회 이상 수집하여 예를 들면 각각의 주기 중에 증폭 역학의 추정을 제공할 수 있다. 일부 사례에서, 신호는 단지 각각의 증폭 주기 이후에 1회 수집하여 증폭 주기의 완료 후 발생하는 증폭의 양을 측정할 수 있다. 신호의 수집은 디바이스의 복수의 구획의 서브세트를 영상화하는 것을 포함할 수 있다. 영상화는 이중 가닥 핵산과 함께 삽입되는 형광 염료를 사용하거나 또는 상보성 서열과 반응한 후에만 형광을 띠는 켄칭된 DNA 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 그러한 사례에서, 구획을 형광 프로브에 적절한 여기 광원으로 조사하며, 어느 구획이 형광을 띠는지 및 형광의 강도를 측정하여 영상화가 수행될 수 있다. 일부 사례에서, 단계(1603 및 1604)는 동시에 수행될 수 있으며, 신호는 핵산 증폭 반응(예, 열순환) 중에 수집(예, 영상화)된다.
단계(1605)에서, 디바이스의 복수의 구획의 서브세트의 각각의 구획에서의 증폭 역학은 단계(1604)에서 수집된 신호에 기초하여 결정된다. 증폭률을 측정하여 복수의 구획의 서브세트의 각각의 구획에 포함된 핵산 분자의 초기 개수를 추정할 수 있다. 예를 들면, 도 11B에서, 구획의 어레이에 대한 증폭 역학은 5개의 증폭 사이클에 해당하는 것으로 도시된다. 그러한 어레이에서 각각의 구획에 해당하는 핵산 분자의 개수는 도 11C에 도시하며, 예를 들면 배경 수준에 대한 형광의 양을 측정하고, 이를 핵산 분자(예, 템플레이트)의 개수에 관련시켜 측정될 수 있다. 그러한 예에서, 더 많은 핵산 분자를 초기에 포함한 구획은 더 신속하게 증폭될 것이며, 그리하여 검출 가능한 형광을 더 이르게 생성할 것이다. 형광이 검출 가능하게 되는 시간(예, 증폭 주기)이 이를수록 더 많은 템플레이트가 구획 내에서 원래 존재하였다. 따라서, 존재하는 핵산 분자의 개수는 형광이 처음 검출 가능하게 될 때 완료되거나 또는 잔존하는 주기의 개수에 의해 결정될 수 있다. 증폭 역학을 결정하는 다른 방법도 또한 적용 가능하다. 각각에서, 최종 측정은 수집된 신호의 양, 신호가 검출되는 타이밍 및/또는 신호 생성의 증가 속도에 기초하여 각각의 구획에서 원래 존재하는 템플레이트의 개수이다.
단계(1606)에서, 디바이스의 복수의 구획의 서브세트 내에 존재하는 핵산 분자의 총수는 복수의 구획의 서브세트의 각각의 구획 내에 원래 존재하는 핵산 분자의 개수를 합하여 결정된다.
단계(1607)에서, 디바이스는 qdPCR을 수행하기 위해 시스템으로부터 언로딩된다. 디바이스의 언로딩(예, 제거)은 단계(1601)의 로딩 절차 또는 상이한 절차의 미러(mirror)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 수동 로딩된 디바이스는 기계적 로딩 유닛에 의해 자동 언로딩될 수 있거나 또는 다른 방식으로(예, 진공 픽 및 배치 시스템에 의해) 언로딩될 수 있다. 그 후, 프로세스는 또 다른 디바이스를 사용하여 반복될 수 있다.
핵산 샘플의 열역학적 분석 방법
본 개시내용은 샘플의 열역학적 분석 방법을 제공한다. 예를 들면, 본원에 기재된 디바이스는 고 해상 용융(HRM) 분석에 사용될 수 있다. 복수의 핵산 분자의 분석 방법은 본원에 기재된 바와 같은 복수의 구획을 포함하는 디바이스를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 복수의 구획의 적어도 하나의 서브세트는 복수의 핵산 분자(예, 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 분자)를 포함할 수 있다. 복수의 구획의 서브세트의 각각의 구획은 구획으로부터 구획의 외부 환경으로 구획을 외부 환경으로부터 분리하는 적어도 하나의 배리어를 통해, 기체 흐름을 허용하도록 설정될 수 있다. 그 후, 복수의 구획의 서브세트는 제어된 가열에 처해질 수 있다. 복수의 구획의 서브세트를 상기 조건에 처하게 하면서, 복수의 구획의 서브세트로부터 예를 들면 복수의 시점에 걸쳐 신호를 수집할 수 있다. 그 후, 복수의 구획으로부터 수집된 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 서브세트 내의 복수의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트의 융점을 나타내는 데이터를 수득할 수 있다. 신호 프로세싱은 제어된 가열을 진행하면서 또는 제어된 가열을 완료한 후 실시될 수 있다.
상기 방법은 복수의 핵산 분자를 핵산 샘플의 증폭 생성물로서 수득하기에 충분한 조건 하에서, 핵산 샘플 상에서 핵산 증폭 반응(예, 본원에 기재한 바와 같음)을 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 증폭 반응은 복수의 구획의 서브세트 내에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자를 포함하는 샘플은 핵산 증폭 반응을 수행하기 이전에, 복수의 구획의 서브세트에 로딩될 수 있다. 증폭 반응의 수행은 복수의 구획의 서브세트의 제어된 가열을 수행하는데 사용된 동일한 열 유닛(예, 가열기)을 사용한 복수의 구획의 서브세트의 가열을 포함할 수 있다. 증폭 반응은 1종 이상의 시약, 예컨대 하나 이상의 프라이머, 데옥시리보뉴클레오티드, 완충제, 보조인자, 삽입 염료 및 폴리머라제 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 시약은 검출 가능한 표지, 예컨대 형광체 또는 형광 표지를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 증폭 반응을 수행하기 이전에, 핵산 샘플의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트를 삽입 염료와 접촉시키는 것이 이로울 수 있다.
디바이스의 복수의 구획의 서브세트의 제어된 가열은 임의의 유용한 속도에서 및 임의의 유용한 온도 범위에 걸쳐 수행될 수 있다. 예를 들면, 제어된 가열은 적어도 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃ 또는 약 95℃ 또는 그보다 더 높은 하부 온도로부터 수행될 수 있다. 제어 가열은 적어도 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃, 약 91℃, 약 92℃, 약 93℃, 약 94℃, 약 95℃, 약 96℃, 약 97℃, 약 98℃, 약 99℃ 또는 약 100℃ 또는 그보다 높은 상부 온도로 수행될 수 있다. 온도는 임의의 유용한 증분에 의해 증가될 수 있다. 예를 들면, 온도는 적어도 약 0.01℃, 약 0.05℃, 약 0.1℃, 약 0.2℃, 약 0.3℃, 약 0.4℃, 약 0.5℃, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃ 또는 약 10℃ 또는 그보다 높은 온도로 증가될 수 있다. 제어된 가열은 또한 균등하게 이격된 온도 증분에 걸쳐 발생될 수 있다. 예를 들면, 온도는 핵산 분자의 상당한 용융이 예상되는 범위에 걸쳐 약 0.1℃로(예, 미세한 그레인 측정) 및 핵산 분자의 상당한 용융이 예상되지 않는 범위에 걸쳐 약 1℃로(예, 거친 그레인 측정) 증가될 수 있다. 제어된 가열은 임의의 유용한 속도, 예컨대 적어도 약 0.0001℃/초, 약 0.0002℃/초, 약 0.0003℃/초, 약 0.0004℃/초, 약 0.0005℃/초, 약 0.0006℃/초, 약 0.0007℃/초, 약 0.0008℃/초, 약 0.0009℃/초, 약 0.001℃/초, 약 0.002℃/초, 약 0.003℃/초, 약 0.004℃/초, 약 0.005℃/초, 약 0.006℃/초, 약 0.007℃/초, 약 0.008℃/초, 약 0.009℃/초, 약 0.01℃/초, 약 0.02℃/초, 약 0.03℃/초, 약 0.04℃/초, 약 0.05℃/초, 약 0.06℃/초, 약 0.07℃/초, 약 0.08℃/초, 약 0.09℃/초, 약 0.1℃/초, 약 0.2℃/초, 약 0.3℃/초, 약 0.4℃/초, 약 0.5℃/초, 약 0.6℃/초, 약 0.7℃/초, 약 0.8℃/초, 약 0.9℃/초, 약 1℃/초, 약 2℃/초, 약 3℃/초, 약 4℃/초 및 약 5℃/초 또는 그보다 큰 속도로 수행될 수 있다. 제어된 가열 프로세스를 실시하는 열 유닛(예, 가열기)은 임의의 유용한 기간 동안 주어진 온도를 유지할 수 있다. 예를 들면 주어진 온도는 적어도 약 1 초, 약 2 초, 약 3 초, 약 4 초, 약 5 초, 약 6 초, 약 7 초, 약 8 초, 약 9 초, 약 10 초, 약 15 초, 약 20 초, 약 25 초, 약 30 초, 약 45 초, 약 60 초, 약 70 초, 약 80 초, 약 90 초, 약 100 초, 약 110 초, 약 120 초, 약 130 초, 약 140 초, 약 150 초, 약 160 초, 약 170 초, 약 180 초, 약 190 초, 약 200 초, 약 210 초, 약 220 초, 약 230 초, 약 240 초, 약 250 초 또는 약 300 초 또는 그보다 더 긴 기간 동안 유지될 수 있다.
