CN115485068A - 用于微流体装置制造的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于形成微流体装置的方法。形成微流体装置的方法可包含提供微流体结构和膜，用溶剂处理所述微流体结构的表面、所述膜的表面或两者，随后在第一加热条件下将所述微流体结构与所述膜压制在一起以形成包含所述溶剂的所述微流体装置，以及在第二加热条件下对所述微流体装置施加负压，所述负压施加的时间段大于30分钟或压力小于20千帕(kPa)，以去除至少一部分溶剂。在一些方面，本公开提供了与本文的方法一致的装置。

Description

用于微流体装置制造的方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年1月24日提交的美国临时专利申请第62/965,690号的权益，该申请整体以引用的方式并入本文中。

政府利益声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的小型企业创新研究基金号1R43OD023028-01的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有某些权利。

背景技术

微流体装置是包含小规模处理流体的结构的装置。通常，微流体装置以亚毫米级操作并处理微升、纳升或更少量的流体。在微流体装置中，主要的污染机制是在微结构内残存的空气或气泡。当使用热塑性材料产生微流体结构时，这可能特别成问题，因为热塑性材料的透气性非常低。

为了避免残存空气的污染，微流体结构使用具有热塑性材料的简单的直通道或分支通道设计，或者使用高透气性材料如弹性体来制造该装置。然而，简单的设计限制了微流体装置的可能功能，并且弹性体材料的制造既困难又昂贵，特别是在大规模时。

微流体结构的一个应用是在数字聚合酶链反应(dPCR)中。在提供许多分区的阵列的微流体结构的每个分区中，dPCR将核酸样品稀释成一个或更少的核酸模板，并在阵列上进行PCR反应。通过对其中模板被成功PCR扩增的分区进行计数并将泊松统计应用于结果，靶核酸被定量。与通过将未知样品的PCR扩增速率与一组已知qPCR标准的速率进行比较来定量模板的流行定量实时PCR(qPCR)不同，dPCR已被证明具有更高的灵敏度、更好的精度和更好的再现性。

对于基因组研究人员和临床医生而言，dPCR在稀有突变检测、定量拷贝数变异和下一代测序文库定量中特别有效。具有细胞游离DNA和病毒载量定量的液体活检在临床环境中的潜在用途进一步提高了dPCR技术的价值。现有的dPCR解决方案已经使用了弹性体阀阵列、硅通孔方法和液滴在油中的微流体封装。尽管可用的dPCR平台的数目不断增加，但是当与依赖于对PCR扩增循环数目进行计数的旧qPCR技术相比时，dPCR一直处于劣势。吞吐量、易用性、性能和成本的组合是在dPCR市场上获得采用的主要障碍。

发明内容

本文提供了可用于扩增和定量核酸的方法和装置。本公开提供可通过使用dPCR实现样品制备、样品扩增和样品分析的方法、系统和装置。与其它系统和方法相比，这可以使核酸以降低的成本和复杂性被扩增和定量。

在一方面，本公开提供了一种用于形成微流体装置的方法，其包含：提供微流体结构和膜；(b)用溶剂处理所述微流体结构的表面、所述膜的表面或两者；(c)在(b)之后，在第一加热条件下将所述微流体结构与所述膜压制在一起以形成包含所述溶剂的所述微流体装置；以及(d)在第二加热条件下对所述微流体装置施加负压，所述负压施加的时间段大于30分钟的或压力小于20千帕(kPa)，以从(b)中去除至少一部分溶剂。

在一些实施例中，所述微流体结构包含微通道、多个微室、多个虹吸孔或其任意组合。在一些实施例中，所述处理包含施加一种或多种溶剂。在一些实施例中，所述一种或多种溶剂包括选自由异丙醇、丙酮、乙醇、己烷、环己烷、甲苯和苯组成的组中的溶剂。在一些实施例中，所述压制包含施加至少约0.5千牛顿(kN)的力。在一些实施例中，所述第一加热条件包含加热到至少约60℃的温度。在一些实施例中，所述施加所述负压包含施加小于约7kPa的压力。在一些实施例中，所述第二加热条件包含将所述微流体装置加热到至少约70℃的温度。在一些实施例中，所述将所述微流体装置加热到至少约70℃的温度从所述微流体装置去除至少约75％的所述溶剂。在一些实施例中，所述施加所述负压包含施加所述负压持续至少约2小时。在一些实施例中，所述施加所述负压从所述微流体装置中去除至少约50％的所述溶剂。在一些实施例中，在所述第二加热条件下所述施加所述负压减少了所述微流体结构与所述膜之间的分隔。在一些实施例中，所述微流体结构包含特征大小至多约500微米的通道或室。在一些实施例中，所述去除所述溶剂使微流体装置生成过程的产率增加至少约25％。在一些实施例中，所述微流体装置具有至少约0.5的可用特征分数。在一些实施例中，所述方法进一步包含对所述微流体装置施加增大的压力，其中所述增大的压力足以排出至少一部分所述溶剂。

根据以下具体实施方式，本领域的技术人员将显而易知本公开的额外方面和优势，在具体实施方式中仅示出和描述本公开的说明性实施例。如将认识到，本公开能够具有其它不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和说明书本质上被视为是说明性的而非限制性的。

通过引用并入

本说明书中所提及的所有公开、专利和专利申请都在本文中通过引用并入，程度如同每一单独的公开、专利或专利申请被专门并且单独地指示以引用的方式并入一般。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述其中利用本发明原理的说明性实施例的详细描述和附图(在本文中也称为“图”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中：

图1A和1B示出了微流体结构的实例；图1A从俯视图示出了该结构，而图1B示出了该结构的横截面；

图2A和2B示意性地示出了微流体装置内的微室、虹吸孔和微通道的实例布置；图2A示出了其中使用平行的子通道和一个或多个交叉通道来形成微室网格的实施例；图2B示出了其中蛇形图案的单个微通道形成微室的六边形网格的实施例；

图3A至3D示出了使用实例微流体装置的方法；图3A示出了在低压下提供试剂；图3B示出了在微流体装置上施加压差以允许分配和除气；图3C示出了在低压下提供流体以清除微通道；图3D示出了在完成方法之后系统的状态；

图4示意性地示出了制造微流体装置的方法；

图5示意性地示出了与微流体装置一起采用的实例数字PCR方法；

图6示意性地示出了用于在单个机器中执行核酸扩增和定量方法的机器；

图7示意性地示出了被编程或以其它方式配置成实施本文提供的方法的实例计算机控制系统；

图8A和8B示出了微流体装置和样品分配；图8A示出了通过微模塑热塑性塑料形成的微流体装置；图8B示出了样品分配过程的荧光图像；

图9示出了用于处理核酸样品的实例系统；

图10A至10D示出了平均含有约一个核酸模板拷贝的分区和含有零核酸模板拷贝的分区(无模板对照或NTC)的核酸扩增的双色(一种颜色表示样品信号，而另一种颜色表示标准化信号)荧光检测；图10A示出了扩增后每分区零拷贝(NTC)；图10B示出了每个分区含有大约一个拷贝的分区的核酸扩增；图10C示出两种荧光颜色的NTC荧光强度图；以及图10D示出了扩增样品的两种荧光颜色的荧光强度图。

图11是用于形成微流体装置的实例过程的流程图。

图12是形成微流体装置的实例示意图。

图13是通过本文所述的方法制造的微流体装置的实例。

图14是在液体加压和加热之后没有去除溶剂的情况下制造的微流体装置的实例。

图15是在空气加压和加热之后没有去除溶剂的情况下制造的微流体的实例。

图16是在液体加压和加热之后去除溶剂的情况下制造的微流体装置的实例。

图17是在空气加压和加热之后去除溶剂的情况下制造的微流体装置的实例。

图18A至18B是在液体加压和加热之前(图18A)和之后(图18B)没有去除溶剂的情况下制造的微流体装置的实例放大图像。

图19A至19B是在液体加压和加热之前(图19A)和之后(图19B)真空处理的微流体装置的实例放大图像。

图20A至20B是在液体加压和加热之前(图20A)和之后(图20B)热处理的微流体装置的实例放大图像。

图21A至21B是在液体加压和加热之前(图21A)和之后(图21B)的真空和热处理的微流体装置的实例特写。

具体实施方式

虽然本文中已经示出并描述了本发明的各种实施例，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，这些实施例仅作为实例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到多种变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施例的各种替代方案。

如本文所用的，术语“扩增(amplification)”和“扩增(amplify)”可互换使用，并且通常是指生成核酸的一个或多个拷贝或者“扩增产物”。例如，这样的扩增可使用聚合酶链反应(PCR)或等温扩增。

如本文所用的，术语“核酸”通常是指任何长度的核苷酸(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、500或1000个核苷酸)的聚合形式，该核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。核酸可以包括选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的一个或多个亚基。核苷酸可包括A、C、G、T或U或其变体。核苷酸可包括可掺入到生长的核酸链中的任何亚基。这样的亚基可以是A、C、G、T或U，或者对一个或多个互补A、C、G、T或U具有特异性的，或与嘌呤(例如，A或G，或其变体)或嘧啶(例如，C、T或U，或其变体)互补的任何其它亚基。在一些实例中，核酸可以是单链或双链的，在一些情况下，核酸分子是环状的。核酸的非限制性实例包括DNA和RNA。核酸可以包括基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的基因座(locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。核酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。

如本文所用的，术语“聚合酶链反应试剂”或“PCR试剂”可互换使用，并且通常是指包含完成核酸扩增反应(例如DNA扩增)所必需的试剂的组合物，此类试剂的非限制性实例包括对靶核酸具有特异性的引物组或引发位点(例如切口)、聚合酶、合适的缓冲液、辅因子(例如二价和一价阳离子)、dNTP和其它酶。PCR试剂还可以包括探针、指示剂和包含探针和指示剂的分子。

如本文所用的，术语“探针”通常是指包含可检测部分的分子，该分子的存在或不存在可用于检测扩增产物的存在或不存在。可检测部分的非限制性实例可包括放射性标记、稳定同位素标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记、比色标记或其任意组合。

如本文所用的，术语“延伸”通常是指以模板指导的方式将核苷酸掺入核酸中。延伸可以借助于酶发生。例如，延伸可以借助于聚合酶发生。可发生延伸的条件包括通常是指实现延伸的温度的“延伸温度”和通常是指为发生延伸所分配的时间量的“延伸持续时间”。

如本文所用的，术语“指示剂分子”通常是指包含可检测部分的分子，该分子的存在或不存在可用于指示样品分配。可检测部分的非限制性实例可包括放射性标记、稳定同位素标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记、比色标记或其任意组合。

如本文所用的，术语“样品”通常是指含有或疑似含有核酸分子的任何样品。例如，样品可以是含有一种或多种核酸分子的生物样品。生物样品可以从血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液获得(例如，提取或分离)或包括以上各者。生物样品可以是流体或组织样品(例如，皮肤样品)。在一些实例中，从无细胞体液如全血获得样品。在这种情况下，样品可以包括无细胞DNA和/或无细胞RNA。在一些实例中，样品可包括循环肿瘤细胞。在一些实例中，样品是环境样品(例如，土壤、废物、环境空气等)、工业样品(例如，来自任何工业过程的样品)和食物样品(例如，乳制品、蔬菜制品和肉制品)。

如本文所用的，术语“流体”通常是指液体或气体。流体不能保持限定的形状，并且将在可观察的时间范围内流动以填充其所放入的容器。因此，流体可以具有允许流动的任何合适的粘度。如果存在两种或更多种流体，则本领域普通技术人员可以在基本上任何流体(液体、气体等)中独立地选择每种流体。

如本文所用的，术语“分配”通常是指划分成或分配成部分或份额。例如，分配的样品是与其它样品分离的样品。能够使样品分配的结构的实例包括孔和微室。

如本文所用的，术语“微流体”通常是指包括至少一个微通道、多个虹吸孔和微室阵列的芯片、区域、装置、物品或系统。微通道的横截面尺寸可以小于或等于约10毫米(mm)、小于或等于约5mm、小于或等于约4mm、小于或等于约3mm、小于或等于约2mm、小于或等于约1.5mm、小于或等于约1mm、小于或等于约750微米(μm)、小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm或更小。

如本文所用的，术语“深度”通常是指从微通道、虹吸孔或微室的底部到封盖微通道、多个虹吸孔和微室阵列的薄膜所测量的距离。

如本文所用的，术语“横断面”或“横截面”可互换使用，并且通常是指微通道或虹吸孔的尺寸或面积，其基本上垂直于特征的长尺寸。

本公开描述了一种微流体装置，该微流体装置由热塑性塑料形成并包含有薄膜，以允许加压除气，同时在释放压力时充当气体屏障。使用热塑性塑料来形成微流体结构可允许使用廉价且高度可扩展的注塑过程，而薄膜可提供经由加压来除气的能力，从而避免可能存在于不包含此类薄膜的一些微流体结构中的污染问题。

该结构的一种用途是微流体设计，其包含由热塑性塑料形成的通过微通道连接的封闭端微室阵列。该设计可用于dPCR应用，以将试剂分配到微室阵列中，从而用于定量dPCR中的核酸。

用于分析核酸样品的微流体装置

在一方面，本公开提供了一种用于分析核酸样品的微流体装置。该装置可以包括连接到入口和出口的微通道。微流体装置还可以包括多个微室和多个虹吸孔。多个微室可以通过多个虹吸孔连接到微通道。微流体装置可包括热塑性薄膜，其封盖并密封(例如，气密密封)微通道、微室和虹吸孔。当在热塑性薄膜上施加压差时，热塑性薄膜可以是至少部分透气的。

图1A和1B示出了根据本公开的某些实施例的微流体结构的实例。图1A从顶视图示出了实例微流体装置。微流体装置包含具有入口120和出口130的微通道110。微通道连接到多个虹吸孔101B至109B。多个虹吸孔将微通道连接到多个微室101A至109A。图1B示出了单个微室沿标记为A-A'的虚线的横截面图。单个微室101A通过虹吸孔101B连接到微通道110。微流体装置主体140可以由刚性塑料材料形成。微流体装置的微结构可以被薄膜150封盖和密封。当在薄膜上施加较小压差时，薄膜可以是不透气的，而当在薄膜上施加较大压差时，薄膜可以是透气的。这可以允许在对微流体装置的内部结构施加压力时通过薄膜来除气。在替代实施例中，当在微流体装置外部施加真空时，可能发生除气。

薄膜的透气性可由高压引起。在一些实施例中，压力诱导的透气性薄膜可以覆盖微室阵列，并且微通道和虹吸孔可以被非透气性膜覆盖。在一些实施例中，压力诱导的透气性薄膜可以覆盖微室阵列和虹吸孔，并且微通道可以被非透气性膜覆盖。可替代地，压力诱导的透气性薄膜可覆盖微室阵列、虹吸孔和微通道。在一些实施例中，薄膜的厚度可以小于或等于约500微米(μm)、小于或等于约250μm、小于或等于约200μm、小于或等于约150μm、小于或等于约100μm、小于或等于约75μm、小于或等于约50μm、小于或等于约25μm或更小。在一些实施例中，薄膜的厚度可为约0.1μm至约200μm或约0.5μm至约150μm。在一些实例中，薄膜的厚度可为约50μm至约200μm。在一些实例中，薄膜的厚度可为约100μm至约200μm。在一些实例中，薄膜的厚度为约100μm至约150μm。在实例中，薄膜的厚度为约100μm。薄膜的厚度可以通过薄膜的可制造性、薄膜的透气性、待除气的每个分区的体积、可用压力和/或完成虹吸过程的时间来选择。

在一些实施例中，微流体装置可包含单个微室阵列。在一些实施例中，微流体装置可以包含多个微室阵列，每个微室阵列与其它微室分离。微室阵列可以成一行、以网格配置、以交替图案或以任何其它配置布置。在一些实施例中，微流体装置可具有至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个或更多个微室阵列。在一些实施例中，微室阵列是相同的。在一些实施例中，微流体装置可包含多个不同的微室阵列。微室阵列可以全部具有相同的外部尺寸(例如，包含微室阵列所有特征的微室阵列的长度和宽度)，或者微室阵列可以具有不同的外部尺寸。

在一些实施例中，微室阵列可具有至多约100mm、约75mm、约50mm、约40mm、约30mm、约20mm、约10mm、约8mm、约6mm、约4mm、约2mm、约1mm或更小的宽度。微室阵列可具有至多约50mm、约40mm、约30mm、约20mm、约10mm、约8mm、约6mm、约4mm、约2mm、1mm或更小的长度。宽度可以为约1mm至100mm或10mm至50mm。长度可为约1mm至50mm或5mm至20mm。

在一些实施例中，微室阵列可具有约100mm的宽度和约40mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约80mm的宽度和约30mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约60mm的宽度和约25mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约40mm的宽度和约15mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约30mm的宽度和约10mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约20mm的宽度和约8mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约10mm的宽度和约4mm的长度。外部尺寸可以由所使用的微室的总数、每个微室的尺寸和每个微室之间的最小距离来确定，以便于可制造性。

在一些实施例中，微通道基本上平行于微流体装置的长尺寸。在一些实施例中，微通道可以基本上垂直于微流体装置的长尺寸。在一些实施例中，微通道可以既不基本上平行也不基本上垂直于微流体装置的长尺寸。微通道和微流体装置的长尺寸之间的角度可以是至少约5°、至少约10°、至少约15°、至少约20°、至少约30°、至少约40°、至少约50°、至少约60°、至少约70°、至少约90°、至少约100°、至少约110°、至少约120°、至少约130°、至少约140°、至少约150°、至少约160°或至少约170°。在一些实施例中，微通道可以是单个长通道。在一些实施例中，微通道可以具有弯曲、曲线或角度。所述微通道可具有小于或等于100mm、小于或等于约75mm、小于或等于约50mm、小于或等于约40mm、小于或等于约30mm、小于或等于约20mm、小于或等于约10mm、小于或等于约8mm、小于或等于约6mm、小于或等于约4mm的长尺寸、小于或等于约2mm或更小。微通道的长度可以由微流体装置的外部长度或宽度限定。微通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm或更小的深度。微通道的横截面尺寸(例如，宽度)可以小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约75μm、小于或等于约50μm、小于或等于约40μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm或更小。

在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约80μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约60μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约40μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约20μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约10μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约80μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约60μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约40μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约20μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约10μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约80μm宽×约80μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约60μm宽×约60μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可以是约10μm宽×约10μm深。微通道的横截面形状可以是任何合适的横截面形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。微通道的横截面积沿着微通道的长度可以是恒定的。可替代地或附加地，微通道的横截面积可以沿着微通道的长度变化。微通道的横截面积可以在约50％至150％之间、在约60％至125％之间、在约70％至120％之间、在约80％至115％之间、在约90％至110％之间、在约95％至100％之间或在约98％至102％之间变化。微通道的横截面积可以小于或等于约10,000平方微米(μm²)，小于或等于约7,500μm²、小于或等于约5,000μm²、小于或等于约2,500μm²、小于或等于约1,000μm²、小于或等于约750μm²、小于或等于约500μm²、小于或等于约400μm²、小于或等于约300μm²、小于或等于约200μm²、小于或等于约100μm²或更小。

在一些实施例中，微通道可具有单个入口和单个出口。可替代地，微通道可具有多个入口、多个出口，或多个入口和多个出口。入口和出口可以具有相同的直径或者它们可以具有不同的直径。入口和出口可具有小于或等于约2.5毫米(mm)、小于或等于约2mm、小于或等于约1.5mm、小于或等于约1mm、小于约0.5mm或更小的直径。

在一些实施例中，微室阵列可具有至少约1,000个微室、至少约5,000个微室、至少约10,000个微室、至少约20,000个微室、至少约30,000个微室、至少约40,000个微室、至少约50,000个微室、至少约100,000个微室或更多。在一些实例中，微流体装置可具有约10,000至约30,000个微室。在一些实例中，微流体装置可具有约15,000至约25,000个微室。微室可以是圆柱形形状、半球形形状或圆柱形和半球形形状的组合。微室可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约15μm或更小的直径。微室的深度可以小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约15μm或更小。在一些实例中，微室可具有约30μm的直径和约100μm的深度。在一些实例中，微室可具有约35μm的直径和约80μm的深度。在一些实例中，微室可具有约40μm的直径和约70μm的深度。在一些实例中，微室可具有约50μm的直径和约60μm的深度。在一些实例中，微室可具有约60μm的直径和约40μm的深度。在一些实例中，微室可具有约80μm的直径和约35μm的深度。在一些实例中，微室可具有约100μm的直径和约30μm的深度。在一些实施例中，微室和微通道具有相同的深度。在替代实施例中，微室和微通道具有不同的深度。

在一些实施例中，虹吸孔的长度是恒定的。在一些实施例中，虹吸孔的长度是变化的。虹吸孔可具有小于或等于约150μm、小于或等于约100μm、小于或等于约50μm、小于或等于约25μm、小于或等于约10μm、小于或等于约5μm或更小的长尺寸。在一些实施例中，虹吸孔的深度可以小于或等于约50μm、小于或等于约25μm、小于或等于约10μm、小于或等于约5μm或更小。虹吸孔可具有小于或等于约50μm、小于或等于约40μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm、小于或等于约5μm或更小的横截面宽度。

在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约50μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约50μm宽×约40μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约50μm宽×约30μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约50μm宽×约20μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约50μm宽×约10μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约50μm宽×约5μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约40μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约30μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约20μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约10μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约5μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约30μm宽×约30μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约10μm宽×约10μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可以是约5μm宽×约5μm深。虹吸孔的横截面形状可以是任何合适的横截面形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。在一些实施例中，虹吸孔的横截面积沿着虹吸孔的长度可以是恒定的。可替代地或附加地，虹吸孔的横截面积可以沿着虹吸孔的长度变化。虹吸孔在与微通道的连接处的横截面积可以大于虹吸孔在与微室的连接处的横截面积。可替代地，虹吸孔在与微室连接处的横截面积可以大于虹吸孔在与微通道连接处的横截面积。虹吸孔的横截面积可以在约50％至150％之间、在约60％至125％之间、在约70％至120％之间、在约80％至115％之间、在约90％至110％之间、在约95％至100％之间或在约98％至102％之间变化。虹吸孔的横截面积可以小于或等于约2,500μm²、小于或等于约1,000μm²、小于或等于约750μm²、小于或等于约500μm²、小于或等于约250μm²、小于或等于约100μm²、小于或等于约75μm²、小于或等于约50μm²、小于或等于约25μm²或更小。虹吸孔在与微通道的连接处的横截面积可以小于或等于微通道的横截面积。虹吸孔在与微通道的连接处的横截面积可以小于或等于约98％、小于或等于约95％、小于或等于约90％、小于或等于约85％、小于或等于约80％、小于或等于约75％、小于或等于约70％、小于或等于约60％、小于或等于约50％、小于或等于约40％、小于或等于约30％、小于或等于约20％、小于或等于约10％、小于或等于约5％、小于或等于约1％或小于或等于约0.5％的微通道横截面积。