신호는 복수의 구획의 서브세트로부터 임의의 원하는 시점에서 수집될 수 있다. 예를 들면 신호는 적어도 1 초마다, 약 2 초마다, 약 3 초마다, 약 4 초마다, 약 5 초마다, 약 6 초마다, 약 7 초마다, 약 8 초마다, 약 9 초마다, 약 10 초마다, 약 20 초마다, 약 30 초마다, 약 45 초마다, 약 60 초마다, 약 70 초마다, 약 80 초마다, 약 90 초마다, 약 100 초마다, 약 110 초마다, 약 120 초마다, 약 130 초마다, 약 140 초마다, 약 150 초마다, 약 160 초마다, 약 170 초마다, 약 180 초마다, 약 190 초마다, 약 200 초마다, 약 210 초마다, 약 220 초마다, 약 230 초마다, 약 240 초마다, 약 250 초 또는 약 300 초마다 또는 더 긴 시간마다 수집될 수 있다. 신호는 온도 간격당 1회 또는 1회보다 많이 수집될 수 있다. 예를 들면, 신호는 온도를 그 다음 온도 간격으로 상승시키기 이전에 온도 간격의 종료시 수집될 수 있다. 신호 수집은 본원에 기재된 바와 같이 영상화를 포함할 수 있다. 수집된 신호의 프로세싱은 복수의 구획의 서브세트 내의 복수의 핵산 분자의 서브세트의 경우 온도 데이터에 대한 신호를 생성하는 신호를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법에서 분석되는 복수의 핵산 분자는 병원체를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플로부터 유도될 수 있다. 병원체는 1종 이상의 박테리아일 수 있다. 박테리아는 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바실루스 할로두란스, 바실루스 미코이데스, 바실루스 폴리멕사, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 투린겐시스, 스타필로코쿠스 카피티스, 스타필로코쿠스 카프라에, 스타필로코쿠스 하에몰리티쿠스, 스타필로코쿠스 호미니스, 스타필로코쿠스 렌투스, 스타필로코쿠스 루그두넨시스, 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스, 스타필로코쿠스 크실로수스, 프로피오니박테리움 아크네스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 악티노박테리아, 알파프로테오박테리아, 박테로이데테스, 베타프로테오박테리아, 클라미디아에스, 엡실론프로테오박테리아, 피르미쿠테스, 감마프로테오박테리아, 스피로카에탈레스 및 테네리쿠테스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 방법은 핵산 분자를 박테리아로부터 단리 또는 추출하는 추가의 프로세싱 단계를 포함할 수 있다. 핵산 샘플 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하는 것은 핵산 샘플의 핵산 분자의 서브세트의 내부 전사된 스페이서 영역의 적어도 일부분을 증폭시키는 것을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 리보솜 RNA(예, 16S)의 증폭이 발생될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 소변, 정액, 점액, 타액 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 체액을 포함할 수 있다. 대안으로, 샘플은 본원에 기재된 바와 같이 환경 샘플일 수 있다.
그러한 방법은 복수의 핵산 분자를 디바이스의 복수의 구획에 로딩하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 로딩 중에, 복수의 핵산 분자를 포함하는 복수의 구획의 서브세트 내의 기체를 복수의 구획의 서브세트로부터 외부 환경으로 유동되도록 한다.
핵산 분자의 분석 방법에 사용된 디바이스는 본원에 기재된 임의의 특징을 가질 수 있다. 디바이스의 배리어는 중합체 물질, 예컨대 열가소성 물질을 포함할 수 있으며, 박막일 수 있다. 배리어는 실질적으로 광학적으로 투명할 수 있다. 배리어는 약 50 ㎛ 내지 약 200 ㎛(예, 약 50 ㎛, 100 ㎛, 150 ㎛ 또는 200 ㎛)의 두께를 가질 수 있다. 디바이스는 적어도 하나의 주입구 및 적어도 하나의 유출구를 포함하는 적어도 하나의 마이크로채널, 및 복수의 사이폰 어퍼쳐를 포함할 수 있다. 복수의 구획의 서브세트는 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 마이크로채널과 유체 연통할 수 있다. 복수의 구획은 약 1,000 내지 약 20,000개의 구획(예, 약 1,000개, 1,500개, 2,000개, 2,500개, 3,000개, 3,500개, 4,000개, 4,500개, 5,000개, 10,000개, 15,000개 또는 20,000개의 구획)을 포함할 수 있다.
도 22A-22B는 고 해상 용융(HRM) 분석을 개략적으로 도시한다. 도 22A는 디지털 및 벌크 HRM 분석 사이의 차이를 도시한다. 상부 패널에 도시한 바와 같이, 디지털 HRM 분석에서 각각의 구획은 1개 이하의 표적 DNA 분자를 포함하며, 상이한 박테리아의 용융 곡선을 설명한다. 하부 패널은 벌크 HRM 분석을 도시하며, 여기서 단일의 비-미분 가능한 용융 곡선은 불균질 샘플로부터 측정한다. 도 22B는 복수의 상이한 박테리아 종을 포함하는 혼합된 샘플에 대한 HRM 곡선을 도시한다. 에스. 아우레우스, 이. 파에칼리스 및 피. 아크네스로부터의 뚜렷한 헬리시티 곡선을 상부 패널에 도시하며, 하부 패널에는 푸아송 통계학을 사용하여 구획의 점유를 결정하기 위한 그의 용도를 도시한다.
도 23A-23E는 다양한 박테리아 종에 대한 HRM 데이터를 도시한다. 도 23A는 89종의 상이한 박테리아에 대한 16S 및 내부 전사 스페이서(ITS) 복합 유도체 HRM 곡선을 도시한다. 특히, 박테리아 핵산 분자의 ITS 영역에 해당하는 용융 곡선은 16S 리보솜 RNA에 해당하는 용융 곡선보다 더 넓은 온도 범위 및 더 큰 곡선 다양성을 나타낸다. 도 23B는 바실루스 속의 7종의 상이한 종에 대한 HRM 곡선을 도시하며, 도 23C는 스타필로코쿠스 속의 9종의 상이한 종에 대한 HRM 곡선을 도시하며, 도 23D는 에스. 뉴모니아의 5종의 상이한 종에 대한 ITS HRM 곡선을 도시한다. 도 23E는 문(phylum)에 의해 체계화된 153종의 상이한 박테리아 종에 대한 ITS 서열 상동성의 히트 맵을 도시한다.
도 24A-24B는 HRM 분석을 개략적으로 도시한다. 도 24A는 복수의 사람 gDNA 및 HIV 프로바이러스성 DNA 분자를 포함한 벌크 PCR 반응으로 증폭된 샘플로부터의 DNA의 구획화를 도시한다. 구획당 gDNA의 평균 약 30억개의 염기쌍이 존재하며, HIV 프로바이러스성 DNA가 방해받지 않도록 샘플을 구획화한다. 도 24B는 PCR이 발생된 구획에 대한 가상의 HRM 분석을 도시한다. 각각의 패널은 상이한 이론적 구획 모집단에 해당하는 온도 의존성 형광 신호를 도시한다. 가장 좌측의 패널은 5개의 앰플리콘 모두를 포함하는 구획에 대한 가상의 신호를 예시하며; 중앙의 패널은 앰플리콘 1, 2 및 4만을 포함하는 구획에 대한 가상의 신호를 예시하며; 가장 오른쪽의 패널은 앰플리콘 2 및 5만을 포함하는 구획에 대한 가상의 신호를 예시한다.
샘플 분석용 시스템
한 구체예에서, 본 개시내용은, 복수의 핵산 분자를 분석하기 위한 마이크로유체 디바이스(예, 본원에 기재한 바와 같음)의 사용을 위한 시스템을 제공한다. 시스템은 복수의 구획을 포함하는 디바이스를 수용하도록 설정된 지지 유닛을 포함할 수 있다. 디바이스의 복수의 구획의 서브세트의 각각의 구획은 구획으로부터 상기 구획의 외부 환경으로, 복수의 구획의 서브세트를 외부 환경으로부터 분리하는 적어도 하나의 배리어를 통해, 기체 흐름을 허용하도록 설정된다. 시스템은 또한 디바이스의 복수의 구획의 서브세트로부터 복수의 시점에 걸쳐 신호를 수집하도록 설정된 검출기를 포함할 수 있다. 그러한 시스템은 또한 검출기에 작동적으로 커플링된 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 포함할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 복수의 핵산 분자를 사용하여 복수의 핵산 분자의 적어도 하나의 서브세트로부터 증폭 생성물을 생성하는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 증폭 반응을 실시하기에 충분한 조건에 복수의 구획의 서브세트를 처하게 하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍될 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 또한 증폭 반응이 진행 중이면서 복수의 구획의 서브세트로부터 복수의 시점에 걸쳐 검출기에 의해 수집된 신호를 수신하도록 프로그래밍될 수 있다. 신호를 수집하고, 검출기에 저장하고, 주어진 시간에서 프로세서(들)로 보내거나 또는 신호가 수집되는대로 프로세서(들)에 제공될 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 복수의 구획의 서브세트로부터 신호의 수집을 명형하도록 프로그래밍될 수 있다. 이들은 또한 복수의 구획의 서브세트 내의 핵산 분자의 개수를 측정하기 위해 수집된 신호를 프로세싱하도록 프로그래밍될 수 있다. 그러한 시스템은 복수의 핵산 분자를 복수의 구획으로 유도하도록 설정된 유체 흐름 유닛(예, 공압식 유닛)을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍되어 유체 흐름 유닛이 복수의 핵산 분자를 복수의 구획에 로딩하도록 명령할 수 있다.
본 개시내용은, 또한 복수의 핵산 분자를 함유하거나 또는 이를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 분석하는 마이크로유체 디바이스(예, 본원에 기재된 바와 같음)를 사용하기 위한 시스템을 제공한다. 그러한 분석은 샘플 중의 핵산 분자, 예컨대 DNA의 해리 특징의 열역학적 평가를 포함할 수 있다. 열역학적 평가는 DNA의 융점 및 DNA 분자의 개개의 가닥의 결합 강도의 측정을 포함할 수 있다.
상기 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 지지 유닛 및 검출기를 포함할 수 있다. 그러한 시스템은 복수의 구획의 서브세트가 제어된 가열에 처하도록 설정된 열 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 상기 시스템은 또한 검출기에 작동적으로 커플링된 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 포함할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍되어 복수의 구획의 서브세트가 제어된 가열에 처하도록 열 유닛에 명령할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 또한 복수의 구획의 서브세트를 제어된 가열에 처하게 하면서, 복수의 구획의 서브세트로부터 수집된 신호를 검출기에 의해 수신하도록 프로그래밍될 수 있다. 이들은 또한 수집된 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 서브세트의 융점을 나타내는 데이터를 수득하도록 프로그래밍될 수 있다. 시스템은 복수의 핵산 분자를 복수의 구획으로 유도하도록 설정된 유체 흐름 유닛(예, 공압식 유닛)을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 유체 흐름 유닛에 명령하여 복수의 핵산 분자를 복수의 구획에 로딩하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍될 수 있다.
상기 시스템은 하나 이상의 마이크로유체 디바이스를 유지하도록 설정된 지지 유닛, 예컨대 이동 스테이지, 플랫폼, 슬롯 또는 그루브를 포함할 수 있다. 마이크로유체 디바이스는 주입구 및 유출구를 갖는 마이크로채널, 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 마이크로채널에 연결된 복수의 마이크로챔버 및, 마이크로유체 디바이스를 막거나 또는 덮는 박막(예, 열가소성 박막)을 포함할 수 있다. 그러한 장치는 마이크로유체 디바이스와 유체 연통하는 공압식 유닛을 포함할 수 있다. 공압식 유닛은 시약을 마이크로유체 디바이스에 로딩시키고, 시약을 마이크로챔버에 구획화시킬 수 있다. 시스템은 복수의 마이크로챔버와 열적 연통하는 열 유닛을 포함할 수 있다. 열 유닛은 마이크로챔버 및 온도를 제어하고, 마이크로챔버를 열순환시킬 수 있다. 시스템은 디바이스의 마이크로챔버 또는 그의 서브세트로부터 신호를 수집하기 위한 검출기를 포함할 수 있다. 검출기는 복수의 마이크로챔버의 영상화가 가능한 광학 유닛일 수 있다. 시스템은 또한 지지 유닛, 공압식 유닛, 열 유닛 및 검출기(예, 광학 유닛)에 커플링된 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 포함할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 (i) 공압식 유닛에 명령하여 시약을 마이크로유체 디바이스에 로딩하고, 시약을 복수의 마이크로챔버에 구획화하며, (ii) 열 유닛을 명령하여 복수의 마이크로챔버를 열순환시키며, (iii) 검출기(예, 광학 유닛)를 명령하여 신호를 복수의 마이크로챔버로부터 수집(영상화)하도록 프로그래밍될 수 있다.
지지 유닛은 마이크로유체 디바이스를 입력하고, 마이크로유체 디바이스를 유지하며, 마이크로유체 디바이스를 출력하도록 설정될 수 있다. 지지 유닛은 하나 이상의 좌표에서 정상 상태일 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 지지 유닛은 X-방향, Y-방향, Z-방향 또는 그의 임의의 조합에서 이동 가능할 수 있다. 지지 유닛은 단일 마이크로유체 디바이스를 지지할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 이동 스테이지는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그보다 많은 마이크로유체 디바이스를 유지할 수 있다.
공압식 유닛은 마이크로유체 디바이스의 주입구 및 유출구와 유체 연통되도록 설정될 수 있다. 공압식 유닛은 복수의 주입구 및 복수의 유출구에 연결될 수 있는 복수의 연결점을 가질 수 있다. 공압식 유닛은 마이크로챔버의 단일 어레이를 한번에 또는 마이크로챔버의 복수의 어레이를 동시에 충전, 백필링 및 구획화시킬 수 있다. 공압식 유닛은 진공 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 공압식 유닛은 마이크로유체 디바이스에 증가된 압력을 제공하거나 또는 진공을 마이크로유체 디바이스에 제공할 수 있다.
열 유닛은 마이크로유체 디바이스의 마이크로챔버와 열적 연통하도록 설정될 수 있다. 열 유닛은 마이크로챔버의 단일 어레이의 온도를 제어하거나 또는 마이크로챔버의 복수의 어레이의 온도를 제어하도록 설정될 수 있다. 열적 제어 유닛은 마이크로챔버의 모든 어레이 전체에 걸쳐 동일한 열적 프로그램을 수행할 수 있거나 또는 마이크로챔버의 상이한 어레이로 상이한 열적 프로그램을 수행할 수 있다. 열 유닛은 열순환 및 제어된 가열 둘다를 실시하도록 설정될 수 있다. 대안으로, 시스템은 복수의 열 유닛을 포함할 수 있으며, 각각은 별도의 열적 프로세스, 예컨대 열순환 및 제어된 가열을 실시하도록 설정된다.
검출기는 디바이스의 복수의 구획의 전체 또는 서브세트로부터 신호를 수집하도록 설정될 수 있다. 예를 들면, 검출기는 광학, 임피던스 또는 임의의 다른 유용한 신호 유형을 수집할 수 있다. 검출기는 광학 유닛일 수 있다. 광학 유닛은 광의 복수의 파장을 방출 및 검출하도록 설정될 수 있다. 방출 파장은 사용된 지시약 및 증폭 프로브의 여기 파장에 해당할 수 있다. 방출된 광은 약 450 ㎚, 500 ㎚, 525 ㎚, 550 ㎚, 575 ㎚, 600 ㎚, 625 ㎚, 650 ㎚, 675 ㎚, 700 ㎚ 또는 그의 임의의 조합의 최대 강도를 갖는 파장을 포함할 수 있다. 검출된 광은 약 500 ㎚, 525 ㎚, 550 ㎚, 575 ㎚, 600 ㎚, 625 ㎚, 650 ㎚, 675 ㎚, 700 ㎚ 또는 그의 임의의 조합의 최대 강도를 갖는 파장을 포함할 수 있다. 광학 유닛은 광의 1, 2, 3, 4개 또는 그보다 많은 파장을 방출하도록 설정될 수 있다. 광학 유닛은 광의 1, 2, 3, 4개 또는 그보다 많은 파장을 검출하도록 설정될 수 있다. 광의 하나의 방출된 파장은 지시약 분자의 여기 파장에 해당할 수 있다. 광의 또 다른 방출된 파장은 증폭 프로브의 여기 파장에 해당할 수 있다. 광의 하나의 검출된 파장은 지시약 분자의 방출 파장에 해당할 수 있다. 광의 또 다른 검출된 파장은 마이크로챔버 내의 반응을 검출하는데 사용된 증폭 프로브에 해당할 수 있다. 광학 유닛은 마이크로챔버의 서브세트 또는 마이크로챔버의 어레이의 부분을 영상화하도록 설정될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 광학 유닛은 단일 화상에서 마이크로챔버의 전체 어레이를 영상화할 수 있다.