在一些实施例中，虹吸孔基本上垂直于微通道。在一些实施例中，虹吸孔基本上不垂直于微通道。在一些实施例中，虹吸孔与微通道之间的角度可以为至少约5°、至少约10°、至少约15°、至少约20°、至少约30°、至少约40°、至少约50°、至少约60°、至少约70°、至少约90°、至少约100°、至少约110°、至少约120°、至少约130°、至少约140°、至少约150°、至少约160°或至少约170°。

微室可以各种图案布置。图2A和2B示出了微室、虹吸孔和微通道布置的实例图案。在一些实施例中，采用多个微通道，而在一些实施例中，可以使用单个微通道。在一些实施例中，微通道可包含一组子通道。该组子信道可以通过一个或多个交叉通道连接。在这些实施例的一些中，子通道基本上彼此平行，使得微室阵列形成微室网格。图2A示出了其中使用平行子通道230和一个或多个交叉通道220形成微室网格的实施例。

在一些实施例中，微室被构造为形成微室的六边形网格，其中弯曲或成角度的子通道连接微室。微室的六边形网格也可以由单个微通道形成和连接，例如由在微流体装置上形成蛇形图案240的微通道形成和连接。图2B示出了其中蛇形图案的单个微通道形成微室的六边形网格的实施例。

在一些实施例中，子信道的长度是恒定的。在一些实施例中，子信道的长度可以变化。子通道可以具有小于或等于100mm、小于或等于约75mm、小于或等于约50mm、小于或等于约40mm、小于或等于约30mm、小于或等于约20mm、小于或等于约10mm、小于或等于约8mm、小于或等于约6mm、小于或等于约4mm的长尺寸。小于或等于约2mm或更小。子通道的长度可以由微流体装置的外部长度或宽度限定。在一些实施例中，子通道可具有与微通道相同的横截面尺寸。在一些实施例中，子通道可具有与微通道不同的横截面尺寸。在一些实施例中，子通道可具有与微通道相同的深度和不同的横截面尺寸。在一些实施例中，子通道可具有与微通道相同的横截面尺寸和不同的深度。例如，子通道可以具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约15μm或更小的深度。子通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约75μm、小于或等于约50μm、小于或等于约40μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm或更小的横截面宽度。

在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约80μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约60μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约40μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约20μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约10μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约80μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约60μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约40μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约20μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约10μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约80μm宽×约80μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约60μm宽×约60μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可以是约10μm宽×约10μm深。子通道的横截面形状可以是任何合适的横截面形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。在一些实施例中，子通道的横截面形状不同于微通道的横截面形状。在一些实施例中，子通道的横截面形状与微通道的横截面形状相同。子通道的横截面积沿着子通道的长度可以是恒定的。可替代地或附加地，子通道的横截面积可以沿微通道的长度变化。子通道的横截面积可以在约50％至150％之间、在约60％至125％之间、在约70％至120％之间、在约80％至115％之间、在约90％至110％之间、在约95％至100％之间或在约98％至102％之间变化。子通道的横截面积可以小于或等于约10,000μm²、小于或等于约7,500μm²、小于或等于约5,000μm²、小于或等于约2,500μm²、小于或等于约1,000μm²、小于或等于约750μm²、小于或等于约500μm²、小于或等于约400μm²、小于或等于约300μm²、小于或等于约200μm²、小于或等于约100μm²或更小。在一些实施例中，子通道的横截面积与微通道的横截面积相同。在一些实施例中，子通道的横截面积可以小于或等于微通道的横截面积。子通道的横截面积可以小于或等于约98％、小于或等于约95％、小于或等于约90％、小于或等于约85％、小于或等于约80％、小于或等于约75％、小于或等于约70％、小于或等于约60％、小于或等于约50％、小于或等于约40％、小于或等于约30％、小于或等于约20％、小于或等于约20％或更小的微通道横截面积。

在一些实施例中，交叉通道的长度是恒定的。在一些实施例中，交叉通道的长度可以变化。交叉通道可具有小于或等于约100mm、小于或等于约75mm、小于或等于约50mm、小于或等于约40mm、小于或等于约30mm、小于或等于约20mm、小于或等于约10mm、小于或等于约8mm、小于或等于约6mm、小于或等于约4mm、小于或等于约2mm或更小的长尺寸。交叉通道的长度可以由微流体装置的外部长度或宽度限定。在一些实施例中，交叉通道可具有与微通道相同的横截面尺寸。在一些实施例中，交叉通道可具有与微通道不同的横截面尺寸。在一些实施例中，交叉通道可以具有与微通道相同的深度和不同的横截面尺寸。在一些实施例中，交叉通道可具有与微通道相同的横截面尺寸和不同的深度。例如，交叉通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约15μm或更小的深度。交叉通道可以具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约75μm、小于或等于约50μm、小于或等于约40μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm或更小的横截面宽度。

在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约80μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约60μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约40μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约20μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约100μm宽×约10μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约80μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约60μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约40μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约20μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约10μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约80μm宽×约80μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约60μm宽×约60μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可以是约10μm宽×约10μm深。

交叉通道的横截面形状可以是任何合适的横截面形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。在一些实施例中，交叉通道的横截面形状不同于微通道的横截面形状。在一些实施例中，交叉通道的横截面形状与微通道的横截面形状相同。横向通道的横截面积沿着横向通道的长度可以是恒定的。可替代地或附加地，交叉通道的横截面积可以沿微通道的长度变化。交叉通道的横截面积可以在约50％至150％之间、在约60％至125％之间、在约70％至120％之间、在约80％至115％之间、在约90％至110％之间、在约95％至100％之间或在约98％至102％之间变化。交叉通道的横截面积可以小于或等于约10,000μm²、小于或等于约7,500μm²、小于或等于约5,000μm²、小于或等于约2,500μm²、小于或等于约1,000μm²、小于或等于约750μm²、小于或等于约500μm²、小于或等于约400μm²、小于或等于约300μm²、小于或等于约200μm²、小于或等于约100μm²或更小。在一些实施例中，交叉通道的横截面积与微通道的横截面积相同。在一些实施例中，交叉通道的横截面积小于微通道的横截面积。交叉通道的横截面积可以小于或等于约98％、小于或等于约95％、小于或等于约90％、小于或等于约85％、小于或等于约80％、小于或等于约75％、小于或等于约70％、小于或等于约60％、小于或等于约50％、小于或等于约40％、小于或等于约30％、小于或等于约20％、小于或等于约20％或更小的微通道横截面积。

用于制造微流体装置的方法

在一方面，本公开提供了用于制造微流体装置的方法。该方法可以包含注塑热塑性塑料以产生微流体结构。微流体结构可以包含微通道、多个微室和多个虹吸孔。多个微室可以通过多个虹吸孔连接到微通道。微通道可以包含入口和出口。热塑性薄膜可用于封盖微流体结构。当在热塑性薄膜上施加压差时，热塑性薄膜可以是至少部分透气的。

在一些实施例中，热塑性薄膜通过注塑形成。热塑性薄膜可以通过热粘合施加到微流体结构上。可替代地或附加地，薄膜可通过化学键合施加。在一些实施例中，热塑性薄膜形成为注塑过程的一部分并在注塑过程期间形成微流体装置。

微流体装置的主体和薄膜可以包含相同的材料。可替代地，微流体装置的主体和薄膜可以包含不同的材料。微流体装置的主体和薄膜可以包含热塑性塑料。热塑性塑料的实例包括但不限于环烯烃聚合物、丙烯酸、丙烯腈丁二烯苯乙烯、尼龙、聚乳酸、聚苯并咪唑、聚碳酸酯、聚醚砜、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚乙烯、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚酯、聚氨酯或其任何衍生物。微流体装置可以包含均聚物、共聚物或其组合。微流体装置可以由非弹性材料形成。可替代地或附加地，微流体装置可以由弹性材料形成。

在本公开的实例实施例中，热塑性材料和薄膜都由环烯烃聚合物组成。一种合适的热塑性塑料是Zeonor 1430R(日本Zeon Chemical)，而一种合适的薄膜是Zeonox 1060R(日本Zeon Chemical)。在一些实施例中，薄膜是在低压下不透气并且在压力下至少部分透气的材料。

在一些实施例中，入口和出口通过机械钻孔形成。在一些实施例中，入口和出口通过熔融、溶解或蚀刻热塑性塑料形成。

图4示出了本公开的实施例的制造方法。在图4中，使用注塑过程401来形成微流体结构。微流体结构包括微室阵列，其通过虹吸孔连接到至少一个微通道，如图1A和1B。微流体结构被薄膜封盖。在封盖过程中，在微结构的至少一侧上的开口被覆盖以封闭和密封微结构。在本公开的一些实施例中，通过将薄膜施加到注塑的微流体结构的过程402来执行封盖。在本公开的一些实施例中，通过作为注塑过程401的一部分形成薄膜来执行封盖。

作为另一个实例，虽然在通过注塑形成的微结构的背景下进行了描述，但是如上所述，通过其它微制造技术形成的微流体装置也可以受益于使用这种薄的热塑性膜以允许除气。这些技术包括微机械加工、微光刻和热压印，以及其它微制造技术。

在一方面，本公开提供了用于形成微流体装置的方法。形成微流体装置的方法可包含提供微流体结构和膜。可以用溶剂处理微流体结构的表面、膜的表面或两者。可在第一加热条件下将微流体结构与膜压制在一起以形成包含溶剂的微流体装置。可在第二加热条件下对微流体装置施加负压，所述负压施加的时间段可大于30分钟或压力小于20千帕(kPa)，以去除至少一部分溶剂。

图11是用于形成微流体装置的实例过程1100的流程图。该过程可以使用如本文别处所述的至少一个适当配置的系统来实施。该系统可以是操作员(例如，技术人员)，自动化系统(例如，能够在没有人为干预的情况下运行)或半自动化系统(例如，人实施一些操作而机器实施其它操作)。该系统可以在一个系统中执行所有操作(例如，具有用于压制、加热和施加真空的一个室)或在多个系统中执行操作(例如，用于热结合的加热夹具以及用于去除溶剂的加热真空烘箱)。

该系统可以提供微流体结构和膜(1110)。微流体结构可以是如本文别处所述的微流体结构。微流体结构可包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、250、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或更多个特征。微流体结构可包括至多约1,000,000、500,000、100,000、50,000、10,000、5,000、1,000、500、250、100、50、10、9、8、7、6、5、4、3、2或更少的特征。该特征可以是至少一个微通道、至少一个微室、至少一个虹吸孔或其任意组合。例如，微流体结构可具有100,000个微通道、100,000个微室和5个虹吸管阵列。微流体结构可以通过注射方法(例如，注塑)、挤出方法(例如，细丝沉积3D打印)、基于光的方法(例如，立体光刻、数字光投影3D打印、激光烧结)等生成。微流体结构可以被配置成容纳和包含反应(例如，PCR反应、化学合成反应)。微流体结构可以由一种或多种材料制成。一种或多种材料可以是复合材料、塑料、金属等。塑料可以是甲基丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸月桂酯(PLMA))、聚乳酸(PLA)、多不饱和聚合物(例如，聚乙烯、聚丙烯)、环烯烃共聚物(COC)、聚碳酸酯、聚砜、聚醚酰亚胺等。复合材料可以是塑料增强剂(例如碳纤维、纳米颗粒等)的组合。金属可以是纯金属(例如铝、铁)或合金(例如不锈钢、锡)。

膜可以是平片(例如，不具有限定特征)、图案化膜(例如，包含限定特征)、微流体系统等。膜可以是与微流体系统相同的微流体系统(例如，具有相同的特征)或不同的微流体系统(例如，具有不同的微流体特征)。膜可以通过注射方法(例如，注塑)、挤出方法(例如，细丝沉积3D打印、膜挤出)、基于光的方法(例如，立体光刻、数字光投影3D打印、激光烧结)等生成。膜可以由如上所述的材料制成。膜可以具有与微流体结构相同的材料。可替代地，膜可以具有与微流体结构不同的材料。例如，由PMMA制成的微流体结构可以结合到由PLMA制成的膜上。在另一个实例中，微流体结构和膜都可以是COC聚合物。

系统可以用溶剂处理微流体结构的表面、膜的表面或两者(1120)。该处理可以是用溶剂的处理、物理过程(例如，等离子体处理、热处理)、表面粗糙化或其任意组合。溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂(例如，水、水溶液、低共熔金属混合物、熔融盐)。有机溶剂可以是非极性溶剂(例如己烷、环己烷、环己烯、甲苯、二甲苯、甲苯、苯、四氯化碳等)或极性溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基甲酰胺(NMF)等)。可基于微流体结构、膜或两者的材料的溶解度来选择溶剂。例如，可以选择溶剂，因为它不完全溶解膜的聚合物，但是它确实提供足够的溶剂化作用以在膜与微流体结构之间生成强密封。该处理可以包含通过滴铸、旋涂、刮涂、离心浇铸，以蒸气形式引入溶剂(例如，使载气通过起泡器室，在具有微流体装置和/或膜的容器中提供一盘开放的溶剂)等。例如，可以将膜放入具有已经鼓泡通过环己烷的氮气入口的钟罩中，从而将蒸发成气体的环己烷施加到膜上。微流体装置和膜可以用相同的溶剂或不同的溶剂处理。例如，微流体装置可以用环己烷处理，而膜可以用二甲苯的混合物处理。该处理可以包含在施用溶剂之后的等待期。等待期可以是在进一步处理之前让溶剂与微流体装置和/或膜相互作用的时间。等待期可以是至少约0.5秒、1秒、5秒、10秒、30秒、60秒、120秒、180秒、240秒、300秒、500秒、1,000秒或更多秒。等待期可以是至多约1,000秒、500秒、300秒、240秒、180秒、120秒、60秒、30秒、10秒、5秒、1秒、0.5秒或更少。等待期可以是由上述任意两个数字定义的范围。例如，在施加丙酮之后，可以将膜放置30至60秒以允许丙酮软化膜的聚合物。

系统可以在第一加热条件下将微流体结构与膜压制在一起以形成包含溶剂的微流体装置(1130)。可以借助于夹具、虎钳、液压机、加压气体室(例如，高压釜、加压烘箱)等进行压制以将微流体结构结合到膜。压制可包括施加至少约0.5千牛顿(kN)、1kN、2kN、4kN、6kN、8kN、10kN、15kN、20kN、25kN、30kN、40kN、50kN的力或更大的力。压制可包括施加至多约50kN、40kN、30kN、25kN、20kN、15kN、10kN、8kN、6kN、4kN、2kN、1kN、0.5kN的力或更小的力。压制可包括施加约0.5kN至1kN、0.5kN至2kN、0.5kN至4kN、0.5kN至6kN、0.5kN至8kN、0.5kN至10kN、0.5kN至15kN、0.5kN至20kN、0.5kN至25kN、0.5kN至30kN、0.5kN至40kN、0.5kN至50kN、1kN至2kN、1kN至4kN、1kN至6kN的力、1kN至8kN、1kN至10kN、1kN至15kN、1kN至20kN、1kN至25kN、1kN至30kN、1kN至40kN、1kN至50kN、2kN至4kN、2kN至6kN、2kN至8kN、2kN至10kN、2kN至15kN、2kN至20kN、2kN至25kN、2kN至30kN、2kN至40kN、2kN至50kN、4kN至6kN、4kN至8kN、4kN至10kN、4kN至15kN、4kN至20kN、4kN至25kN、4kN至30kN、4kN至40kN、4kN至50kN、6kN至8kN、6kN至10kN、6kN至15kN、6kN至20kN、6kN至25kN、6kN至30kN、6kN至40kN、6kN至50kN、8kN至10kN、8kN至15kN、8kN至20kN、8kN至25kN、8kN至30kN、8kN至40kN、8kN至50kN、10kN至15kN、10kN至20kN、10kN至25kN、10kN至30kN、10kN至40kN、10kN至50kN、15kN至20kN、15kN至25kN、15kN至30kN、15kN至40kN、15kN至50kN、20kN至25kN、20kN至30kN、20kN至40kN、20kN至50kN、25kN至30kN、25kN至40kN、25kN至50kN、30kN至40kN、30kN至50kN或40kN至50kN。在实例中，压制包括施加至少1kN的力。在另一实例中，包括施加1kN至40kN的力。第一加热条件可以是将微流体结构与膜一起加热到至少约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃或更高的温度。第一加热条件可以是将微流体结构与膜一起加热到至多约200℃、190℃、180℃、170℃、160℃、150℃、140℃、130℃、120℃、110℃、105℃、100℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃或更低的温度。第一加热条件可以是加热到由以上任何两个数字限定的温度范围。例如，第一加热条件可以是加热至75℃至85℃范围内的温度。第一加热条件可以是在溶剂的沸点下加热到至少约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃或更高。第一加热条件可以是在溶剂的沸点下加热到至多约10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃或更低。例如，如果使用环己烷作为溶剂，则第一加热条件可以是加热至78℃，因为环己烷的沸点为约80℃。压制可以与第一加热条件同时发生。压制可以在第一加热条件之前和/或之后发生。例如，微流体装置可以被加热，且然后置于压力下。压制和第一加热条件可以保持至少约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟或更多。压制和第一加热条件可以保持至多约60分钟、45分钟、30分钟、20分钟、19分钟、18分钟、17分钟、16分钟、15分钟、14分钟、13分钟、12分钟、11分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟或更少。例如，可将正己烷施加到微流体结构和膜两者上，可将两者在350kPa下压制在一起并在80℃的温度下保持2分钟以形成微流体装置。第一加热条件的加热可从微流体装置中去除至少一部分溶剂。第一加热条件的加热可以去除至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多的溶剂。第一加热条件的加热可以去除至多约99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的溶剂。

随后，为了形成微流体装置，系统可以在第二加热条件下对微流体装置施加负压大于30分钟的时间段，以去除至少一部分溶剂(1140)，从而去除至少一部分残留溶剂。残留溶剂可以是从操作1120留下的溶剂。可以使用真空泵施加负压。真空泵可以附接到包含微流体装置的室(例如钟罩、真空烘箱)。负压可以是至少约1kPa、5kPa、10kPa、15kPa、20kPa、25kPa、30kPa、35kPa、40kPa、45kPa、50kPa、55kPa、60kPa、65kPa、70kPa、75kPa、80kPa、85kPa、90kPa、91kPa、92kPa、93kPa、94kPa、95kPa、96kPa、97kPa、98kPa、99kPa、100kPa或更大的压力降低。负压可以是至多约100kPa、99kPa、98kPa、97kPa、96kPa、95kPa、94kPa、93kPa、92kPa、91kPa、90kPa、85kPa、80kPa、75kPa、70kPa、65kPa、60kPa、55kPa、50kPa、45kPa、40kPa、35kPa、30kPa、25kPa、20kPa、15kPa、10kPa、5kPa、1kPa或更小的压力降低。负压可以与第二加热条件一前一后地施加。负压可以在第二加热条件之前和/或之后施加。第二加热条件可以是将微流体装置加热到至少约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃或更高的温度。第二加热条件可以是将微流体装置加热到至多约200℃、190℃、180℃、170℃、160℃、150℃、140℃、130℃、120℃、110℃、105℃、100℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃或更低的温度。第二加热条件可以是加热到由以上任何两个数字限定的温度范围。例如，第二加热条件可以是加热至80℃至90℃范围内的温度。第二加热条件可以是在溶剂的沸点下加热到至少约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃或更高。第二加热条件可以是在溶剂的沸点下加热到至多约10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃或更低。溶剂的沸点可取决于所施加的负压的大小。例如，如果使用环己烷作为溶剂，则第二加热条件可以加热至44℃，因为环己烷的沸点在20kPa的压力下为约45℃。负压和/或第二加热条件可施加至少约0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时或更多。负压和/或第二加热条件可以施加至多约72小时、66小时、60小时、54小时、48小时、42小时、36小时、30小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9.5小时、9小时、8.5小时、8小时、7.5小时、7小时、6.5小时、6小时、5.5小时、5小时、4.5小时、4小时、3.5小时、3小时、2.5小时、2小时、1.5小时、1小时、0.75小时、0.5小时、0.25小时或更少。操作1140的加热和/或负压可从微流体装置中去除至少一部分残留溶剂。操作1140的加热和/或负压可以去除至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或更多的残留溶剂。操作1140的加热和/或负压可以去除至多约99.9％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的残留溶剂。在第二加热条件下施加负压可以减少微流体结构和膜之间的分隔。

可以使用另外的策略来进一步减少微流体装置中残留溶剂的量。可以对微流体装置施加增大的压力。增加的压力可足以排出至少一部分残留溶剂。例如，加压气体管线可以附接到微流体装置上，并且干燥气体可以流过该装置，从而进一步去除残留溶剂。微流体装置可以用具有较高蒸气压的不同溶剂洗涤。例如，如果辛烷用作结合微流体结构和膜的溶剂，则在微流体装置经受负压和第二加热条件以去除戊烷之前，戊烷可快速流过以去除大部分高沸点辛烷。

图12是用于形成微流体装置的实例示意图。微流体结构1210和膜1220可如本文其它地方所述形成。微流体结构1210可以具有特征大小为至少约0.1微米、1微米、5微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、125微米、150微米、175微米、200微米、225微米、250微米、275微米、300微米、325微米、350微米、375微米、400微米、450微米、500微米、550微米、600微米、650微米、700微米、750微米、800微米、850微米、900微米、950微米、1,000微米或更大的特征。微流体结构1210可具有特征大小为至多约1,000微米、950微米、900微米、850微米、800微米、750微米、700微米、650微米、600微米、550微米、500微米、450微米、400微米、375微米、350微米、325微米、300微米、275微米、250微米、225微米、200微米、175微米、150微米、125微米、100微米、90微米、80微米、70微米、60微米、50微米、40微米、30微米、20微米、10微米、5微米、1微米、0.1或更小的特征。微流体结构可以具有多个不同的特征大小。例如，微流体结构可具有通过100微米槽连接到250微米通道的500微米孔。该特征可以是通道、室、孔、泵、颈部等。在该实例示意图中，膜1220具有施加到其上的溶剂1230，如图11的操作1120中所述。