도 6은 단일 기기 내에서 도 5의 프로세스를 수행하기 위한 기기(600)를 도시한다. 기기(600)는 펌프 및 매니폴드를 함유하는 공압식 유닛(601)을 포함하며, Z-방향으로 이동 가능하여 도 3A-3D에 기재된 바와 같이 압력의 적용을 수행하도록 작동 가능하다. 기기(600)는 또한 열 유닛(602), 예컨대 플랫 블록 열순환기를 포함하여 마이크로유체 디바이스를 열순환시켜서 폴리머라제 연쇄 반응이 실시되도록 한다. 기기(600)는 광학 유닛(603), 예컨대 에피(epi)-형광 광학 유닛을 추가로 포함하며, 이는 마이크로유체 디바이스 내의 마이크로챔버가 PCR 반응을 성공적으로 실시하였는지를 광학적으로 결정할 수 있다. 광학 유닛(603)은 정보를 프로세서(604)에 공급할 수 있으며, 이는 푸아송 통계학을 사용하여 성공적인 마이크로챔버의 미가공 계수를 핵산 농도로 전환시킨다. 지지 유닛(605)(예, 이동 스테이지)을 사용하여 제시된 마이크로유체 디바이스를 다양한 유닛 사이에서 이동시키며, 복수의 마이크로유체 디바이스를 동시에 취급할 수 있다. 단일 기기에 상기 작용의 혼입과 조합된 상기 기재된 마이크로유체 디바이스는 dPCR의 다른 수행에 비하여 dPCR에 대한 비용, 작업흐름 복잡성 및 공간 요건을 감소시킨다.
도 12A는 본 개시내용의 하나의 실시양태에 따른 디바이스를 도시한다. 디바이스는 8개의 독립적 반응 어레이를 함유하는 것을 도시하며, 이들 각각은 시약을 독립적으로 충전시킬 수 있다. 각각의 반응 어레이는 20,000개의 개개의 구획을 함유한다. 도 12B는 디바이스의 하나의 반응 어레이 내에서 구획의 부분의 배치를 도시한다. 그러한 도시는 로딩 도관의 서펜틴 경로 및 로딩 도관으로부터 차단되어 로딩되는 구획의 확대도를 도시한다. 각각의 원형 형상은 0, 1 또는 그보다 많은 핵산 템플레이트를 함유하는 시약에 로딩될 수 있으며, 본원에 기재된 바와 같이 개별적으로 증폭 및 분석될 개개의 구획을 나타낸다.
도 13은 디바이스 유체 제어를 제공하는데 사용하기 위한 공압식 유닛을 따른 디바이스의 개략적 표시를 도시한다. 각각의 포트는 디바이스(1300) 상의 8개의(본 실시양태에서) 반응 어레이 중 하나로의 유체 인터페이스를 제공한다. 본원에 기재한 바와 같이, 각각의 반응 어레이의 주입구 및 유출구에서 적용된 저압 및 고압의 시퀀스는 시약을 반응 어레이 내의 구획에 로딩한다. 공압식 유닛(1301)은 상기 압력의 적용을 제어하며, 전자 압력 조절기(1302) 및 적어도 2개의 밸브(1303 및 1304)를 포함한다. 더 많은 밸브가 포함될 수 있다(예, 각각 개개의 반응 어레이의 별도의 로딩을 제공하기 위해). 디바이스는 본 개시내용의 시스템 내에서 배향 및 등록을 돕기 위한 기계적 키(예컨대 디바이스의 상부에서의 탭(1305))를 포함할 수 있거나 또는 시각적 특징, 예컨대 등록 마크(도시하지 않음)를 포함할 수 있다.
도 14A는 본 개시내용의 실시양태에 사용하기 위한 플랫 블록 열순환 유닛을 도시한다. 플랫 블록 열순환 유닛은 본 개시내용의 실시양태에 의한 PCR 증폭 주기를 가능케 하는 열적 제어를 제공한다. 플랫 블록은 공압식 클램프가 플랫 블록에 직접 장착될 수 있도록 나사형 구멍(도시하지 않음)을 포함한다. 이는 예를 들면 본원에 기재된 바와 같이 디바이스 내에 함유된 샘플 및 시약(들)의 열순환을 위한 플랫 블록에 디바이스의 클램핑을 허용한다.
도 14B는 공압식 클램프(1402)가 추가된 도 14A의 플랫 블록 열순환 유닛(1401)을 도시하며, 클램프는 디바이스(1403), 예컨대 도 12A의 디바이스가 열 유닛에 로딩될 수 있도록 개방된다. 그러한 도시에서, 디바이스(1403)는 PCR 증폭 주기를 위해 조합된 열 유닛/클램프 시스템에 로딩된다. 열 유닛/클램프 시스템으로의 디바이스(1403)의 로딩 후, 공압식 클램프(1402)로 클램핑 다운하고, 디바이스를 적소에 유지하기 위해 공압식 드라이브를 경유하여 공압식 압력을 적용할 수 있다. 공압식 드라이브는 도 13에 관하여 상기 기재된 공압식 유닛과 통합될 수 있거나 또는 별도의 공압식 시스템이 될 수 있다. 공압식 유닛이 통합된 시스템에서, 비어 있는 디바이스는 순환 유닛에 배치될 수 있으며, 디바이스는 블록 상에서 적소에서 유지하면서 시약이 로딩될 수 있다. 시약/샘플 로딩된 디바이스를 예를 들면 증폭을 위해 시스템에 로딩시키기 이전에 시약 및/또는 샘플 로딩은 또한 별도의 공압식 유닛으로 실시될 수 있다.
도 15는 본 개시내용의 실시양태에 사용하기 위한 완전한 qdPCR 시스템(1500)을 도시한다. 시스템(1500)은 열 유닛(1501), 광학 유닛(1502)(부품(1502A, 1502B 및 1502C) 포함), 공압식 유닛(1503) 및 기계적 유닛(1504)을 포함한다. 각각의 유닛은 서로 함께 작동하여 본 개시내용의 실시양태에 의한 qdPCR 프로세스를 수행한다.
열 유닛(1501)은 시약 및/또는 샘플 로딩된 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트의 열순환 및/또는 제어된 가열을 제공한다. 열 유닛(1501)은 디바이스가 열주기 및/또는 제어된 가열에 처해지는 능력을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 열주기는 변성 상, 어닐링 상 및 신장 상을 포함할 수 있다. 단일 PCR 증폭 주기는 예를 들면 약 60 내지 120 초 사이의 기간 중에 발생될 수 있다. 온도의 다른 프로파일은 또한 본 개시내용에 의한 실시양태와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 열 유닛(1501)은 추가의 변경 없이 PCR 증폭 반응의 생성물의 저장을 허용하는 유지 온도로 디바이스를 가열하도록 설정될 수 있다. 열 유닛(1501)은 또한 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 고 해상 용융 분석을 위한 제어된 가열을 수행하도록 설정될 수 있다. 열 유닛(1501)은 부품, 예컨대 온도 제어 유닛, 온도 프로브, 회로 및 임의의 다른 유용한 부품을 포함할 수 있다. 열 유닛(1501)은 디바이스를 지지하기 위한 지지 유닛을 포함할 수 있으며, 디바이스를 열 유닛(1501)에 유지하기 위해 공압식 클램프(1505)를 혼입시킬 수 있다.
광학 유닛(1502)은 증폭 또는 제어된 가열 프로세스 도중에, 이전에 및/또는 이후에 디바이스 또는 그의 복수의 구획의 서브세트의 영상화를 제공한다. 광학 유닛(1502)은 각각의 구획을 예를 들면 증폭 주기당 적어도 1회 영상화시키도록 설정될 수 있다. 각각의 구획은 본원에 기재된 바와 같이 더 자주(예, 증폭 주기당 2회 또는 증폭 주기당 10회) 영상화할 수 있다. 광학 유닛(1502)은 또한 각각의 구획을 복수의 시점에서 제어된 가열 프로세스 도중에 영상화하도록 설정될 수 있다.
광학 유닛(1502)은 전체로서 디바이스를 부분적으로(예, 각각의 영상에서 구획의 5×5 그리드를 영상화함) 또는 어레이당의 기준으로(예, 단일 화상에서 주어진 어레이에서 20,000개의 구획 전부를 영상화함) 영상화할 수 있다. 광학 유닛(1502)이 단일 샷으로 전체 디바이스를 영상화할 수 있을 경우 광학 유닛(1502)의 이동은 필요하지 않을 수 있다. 부분적 영상화의 경우, 광학 유닛(1502)은 그 자체를 디바이스로 배향시키고(예, 기계적 키 또는 등록 마크를 사용함), 그 후 디바이스의 구획 전체에 걸쳐 스캐닝하도록 설정될 수 있다. 대안으로, 광학 유닛(1502)은 적소에 고정될 수 있으며, 열 유닛(1501)은 광학 유닛(1502)이 각각의 구획 또는 구획의 그룹을 영상화하도록 이동될 수 있다. 광학 유닛(1502)은 디바이스 상에 인쇄된 등록 마크를 사용하여 그 자체를 배향시키도록 설정될 수 있다. 광학 유닛(1502)은 열 유닛(1501)의 위치에 의해 또는 광학 유닛(1502), 열 유닛(1501) 및 임의의 관련 취급 유닛의 포지셔닝에 의해 배향될 수 있다. 광학 유닛(1502)은 본원에 기재된 바와 같이 광원(1502A), 여기 필터(1502B), 색선별 거울(1502C), 방출 필터(1502D), 초점 렌즈(1502E) 및 화상 센서(1502F)를 포함한다.
공압식 유닛(1503)은 유체가 디바이스를 취급 및/또는 클램핑하는 기능을 제공한다. 동일한 공압식 유닛(1503)은 유체 취급/시약 로딩 능력 둘다를 디바이스에 제공할 수 있으며, 공압식 클램프핑 기능을 열 유닛(1501) 상에 장착된 공압식 클램프(1505)에 제공한다. 대안으로, 공압식 유닛(1503)은 단지 클램핑 기능을 공압식 클램프(1505)에 제공할 수 있으며, 별도의 공압식 유닛(도시하지 않음)은 시약 로딩을 디바이스에 제공한다.
기계적 유닛(1504)은 다양한 부품의 기계적 취급 및 이동을 제공한다. 도시된 실시양태에서, 기계적 유닛(1504)은 디바이스의 구획 전체에 걸쳐 광학 유닛(1502)을 스캐닝하는 능력을 제공한다. 본 실시양태에서, 기계적 유닛(1504)은 광학 유닛(1502)을 그 다음 영상화 위치로 이동시키며, 이를 영상화한 후, 모든 구획이 영상화될 때까지 프로세스를 반복한다. 그러한 프로세스는 원하는 증폭 주기의 횟수 및 주기당 영상화 횟수 및/또는 관심의 제어된 가열 프로세스에 의존하여 필요한 만큼 반복될 수 있다. 기계적 유닛(1504)은 광학 유닛(1502) 대신에 열 유닛(1501)을 이동시킬 수 있다. 예를 들면, 기계적 유닛(1504)은 화상이 광학 유닛(1502)에 의해 촬영될 수 있도록 열 유닛(1501)을 영상화 위치로 이동시킬 수 있으며, 그 후 열 유닛(1501)은 다시 새로운 영상화 위치의 영상화를 허용하도록 이동될 수 있다. 그러한 프로세스를 필요한 바에 따라 반복할 수 있다. 기계적 유닛(1504)은 추가의 기능, 예컨대 디바이스의 기계적 취급을 제공하여 qdPCR 프로세스의 수행 이전에 열 유닛(1501)에 로딩시키거나 또는 qdPCR 프로세스가 완료된 후 열 유닛(1501)으로부터 자동적으로 언로딩될 수 있다.
본 개시내용의 시스템은 복수의 디바이스를 동시에 프로세싱할 수 있거나 또는 상이한 단계의 수행을 상이한 디바이스 상에서 차례로 허용할 수 있는 자동 시스템을 제공하기 위해 동일한 시스템에 혼입될 수 있는 열 유닛(1501), 광학 유닛(1502), 공압식 유닛(1503) 및 기계적 유닛(1504) 중 하나 이상의 복수의 경우를 포함할 수 있다. 게다가, 시스템은 본 개시내용에 관하여 상기 기재된 바와 같은 다른 분석 기능을 위해 또는 광학 유닛(1502)에 의해 검출된 증폭 역학의 분석을 수행하기 위해 프로세스를 혼입할 수 있다.
도 17A-17B는 핵산 분자를 프로세싱하기 위한 예시의 시스템을 도시한다. 도 17A는 컴퓨터 프로세서(1702)에 커플링된 유저 인터페이스(1701), 열 유닛(1703) 및 카메라(1704)를 포함하는, 핵산 분자를 프로세싱하기 위한 전체 예시의 시스템을 도시한다. 도 17B는 디바이스(1708) 위의 카메라(1704), LED 발광체/히트 싱크(heat sink)(1705), 필터 큐브(1706) 및 셔터(1707)를 도시하는 확대도를 도시한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의한 범주로 한정되지 않는다. 사실상, 본원에 기재된 것 이외에 본 개시내용의 다른 다양한 실시양태 및 변경예는 상기 기재 및 첨부하는 도면으로부터 당업자의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
예를 들면, dPCR 적용의 문맥에서 기재되지만, 기체 또는 다른 유체를 경유하여 단리되는 액체로 충전되는 다수의 단리된 마이크로챔버를 필요로 할 수 있는 다른 마이크로유체 디바이스는 또한 제조 가능성 및 비용에 관하여 잇점을 제공하면서 기체 오염을 방지하기 위해 탈기를 허용하는 열가소성 박막의 사용으로부터 이득을 얻을 수 있다. PCR을 제외하고, 다른 핵산 증폭 방법, 예컨대 루프 매개된 등온 증폭은 본 개시내용의 실시양태에 따른 특정한 핵산 서열의 디지털 검출을 수행하도록 변형될 수 있다. 마이크로챔버는 또한 단리시키고자 하는 세포의 직경에 근접하도록 설계된 사이포닝 어퍼쳐를 갖는 단일 세포를 단리시키는데 사용될 수 있다. 사이포닝 어퍼쳐가 혈액 세포의 크기보다 훨씬 더 작을 경우, 본원에 기재된 방법은 예를 들면 혈액 혈장을 전혈로부터 분리시키는데 사용될 수 있다.
핵산 샘플 분석용 컴퓨터 시스템
본 개시내용은, 본 개시내용의 방법을 수행하도록 프로그래밍된 컴퓨터 제어 시스템을 제공한다. 도 7은 샘플 구획화, 증폭 및 검출을 포함한 핵산 샘플 프로세싱 및 분석을 위해 프로그래밍 또는 달리 설정될 수 있는 컴퓨터 시스템(701)을 도시한다. 컴퓨터 시스템(701)은 본 개시내용의 방법 및 시스템의 다양한 측면을 조절할 수 있다. 컴퓨터 시스템(701)은 전자 디바이스에 관하여 원격 배치될 수 있는 컴퓨터 시스템 또는 유저의 전자 디바이스일 수 있다. 전자 디바이스는 휴대용 전자 디바이스일 수 있다.
컴퓨터 시스템(701)은 단일 코어 또는 멀티 코어 프로세서 또는, 병렬 프로세싱을 위한 복수의 프로세서가 될 수 있는 중앙 프로세싱 유닛(CPU, 또한 본원에서 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서")(705)을 포함한다. 컴퓨터 시스템(701)은 또한 메모리 또는 메모리 로케이션(710)(예, 랜덤 액세스 메모리, 판독 전용 메모리, 플래쉬 메모리), 전자 저장 유닛(715)(예, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스(720)(예, 네트워크 어댑터) 및 주변 디바이스(725), 예컨대 캐시. 다른 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함한다. 메모리(710), 저장 유닛(715), 인터페이스(720) 및 주변 디바이스(725)는 통신 부스(실선), 예컨대 머더보드를 통해 CPU(705)와 통신한다. 저장 유닛(715)은 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 유닛(또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 시스템(701)은 통신 인터페이스(720)의 도움으로 컴퓨터 네트워크("네트워크")(730)에 작동적으로 커플링될 수 있다. 네트워크(730)는 인터넷 및/또는 엑스트라넷인 인터넷일 수 있거나 또는 인터넷과 통신할 수 있는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크(730)는 일부 사례에서 전기통신 및/또는 데이터 네트워크일 수 있다. 네트워크(730)는 분산 컴퓨팅, 예컨대 클라우드 컴퓨팅을 가능케 하는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다. 네트워크(730)는 일부 사례에서 컴퓨터 시스템(701)의 도움으로 피어-투-피어 네트워크를 실행할 수 있으며, 이는 컴퓨터 시스템(701)에 커플링된 디바이스가 클라이언트 또는 서버로서 작동하게 할 수 있다.
CPU(705)는 프로그램 또는 소프트웨어로 구현될 수 있는 기기 판독 가능한 명령의 시퀀스를 실행할 수 있다. 명령은 메모리 로케이션, 예컨대 메모리(710)에 저장할 수 있다. 명령은 CPU(705)에 명령할 수 있으며, 이는 본 개시내용의 방법을 실행하기 위해 차후에 CPU(705)를 프로그래밍 또는 달리 설정할 수 있다. CPU(705)에 의해 수행되는 작동의 예는 펫치, 디코드, 실행 및 라이트백을 포함할 수 있다.
CPU(705)는 회로, 예컨대 집적 회로의 일부일 수 있다. 시스템(701)의 하나 이상의 다른 부품은 회로에 포함될 수 있다. 일부 사례에서, 회로는 주문자 요구형 반도체(ASIC)이다.