在图11的操作1130之后，结合微流体结构和膜以生成微流体装置1240。微流体装置1240可包含空隙1250。空隙可以是如上所述的特征。在结合过程完成之后，空隙1250可以保留一些溶剂1230。保留的溶剂可削弱微流体装置，从而导致当施加压力和/或热时微流体结构1210和膜1220分层或分离。为了从空隙1250中去除残留溶剂，可以将微流体装置1240置于真空室1260中。在图11的操作1140的实施中可以包含真空室1260，以从微流体装置中去除残留溶剂。去除残留溶剂可减少微流体结构和膜的分层。分层的量可减少至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或更多。分层的量可减少至多约99.9％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少。例如，用热和真空处理的微流体装置在操作条件下可具有比未处理的微流体装置少50％的分层。

图18A至18B是在液体加压和加热之前(图18A)和之后(图18B)没有去除溶剂的情况下制造的微流体装置的实例放大图像。液体加压和加热可以模拟微流体装置的操作条件。在图18B中看到的大的暗泡可以指示微流体结构与膜的分层。

图19A至19B是在液体加压和加热之前(图19A)和之后(图19B)真空处理的微流体装置的实例放大图像。图20A至20B是在液体加压和加热之前(图20A)和之后(图20B)热处理的微流体装置的实例放大图像。图19B和20B的微流体装置都示出了与图18B相比气泡和分层的数量和严重程度的减少。

图21A至21B是如本文其它地方所述的在液体加压和加热之前(图21A)和之后(图21B)的微流体装置的真空和热处理的实例放大图像。使用热处理和负压可消除残留溶剂和分层。去除残留溶剂可将微流体装置生成过程的产率增加至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1,000％或更多。去除残留溶剂可将微流体装置产生过程的产率增加至多约1,000％、900％、800％、700％、600％、500％、400％、300％、250％、200％、175％、150％、125％、100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％，60％、55％，50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少。微流体装置的可用特征分数可以是可用特征(例如微室)的数目除以微流体装置内该特征的总数。例如，具有总共1,500个微室中的500个可用微室的微流体装置具有0.33的可用微室分数。由本文所述的方法和系统产生的微流体装置可具有至少约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、0.999或更大的可用特征分数。由本文所述的方法和系统产生的微流体装置可具有至多约0.999、0.99、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.01或更小的可用特征分数。

分析核酸样品的方法

在一方面，本公开提供了使用微流体装置分析核酸样品的方法。该方法可包含提供包含微通道的微流体装置。微通道可以包含入口和出口。微流体装置可进一步包含通过多个虹吸孔连接到微通道的多个微室。微流体装置可以由邻近微流体装置的表面设置的热塑性薄膜密封，使得所述热塑性薄膜封盖微通道、多个微室和多个虹吸孔。试剂可以施加到入口或出口。微流体装置可以通过在试剂与微流体装置之间提供第一压差来填充，从而使试剂流入微流体装置中。通过在微通道与多个微室之间施加第二压差以将试剂移动到多个微室中并迫使多个微室中的气体通过热塑性薄膜，可以使试剂分配到微室中。第二压差可以大于第一压差。可在入口与出口之间施加第三压差以将流体引入微通道中而不将流体引入微室中。第三压差可以小于第二压差。

在一些实施例中，入口和出口与气动泵流体连通。在一些实施例中，微流体装置与真空系统接触。样品的填充和分配可以通过在微流体装置的各个特征上施加压差来进行。在一些实施例中，可以在不在微室与微通道之间使用阀来分离样品的情况下执行样品的填充和分配。例如，可以通过在待装载的样品与微通道之间施加压差来执行微通道的填充。该压差可通过对样品加压或通过对微通道施加真空来实现。可以通过在微通道与微室之间施加压差来执行填充微室。这可以通过对微通道加压或对微室施加真空来实现。使样品分配可以通过在流体与微通道之间施加压差来执行。该压差可通过对流体加压或通过对微通道施加真空来实现。

在不同的施加压差下，薄膜可以具有不同的渗透特性。例如，薄膜在第一压差和第三压差(例如，低压)下可以是不透气的，该第一压差和第三压差可以是较小幅度的压差。该薄膜在第二压差(例如，高压)下可以是至少部分透气的，该第二压差可以是较高幅度的压差。第一压差和第三压差可以相同或不同。第一压差可以是入口或出口中的试剂与微流体装置之间的压力差。在微流体装置的填充期间，试剂的压力可以高于微流体装置的压力。在微流体装置的填充期间，试剂与微流体装置之间的压力差(例如，低压)可以小于或等于约8磅每平方英寸(psi)、小于或等于约6psi、小于或等于约4psi、小于或等于约2psi、小于或等于约1psi或更小。在一些实例中，在微流体装置的填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可为约1psi至约8psi。在一些实例中，在微流体装置的填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可为约1psi至约6psi。在一些实例中，在微流体装置的填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可为约1psi至约4psi。可以通过在试剂与微流体装置之间施加压差达小于或等于约20分钟、小于或等于约15分钟、小于或等于约10分钟、小于或等于约5分钟、小于或等于约3分钟、小于或等于约2分钟、小于或等于约1分钟或更短来填充微流体装置。

填充的微流体装置可以在微通道、虹吸孔、微室或其任意组合中具有试剂。试剂回填到微室中可在填充微流体装置时发生或可在施加第二压差期间发生。第二压差(例如，高压)可以对应于微通道与多个微室之间的压力差。在第二压差的施加期间，较高压力域中的第一流体可推动较低压力域中的第二流体通过薄膜并离开微流体装置。第一流体和第二流体可以包含液体或气体。液体可包含水混合物或油混合物。第二压差可以通过对微通道加压来实现。可替代地或附加地，可以通过向微室施加真空来实现不同的第二压差。在第二压差的施加期间，微通道中的试剂可流入微室中。另外，在第二压差的施加期间，被截留在虹吸孔、微室和微通道内的气体可通过薄膜除气。在微室的回填和除气期间，微室与微通道之间的压差可以大于或等于约6psi、大于或等于约8psi、大于或等于约10psi、大于或等于约12psi、大于或等于约14psi、大于或等于约16psi、大于或等于约18psi、大于或等于约20psi或更大。在一些实例中，在微室的回填过程中，微室与微通道之间的压差为约8psi至约20psi。在一些实例中，在微室的回填过程中，微室与微通道之间的压差为约8psi至约18psi。在一些实例中，在微室的回填过程中，微室与微通道之间的压差为约8psi至约16psi。在一些实例中，在微室的回填过程中，微室与微通道之间的压差为约8psi至约14psi。在一些实例中，在微室的回填过程中，微室与微通道之间的压差为约8psi至约12psi。在一些实例中，在微室的回填过程中，微室与微通道之间的压差为约8psi至约10psi。可通过施加压差达大于约5分钟、大于约10分钟、大于约15分钟、大于约20分钟、大于约25分钟、大于约30分钟或更长时间来对微室进行回填和除气。

可以通过从微通道中去除过量的样品来分配样品。从微通道中去除过量的样品可以防止一个微室中的试剂通过虹吸孔扩散到微通道中和其它微室中。可以通过将流体引入微通道的入口或出口来去除微通道内过量的样品。流体的压力可以大于微通道的压力，从而在流体与微通道之间产生压差。流体可以是氧气、氮气、二氧化碳、空气、稀有气体或其任意组合。在样品的分配过程中，流体和微通道之间的压差可以小于或等于约8psi、小于或等于约6psi、小于或等于约4psi、小于或等于约2psi、小于或等于约1psi或更小。在一些实例中，在样品的分配过程中，流体与微通道之间的压差可以为约1psi至约8psi。在一些实例中，在样品的分配过程中，流体与微通道之间的压差可以为约1psi至约6psi。在一些实例中，在样品的分配过程中，流体与微通道之间的压差可以为约1psi至约4psi。可通过在流体与微通道之间施加压差达小于或等于约20分钟、小于或等于约15分钟、小于或等于约10分钟、小于或等于约5分钟、小于或等于约3分钟、小于或等于约2分钟、小于或等于约1分钟或更短来分配样品。

图3A至3D示出了使用图1A所示的微流体装置的方法。在图3A中，通过气动泵300对入口120处的试剂施加低压，以迫使试剂进入微通道110，且因此通过虹吸孔填充微室。压力迫使试剂流过微通道，且因此通过虹吸孔流入微室中。此时，诸如气泡301的气泡可保留在微室、虹吸孔或微通道内。通过施加低压可以继续填充，直到微室、虹吸孔和微通道基本上填充有试剂。试剂可以是用于聚合酶链式反应的试剂。在一些实施例中，试剂被稀释，使得在微流体装置的每个微室中的试剂中存在不超过一种PCR模板。

在图3B中，气动泵300连接到入口120和出口130，并且施加高压。高压经由试剂传递并施加到诸如气泡301的气泡上。在该高压的影响下，薄膜150变得可透气，并且气泡301可以通过薄膜150除气。通过施加这种高压，可使微室、虹吸孔和微通道基本上不含气泡，从而避免污染。

在图3C中，通过气动泵300在入口120处对气体施加低压而重新引入流体。空气压力可能不足以使气体通过薄膜而除气或足够高以迫使气泡进入虹吸孔和微室。相反，气体可以清除微通道中的试剂，从而使试剂分离在每个微室和虹吸孔中。在一些实施例中，气体是空气。在一些实施例中，气体可以是惰性气体，例如氮气、二氧化碳或稀有气体。这样的气体可用于避免试剂与空气的组分气体之间的反应。

图3D示出了在图3C中已经施加低压之后系统的状态。在施加低压气体之后，微室和虹吸孔可以保持充满试剂，而微通道可以被清除试剂。由于虹吸孔产生的毛细力和高表面张力，试剂可以在微室内保持静止。毛细力和高表面张力可防止试剂流入微通道并使试剂蒸发最小化。

样品的分配可以通过试剂中指示剂的存在来验证。指示剂可包括包含可检测部分的分子。可检测部分可包括放射性种类、荧光标记、化学发光标记、酶标记、比色标记或其任意组合。放射性种类的非限制性实例包括³H、¹⁴C、²²Na、³²P、³³P、³⁵S、⁴²K、⁴⁵Ca、⁵⁹Fe、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I或²⁰³Hg。荧光标记的非限制性实例包括荧光蛋白、光学活性染料(例如荧光染料)、有机金属荧光团或其任意组合。化学发光标记的非限制性实例包括荧光素酶类的酶，例如海萤(Cypridina)萤光素酶、高斯(Gaussia)萤光素酶、海肾(Renilla)萤光素酶和萤火虫萤光素酶。酶标记的非限制性实例包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或其它标记。