저장 유닛(715)은 파일, 예컨대 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램을 저장할 수 있다. 저장 유닛(715)은 유저 데이터, 예를 들면 유저 선호도 및 유저 프로그램을 저장할 수 있다. 컴퓨터 시스템(701)은 일부 사례에서 컴퓨터 시스템(701)의 외부이며, 예컨대 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템(701)과 통신하는 원격 서버 상에 위치하는 하나 이상의 추가의 데이터 저장 유닛을 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템(701)은 네트워크(730)를 통해 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 예를 들면, 컴퓨터 시스템(701)은 유저(예, 서비스 제공자)의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템의 예는 퍼스널 컴퓨터(예, 휴대용 PC), 슬레이트 또는 태블릿 PC(예, 애플(Apple)® 아이패드(iPad), 삼성(Samsung)® 갤럭시 탭(Galaxy Tab)), 전화기, 스마트 폰(예, 애플® 아이폰(iPhone), 안드로이드 지원 디바이스, 블랙베리(Blackberry)®) 또는 퍼스널 디지털 단말기를 포함한다. 유저는 네트워크(730)를 경유하여 컴퓨터 시스템(701)에 액세스 가능하다.
본원에 기재된 바와 같은 방법은 컴퓨터 시스템(701)의 전자 저장 로케이션에서, 예를 들면 메모리(710) 또는 전자 저장 유닛(715)에서 저장된 기기(예, 컴퓨터 프로세서) 실행 가능한 코드에 의해 실행될 수 있다. 기기 실행 가능하거나 또는 기기 판독 가능한 코드는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 사용시, 코드는 프로세서(705)에 의해 실행될 수 있다. 일부 사례에서, 코드는 저장 유닛(715)으로부터 검색될 수 있으며, 프로세서(705)에 의한 액세스 준비를 위해 메모리(710)에 저장될 수 있다. 일부 경우에서, 전자 저장 유닛(715)은 배제될 수 있으며, 기기 실행 가능한 명령은 메모리(710)에 저장된다.
코드는 코드를 실행하기 위해 응용된 프로세서를 갖는 기기와 함께 사용하기 위해 사전컴파일링 및 구성될 수 있거나 또는 실행 시간 중에 컴파일링될 수 있다. 코드는 사전컴파일링된 또는 유사 컴파일링된 방식으로 코드를 실행할 수 있도록 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 공급될 수 있다.
한 구체예에서, 본 개시내용은, 하나 이상의 컴퓨터 프로세서에 의한 실행시 핵산 샘플을 증폭 및 정량화시키기 위해 마이크로유체 디바이스를 형성하는 방법을 실행하는 기기 실행 가능한 코드를 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다. 상기 방법은 열가소성 수지를 사출 성형시켜 적어도 하나의 마이크로채널, 복수의 마이크로챔버 및 복수의 사이폰 어퍼쳐를 포함하는 마이크로유체 구조체를 생성하는 단계, 여기서 복수의 마이크로챔버는 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 적어도 하나의 마이크로채널에 연결되며; 적어도 하나의 주입구 및 적어도 하나의 유출구를 형성하는 단계, 여기서 적어도 하나의 주입구 및 적어도 하나의 유출구는 적어도 하나의 마이크로채널과 유체 연통하며; 열가소성 박막을 적용하여 마이크로유체 구조체를 덮는 단계, 여기서 열가소성 박막은 열가소성 박막 전체에 걸쳐 적용된 압력차에 대하여 적어도 부분적으로 기체 투과성인 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 개시내용은, 하나 이상의 컴퓨터 프로세서에 의한 실행시 핵산 샘플을 분석 및 정량화시키기 위한 방법을 실행하는 기기 실행 가능한 코드를 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다. 그러한 방법은 복수의 마이크로챔버를 포함하는 마이크로유체 디바이스를 제공하는 단계; 본원에 기재된 바와 같이 마이크로유체 디바이스를 샘플 및/또는 1종 이상의 시약으로 충전시키며(예, 공압식 또는 유체 흐름 유닛 및 일련의 압력차를 사용함); 디바이스의 복수의 마이크로챔버 또는 그의 서브세트를 주기적으로(예, 증폭 반응을 위한 열순환) 및/또는 제어된 상승으로(예, 고 해상 용융 또는 다른 열역학적 분석의 경우) 가열하는 단계; 증폭 반응 또는 제어된 가열 중에 또는 진행 중에 또는 상기 프로세스를 완료한 후 신호를 복수의 마이크로챔버 또는 그의 서브세트로부터 수집하는 단계; 복수의 마이크로챔버로부터 수집된 신호를 프로세싱하여, 복수의 구획의 서브세트 내의 핵산 분자의 개수를 측정하며 및/또는 복수의 구획의 서브세트 내의 복수의 핵산 분자 또는 그의 서브세트에 해당하는 융점을 나타내는 데이터를 수득하는 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 또한 디바이스의 마이크로챔버 또는 그의 서브세트를 샘플 및/또는 시약으로 충전시키는 방법을 실행하도록 프로그래밍될 수 있다. 상기 방법은 적어도 하나의 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 디바이스를 제공하는 단계, 여기서 적어도 하나의 마이크로채널은 적어도 하나의 주입구 및 적어도 하나의 유출구를 포함하며, 마이크로유체 디바이스는 복수의 사이폰 어퍼쳐에 의해 마이크로채널에 연결된 복수의 마이크로챔버 및, 열가소성 박막이 마이크로채널, 복수의 마이크로챔버 및 복수의 사이폰 어퍼쳐를 막도록 마이크로유체 디바이스의 표면과 이웃하게 배치된 열가소성 박막을 추가로 포함하며; 시약을 적어도 하나의 주입구 또는 적어도 하나의 유출구에 제공하는 단계; 샘플 및/또는 시약 및 마이크로유체 디바이스 사이의 제1의 압력차를 제공하여 마이크로유체 디바이스를 충전시키는 단계, 여기서 제1의 압력차는 샘플 및/또는 시약이 마이크로유체 디바이스로 유동되게 하며; 마이크로채널 및 복수의 마이크로챔버 사이의 제2의 압력차를 적용하여 샘플 및/또는 시약을 복수의 마이크로챔버로 이동시키고, 복수의 마이크로챔버 내의 기체가 복수의 마이크로챔버, 복수의 사이폰 어퍼쳐 및 마이크로채널을 막거나 또는 덮는 열가소성 박막을 통과하도록 하는 단계, 여기서 제2의 압력차는 제1의 압력차보다 크며; 적어도 하나의 주입구 및 적어도 하나의 유출구 사이의 제3의 압력차를 적용하여 유체를 마이크로챔버에 투입하지 않으면서 유체를 마이크로채널에 투입하는 단계, 여기서 제3의 압력차는 제2의 압력차보다 적은 것을 포함한다.
본원에 제공된 시스템 및 방법, 예컨대 컴퓨터 시스템(701)의 구체예는 프로그래밍으로 구체화될 수 있다. 그러한 기술의 다양한 구체예는 통상적으로 기기 판독 가능한 매체의 형태로 실시되거나 또는 구체화된 기기(또는 프로세서) 실행 가능한 코드 및/또는 관련된 데이터의 형태로 "생성물" 또는 "제조 물품"으로서 여겨질 수 있다. 기기 실행 가능한 코드는 전자 저장 유닛, 예컨대 메모리(예, 판독 전용 메모리, 랜덤 액세스 메모리, 플래쉬 메모리) 또는 하드 디스크 상에 저장될 수 있다. "저장" 타입 매체는 비일시적 저장을 언제라도 소프트웨어 프로그래밍에 제공할 수 있는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형의 메모리 또는, 관련된 유닛 또는 그의 모듈, 예컨대 각종 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등에서 임의의 또는 전부를 포함할 수 있다. 소프트에어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 각종 다른 전기통신 네트워크를 통해 통신할 수 있다. 그러한 통신은 예를 들면 하나의 컴퓨터 또는 프로세서로부터 또 다른 것으로, 예를 들면 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터로부터 애플리케이션 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어를 로딩할 수 있다. 그래서, 소프트웨어 요소를 지닐 수 있는 매체의 또 다른 유형은 광학적, 전기적 및 전자기 파, 예컨대 로컬 디바이스 사이의 물리적 인터페이스에 사용되는 것을 유선 및 광학 유선 네트워크를 통해 및 각종 에어 링크 상에서 포함한다. 상기 파, 예컨대 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등을 지니는 물리적 요인은 또한 소프트웨어를 지니는 매체로서 간주될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비일시적 유형의 "저장" 매체에 제한되지 않는다면 컴퓨터 또는 기기 "판독 가능한 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는 것에 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
그래서, 기기 판독 가능한 매체, 예컨대 컴퓨터 실행 가능한 코드는 유형의 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 전송 매체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 형태를 취할 수 있다. 비휘발성 저장 매체는 예를 들면 광학 또는 자기 디스크, 예컨대 임의의 컴퓨터(들)에서의 임의의 저장 디바이스 등, 예컨대 도면에 도시된 데이터베이스 등을 실행하는데 사용될 수 있는 것을 포함한다. 휘발성 저장 매체는 상기 컴퓨터 플랫폼의 동적 메모리, 예컨대 주 메모리를 포함한다. 유형의 전송 매체는 동축 케이블; 컴퓨터 시스템 내에서 부스를 포함하는 와이어를 포함한 구리 와이어 및 광섬유를 포함한다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호 또는 음향 또는 광 파, 예컨대 무선 주파수(RF) 및 적외선(IR) 데이터 통신 중에 생성되는 것의 형태를 취할 수 있다. 그러므로, 컴퓨터 판독 가능한 매체의 통상의 형태는 예를 들면 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 페이퍼 테이프, 천공의 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 반송파 전송 데이터 또는 명령, 케이블 또는 반송파를 수송하는 링크 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 다수의 상기 형태의 컴퓨터 판독 가능한 매체는 실행을 위해 프로세서에 하나 이상의 명령의 하나 이상의 시퀀스를 운송하는 것에 관련될 수 있다.
컴퓨터 시스템(701)은 예를 들면 상피 조직의 깊이 프로파일을 제공하기 위해 유저 인터페이스(UI)(740)를 포함하는 전자 디스플레이(735)를 포함하거나 또는 이와 통신할 수 있다. UI의 예는 그래픽 유저 인터페이스(GUI) 및 웹 기반 유저 인터페이스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용의 방법 및 시스템은 하나 이상의 알고리즘에 의해 실시될 수 있다. 알고리즘은 중앙 프로세싱 유닛(705)에 의해 실행시, 소프트웨어에 의해 시행될 수 있다. 알고리즘은 예를 들면 본원에 제공된 시스템 또는 실행 방법을 조절할 수 있다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태를 본원에 제시 및 기재하지만, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 점은 당업계의 기술자에게 자명할 것이다. 다수의 수정예, 변경예 및 치환예는 본원에 기재된 본 발명으로부터 벗어남이 없이 당업계의 기술자에게 발생될 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 각종 대안예는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하며, 그러한 청구범위 내의 방법 및 구조 및 그의 균등예도 그에 의해 포함시키고자 한다.
실시예 1: 시약 구획화의 예시
시약 구획은 표준 현미경 슬라이드 치수를 사용하여 제조된 마이크로유체 디바이스를 사용하여 입증된다. 마이크로유체 디바이스의 총 치수는 1 인치 폭, 3 인치 길이 및 0.6 인치 두께를 갖는다. 디바이스는 4종의 상이한 마이크로챔버 어레이 설계 및 마이크로챔버의 총 8개의 상이한 어레이를 함유한다. 도 8A는 8개의 유닛 디바이스 및, 4개의 어레이 설계 중 하나의 확대 투시도를 도시한다. 마이크로유체 디바이스는 시클로올레핀 중합체(COP)인 제너 790R(제온 케미칼즈, 일본 소재)로부터 성형되며, 100 ㎛ COP 박막인 제오녹스 ZF14(제온 케미칼즈, 일본 소재)를 사용한 열적 접합에 의해 밀봉된다. 제시된 확대 마이크로유체 세그먼트는 사이폰 어퍼쳐에 의해 마이크로챔버에 연결된 서펜틴 마이크로채널을 갖는다. 마이크로챔버는 그리드형 배치로 존재한다. 마이크로챔버 및 마이크로채널은 40 ㎛ 깊이를 가지며, 사이폰 어퍼쳐는 10 ㎛ 깊이를 갖는다. 각각의 단리된 마이크로유체 세그먼트는 주입구 및 유출구 채널을 갖는다. 주입구 및 유출구 채널은 필름이 마이크로유체 디바이스의 기부에 열적 접합되기 전 기계적 천공된다. 주입구 및 유출구 채널은 1.6 ㎜의 직경을 갖는다.
도 8B는 시약 로딩, 마이크로챔버 백필링 및 구획화의 형광 화상을 도시한다. 마이크로유체 디바이스를 로딩하기 전, 2 마이크로리터(㎕)의 4 킬로달톤(kDa) 플루오레세인 콘쥬게이트된 덱스트란(시그마-알드리치(igma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 주입구에 피펫팅한다. 그 후, 마이크로유체 디바이스를 공압식 제어기와 접촉시킨다. 공압식 제어기는 4 psi의 압력을 주입구에 3 분 동안 적용하여 마이크로유체 디바이스의 마이크로채널을 로딩한다. 주입구 및 유출구 둘다를 10 psi로 20 분 동안 가압시켜 마이크로챔버를 충전시킨다. 그 후, 공기를 4 psi에서 마이크로유체 디바이스의 주입구로부터 유동시켜 시약을 마이크로채널로부터 제거하여 시약을 구획화시킨다.
도 20A는 일련의 디바이스의 차동 바이러스 로딩에 해당하는 화상을 도시한다. 패널은 구획당 5, 0.5, 0.05 및 0.005개의 핵산 복제를 포함하는 구획의 화상을 포함한다. 그러한 화상은 열순환 후 촬영하였으며, FAM 및 ROX 형광체에 대한 형광 화상기를 사용하여 영상화하였다. 도 20B는 이미지(Image) J 앤드 R 소프트웨어를 사용하여 도 20A에서 화상의 해당 푸아송 분석을 도시한다. 도 21은 일련의 디바이스의 차동 로딩에 해당하는 화상을 도시한다. 패널은 구획당 10, 1.0, 0.1 및 0.01개의 핵산 복제를 포함하는 구획의 화상을 포함한다. 가장 오른쪽의 패널은 각각의 디바이스에 해당하는 해당 밀도 및 구획 점유를 도시한다.
실시예 2: dPCR에 대한 단일 기기 작업흐름
마이크로유체 디바이스에서 핵산의 증폭 및 정량화 방법은 단일 기기 내에서 수행될 수 있다. 기기는 시약 구획화, 열순환, 화상 획득 및 데이터 분석이 가능하다. 도 9는 단일 기기 작업 흐름이 가능한 프로토타입 기기를 도시한다. 기기는 4개 이하의 디바이스를 한번에 수용하며, 동시에 화상 획득 및 열순환이 가능하도록 설계된다. 기기는 시약 구획화를 위한 공압식 유닛, 온도 제어 및 열순환을 위한 열 유닛, 영상화를 위한 광학 유닛 및 스캐닝 유닛을 함유한다. 광학 유닛은 2개의 형광 영상화 능력을 가지며, 각각 FAM 및 ROX 형광체의 방출 파장에 해당하는 대략 520 ㎚ 및 600 ㎚의 형광 방출을 검출할 수 있다. 광학 유닛은 25 ㎜×25 ㎜ 시야 및 0.14의 수치 어퍼쳐(NA)를 갖는다.
단일 기기 작업흐름은 리포터로서 TaqMan 프로브를 사용하는 확립된 qPCR 검정을 사용하여 테스트될 수 있다. 간략하게, 핵산 샘플을 PCR 시약과 혼합한다. PCR 시약은 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, TaqMan 프로브 및 ROX 지시약을 포함한다. 정방향 프라이머의 서열은 5'-GCC TCA ATA AAG CTT GCC TTG A-3'이다. 역방향 프라이머의 서열은 5'-GGG GCG CAC TGC TAG AGA-3'이다. TaqMan 프로브의 서열은 5'-[FAM]-CCA GAG TCA CAC AAC AGA CGG GCA CA-[BHQ1]-3'이다. 핵산 샘플 및 PCR 시약을 로딩하고, 전술한 프로토콜에 이후에 마이크로유체 디바이스를 구획화한다. PCR 증폭은 마이크로챔버의 온도를 95℃로 증가시키고, 상기 온도에서 10 분 동안 유지한 후, 95℃로부터 59℃로 1 초당 2.4℃의 비율로 마이크로챔버의 온도를 상승시키는 40회 주기로 수행하며, 온도가 95℃로 되돌아가기 전 59℃에서 1 분 유지한다. 도 10A-10D는 PCR 증폭후 구획당 대략 1개의 핵산 템플레이트 복제 및 구획당 0개의 핵산 템플레이트 복제(템플레이트 제어 없음 또는 NTC)를 포함하는 구획을 함유하는 샘플의 형광 화상 및, PCR 증폭후 구획당 대략 1개의 핵산 복제 및 NTC 구획을 함유하는 샘플의 형광 강도 플롯을 도시한다. 도 10A는 핵산 템플레이트를 함유하지 않는 구획화된 샘플의 형광 화상을 도시하며, 각각의 회색 도트는 PCR 시약을 함유하는 단일 마이크로챔버를 나타낸다. 각각의 마이크로챔버 내의 ROX 지시약을 대략 575 ㎚ 광으로 여기시키고, 대략 600 ㎚에서 최대 방출을 갖는 방출 스펙트럼을 영상화하여 화상을 촬영한다. 도 10B는 PCR 증폭후 구획당 대략 1개의 핵산 템플레이트 복제를 포함하는 구획화된 샘플을 도시한다. PCR 증폭 후, 영상화는 ROX 지시약을 함유하는 마이크로챔버 및 FAM 프로브로부터의 방출 및 ROX 지시약 둘다를 함유하는 마이크로챔버를 도시한다. FAM 프로브는 대략 495 ㎚의 여기 파장 및 대략 520 ㎚의 여기 파장 최대치를 갖는다. 개개의 마이크로챔버는 ROX 지시약, FAM 프로브 및 BHQ-1 켄칭제를 함유한다. 도 10A에서와 같이, 각각의 회색 도트는 핵산 템플레이트를 갖지 않는 구획화된 샘플을 함유하는 마이크로챔버를 나타낸다. 백색 도트는 성공적으로 증폭시킨 핵산 샘플을 함유하는 마이크로챔버를 나타낸다. 성공적인 PCR 증폭시, FAM 형광체 및 BHQ-1 켄칭제를 TaqMan 프로브로부터 분할시켜 검출 가능한 형광 신호를 생성할 수 있다. 도 10C 및 10D는 각각 구획화 및 증폭된 마이크로유체 디바이스에 대한 각각의 마이크로챔버에 대한 ROX 형광 강도의 함수로서 FAM 형광 강도의 2차원 산란을 도시한다. 도 10C는 구획당 0개의 핵산 템플레이트를 함유하여 ROX 형광 강도 범위에 걸쳐 대부분 일정한 FAM 형광 강도를 생성하는 샘플을 도시한다. 도 10D는 구획당 대략 1개의 핵산 템플레이트 복제를 함유하여 구획내의 증폭 신호의 존재로 인한 ROX 형광 강도의 함수로서 변경되는 FAM 형광 강도를 생성하는 샘플을 도시한다.