在一些实施例中，指示剂分子是荧光分子。荧光分子可包括荧光蛋白、荧光染料和有机金属荧光团。在一些实施例中，指示剂分子是蛋白质荧光团。蛋白质荧光团可以包括：绿色荧光蛋白(GFP，在绿色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为500至550纳米的光)、青色荧光蛋白(CFP，在青色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为450至500纳米的光)、红色荧光蛋白(RFP，在红色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为600至650纳米的光)。蛋白质荧光团的非限制性实例包括AcGFP、AcGFP1、AmCyan、AmCyan1、AQ143、AsRed2、Azami Green、Azurite、BFP、Cerulean、CFP、CGFP、Citrine、copGFP、CyPet、dKeima-Tandem、DsRed、dsRed-Express、DsRed-Monomer、DsRed2、dTomato、dTomato-Tandem、EBFP、EBFP2、ECFP、EGFP、Emerald、EosFP、EYFP、GFP、HcRed-Tandem、HcRed1、JRed、Katuska、Kusabira Orange、Kusabira Orange2、mApple、mBanana、mCerulean、mCFP、mCherry、mCitrine、mECFP、mEmerald、mGrape1、mGrape2、mHoneydew、Midori-Ishi Cyan、mKeima、mKO、mOrange、mOrange2、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mRuby、mStrawberry、mTagBFP、mTangerine、mTeal、mTomato、mTurquoise、mWasabi、PhiYFP、ReAsH、Sapphire、SuperfolderGFP、T-Sapphire、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagRFP-T、TagYFP、tdTomato、Topaz、TurboGFP、Venus、YFP、YPet、ZsGreen和ZsYellow1的突变体和光谱变体。

在一些实施例中，指示剂分子是荧光染料。荧光染料的非限制性实例包括SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙啶、Hoeste、SYBR金、溴化乙锭、吖啶、普罗黄素、吖啶橙、吖啶黄素、荧光香豆素(fluorcoumanin)、椭圆玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶(homidium)、光神霉素、多吡啶钌、氨茴霉素、菲啶和吖啶、溴化乙锭、碘化丙锭、碘化己锭、二氢乙锭、乙锭同型二聚体-1和乙锭同型二聚体-2、叠氮溴化乙锭和ACMA、Hoechst33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、DAPI、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、羟基芪脒、SYTOXBlue、SYTOX Green、SYTOX Orange、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR DX、SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44、SYTO-45(蓝色)、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-24、SYTO-21、SYTO-23、SYTO-12、SYTO-11、SYTO-20、SYTO-22、SYTO-15、SYTO-14、SYTO-25(绿色)、SYTO-81、SYTO-80、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84、SYTO-85(橙色)、SYTO-64、SYTO-17、SYTO-59、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-60、SYTO-63(红色)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、德克萨斯红(TexasRed)、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、SybrGreen I、Sybr Green II、Sybr Gold、CellTrackerGreen、7－AAD、乙锭同型二聚体I、乙锭同型二聚体II、乙锭同型二聚体III、溴化乙锭、伞形酮、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、芪、荧光黄、级联蓝、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、荧光镧系元素络合物(如包括铕和铽的那些络合物)、羧基四氯荧光素、5-羧基荧光素和/或6-羧基荧光素(FAM)、5-碘乙酰胺基荧光素或6-碘乙酰胺基荧光素、5-{[2-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素和5-{[3-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、5-羧基罗丹明和/或6-羧基罗丹明(ROX)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白、AlexaFluor350、AlexaFluor 405、AlexaFluor 430、AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor546、AlexaFluor 555、AlexaFluor 568、AlexaFluor 594、AlexaFluor 610、AlexaFluor633、AlexaFluor 635、AlexaFluor 647、AlexaFluor 660、AlexaFluor 680、AlexaFluor700、AlexaFluor 750和AlexaFluor 790染料、DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 550、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 650、DyLight 680、DyLight 755和DyLight 800染料或其它荧光团。

在一些实施例中，指示剂分子是有机金属荧光团。有机金属荧光团的非限制性实例包括镧系离子螯合物，该镧系离子螯合物的非限制性实例包括三(二苯甲酰甲烷)单(1,10-菲咯啉)铕(III)、三(二苯甲酰甲烷)单(5-氨基-1,10-菲咯啉)铕(III)和Lumi4-Tb穴状化合物。

在一些实施例中，拍摄微流体装置的图像。可以同时拍摄单个微室、微室阵列或多个微室阵列的图像。在一些实施例中，通过微流体装置的主体拍摄图像。在一些实施例中，通过微流体装置的薄膜拍摄图像。在一些实施例中，通过微流体装置的主体和通过薄膜拍摄图像。在一些实施例中，微流体装置的主体基本上是光学透明的。在一些实施例中，微流体装置的主体基本上是光学不透明的。在一些实施例中，薄膜基本上是光学透明的。在一些实施例中，可以在用试剂填充微流体装置之前拍摄图像。在一些实施例中，可以在用试剂填充微流体装置之后拍摄图像。在一些实施例中，可以在用试剂填充微流体装置期间拍摄图像。在一些实施例中，拍摄图像以验证试剂的分配。在一些实施例中，在反应期间拍摄图像以监测反应的产物。在一些实施例中，反应产物包含扩增产物。在一些实施例中，以指定的间隔拍摄图像。可替代地，或附加地，拍摄微流体装置的视频。指定的间隔可包括在反应期间至少每300秒、至少每240秒、至少每180秒、至少每120秒、至少每90秒、至少每60秒、至少每30秒、至少每15秒、至少每10秒、至少每5秒、至少每4秒、至少每3秒、至少每2秒、至少每1秒或更频繁地拍摄图像。

在一些实施例中，使用微流体装置的方法可进一步包含扩增核酸样品。微流体装置可以填充有扩增试剂，所述扩增试剂包含核酸分子、扩增反应所需的组分、指示剂分子和扩增探针。可以通过对多个微室进行热循环来进行放大。核酸扩增的检测可以通过对微流体装置的微室成像来进行。可以通过对其中核酸分子被成功扩增的微室进行计数并应用泊松统计来对核酸分子进行定量。在一些实施例中，核酸扩增和定量可以在单个整合单元中进行。

多种核酸扩增反应可用于扩增样品中的核酸分子以生成扩增产物。核酸靶的扩增可以是线性的、指数式的或其组合。核酸扩增方法的非限制性实例包括引物延伸、聚合酶链反应、逆转录、等温扩增、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增和多重置换扩增。在一些实施例中，扩增产物是DNA或RNA。对于针对DNA扩增的实施例，可以使用任何DNA扩增方法。DNA扩增方法包括但不限于PCR、实时PCR、装配PCR、不对称PCR、数字PCR、拨出PCR、解旋酶依赖性PCR、巢式PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、小引物PCR、多重PCR、重叠延伸PCR、热不对称交错PCR、降落PCR和连接酶链反应。在一些实施例中，DNA扩增是线性的、指数式的或其任意组合。在一些实施例中，用数字PCR(dPCR)实现DNA扩增。

核酸扩增所需的试剂可包括聚合酶、反向引物、正向引物和扩增探针。聚合酶的实例包括但不限于核酸聚合酶、转录酶或连接酶(例如，催化键形成的酶)。聚合酶可以是天然存在的或合成的。聚合酶的实例包括DNA聚合酶，和RNA聚合酶、热稳定聚合酶、野生型聚合酶、修饰的聚合酶、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、噬菌体T4 DNA聚合酶、Φ29(phi29)DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、Ex-Taq聚合酶、LA-Taw聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tca聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、铂taq聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、具有3'至5'外切核酸酶活性的Klenow片段聚合酶及其变体、修饰产物及衍生物。对于热启动聚合酶，可使用在约92℃至95℃的温度下变性约2分钟至10分钟的时间段。

在一些实施例中，扩增探针是序列特异性寡核苷酸探针。当与扩增产物杂交时，扩增探针可以是光学活性的。在一些实施例中，扩增探针在核酸扩增进行时是可检测的。光信号的强度可以与扩增产物的量成比例。探针可以连接至本文所述的任何光学活性可检测部分(例如，染料)，并且还可以包括能够阻断相关联的染料的光学活性的猝灭剂。可用作可检测部分的探针的非限制性实例包括TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针、Lion探针、锁定核酸探针或分子信标。可用于阻断探针的光学活性的猝灭剂的非限制性实例包括黑洞猝灭剂(BHQ)、Iowa Black FQ和RQ猝灭剂，或内部ZEN猝灭剂。可替代地或附加地，探针或猝灭剂可以是可用于本公开的方法的上下文中的任何探针。

在一些实施例中，扩增探针是双标记荧光探针。双标记探针可包括与核酸连接的荧光报道分子和荧光猝灭剂。荧光报道分子和荧光淬灭剂可以紧邻彼此定位。荧光报道分子和荧光猝灭剂的紧邻可以阻断荧光报道分子的光学活性。双标记探针可与待扩增的核酸分子结合。在扩增过程中，荧光报道分子和荧光猝灭剂可被聚合酶的外切核酸酶活性切割。从扩增探针切割荧光报道分子和猝灭剂可以使荧光报道分子恢复其光学活性并能够检测。双标记荧光探针可以包括5'荧光报道分子，其具有约450纳米(nm)、500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或更高的激发波长最大值和约500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或更高的发射波长最大值。双标记荧光探针还可以包括3'荧光猝灭剂。荧光淬灭剂可以淬灭约380nm至550nm、390nm至625nm、470nm至560nm、480nm至580nm、550nm至650nm、550nm至750nm，或620nm至730nm之间的荧光发射波长。

在一些实施例中，通过对微流体装置的微室热循环来执行核酸扩增。热循环可包括通过对微流体装置施加加热或冷却来控制微流体装置的温度。加热或冷却方法可以包括电阻加热或冷却、辐射加热或冷却、传导加热或冷却、对流加热或冷却，或其任意组合。热循环可包括将微室在足够高以使核酸分子变性的温度下温育一段时间，随后在延伸温度下微室温育延伸持续时间的循环。变性温度可以根据例如特定的核酸样品、使用的试剂和反应条件而变化。在一些实施例中，变性温度可为约80℃至约110℃。在一些实施例中，变性温度可为约85℃至约105℃。在一些实施例中，变性温度可为约90℃至约100℃。在一些实施例中，变性温度可为约90℃至约98℃。在一些实施例中，变性温度可为约92℃至约95℃。在一些实施例中，变性温度可为至少约80℃、至少约81℃、至少约82℃、至少约83℃、至少约84℃、至少约85℃、至少约86℃、至少约87℃、至少约88℃、至少约89℃、至少约90℃、至少约91℃、至少约92℃、至少约93℃、至少约94℃、至少约95℃。至少约96℃、至少约97℃、至少约98℃、至少约99℃、至少约100℃或更高。

变性的持续时间可以根据例如特定的核酸样品、使用的试剂和反应条件而变化。在一些实施例中，变性的持续时间可以小于或等于约300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。在另一个实施例中，变性的持续时间可以不超过约120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

延伸温度可根据例如特定核酸样品、使用的试剂和反应条件而变化。在一些实施例中，延伸温度可为约30℃至约80℃。在一些实施例中，延伸温度可为约35℃至约75℃。在一些实施例中，延伸温度可为约45℃至约65℃。在一些实施例中，延伸温度可为约55℃至约65℃。在一些实施例中，延伸温度可为约40℃至约60℃。在一些实施例中，延伸温度可以是至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约41℃、至少约42℃、至少约43℃、至少约44℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃、至少约71℃、至少约72℃、至少约73℃、至少约74℃、至少约75℃、至少约76℃、至少约77℃、至少约78℃、至少约79℃或至少约80℃。

延伸时间可根据例如特定核酸样品、使用的试剂和反应条件而变化。在一些实施例中，延伸的持续时间可以小于或等于约300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。在替代实施例中，延伸的持续时间可不超过约120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

核酸扩增可以包括热循环的多个循环。可以执行任何合适数目的循环。在一些实施例中，所执行的循环数目可大于约5个、大于约10个、大于约15个、大于约20个、大于约30个、大于约40个、大于约50个、大于约60个、大于约70个、大于约80个、大于约90个、大于约100个循环或更多。所执行的循环数目取决于获得可检测扩增产物所需的循环数目。例如，在dPCR期间检测核酸扩增所需的循环数目可以小于或等于约100、小于或等于约90、小于或等于约80、小于或等于约70、小于或等于约60、小于或等于约50、小于或等于约40、小于或等于约30、小于或等于约20、小于或等于约15、小于或等于约10、小于或等于约5个循环或更少。

达到可检测量的扩增产物的时间可以根据具体的核酸样品、使用的试剂、使用的扩增反应、使用的扩增循环数目和反应条件而变化。在一些实施例中，达到可检测量的扩增产物的时间可为约120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、40分钟或更短、30分钟或更短、20分钟或更短、10分钟或更短或5分钟或更短。

在一些实施例中，缓变速率(例如微室从一个温度转变到另一个温度的速率)对于扩增是重要的。例如，扩增反应产生可检测量的扩增产物的温度和时间可根据缓变速率而变化。缓变速率可影响在扩增期间使用的时间、温度，或时间和温度两者。在一些实施例中，缓变速率在循环之间是恒定的。在一些实施例中，缓变速率在循环之间变化。可以基于正被处理的样品来调节缓变速率。例如，可以选择最佳缓变速率，以提供稳健且有效的扩增方法。

图5示出了与上述微流体装置一起使用的数字PCR过程。在操作501中，试剂如图3A至3D中所示被分配。在操作502中，使试剂经受热循环以对微室中的试剂运行PCR反应。该操作可以例如使用平板热循环仪进行。在操作503中，执行图像采集以确定哪些微室已经成功地运行PCR反应。例如，可以使用三色探针检测单元来执行图像采集。在操作504中，将泊松统计应用于在操作503中确定的微室的计数，以将阳性室的原始数目转换成核酸浓度。

用于分析核酸样品的系统

在一方面，本公开提供了一种使用微流体装置分析核酸样品的设备。该设备可包含被配置成保持一个或多个微流体装置的转移台。微流体装置可以包含具有入口和出口的微通道、通过多个虹吸孔连接到微通道的多个微室以及封盖或覆盖微流体装置的薄膜。该设备可包含与微流体装置流体连通的气动模块。气动模块可将试剂装载到微流体装置中并将试剂分配到微室中。该设备可包含与多个微室热连通的热模块。热模块可以控制微室的温度和微室的热循环。该设备可以包含能够对多个微室成像的光学模块。该设备还可以包含耦合到传送台、气动模块、热模块和光学模块的计算机处理器。计算机处理器可被编程以(i)引导气动模块将试剂装载到微流体装置中并将试剂分配到多个微室中，(ii)引导热模块使多个微室热循环，和(iii)引导光学模块使多个微室成像。

传送台可以被配置成输入微流体装置，保持微流体装置，和输出微流体装置。传送台在一个或多个坐标中可以是静止的。可替代地或附加地，传送台可能够在X方向、Y方向、Z方向或其任意组合上移动。传送台能够保持单个微流体装置。可替代地或附加地，传送台能够保持至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个微流体装置。

气动模块可被配置成与微流体装置的入口和出口流体连通。气动模块可以具有能够连接到多个入口和多个出口的多个连接点。气动模块能够一次填充、回填和分隔单个微室阵列或串联的多个微室阵列。气动模块可进一步包含真空模块。气动模块可以对微流体装置提供增加的压力或向微流体装置提供真空。

热模块可被配置成与微流体装置的微室热连通。热模块可被配置成控制单个微室阵列的温度或控制多个微室阵列的温度。热控制模块可以对所有微室阵列执行相同的热程序，或者可以对不同的微室阵列执行不同的热程序。

光学模块可以被配置成发射和检测多个波长的光。发射波长可以对应于所使用的指示剂和扩增探针的激发波长。所发射的光可包括最大强度为约450nm、500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或其任意组合的波长。检测到的光可包括最大强度为约500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或其任意组合的波长。光学模块可以被配置成发射一种、两种、三种、四种或更多种波长的光。光学模块可以被配置成检测一种、两种、三种、四种或更多种波长的光。一种发射光的波长可对应于指示剂分子的激发波长。另一种发射光的波长可以对应于扩增探针的激发波长。一种检测到的光波长可以对应于指示剂分子的发射波长。另一种检测到的光波长可以对应于用于检测微室内反应的扩增探针。光学模块可以被配置成对微室阵列的部分成像。可替代地或附加地，光学模块可以单个图像对整个微室阵列进行成像。

图6示出了用于在单个机器中执行图5的过程的机器600。机器600包括气动模块601，该气动模块包含泵和歧管并且可以在Z方向上移动，可操作以执行如图3A至3D中所示的压力施加。机器600还包括热模块602，如平板块热循环仪，以使微流体装置进行热循环，从而使聚合酶链反应得以运行。机器600进一步包括光学模块603，例如落射荧光光学模块，其可以光学地确定微流体装置中的哪些微室已经成功地运行PCR反应。光学模块603可以将该信息馈送到处理器604，该处理器使用泊松统计将成功微室的原始计数转换为核酸浓度。传送台605可用于在各个模块之间移动给定的微流体装置并同时处理多个微流体装置。与dPCR的其它实施方案相比，上述微流体装置与将该功能并入单个机器相结合，降低了dPCR的成本、工作流复杂性和空间要求。

本公开不限于本文所述的具体实施例的范围。实际上，除了在此描述的那些实施例之外，根据前面的描述和附图，本领域的普通技术人员将明白本公开的其它各种实施例和修改。

例如，虽然在dPCR应用的上下文中进行了描述，但是可能需要填充有经由气体或其他流体分离的液体的多个分离微室的其它微流体装置可以受益于使用热塑性薄膜来允许除气以避免气体污染，同时还提供关于可制造性和成本的优点。除了PCR之外，其它核酸扩增方法如环介导等温扩增可适于进行根据本公开的实施例的特定核酸序列的数字检测。微室也可用于分离单个细胞，其中虹吸孔被设计成接近待分离细胞的直径。在一些实施例中，当虹吸孔远小于血细胞的大小时，本公开的实施例可用于从全血分离血浆。

用于分析核酸样品和用于形成微流体装置的计算机系统

本公开提供了被编程以实施本公开的方法的计算机控制系统。图7示出了计算机系统701，其可以被编程或以其它方式被配置用于核酸样品处理和分析，包括样品分配、扩增和检测。计算机系统701可以调节本公开的方法和系统的各个方面。计算机系统701可以是用户的电子装置或可以相对于该电子装置远程定位的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。计算机系统701可以被编程或以其它方式被配置成实施图11的一个或多个操作。例如，加热条件和负压的应用可以是计算机控制的。在另一个实例中，计算机系统可以控制溶剂对微流体结构的施加。

计算机系统701包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)705，其可以是单核或多核处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统701还包括存储器或存储位置710(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元715(例如，硬盘)、用于与一个或多个其它系统通信的通信接口720(例如，网络适配器)以及外围装置725，诸如高速缓存、其它存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器710、存储单元715、接口720和外围装置725通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU 705通信。存储单元715可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统701可以借助于通信接口720可操作地耦合到计算机网络(“网络”)730。网络730可以是因特网、互联网和/或外联网，或可与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络730可以是电信和/或数据网络。网络730可以包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，例如云计算。在一些情况下，网络730可以借助于计算机系统701实施对等网络，这可以使耦合到计算机系统701的装置能够表现为客户机或服务器。

CPU 705可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。所述指令可存储在存储器位置如存储器710中。可将指令引导到CPU 705，所述指令可随后编程或以其它方式配置CPU 705以实施本公开的方法。由CPU 705执行的操作的实例可以包括提取、解码、执行和回写。

CPU 705可以是如集成电路之类的电路的一部分。系统701的一个或多个其它组件可以包括在电路中。在一些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)。

存储单元715可以存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储单元715可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统701可以包括在计算机系统701外部的一个或多个附加数据存储单元，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统701通信的远程服务器上。

计算机系统701可以通过网络730与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统701可以与用户(例如，服务提供商)的远程计算机系统通信。远程计算机的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板型PC(例如，

GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，

iPhone、支持Android的装置、

)或个人数字助理。用户可以通过网络730访问计算机系统701。

本文所述的方法可通过存储在计算机系统701的电子存储位置(例如，存储器710或电子存储单元715)上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实施。可以以软件的形式提供机器可执行代码或机器可读代码。在使用期间，该代码可以由处理器705执行。在一些情况下，可从存储单元715检索代码并将其存储在存储器710上以供处理器705随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元715，并且将机器可执行指令存储在存储器710上。

该代码可以被预编译并配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时期间被编译。可以用编程语言来提供代码，可以选择编程语言来使代码能够以预编译或即时编译的方式执行。

在一个方面，本公开提供了包含机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实施用于形成微流体装置以扩增和定量核酸样品的方法。该方法可以包含：注塑热塑性塑料以产生微流体结构，所述微流体结构包含至少一个微通道、多个微室和多个虹吸孔，其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔连接到所述至少一个微通道；形成至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和所述至少一个出口与所述至少一个微通道流体连通；以及施加热塑性薄膜以封盖所述微流体结构，其中所述热塑性薄膜对于施加在所述热塑性薄膜上的压差是至少部分透气的。

在一个方面，本公开提供了包含机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实施用于分析和定量核酸样品的方法。该方法可以包含：提供包含至少一个微通道的微流体装置，其中所述至少一个微通道包含至少一个入口和至少一个出口，并且其中所述微流体装置进一步包含通过多个虹吸孔连接到所述微通道的多个微室，和邻近所述微流体装置的表面安置的热塑性薄膜，使得所述热塑性薄膜封盖所述微通道、所述多个微室和所述多个虹吸孔；向所述至少一个入口或向所述至少一个出口提供试剂；通过在所述试剂和所述微流体装置之间提供第一压差来填充所述微流体装置，其中所述第一压差使所述试剂流入所述微流体装置中；在所述微通道与所述多个微室之间施加第二压差，以将所述试剂移动到所述多个微室中，并迫使所述多个微室内的气体通过封盖或覆盖所述多个微室、所述多个虹吸孔和所述微通道的所述热塑性薄膜，其中所述第二压差大于所述第一压差；以及在所述至少一个入口与所述至少一个出口之间施加第三压差，以将流体引入所述微通道，而不将所述流体引入所述微室中，其中所述第三压差小于所述第二压差。