실시예 3: qdPCR
공지된 PCR 시약 키트는 2종의 시약 혼합물을 생성하는데 사용하였으며, 제1의 시약은 제2의 시약의 표적량의 10배이다. 시약을 디바이스의 2개의 이웃하는 유닛에 로딩하고, 오프-세프(off-shelf) 제어기 및 주문형(custom) 인터페이스 지그를 사용하여 공압식으로 생성하였다. 그 후, 디바이스(1708)를 꺼내서 도 17A-17B의 시스템 내에 배치한다. 디바이스(1708)를 표준 플랫 블록 열순환기(1703) 상에서 우수한 열 접촉을 위해 유리 부재에 의해 유지하였다. 디바이스(1708)를 표준 96-61℃x40 PCR 프로토콜을 사용하여 40회 열순환시켰다. 각각의 주기(주기 11-40)의 저온 단계(61℃) 중에, 카메라(1704)를 사용하여 화상을 자동 촬영하였다. 화상을 도 18에 도시하며, 여기서 첫번째 행의 화상은 20 주기에 촬영하였으며, 두번째 행의 화상은 30 주기에서 촬영하였으며, 세번째 행은 40 주기에서 촬영하였다. 화상의 상부 열은 구획당 10개의 복제의 비율에서의 로딩에 해당하며, 바닥의 열은 구획당 1개의 복제에 해당한다. 주문형 이미지J 플러그인을 사용하여 30 주기 화상 각각에서 10배 화상 설정의 53개의 선택된 지점에 대한 평균 강도 데이터를 추출하였다. 그러한 데이터를 도 19에 플롯하며, 배경 변동에 대하여 정규화한다.
실시예 4: HRM 분석
공지의 시약 키트를 사용하여 2종의 시약 혼합물을 생성하였으며, 제1의 시약은 제2의 시약의 표적량의 10배이다. 시약을 디바이스의 2개의 이웃하는 유닛에 로딩하고, 오프-세프 제어기 및 주문형 인터페이스 지그를 사용하여 공압식으로 생성하였다. 그 후, 디바이스(1708)를 꺼내고, 도 17A-17B의 시스템 내에 배치한다. 디바이스(1708)를 표준 플랫 블록 열순환기(1703) 상에서 우수한 열 접촉을 위해 유리 부재에 의해 유지하였다. 디바이스(1708)를 표준 96-61℃x40 PCR 프로토콜을 사용하여 40회 열순환시켜 dPCR 단계를 완료하였다. 열 유닛(1703)이 약 0.1℃/s의 속도로 온도를 약 60℃로부터 약 90℃로 증가시킴에 따라 카메라(1704)는 5 초마다 연속적으로 디바이스를 영상화하였다. 화상을 도 25에 도시하며, 첫번째 행의 화상은 약 70℃에서 촬영하였으며, 두번째 행의 화상은 약 80℃에서 촬영하였으며, 세번째 행의 화상은 약 90℃에서 촬영하였다. 화상의 상부 열은 구획당 10개의 복제 비율의 로딩에 해당하며, 하부 열은 구획당 1개의 복제에 해당한다. 주문형 이미지J 플러그인을 사용하여 10배 화상 설정의 각각의 화상에서 54개의 선택된 지점에 대한 평균 강도 데이터를 추출하였다. 그러한 데이터를 도 26에 플롯하였다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 본원에 제시 및 기재하기는 하였으나, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것은 당업계의 기술자에게 자명할 것이다. 본 발명은 본 명세서에 제공된 구체적인 예에 의해 한정되는 것을 의도하지 않는다. 본 발명이 전술한 명세서에 관하여 기재하기는 하였으나, 본원의 실시양태의 기재 및 예시는 제한의 의미로 간주되는 것을 의미하지 않는다. 다수의 수정예, 변경예 및 치환예는 본 발명으로부터 벗어남이 없이 당업계의 기술자에게 발생될 것이다. 더욱이, 본 발명의 모든 구체예는 각종 조건 및 변수에 의존하는 본원에 명시된 구체적인 서술, 배치 또는 상대적 비율에 한정되지 않는 것으로 이해하여야 한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안예는 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 그러므로, 본 발명은 또한 임의의 상기 대안예, 변형예, 수정예 또는 균등예를 포함하는 것으로 고려한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하며, 그러한 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그의 균등예도 그에 따라 포함시키고자 한다.
Claims (19)
- 복수의 핵산 분자의 분석 방법으로서,
(a) 상기 복수의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 복수의 구획을 포함하는 장치에 제공하는 단계;
(b) 유체 흐름 유닛을 사용하여, 상기 샘플을 상기 복수의 구획으로 디지털화하는 단계;
(c) 상기 샘플을 포함하는 상기 복수의 구획을 상기 복수의 핵산 분자에 대한 핵산 증폭 반응을 수행하기에 충분한 조건에 적용하여 상기 복수의 핵산 분자를 증폭함으로써 증폭 생성물을 생성하는 단계;
(d) 상기 조건에 노출된 상기 복수의 구획에 함유된 상기 샘플로부터 복수의 시점에 걸쳐 신호를 수집하는 단계; 및
(e) 상기 신호를 처리하여 상기 복수의 핵산 분자를 정량화하는 단계
를 포함하는 분석 방법. - 제1항에 있어서, 상기 복수의 구획 중 한 구획이 약 500 마이크로미터(㎛) 이하의 직경을 갖는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 구획이 약 500 ㎛ 이하의 깊이를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 복수의 구획이 약 1,000개 내지 약 20,000개의 구획을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 복수의 구획에 적용하는 것은 상기 핵산 증폭 반응을 수행하기에 충분한 상기 조건으로 상기 복수의 구획에 함유된 상기 샘플을 열 순환시키는 것을 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 신호를 수집하는 단계는 열 사이클당 1회 초과로 상기 복수의 구획의 각 구획으로부터 신호를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 열 순환이 플랫 블록 열 순환기(flat block thermal cycler)를 사용하여 수행되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플을 포함하는 상기 복수의 구획을 상기 조건에 적용하는 단계 및 상기 신호를 수집하는 단계가 동시에 수행되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플을 포함하는 상기 복수의 구획을 상기 조건에 적용하는 단계 및 상기 신호를 수집하는 단계가 순차적으로 수행되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호의 처리는 상기 복수의 시점에 걸쳐 상기 복수의 핵산 분자의 제1 핵산 분자의 증폭률을 결정하는 것을 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 증폭률을 사용하여 상기 복수의 구획의 제1 구획 내의 상기 제1 핵산 분자의 수를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 구획 내의 상기 제1 핵산 분자의 상기 수를 결정하는 단계는 제1 구획 내의 상기 제1 핵산 분자의 증폭률을 상기 복수의 구획의 다른 구획 내의 상기 제1 핵산 분자의 또 다른 증폭률과 비교하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호는 광학 신호인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호를 수집하는 단계는 상기 신호를 수집하기 위해 상기 복수의 구획 각각을 영상화하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호를 수집하는 단계는 검출기를 사용하여 2개 이상의 파장에서 형광 방출을 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호를 처리하는 것은 상기 복수의 시점에 걸쳐 상기 복수의 구획 중 한 구획에 대한 광학 강도를 결정하는 것을 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 신호를 처리하는 것은 상기 광학 강도를 사용하여 상기 복수의 핵산 분자 중 한 핵산 분자의 증폭률을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신호를 수집하는 단계는 복수의 구획 각각으로부터 상기 신호를 동시에 수집하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,
복수의 구획은 배리어로 덮여 있고,
상기 샘플을 디지털화하는 단계는 상기 유체 흐름 유닛을 사용하여 상기 배리어를 가로질러 압력차를 적용하여 상기 복수의 구획 내의 가스가 상기 배리어를 통해 상기 외부 환경으로 흐르게 하는 것을 포함하는 방법.
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