在一个方面，本公开提供了包含机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实施用于形成微流体装置的方法。该方法可以包含：提供微流体结构和膜；用溶剂处理所述微流体结构的表面、所述膜的表面或两者，随后在第一加热条件下将所述微流体结构与所述膜压制在一起以形成包含所述溶剂的所述微流体装置，以及在第二加热条件下对所述微流体装置施加负压。负压施加的时间段可大于30分钟或压力小于20千帕，以去除至少一部分溶剂。该方法的实施可以包含至少部分地基于构成微流体结构和/或膜的材料来选择溶剂。计算机可以监控微流体结构和膜的压制过程。例如，在溶剂和膜的界面处形成的和谐波生成信号可用于确定溶剂嵌入到膜的聚合物中的程度。计算机可读介质可以被配置成提高所生产的微流体装置的一致性。例如，计算机可读介质可以为一系列微流体装置保持基本相似的条件，从而减少装置之间存在的变化。

这里提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统701，可以在编程中体现。该技术的各个方面可以被认为是通常以机器(或处理器)可执行代码和/或相关联的数据的形式的“产品”或“制品”，该机器可执行代码和/或相关联的数据被承载在或体现在一种类型的机器可读介质中。机器可执行代码可以存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘等电子存储单元上。“存储”型介质可包括计算机的任何或所有有形存储器、处理器等，或其相关联的模块，例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其它电信网络进行通信。例如，这种通信可以使软件能够从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如通过有线和光陆线网络以及通过各种空中链路在本地装置之间的物理接口上使用的光波、电波和电磁波。承载这种波的物理元件，例如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用的，除非限定为非临时性有形“存储”介质，否则例如计算机或机器“可读介质”之类的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，例如计算机可执行代码之类的机器可读介质可以采取多种形式，包括但不限于有形存储介质，载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机等中任何存储设备，诸如可以用于实现在附图中示出的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括计算机系统内包括总线的线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号，或声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，常见形式的计算机可读介质包括：例如，软盘，可折叠磁盘，硬盘，磁带，任何其它磁介质，CD-ROM，DVD或DVD-ROM，任何其它光学介质，穿孔卡纸磁带，具有孔图案的任何其它物理存储介质，RAM，ROM，PROM和EPROM，FLASH-EPROM，任何其它存储芯片或盒式磁带，载波传输数据或指令，传输此类载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其它介质。多种这些形式的计算机可读介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以便执行。

计算机系统701可以包括电子显示器735或与之通信，该电子显示器包含用于提供例如上皮组织的深度轮廓的用户界面(UI)740。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。

本公开的方法和系统可以通过一个或多个算法来实施。算法可以在由中央处理单元705执行时通过软件来实施。该算法例如可以调节系统或实施本文提供的方法。例如，该算法可以监测从微流体装置中放出气体的溶剂的压力，并调节热量、真空压力和/或时间以达到微流体装置中溶剂的预定水平。

虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员将显而易见的是，这些实施例仅以实例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员将想到许多变化、改变和替换。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。预期随附权利要求界定本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

实例1：试剂分配的证明

使用以标准显微镜载玻片尺寸制造的微流体装置证明试剂分配。微流体装置的总尺寸为1英寸宽，3英寸长和0.6英寸厚。该装置包含四个不同的微室阵列设计和总共八个不同的微室阵列。图8A示出了八单元装置和四个阵列设计之一的放大透视图。微流体装置由环烯烃聚合物(COP)Zeonor 790R(日本Zeon Chemicals)模塑，并通过与100μm COP薄膜Zeonox ZF14(日本Zeon Chemicals)热粘合而密封。所示的放大的微流体区段具有通过虹吸孔连接到微室的蛇形微通道。微室呈网格配置。微室和微通道的深度为40μm，虹吸孔的深度为10μm。每个分离的微流体区段具有入口通道和出口通道。在将膜热结合到微流体装置的基部之前，对入口通道和出口通道机械钻孔。入口通道和出口通道的直径为1.6mm。

图8B显示了试剂装载、微室回填和分配的荧光图像。在装载微流体装置之前，将2微升(μL)的4千道尔顿(kDa)荧光素缀合的葡聚糖(密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)移液到入口中。然后使微流体装置与气动控制器接触。气动控制器通过向入口施加4psi的压力3分钟来装载微流体装置的微通道。通过将入口和出口加压至10psi达20分钟来填充微室。然后通过从微流体装置的入口使空气以4psi流动来分配试剂，以从微通道中清除试剂。

实例2：dPCR的单仪器工作流程

用于在微流体装置中扩增和定量核酸的方法可以在单个仪器中进行。该仪器能够进行试剂分配、热循环、图像采集和数据分析。图9示出了能够进行单个仪器工作流程的原型仪器。该仪器被设计为一次容纳多达四个装置，并且能够同时进行图像采集和热循环。该仪器包含用于试剂分配的气动模块、用于温度控制和热循环的热模块、用于成像的光学模块和扫描模块。光学模块具有两种荧光成像能力并且能够检测大约520nm和600nm的荧光发射，其分别对应于FAM和ROX荧光团的发射波长。光学模块具有25mm×25mm的视场和0.14的数值孔径(NA)。

可以使用利用TaqMan探针作为报道分子的成熟qPCR测定来测试单个仪器工作流程。简言之，将核酸样品与PCR试剂混合。PCR试剂包括正向引物、反向引物、TaqMan探针和ROX指示剂。正向引物的序列是5'-GCC TCA ATA AAG CTT GCC TTG A-3'。反向引物的序列是5'-GGG GCG CAC TGC TAG AGA-3'。TaqMan探针的序列是5'-[FAM]-CCA GAG TCA CACAAC AGA CGG GCA CA-[BHQ1]-3'。按照上述方案将核酸样品和PCR试剂装载并在微流体装置内并分配。通过将微室的温度升高至95℃并保持该温度10分钟，随后进行四十个以下循环：以2.4℃/秒的速率将微室的温度从95℃缓变至59℃来进行PCR扩增，在恢复至95℃之前在59℃下保持1分钟来进行PCR扩增。图10A至10D示出了PCR扩增后每个分区含有大约一个核酸模板拷贝的样品和每个分区含有零个核酸模板拷贝(无模板对照或NTC)的分区的荧光图像，以及PCR扩增后每个分区含有大约一个核酸拷贝和NTC分区的样品的荧光强度图。图10A示出了不含核酸模板的分配样品的荧光图像，每个灰色点代表含有PCR试剂的单个微室。通过用约575nm的光激发每个微室内的ROX指示剂并对发射光谱进行成像来获取图像，所述发射光谱在约600nm处具有最大发射。图10B示出了在PCR扩增后每个分区含有大约一个核酸模板拷贝的分配样品。PCR扩增后，成像示出了含有ROX指示剂的微室和含有ROX指示剂和来自FAM探针的发射的微室。FAM探针具有约495nm的激发波长和最大约520nm的发射波长。单个微室含有ROX指示剂、FAM探针和BHQ-1猝灭剂。与图10A一样，每个灰色点代表含有无核酸模板的分配样品的微室。白点代表含有已成功扩增的核酸样品的微室。在成功PCR扩增后，FAM荧光团和BHQ-1猝灭剂可以从TaqMan探针切割，从而产生可检测的荧光信号。图10C和10D分别示出了经分配和扩增的微流体装置的每个微室的随ROX荧光强度变化的FAM荧光强度的2维散点图。图10C示出了每个分区含有零个核酸模板的样品，从而导致在ROX荧光强度范围内主要恒定的FAM荧光强度。图10D示出了每个分区含有大约一个核酸模板拷贝的样品，从而导致FAM荧光强度由于分区中存在扩增信号而随ROX荧光强度变化。

实例3：处理对制造的微流体装置的影响

图13至17是在图11的各个操作点处的微流体装置的实例。在图13至17中的每一个中，这五个图像是示出微流体装置的宽区域的光学显微镜图像。图13是在用溶剂处理微流体结构的表面或膜的表面或两者之后的微流体装置的实例。可以通过经由旋涂将环己烷或乙醇施加到挤出的环烯烃聚合物(COP)膜并且随后在350kPa和80℃下将注塑的COP微流体结构压制到涂布溶剂的膜2分钟来形成微流体装置。图14是液体加压和加热后的微流体装置的实例。作为微流体装置使用的一部分，微流体装置可以经受热和液体压力。热和液体压力可导致分层事件1410。分层事件可以通过图像的暗化来观察。在图14中可观察到比标记的更多的分层事件。在图15中可以观察到更强烈的分层，图15是在空气加压和加热之后的微流体装置的实例。微流体装置的整个图像中增加的暗度可显示微流体结构与膜几乎完全分层。

图16是在液体加压和加热之后经处理的微流体装置的实例。微流体装置的处理可包括将装置周围的压力降低至约4kPa(降低约97kPa)，同时将装置加热至80℃，并保持真空和温度24小时。与图14相反，图16没有示出任何分层事件。类似地，图17是在空气加压和加热之后经处理的微流体装置的实例，没有示出在图15中观察到的完全分层。这可能是由于图16至17与图14至15相比更完全地去除了溶剂。残留溶剂的去除可以增加可用的微流体装置的分数，从而减少浪费和成本。

虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员将显而易见的是，这些实施例仅以实例的方式提供。本发明不旨在受说明书中提供的具体实施例的限制。虽然已参考前述说明书描述本发明，但本文实施例的描述和说明不打算以限制性意义进行。在不脱离本发明的情况下，所属领域的技术人员现在将意识到许多变型、变化和替代物。此外，应当理解，本发明的全部方面不限于本文所阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。因此，经考虑本发明应同样涵盖任何这类替代方案、修改、变型或等效物。所附权利要求书旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

Claims (16)

1.一种用于形成微流体装置的方法，其包含：

a)提供微流体结构和膜；

b)用溶剂处理所述微流体结构的表面、所述膜的表面或两者；

c)在(b)之后，在第一加热条件下将所述微流体结构与所述膜压制在一起以形成包含所述溶剂的所述微流体装置；以及

d)在第二加热条件下对所述微流体装置施加负压，所述负压施加的时间段大于30分钟或压力小于20千帕(kPa)，以从(b)中去除至少一部分所述溶剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微流体结构包含微通道、多个微室、多个虹吸孔或其任意组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理包含施加一种或多种溶剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种溶剂包括选自由异丙醇、丙酮、乙醇、己烷、环己烷、甲苯和苯组成的组中的溶剂。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述压制包含施加至少约0.5千牛顿(kN)的力。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一加热条件包含加热到至少约60℃的温度。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述施加所述负压包含施加小于约7kPa的压力。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二加热条件包含将所述微流体装置加热到至少约70℃的温度。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述将所述微流体装置加热到至少约70℃的温度从所述微流体装置去除至少约75％的所述溶剂。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述施加所述负压包含施加所述负压持续至少约2小时。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述施加所述负压从所述微流体装置中去除至少约50％的所述溶剂。

12.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第二加热条件下所述施加所述负压减少了所述微流体结构与所述膜之间的分隔。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述微流体结构包含特征大小至多约500微米的通道或室。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述去除所述溶剂使微流体装置生成过程的产率增加至少约25％。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述微流体装置具有至少约0.5的可用特征分数。

16.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含对所述微流体装置施加增大的压力，其中所述增大的压力足以排出至少一部分所述溶剂。

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